JPH0691831B2 - １３β−１３−デオキシ−２２，２３−ジヒドロアベルメクチン−Ｂｌａ／Ｂｌｂアグリコンの微生物学的製造 - Google Patents
１３β−１３−デオキシ−２２，２３−ジヒドロアベルメクチン−Ｂｌａ／Ｂｌｂアグリコンの微生物学的製造Info
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- JPH0691831B2 JPH0691831B2 JP3239615A JP23961591A JPH0691831B2 JP H0691831 B2 JPH0691831 B2 JP H0691831B2 JP 3239615 A JP3239615 A JP 3239615A JP 23961591 A JP23961591 A JP 23961591A JP H0691831 B2 JPH0691831 B2 JP H0691831B2
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- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
- C12N1/205—Bacterial isolates
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
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- C12P17/18—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms containing at least two hetero rings condensed among themselves or condensed with a common carbocyclic ring system, e.g. rifamycin
- C12P17/181—Heterocyclic compounds containing oxygen atoms as the only ring heteroatoms in the condensed system, e.g. Salinomycin, Septamycin
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- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/465—Streptomyces
- C12R2001/545—Streptomyces griseus
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- Heterocyclic Carbon Compounds Containing A Hetero Ring Having Oxygen Or Sulfur (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Description
【０００１】本発明の製法により製造される化合物は、
米国特許４，５８７，２４７に開示された既知の化合物
である。その化合物は厳しい化学的エピマー化により製
造する事ができ、又、米国特許４，６６６，９３７に記
載されたごとく微生物学的に製造される。本製法は３種
の微生物のうちのいずれかひとつを用いて天然生成物１
３−α−化合物から直接的に１３−β化合物の新規製造
を提供するものである。尚、３つの微生物のうちの２つ
は新規のものである。
米国特許４，５８７，２４７に開示された既知の化合物
である。その化合物は厳しい化学的エピマー化により製
造する事ができ、又、米国特許４，６６６，９３７に記
載されたごとく微生物学的に製造される。本製法は３種
の微生物のうちのいずれかひとつを用いて天然生成物１
３−α−化合物から直接的に１３−β化合物の新規製造
を提供するものである。尚、３つの微生物のうちの２つ
は新規のものである。
【０００２】本発明は、駆虫剤及び抗寄生虫剤として有
用であり、又、他の駆虫剤の製造の為の中間体としても
有用である、本化合物１３−β−２２，２３−ジヒドロ
アベルメクチンＢ１ａ／Ｂ１ｂアグリコンの製造の為の
新規方法に関する。すなわち本発明の目的は、出発物質
１３−デオキシ−２２，２３−ジヒドロアベルメクチン
Ｂ１ａ／Ｂ１ｂアグリコンの生物的形質転換醗酵による
上記化合物の製造を開示する事にある。本発明の他の目
的は、醗酵ブロスから所望の生成物を単離する為に使用
される方法を開示する事にある。本発明の更に他の目的
は生物的形質転換反応を行いうる既知の微生物ストレプ
トマイセスラベンジュレＭＡ−６５５５、ＡＴＣＣ１４
１５９に加えて２つの新規な微生物（ＭＡ−６７６２、
ＡＴＣＣ５５０６９）及び（ＭＡ−６７６３、ＡＴＣＣ
５５０７０）を開示する事にある。本発明の更に他の目
的は以下の記載から明らかとなる。
用であり、又、他の駆虫剤の製造の為の中間体としても
有用である、本化合物１３−β−２２，２３−ジヒドロ
アベルメクチンＢ１ａ／Ｂ１ｂアグリコンの製造の為の
新規方法に関する。すなわち本発明の目的は、出発物質
１３−デオキシ−２２，２３−ジヒドロアベルメクチン
Ｂ１ａ／Ｂ１ｂアグリコンの生物的形質転換醗酵による
上記化合物の製造を開示する事にある。本発明の他の目
的は、醗酵ブロスから所望の生成物を単離する為に使用
される方法を開示する事にある。本発明の更に他の目的
