JPS62207284A - 抗生物質ｒｋ−９５５ａ及びその製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （発明の技術分野） 本発明は、抗生物質ＲＫ−９５５Ａ及びその製造法に関
するものである。本発明のＲＫ−９５５Δは、ストレプ
トミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）　　ｒに属する
抗生物質ＲＫ−９５５Ａ生産菌を培養して、その培養物
中から分離採取される文献未載の新規抗生物質である。

（発明の背景） 抗生物質は、医療用のみならず農薬用としても利用しう
るちのが現在までに数多く見出されている。

本発明者らは、従来より上記の如き有用な抗生物質の探
索を目的として、多数の土壌中から微生物を分離し、そ
の産出する抗生物質について、精製、同定及び用途の開
発を行ってきた。

その結果、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅ
ｓ）属に属する微生物の培養物中に文献未載の新規抗生
物質が産出、蓄積されることの知見を寿、その単離、精
製に成功した。

（発明の目的） 本発明の目的は、新規な抗生物質および該抗生物質を放
射菌ストレプトミセス属に属する微生物から分離・採取
する方法を提供することにある。

（発明の構成） く使用する微生物〉 まず、本発明において用いる微生物は、抗生物質ＲＫ−
９５５Ａの生産能を有するものであり、ストレプトミセ
ス属に属する菌種である。

その−例として、ストレプトミセス・エスピー・ＲＫ　
−９５５（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　　ｓ　ｐ、　　
ＲＫ　−９５５（以下“ＲＫ−９５５株”という）と呼
称される微生物は上記の特性を有し、本発明の抗生物質
ＲＫ−９５５Ａを有利に生産するものであり、本発明方
法に有効に利用し得るものである。

また、上記ＲＫ−９５５株の自然的及び人工的変異株は
勿論、ストレプトミセス属に属する菌種で後述の抗生物
質ＲＫ−９５５Ａの生産能を有する微生物はすべて本発
明方法において使用することができる。

上記ＲＫ−９５５株は、本発明者により神奈川県横須賀
市で採取された土壌中より発見された土壌放射菌であり
、工業技術院微生物工業技術研究所に昭和６１年２月２
１日付寄託され、その微生物受託番号は、微工研菌寄第
８６６０号（ＦＢＲＭ　Ｐ−８６６０）である。

ＲＫ−９５５株は、次の菌学的性質を有する。

［９形態 前記ＲＫ−９５５株を菌体成分分析用培地であるグルコ
ース・イーストエキス培地で培養し、菌体を分離乾煙後
、６ＮＨＣＩ！、１１０℃、２０時間、加水分解したも
ののペーパークロマトグラフではり、Ｌ−ジアミノピメ
リン酸を検出した。

木閑の平板培養したものは密な螺旋性を有し、胞子表面
は平滑だがしわがあり、胞子間は明確でない。胞子鎖は
数十個連なり、胞子のう、運動性胞子は観察されない。

以上のことから本菌株はストレプトミセスに属するが、
各培地に於ける性状は次の様である。

２、　各種培地での生育状態（２７℃３週間培養、色調
はディスクリブチイブ・カラー・ネームズ・ディクショ
ナリ（Ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｖｅ　ｃｏｌｏｒ　ｎａｍｅ
ｓｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ　）による）。

