JPS6260391B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、新規抗生物質RK−647A及びその製
造法に関するものである。 更に詳しくは、本発明のRK−647Aは、ストレ
プトミセス（Streptomyces）属に属する抗生物
質RK−647A生産菌を培養して、その培養物中か
ら前記抗生物質RK−647Aを分離採取することに
より得られる文献未載の新規抗生物質である。 本発明者は、新規抗生物質の探索を目的として
多数の土壌中から微生物を分離し、その産生する
抗生物質を分離探索した結果、ストレプトミセス
属に属する微生物の培養液及び培養菌体に文献未
載の新規抗生物質が産生、蓄積されることの新た
な知見を得て、ここに本発明を完成するに至つ
た。 以下に、本発明の新規抗生物質RK−647A及び
その製造法について詳述する。 まず、本発明において用いる微生物は、抗生物
質RK−647Aの生産能を有するものであり、スト
レプトミセス属に属する菌種である。 その一例として、ストレプトミセス属No.80−
Ｈ−647（Streptomyces sp.No.80−Ｈ−647）と
呼称される微生物は上記の特性を有し、本発明の
抗生物質RK−647Aを有利に生産するものであ
り、本発明方法に有効に利用し得るものである。 また、上記ストレプトミセス属No.80−Ｈ−
647の自然的及び人工的変異株は勿論、ストレプ
トミセス属に属する菌種で後述の抗生物質RK−
647Aの生産能を有する微生物はすべて本発明方
法において使用することができる。 上記ストレプトミセス属No.80−Ｈ−647（以
下、単に「Ｈ−647株」という。）は、本発明者に
より静岡県浜松市で採取された土壤中より発見さ
れた土壤放線菌であり、工業技術院微生物工業技
術研究所に昭和58年４月11日付寄託され、その微
生物受託番号は、微工研菌寄第7039号（FERMP
−7039）である。 上記Ｈ−647株は、次の菌学的性質を有する。 〔〕 形態的特徴 Ｈ−647株は、ストレプトミセス属に属する
形態を示し、スターチ無機塩寒天培地、チロシ
ン寒天培地、イースト麦芽寒天培地、オートミ
ール寒天培地上によく発育し、気中菌糸は豊富
で胞子の形成も良好である。本菌株は、シユー
クロース・硝酸塩寒天培地では発育しない。グ
リセロール・アスパラギン寒天培地、栄養寒天
培地、ペプトン・イースト・鉄寒天培地では、
発育稍不良ながら発育するが、気中菌糸の着生
は充分でなく胞子の形成もないかあるいは極め
て少ない。又、グルコース・アスパラギン寒天
培地では、わずかながら発育が認められる。ス
ターチ無機塩寒天培地、チロシン寒天培地、イ
ースト麦芽寒天培地等に生育した菌の気中菌糸
は長く直線上に発達し、菌糸の所々に数十個の
胞子が集まつた塊が顕微鏡で観察された。気中
菌糸は白又は白にわずかに灰色又は黄色がかつ
た色を呈している。各培地でメラニン色素及び
可溶性色素の生成は認められず、炭素源の資化
性試験において、Ｄ−グルコースとイノシトー
ルでは発育は良好であつた。Ｄ−フラクトース
では、発育は良いが、Ｌ−アラビノース、シユ
ークロース、ラフイノースでは発育は悪い。
又、Ｄ−キシロース、Ｌ−ラムノース、Ｄ−マ
ンニツトでは発育せず、これらの糖は資化でき
ない。ゼラチンの液化試験では、ゼラチン培地
の完全液化が認められ、又脱脂牛乳では、凝固
を伴なわず完全に液化した。 〔〕 各種培地上での生育状態 特許庁産業別審査基準に従い、各種培地を調
製し、接種後３週間を経過した時点で観察した
結果を次に記載する。なお、色調の記載におい
て（ ）内の記号と色の表現法は、デイスクリ
プテイブ・カラー・ネームズ・デイクシヨナリ
ー（Descriptive Color Names Dictionary）