は生物的形質転換反応を行いうる既知の微生物ストレプ
トマイセスラベンジュレＭＡ−６５５５、ＡＴＣＣ１４
１５９に加えて２つの新規な微生物（ＭＡ−６７６２、
ＡＴＣＣ５５０６９）及び（ＭＡ−６７６３、ＡＴＣＣ
５５０７０）を開示する事にある。本発明の更に他の目
的は以下の記載から明らかとなる。
【０００３】本発明の第一の局面は、以下の構造を有す
る化合物の製造方法にある：
る化合物の製造方法にある：
【化１】 ここで、Ｒはエチル（ａ化合物）又はメチル（ｂ化合
物）である。化合物は１３−β−２２，２３−ジヒドロ
アベルメクチンＢ１ａ／Ｂ１ｂアグリコンと呼ぶ。化合
物は１３−ヒドロキシ基をもたない類似化合物である１
３−デオキシ−２２，２３−ジヒドロアベルメクチンＢ
１ａ／Ｂ１ｂアグリコンから微生物学的形質転換反応に
より製造される。加えて、生成物はアベルメクチン天然
生成物と比較して１３位での逆立体化学によりエピマー
化される。本製法は従って１３位での微生物学的酸化及
びエピマー化であることがいえる。
物）である。化合物は１３−β−２２，２３−ジヒドロ
アベルメクチンＢ１ａ／Ｂ１ｂアグリコンと呼ぶ。化合
物は１３−ヒドロキシ基をもたない類似化合物である１
３−デオキシ−２２，２３−ジヒドロアベルメクチンＢ
１ａ／Ｂ１ｂアグリコンから微生物学的形質転換反応に
より製造される。加えて、生成物はアベルメクチン天然
生成物と比較して１３位での逆立体化学によりエピマー
化される。本製法は従って１３位での微生物学的酸化及
びエピマー化であることがいえる。
【０００４】微生物学的生物変換反応は、３つの微生物
のうちのいずれかひとつを用いて行われる。これらの微
生物のうち２つは新規であり、これらの微生物は、本発
明の第二の局面を形成する。第三の微生物は既知であ
り、アメリカン タイプ カルチャー コレクション
（ＡＴＣＣ）から公的に入手可能である。
のうちのいずれかひとつを用いて行われる。これらの微
生物のうち２つは新規であり、これらの微生物は、本発
明の第二の局面を形成する。第三の微生物は既知であ
り、アメリカン タイプ カルチャー コレクション
（ＡＴＣＣ）から公的に入手可能である。
【０００５】本発明によれば、微生物ストレプトマイセ
スグリセウス株を制御した条件下で増殖させ、１３−デ
オキシ−２２，２３−ジヒドロアベルメクチンＢ１ａ／
Ｂ１ｂアグリコン化合物である基質を醗酵ブロスに包含
させる事により上記化合物を製造する新規製法を開示す
るものである。これらの微生物は、メルクカルチャー
コレクション（Merck Culture Collection) においてＭ
Ａ−６７６２及びＭＡ−６７６３として確認でき、これ
らは公にＡＴＣＣから入手可能である。ＡＴＣＣにおけ
る受託番号は、それぞれＡＴＣＣ５５０６９及び５５０
７０であり、ＡＴＣＣの住所は、アメリカ合衆国、２０
８５２メリーランド州、ロックビル、パークラーンドラ
イブ、１２３０１（１２３０１ Parklawn Drive,Rockvi
lle,ＭＤ２０８５２）である。
スグリセウス株を制御した条件下で増殖させ、１３−デ
オキシ−２２，２３−ジヒドロアベルメクチンＢ１ａ／
Ｂ１ｂアグリコン化合物である基質を醗酵ブロスに包含
させる事により上記化合物を製造する新規製法を開示す
るものである。これらの微生物は、メルクカルチャー
コレクション（Merck Culture Collection) においてＭ
Ａ−６７６２及びＭＡ−６７６３として確認でき、これ
らは公にＡＴＣＣから入手可能である。ＡＴＣＣにおけ
る受託番号は、それぞれＡＴＣＣ５５０６９及び５５０
７０であり、ＡＴＣＣの住所は、アメリカ合衆国、２０
８５２メリーランド州、ロックビル、パークラーンドラ
イブ、１２３０１（１２３０１ Parklawn Drive,Rockvi
lle,ＭＤ２０８５２）である。
【０００６】ＭＡ−６７６２、ＡＴＣＣ５５０６９及び
ＭＡ−６７６３、ＡＴＣＣ５５０７０の形態特性及び培
養特性については以下のごときである。以下は、ＭＡ−
６７６２及びＭＡ−６７６３株の一般的記載である。増
殖、一般的培養特性及び炭素源利用度についての観察
は、シャーリング及びゴットレイブ（インターナット．
ジェイ．システム．バクテリオル．（Shirling and Got
tleid （Internat.J.System.Bacteriol.））１６：第３
１３−３４０頁）の方法に従って行った。細胞の化学的
組成については、レチェバリア及びレチェバリア（アク
チノマイセイト タクソノミー、エー．ディーツ及びデ
ィー．ダブリュー．セイヤー，イーゲィ．ソサイティ
フォー インダストリアル マイクロバイオロジー（Le
chevalier and Lechevalier(Actinomycete Taxonomy,
A. Dietz andD.W. Thayer, Ed. Society for Industria
l Microbiology, ）１９８０）の方法を用いて決定し
た。培養物の着色については以下のチャートにおける色
見本との比較により決定した。（インター−ソサィティ
カラー カウンセル−ナショナル ブレゥオブ スタ
ンダーズ セントロイド カラー チャーツ（ユー．エ
ス．デプト．オブ コマース ナショナル ブレウ オ
ブ スタンダーズ サプリメント トウ エヌビーエス
サーキュラー）（Inter-Society Color Council-Nati
onal Bureau of Standards Centroid Color Charts（U.