全ての培地で可溶性色票は認められなかった。

１）シュクロース硝酸塩寒天培地 発育　：不良 気菌糸：少ｆｆｉ　　ｃ（ライトグレー）−ｎ（黒）裏
面　：　　　ｂ（オイスター・ホワイト）２）グルコー
ス・アスパラギン寒天培地発育　：不良 気菌糸：１ｊ＆ｖｂ＜オイスター・ホワイト）裏面　：
２ｂａ（パール） ３）グリセリン・アスパラギン寒天培地生育　：不良 気菌糸；微ｆｆｉ　　ｂ（オイスター・ホワイト）裏面
　＋　　　２ｂａ　（パール〉 ４）スターチ無機塩寒天培地 生育　：普通 気菌糸：普通　ｂ−ｋ（オイスター・ホワイト−グレー
）−〇（黒） 四面　：　　　３ｈａ　（パール） ５）チロシン寒天培地 生育　：良好 気菌糸：多Ｉｎ＋ｃ（チャコールグレー＋ライトグレー
）−ｎ（黒） 裏面　：　　　２ｇｃ　（バンブー） ６）栄養寒天培地 生育　：普通 気菌糸：少Ｉ　Ｃ（ライトグレー） 裏面　：　　　２ｇｃ　（バンブー） ７）イースト麦芽寒天培地 生育　二普通 気菌糸：普通２ｄｃ　（ナチュラルストリング）裏面　
：　　　２ｇｃ　（バンブー） ８）オートミール寒天培地 生育　：良好 気菌糸：多ｆｆ１ｃ＋ｎ（ライトグレー十黒〉裏面　：
　　　　ｂ十ｇ　（オイスター・ホワイト＋グレー） ９）ペプトン・イースト・鉄寒天培地 生育　；普通 気菌糸：なし 裏面　：　　　　２ｅｃ　　（サンド）３、炭素源の資
化性（ブリドハム・ゴツトリーブ寒天培地） 生育培地 Ｌ−アラビノース　　　　　＋ Ｄ−キシロース　　　　　　＋ Ｄ−グルコース　　　　　　＋ Ｄ−フラクトース　　　　　＋ シュクロース　　　　　　　＋ イノシトール　　　　　　　＋ Ｌ−ラムノース　　　　　　＋ ラフィノース　　　　　　　＋ Ｄ−マンニトール　　　　　＋ ４、その他の生理的性質 ■、至適温度　　　　　　　２５〜３５℃２、ゼラチン
の液化　　　　　陰性 ３、澱粉の加水分解　　　　　陽性 ４、脱脂乳の凝固　　　　　　陽性 ５、脱脂乳のペプトン化　　　陽性 ６、メラニン様色素の生成　　陰性 本菌株はシュクロース硝酸塩寒天培地、スターチ無機塩
寒天培地、チロシン寒天培地、オートミル寒天培地にみ
られるように気菌糸の湿潤黒化がみられる。これはＳ、
バイグロスコピカスの特徴であり、菌糸の、形態からも
本菌はＳ、バイグロスコピカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃ
ｅｓ　ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ）に属する菌株であ
ると推定される。

（培養法及び精製法） 本発明の抗生物質ＲＫ−９５５Ａを得るに当っては、ス
トレプトミセス属に属する上記抗生物質生産菌を、抗生
物質を生産する通常の方法で培養すればよい。培養の形
態は、液体培養でも固体培養でもよく、工業的に有利に
培養するためには、前記生産菌の胞子懸濁液又は培養液
を培地に接種し、通気攪拌培養を行えばよい。

培地の栄養源としては特に限定されることはなく、微生
物の培養に通常用いられる炭素源、窒素源その他を培地
中に含有させることができる。炭素、原としては、殿粉
、デキストリン、グリセリン、グルコース、シュクロー
ス、ガラクトース、イノントール、マンニトールなどが
、また窒素源としては、ペプトン、大豆粉、肉エキス、
米ぬか、麩、尿素、コーンステイープリカー、アンミニ
ラム塩、硝酸塩、その他の有機または無機の窒素化合物
が用いられる。その池、無機塩類、たとえば食塩、燐酸
塩類、カリウム、カルシウム、亜鉛、マンガン、鉄等の
金属塩類等を適宜に添加してもよく、必要に応じて消氾
剤として、勅、植、鉱物油等を添加してもよい。培養温
度、培養時間等の培養条件は使用菌の発育に適し、しか
もＲＫ−９５５Ａの生産が最高となるような条件が選ば
れる。たとえば、培地のｐＨは４〜９、特に７〜７．５
付近がよく、培養の適温は２５−３５℃程度がよい。し
かし、°これらの培養組成物、培地の水素イオン濃度、
培養温度、把拌条件などの培養条件は使用する菌株の種
類や、外部の条件などに応じて好ましい結果が得られる
ように適宜調節されるべきであることはいうまでもない
。このようにして得られる培養物から、ＲＫ−９５５Ａ
を得るには、代謝産物を採取するのに通常用いられる手
段を適宜に利用して採取しｆｒ？る。たとえば、ＲＫ−
９５５Ａと不純物との溶解度差を利用する手段、イオン
結合力の差を利用する手段、吸着親和力の差を利用する
手段、分子量の差を利用する手段のいずれも、それぞれ
単独、又は、適宜組合わせて、あるいは反復して使用さ
れる。具体的には、ＲＫ−９５５Ａは、その培養濾液及
び菌体中の双方に存在するが、菌体中に存在する活性区
分は、含水アセトン抽出後、アセトンを留去して得られ
る。これを、前記培養濾液と合わせ、吸着クロマトグラ
フィー、シリカゲルクロマトグラフィー、液体クロマト
グラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過
クロマトグラフィーを適宜組合わせて精製すると、ＲＫ
−９５５Ａの活性成分を含んだ粗物質を得る。のられた
粗物質を、例えば、分取りロマトグラフィー等により更
に活性成分を分取し、濃縮、結晶化を行うことにより、
純粋なＲＫ−９５５Ａを得ることができる。