第４版の色名記号に従つた。 １ シユークロース・硝酸塩寒天培地 生育：発育せず ２ グルコース・アスパラギン寒天培地 生育：不良 気中菌糸の着生：殆んどなし 気中菌糸の色：不明 基底菌糸の色：（a.ホワイト） 可溶性色素：なし ３ グリセロール・アスパラギン寒天培地 生育：稍不良 気中菌糸の着生：不良 気中菌糸の色：（3ba.パール） 基底菌糸の色：（2ea.ライト・メイズ） 可溶性色素：なし ４ スターチ無機塩寒天培地 生育：良好 気中菌糸の着生：良好 気中菌糸の色：（ａ＋ｇ＝ホワイト＋グレ
イ） 基底菌糸の色：（１ 1/2Ca＋１ 1/2gc＝
クリーム＋ライトオリーブグレー） 可溶性色素：なし ５ チロシン寒天培地 生育：良好 気中菌糸の着生：良好 気中菌糸の色：（ｂ＋ｆ＝オイスターホワ
イト＋グレイ） 基底菌糸の色：（2le＋2nl＝マスタード＋
コバートブラウン） 可溶性色素：なし ６ 栄養寒天培地 生育：稍不良 気中菌糸の着生：稍不良 気中菌糸の色：（2eaライト・メイズ） 可溶性色素：なし ７ イースト・麦芽寒天培地 生育：良好 気中菌糸の着生：良好 気中菌糸の色：（ｂ＋ｆ＝オイスターホワ
イト＋グレイ） 基底菌糸の色：（2le＋2nl＝マスタード＋
コバートブラウン） 可溶性色素：なし ８ オートミール寒天培地 生育：良好 気中菌糸の着生：良好 気中菌糸の色：（ｂ＋ｆ＝オイスターホワ
イト＋グレイ） 基底菌糸の色：（2le＋2nl＝マスタード＋
コバートブラウン） 可溶性色素：なし ９ ペプトン・イースト鉄寒天培地 生育：稍不良 気中菌糸の着生：不良 気中菌糸の色：不明 基底菌糸の色：（2icハネー・ゴールド） 〔〕 炭素源の資化性（プリドハム・ゴツトリ
ーブ寒天培地） Ｌ−アラビノース ＋ Ｄ−キシロース − Ｄ−グルコース ＋＋＋ Ｄ−フラクトース ＋＋ シユークロース ＋ イノシトール ＋＋＋ Ｌ−ラムノース − ラフイノース ＋ Ｄ−マンニツト − コントロール − 発育状況：＋＋＋ 非常によく発育する。 ＋＋ よく発育する。 ＋ 発育する。 ± 稍々発育する。 − 発育しない。 〔〕 その他の生理的性質 １ 至適生育温度：27〜30℃ ２ ゼラチンの液化（グルコース・ペプトンゼ
ラチン培地）：完全に液化する。 ３ スターチの加水分解（スターチ寒天培
地）：分解しない。 ４ 脱脂牛乳の凝固、ペプトン化：凝固せずに
完全に液化する。 ５ メラニン様色素の生成（チロシン寒天培地
及びペプトン・イースト鉄寒天培地）：なし 上記の諸性質を有するストレプトミセス属の菌
種を野々村氏によるジヤーナル・オブ・フアーメ
ンテイシヨン・テクノロジー52巻２号（Journal
of fermentation technology Vol.52.No.2）記載
の放線菌I.S.P.458菌種の分類法の記載（キイ・
フオア・クラシフイケーシヨン・アンド・アイデ
ンテイフイケイシヨン・オブ・458スペシーズ・
オブ・ザ・ストレプトミセス・インクルーデツ
ド・イン・I.S.P）〔Key for Classification and
Identification of458species of the
Streptomyces Included in I.S.P.）により検索
した結果、気生菌糸が一般に白色かそれに近いも
ので、メラニン様色素と可溶性色素を作らずＤ−
キシロース、Ｌ−ラムノース、Ｄ−マンニツトを
炭素源として資化できない点から、ストレプトミ
セス・アルボニガー（Streptomyces
alboniger）に近縁の種と思われる。しかしなが
ら、抗生物質の生産能において明らかに相違が認
められるので、Ｈ−647株は、ストレプトミセ
ス・アルボニガーに属する新菌株とすることが妥
当と結論された。 次に、本発明方法を実施するに当つては、スト
レプトミセス属に属する抗生物質RK−647A生産
菌を、抗生物質を生産する通常の方法で培養する
ことができる。培養の形態は、液体培養でも固体
培養でもよく、工業的に有利に培養するために
は、上記生産菌の胞子懸濁液又は培養液を培地に
接種し、通気撹拌培養を行えばよい。 培地の栄養源としては特に限定されることな
く、微生物の培養に通常用いられる炭素源、窒素
源その他を培地中に含有させることができる。 炭素源としては、澱粉、デキストリン、グリセ
リン、グルコース、シユークロース、ガラクトー
ス、イノシトール、マンニトールなどが、また窒
素源としては、ペプトン、大豆粉、肉エキス、米
ぬか、〓、尿素、コーンステイープリカー、アン
モニウム塩、硝酸塩、その他の有機または無機の
窒素含有物が用いられる。その他、無機塩類、た
とえば食塩、リン酸塩類、カルシウム、亜鉛、マ
ンガン、鉄等の金属塩類等を適宜に添加してもよ
く、必要に応じて消泡剤としての動、植、鉱物油
等を添加してもよい。 培養温度、培養時間等の培養条件は使用菌の発
育に適し、しかもRK−647Aの生産が最高となる
ような条件が選ばれる。たとえば、培地のPHは中
性付近がよく、培養の適温は25℃〜35℃程度が望
ましい。また培養時間は通常２〜７日間程度がよ
い。 しかし、これらの培養組成物、培地の液性、培
養温度、撹拌条件などの培養条件は使用する菌株
の種類や外部の条件などに応じて好ましい結果が
得られるよう適宜調節選択されるべきであること
はいうまでもない。このようにして得られる培養
物から、抗生物質RK−647Aを得るには代謝産物
を採取するのに通常用いられる手段を適宜に利用
して採取し得る。たとえば、RK−647Aと不純物
との溶解度差を利用する手段、吸着親和力の差を
利用する手段、イオン結合力の差を利用する手
段、有機溶剤との間の分配の差を利用する手段の
いずれも、それぞれ単独で、または組合わせて、
あるいは反復して利用される。 具体的には、RK−647Aは培養液及び培養菌
体に存在するが、培養液より陽イオン交換樹脂
Dowex50W×８（Ｈ型）に吸脱着させることが適
当である。培養菌体中に存在するRK−647Aは、
菌体を含水アセトン、あるいは含水メタノール等
を用いて抽出することが出来る。このように抽出
されたRK−647Aは、その両性の性質を利用し
て、吸着クロマトグラフイー、イオン交換クロマ
トグラフイー、ゲル過クロマトグラフイー等を
組み合わせて精製することが出来る。吸着クロマ
トグラフイーの担体としては、ダイヤイオンHP
−10、活性炭、シリカゲル等の吸着剤が使用され
る。イオン交換クロマトグラフイーの担体として
は、DEAE−セルロース、DEAE−セフアロー
ス、CM−セルロース、CM−セフアデツクス等
のイオン交換体を利用することが出来る。又、ゲ
ル過には、セフアデツクスLH−20が有利に使
用し得る。更に高度の精製には高速液体クロマト
グラフイーが利用される。この場合の使用カラム
は逆層分配型のものが有利に使用出来る。このよ
うにして精製されたRK−647Aは、その水溶液に
エタノール、アセトン等を加えると高純度の白色
の粉末として沈澱するので、これを過により採
取することが出来る。この白色粉末を含水アルコ
ール、含水アセトン等により再結晶して無色結晶
を得る。かくして得られた抗生物質RK−647Aの
理化学的性質及び生物学的性状は次のとおりであ
る。 〔抗生物質RK−647Aの理化学的性質及び生物学
的性状〕 (1) 形状：無色針状結晶 (2) 融点：270℃以上で分解 (3) 元素分析：炭素31.51％、水素4.02％、窒素
19.53％、硫黄6.51％、塩素7.33％ (4) 分子量：451（二次イオン・マススペクト
ル：（Ｍ＋１）⁺m／z452、（Ｍ＋Na）⁺m／