口ＲＫ−９５５Ａの理化学的性質及び生物学的性質〕 （１）形状：白色結晶状粉末 （２）　　融点：２１７〜２２０℃（−Ｎａ塩）（３）
元素分析：炭素６４．５８％、水素９．３０％、酸累２
３．４１％ （４）比旋光度：　〔αＬ＋２３°（Ｃ＝０．１５、Ｃ
ｌ（α、）第２図のとおり （７）分子量ニア３８（遊離）、７６０　（ナトリウム
塩）〔マス・スペクトルによる〕 ＦＤマス・スペクトル（ナトリウム塩）（Ｍ＋Ｈ）”　
、ｍ／ｚ　　７６１ （Ｍ＋Ｎａじ、ｍ／ｚ　　７８３ （Ｍ　＋　Ｋ）”　　、ｍ　／　ｚ　　　７　９　９高
分解能ＥＩマス・スペクトル（ナトリウム塩） Ｍ”　、ｍ／ｚ　　７６０．４７６７ （ｍ／ｚ　　７６０．４８０１　　Ｃ４１Ｈ６９０ｚＮ
ａとしての計算値） （８）　　溶解性：メタノール、エタノール、アセトン
、クロロホルム、酢酸エチルに可溶、水に不溶 （９）　　呈色反応ニアニスアルデヒド−硫酸反応・・
・陽性 レミュー試薬、ニンヒドリン試 薬、過マンガン酸カリ反応・・・陰 性 α［）　　Ｒｆ　値；シリカゲル薄層クロマトグラフィ
（Ｍｅｒｃｋ　Ｆ２５４） 溶　　媒　　系　　　　　　　　　　　　　　Ｒｆ　　
値クロロホルムーメタノール（９：ｌ）　　０．７５同
　　　　　　　（１９：１）　　　　０．３２＋１０　
　塩基性、酸性、中性の区別：酸性物質（１２）抗菌ス
ペクトル；ペーパー・ディスク検定、寒天プレート法（
１０００μｇ／ｍｌ）供　試　菌　　　　　阻止円の大
きさくｍｍ）・スフフィロコブカス・　　　　　　　　
２１オーレウス２０９Ｐ （Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ　２０
９Ｐ）・ミコバクテリウム・フライ　　　　　　　３２
（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｐｈｌｅｉ　　）・シ
ュードモナス・アエルギノ　　　　　　　〇−ザ（Ｐｓ
ｅｕｄｏｍｏｎａｓ　　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）・シュ
ードモナス・アエルギノ　　　　　２５一ザＬ株 （Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ　Ｌ
　５ｔｒａｉｎ）・キサントモナス・オリゼー　　　　
　　１２（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ　ｏｒｙｚａｅ　）
・ピリキュラリア・オリゼー　　　　　（１６）（Ｐｙ
ｒｉｃｕｌａｒｉａ　ｏｒｙｚａｅ　）・オルフナリア
・マリ　　　　　　　　（２２）（八Ｈｅｒｎａｒｉａ
　　ｍａｌｉ　　　）・ボトリチス・シネリア （１３ｏｔｒｙいｓ　ｃｉｎｅｒｅａ）ＲＫ−９５５Ａ
物質は、その物理化学的、生物学的性状においてニゲリ
シン（ｎｉｇｅｒｉｃｉｎ）　（Ｌ、　Ｋ。