z474） (5) 比旋光度：〔α〕^２０ _Ｄ＋2.34（C1.0、水） (6) 紫外部吸収スペクトル（第１図参照）：中
性、塩基性、酸性で263nｍにそれぞれＥ^１％_１ｃｎ
272、257、253の極大吸収を示す。 (7) 赤外部吸収スペクトル（第２図参照）：臭化
カリ中、次の波数に特徴的な吸収帯を有す
る。 3370、3160、2920、1645、1600、1500、
1455、1290、1205、1140、1095、975、835、
780、625、585cm^-1 (8) 溶解性：水に可溶、その他の有機溶媒に不溶
である。 (9) Rf値：（薄層クロマトグラフイー）Rf シリカゲル：クロロホルム−メタノール
（１：１）0.16 酢酸エチル−メタノール（５：１）0.03 セルロース：ブタノール−メタノール−水
（４：１：１）0.22 ブタノール−酢酸−水（４：１：２）
0.45 (10) 呈色反応：過マンガン酸カリウム溶液を脱色
する。アニスアルデヒド−硫酸試薬、過沃素
酸−ベンジジン試薬、ニンヒドリン試薬に陽
性である。 (11) 塩基性、酸性、中性の区別：両性物質 (12) 抗菌スペクトル（ペーパーデイスクを用いた
寒天プレート法による）：以下に示すようにキサ
ントモナス（Xanthomonas）属の細菌に特
異的に強い生育阻害活性を示す。

【表】 以上の抗生物質RK−647A物質の理化学的性質
及び生物学的性状を、既知の抗生物質と比べる
と、紫外部吸収スペクトルに於て、263nｍに極
大吸収を示すこと、分子内に硫黄、塩素を含むこ
とから、抗生物質AT−265（E.Takahashi and
T.Beppu、J.Antibiotics、35、939（1982））が類
似物質として挙げられる。しかし、AT−265は
グラム陽性、グラム陰性の細菌に対して抗菌作用
を示すのに対し、RK−647Aはキサントモナス
（Xanthomonas）属の細菌に特異的に生育阻害作
用を示し、他の細菌に活性を示さない。またRK
−647AはＨ−NMRスペクトルに於て、δ_H
1.5ppmにメチル基のピークが観測されるのに対
し、AT−265にはメチル基は存在しない。また
赤外部吸収スペクトルに於ても明らかに有意な相
違が認められる。以上の点からRK−647Aは新規
抗生物質であると結論した。 RK−647Aは、植物病原性細菌に対して抗菌活
性を示すことから農業用抗菌剤としての利用が期
待できる。 以下に、本発明方法を実施例によつて詳述する
が、本発明方法はこれらに何ら限定されるもので
はない。 実施例 30容積のジヤーフアーメンターにグルコース
２％、可溶性澱粉１％、肉エキス0.1％、酵母0.4
％、大豆粉2.5％、食塩0.2％、第二燐酸カリ0.005
％の組成よりなる培地18に、あらかじめ同一培
地に、前記Ｈ−647株（微工研菌寄第7039号）を
接種して48〜72時間27℃で振盪培養した培養液
150mlを接種して27℃で48〜72時間、通気撹拌培
養を行う。最終PH7.2〜8.0である。ジヤーフアー
メンター２基分の培養液に過助剤セライトを加
えて遠心過し菌体と液とに分ける。菌体は60
％アセトン10を用いて抽出し、これを減圧濃縮
してアセトンを溜去し、４の水溶液を得る。培
養液と菌体抽出液を合わせ、陽イオン交換樹脂
Dowex50W×８（Ｈ型）、４のカラムを通過さ
せる、カラムは水15を用いて洗滌後、0.5規定
アンモニア水45を用いて溶出を行う。活性区分
を集め、溶出液をそのまま活性炭カラム（1.5
）にかける。水30、10％アセトン10で洗浄
後、活性物質を60％アセトンで溶出する。活性区
分を集め、減圧濃縮して得られる水溶液600mlを
酢酸エチル300mlで３回抽出し、その水層を減圧
で濃縮し、酢酸エチルを完全に除去する。この水
溶液をダイヤイオンHP−102のカラムに通過さ