シニタインラウ７　（Ｓｔｅｉｎｒａｕｆ　　）　ｅｔ
　ａｌ、、Ｂ、Ｂ、Ｒ，Ｃ，。

３３：２９−３１　（１９６８）と類似しているので、
ポリエーテル系抗生物質であると考えられる。

’Ｈ−ＮＭＲスペクトルの類似性は両者の基本的構造の
相似性を示唆する。しかしＲＫ−９５５Ａ物質は、旧ｇ
ｅｒｉｃｉｎよりＣＨ２だけ大きい分子式を有し、明ら
かに異なった物質である。これらの事実から文献を検索
すると、ｎｉｇｅｒｉｃｉｎ　と類似の骨格を有して、
ＣＨ２の元素組成の異なる物質は報告されていない。従
って本物質を新規物質であると結論した。

（有用性） 本発明の抗生物質ＲＫ−９５５Ａは、各種細菌及び植物
病原菌に対し抗菌性を示すことから、抗菌剤及び農業用
殺菌剤としての利用が期待される。

以下に、本発明を実施例により更に詳細に説明する。

実施例 ＲＫ−９５５株（微工研閑寄第８６６０号）を、グルコ
ース２％、可溶性デンプン１％、陶工１キス０．１％、
酵母０．４％、大豆粉２．５％、食塩０．２％、第二燐
酸力ＩＪ　０．００５％の組成の液体培地７Ｑｎ＋ｊ！
中に接種し、Ｋ、フラスコ（５００ｍｌ容）中で、２７
℃、７２〜９６時間、通気振盪培養を行なう。

培養終期のρ１１は７．１〜７．５である。Ｋ＋　　フ
ラスコ２５本分の培養液を６０００ｒｐｍ、２０分間、
遠心して、１．２βの上清と菌体を得る。菌体は７０％
アセトン水１１に浸漬し一夜放置後濾過して、菌体抽出
液１１を辱る。これを減圧濃縮してアセトンを除去し、
遠心上清と合わせてそのままのｐｆｌで酢酸エチルＩＩ
２にて２回抽出する。酢酸エチル層を合わせて無水硫酸
す）　ＩＪウムを加えて脱水した後、酢酸エチル抽出液
を減圧濃縮する。残渣を乾燥すると５ｇの粗抽出物が得
られる。これを１５ｍ１のクロロホルム−メタノール（
１：１）混液に溶解し、クロロホルムにてパックしたシ
リ　２カゲル・カラム（４Ｘ３０Ｃ＋ｎ）に乗せる。ク
ロロホルム１．５　ｚ　、クロロホルム−メタノール（
１９：ｌ）Ｌ、５ｊ！、クロロホルム−メタノール（９
：１）ｉ、Ｂ、クロロホルム−メタノール（４：　１）
１．５１、の順に溶出を行ない、５Ｑ＋＋＋Ｊ！づつ分
画する。抗菌活性の追跡はシュードモナス・アエルギノ
ーザ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ
　）　Ｌ株を用いて行ない、クロロホルム−メタノール
（１９：１）にて溶出される活性画分を集めて減圧濃縮
し乾燥すると１．２ｇの粗物質が得られる。これを５ｍ
ｊ２のメタノールに溶解して、メタノールでパックした
トヨパー／Ｌ／　（Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ）　ＨＷ　４０
　（Ｆｉｎｅ）　　（東洋曹達製）のカラム（２，４Ｘ
８０ｃｍ）に乗せる。

メタノールにて展開して１２ｍ１づつ分画する。

活性画分を集めて濃縮し乾燥すると　２４０　ｍｇの粗
物質が得られる。これを１．５ｍｊ！のメタノールに溶
解し、シリカゲル分取薄層クロマトグラフィーヲ、クロ
ロホルム−゛メタノール（９：　１）の溶媒系によって
行なう。水をＴＬＣプレートに噴霧することによって現
れる白いバンドを指標にして分取する。Ｒｆ＝０．５５
の太いバンドとＲｆ　＝０．６５の細いバンドを分離し
て分取する。それぞれのシリカゲルより酢酸エチルにて
活性物質を溶出する。それぞれを減圧濃縮して乾煙する
と、Ｒｆ　　＝０．５５ノハンｔ’ヨｌ：）　７０ｍｇ
５Ｒｆ　　＝０．６５のバンドより３　ｍｇの物質がほ
ぼ単一に得られる。

Ｒｆ＝０．５５のバンドより得られる物質は既知のポリ
エーテル抗生物質である旧ｇｅｒｉｃｉｎ　と同定され
る。Ｒｒ＝０．６５のバンドより得られる物質を酢酸エ
チル−ヘキサンにより結晶化すると２．５　ｍｇのＲＫ
−９５５Ａ物質がナトリウム塩の形で結晶状粉末として
得られる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明の抗生物質ＲＫ−９５５Ａの紫外部吸
収スペクトルを示す図面であり、第２図は、ＲＫ−９５
５Ａの赤外部吸収を示すスペクトルである。 手続補正帯（方式） １．事件の表示　　　昭和６１年特許願第５００７１号
２、発明の名称　　　抗生物質ＲＫ−９５５Ａ及びその
製造法３、補正をする者 事件との関係　　出願人 ４、代理人 ５、補正命令の日付　　昭和６１年５月２７日手続補正
書 １、事件の表示　　　昭和６１年特許願第５００７１号
２、発明の名称　　抗生物質ＲＫ−９５５Ａ及びその製
造法３、補正をする者 、事件との関係　　出願人 名称　（６７９）理化学研究所 ４、代理人

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、下記の理化学的性質及び生物学的性質を有する抗生
   物質ＲＫ−９５５Ａ。 （１）形状：白色結晶状粉末 （２）融点：２１７〜２２０℃（−Ｎａ塩） （３）元素分析：炭素６４．５８％、水素９．３０％、
   酸素２３．４１％ （４）比旋光度：〔α〕＿Ｄ＋２３°（Ｃ＝０．１５、
   ＣＨＣｌ＿３） （５）紫外部吸収スペクトル：λ＾ク＾ロ＾ロ＾ホ＾ル
   ＾ム＿ｍ＿ａ＿ｘｍμ（Ｅ＾１＾％＿１ｃｍ）　ｓｈ２
   ２０（７） （６）赤外部吸収スペクトル：ν＾ク＾ロ＾ロ＾ホ＾ル
   ＾ム＿ｍ＿ａ＿ｘ ３４００、２９３０、１６０２、１５０２、１４２０、
   １１７０、１１１０、１０２０、９６０、９２５、６６
   ０ｃｍ＾−＾１ （７）分子量：７３８（遊離）、７６０（ナトリウム塩
   ） マス・スペクトル：ＦＤＭＳ（ナトリウム塩）（Ｍ＋Ｈ
   ）＾＋、ｍ／ｚ７６１ （Ｍ＋Ｎａ）＾＋、ｍ／ｚ７８３ （Ｍ＋Ｋ）＾＋、ｍ／ｚ７９９ 高分解能ＥＩＭＳ（ナトリウム塩） Ｍ＾＋、ｍ／ｚ７６０、４７６７ （ｍ／ｚ７６０、４８０１　Ｃ＿４＿１Ｈ＿６＿９Ｏ＿
   １＿１Ｎａとしての計算値） （８）溶解性：メタノール、エタノール、アセトン、ク
   ロロホルム、酢酸エチルに可溶、水に不溶 （９）呈色反応：アニスアルデヒド−硫酸反応・・・陽
   性 レミュー試薬、ニンヒドリン試薬、過マンガン酸カリ反
   応・・・陰性 （１０）塩基性、酸性、中性の区別：酸性物質 （１１）抗菌スペクトル：各種細菌、植物病原菌に対し
   、抗菌活性を示す。 ２、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属
   に属する抗生物質ＲＫ−９５５Ａ生産菌を培養し、その
   培養物から抗生物質ＲＫ−９５５Ａを分離採取すること
   を特徴とする抗生物質ＲＫ−９５５Ａの製造法。 ３、抗生物質ＲＫ−９５５Ａ生産菌が、ストレプトミセ
   ス・エスピー・ＲＫ−９５５（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅ
   ｓ　ｓｐ．ＲＫ−９５５）である特許請求の範囲第２項
   記載の製造法。