せ、カラムを水洗後、10％アセトンで溶出する。
活性区分８を集め減圧濃縮し、凍結乾燥するこ
とによつて粗物質500mgを得る。粗物質をセルロ
ース500mlのカラムにてクロマトグラフイーを行
ない精製する。ブタノール−メタノール−水
（４：１：0.5→４：１：１）の溶媒系を用いて分
画し、有効区分を集めて濃縮・凍結乾燥すること
により粗物質200mgを得る。これを、溶媒系クロ
ロホルム−メタノール（１：１）を用いたシリカ
ゲル、カラムクロマトグラフイーにて分離し、活
性区分を集めて濃縮乾固すると粗物質80mgを得
る。更にこれをセフアデツクスLH−20、300mlの
カラムにかけ、10％メタノールにて展開し、活性
区分を集めて濃縮し、凍結乾燥することにより粗
物質60mgを得る。この粗物質の精製は逆相カラム
（ヌクレオジル5C₁₈、φ20×300mm）を用いた高速
液体クロマトグラフイーをメタノール−水（３：
７）の溶媒系で行ない、活性ピークを分取し、メ
タノールを除去後凍結乾燥すると白色粉末20mgが
得られる。この粉末を0.1Mピリジン−蟻酸（PH
２）の緩衝液を用いて、高圧紙電気泳動
（2500V、20分）によつて精製する。陰極側に１
cm移動する、ニンヒドリン陽性でUV吸収のある
部分を帯状に切り取つて水で抽出し、凍結乾燥す
ると15mgの白色粉末が得られ、これを水−エタノ
ール系で再結晶すると無色針状の結晶７mgが得ら
れる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、RK−647Aの紫外吸収スペクトルを
示す図面であり、第２図は、RK−647Aの赤外吸
収スペクトルを示す図面である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 下記の理化学的性質及び生物学性状を有する
   抗生物質RK−647A (1) 形状：無色針状結晶 (2) 融点：270℃以上で分解 (3) 元素分析：炭素31.51％、水素4.02％、窒素
   19.53％、硫黄6.51％、塩素7.33％ (4) 分子量：451（二次イオン・マススペクト
   ル：（Ｍ＋１）⁺m／z452、（Ｍ＋Na）⁺m／
   z474） (5) 比旋光度：〔α〕^２０ _Ｄ＋2.34゜（C1.0、水） (6) 紫外部吸収スペクトル：中性、塩基性、酸性
   で263nｍにそれぞれＥ^１％_１ｃｎ272、257、253の極大
   吸収を示す。 (7) 赤外部吸収スペクトル：臭化カリ中、次の波
   数に特徴的な吸収帯を有する。 3370、3160、2920、1645、1600、1500、1455、
   1290、1205、1140、1095、975、835、780、
   625、585cm^-1 (8) 溶解性：水に可溶、その他の有機溶媒に不溶
   である。 (9) 呈色反応：過マンガン酸カリウム溶液を脱色
   する。アニスアルデヒド−硫酸試薬、過沃素酸
   −ベンジジン試薬、ニンヒドリン試薬に陽性で
   ある。 (10) 塩基性、酸性、中性の区別：両性物質 (11) 抗菌スペクトル：（ペーパーデイスクを用い
   た寒天プレート法による）；キサントモナス
   （Xanthomonas）属の細菌に特異的に強い阻害
   活性を示す。 ２ ストレプトミセス（Streptomyces）属に属
   する抗生物質RK−647A生産菌を培養し、その培
   養物より抗生物質RK−647Aを分離採取すること
   を特徴とする抗生物質RK−647Aの製造法。 ３ ストレプトミセス属に属する抗生物質RK−
   647A生産菌が、ストレプトミセス属No.80−Ｈ−
   647（Streptomyces sp.No.80−Ｈ−647）である
   特許請求の範囲第２項記載の方法。