S.Dept. of Commerce National Bureau of Standards S
upplement toNBS Circular ５５３、１９８５））。
ＭＡ−６７６３、ＡＴＣＣ５５０７０の形態特性及び培
養特性については以下のごときである。以下は、ＭＡ−
６７６２及びＭＡ−６７６３株の一般的記載である。増
殖、一般的培養特性及び炭素源利用度についての観察
は、シャーリング及びゴットレイブ（インターナット．
ジェイ．システム．バクテリオル．（Shirling and Got
tleid （Internat.J.System.Bacteriol.））１６：第３
１３−３４０頁）の方法に従って行った。細胞の化学的
組成については、レチェバリア及びレチェバリア（アク
チノマイセイト タクソノミー、エー．ディーツ及びデ
ィー．ダブリュー．セイヤー，イーゲィ．ソサイティ
フォー インダストリアル マイクロバイオロジー（Le
chevalier and Lechevalier(Actinomycete Taxonomy,
A. Dietz andD.W. Thayer, Ed. Society for Industria
l Microbiology, ）１９８０）の方法を用いて決定し
た。培養物の着色については以下のチャートにおける色
見本との比較により決定した。（インター−ソサィティ
カラー カウンセル−ナショナル ブレゥオブ スタ
ンダーズ セントロイド カラー チャーツ（ユー．エ
ス．デプト．オブ コマース ナショナル ブレウ オ
ブ スタンダーズ サプリメント トウ エヌビーエス
サーキュラー）（Inter-Society Color Council-Nati
onal Bureau of Standards Centroid Color Charts（U.
S.Dept. of Commerce National Bureau of Standards S
upplement toNBS Circular ５５３、１９８５））。
【０００７】寄託 特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペ
スト条約に基づき１９９０年７月１１日においてＭＡ−
６７６２は、ＡＴＣＣ５５０６９として寄託され、ＭＡ
−６７６３はＡＴＣＣ５５０７０として寄託された。
スト条約に基づき１９９０年７月１１日においてＭＡ−
６７６２は、ＡＴＣＣ５５０６９として寄託され、ＭＡ
−６７６３はＡＴＣＣ５５０７０として寄託された。
【０００８】細胞壁組成物の分析 ＭＡ−６７６２ ペプチドグリカンはＬ−ジアミノピメリン酸を含み、完
全な細胞糖分析により、グルコース及び微量のキシロー
スを示す。ＭＡ−６７６３ ペプチドグリカンはＬ−ジアミノピメリン酸を含み、完
全な細胞糖分析により、グルコースを示す。
全な細胞糖分析により、グルコース及び微量のキシロー
スを示す。ＭＡ−６７６３ ペプチドグリカンはＬ−ジアミノピメリン酸を含み、完
全な細胞糖分析により、グルコースを示す。
【０００９】一般的増殖特性 ＭＡ−６７６２及びＭＡ−６７６３ いずれの株も、酵母麦芽エキス、グリセロールアスパラ
ギン、無機塩−でんぷん、オートミール、及びトリプチ
カーゼ ソイ（Trypticase Soy) 寒天上において充分に
増殖する。増殖は２７℃及び３７℃で生ずる。いずれの
培養物も酵母デキストロースブロスのごとき、液体培地
中においても充分に増殖する。
ギン、無機塩−でんぷん、オートミール、及びトリプチ
カーゼ ソイ（Trypticase Soy) 寒天上において充分に
増殖する。増殖は２７℃及び３７℃で生ずる。いずれの
培養物も酵母デキストロースブロスのごとき、液体培地
中においても充分に増殖する。
【００１０】コロニーの形態（酵母麦芽エキス寒天Ｃ２
１ｄ上において） ＭＡ−６７６２ 基質菌糸体は、中程度のオリーブブラウン色（９５ｍ．
OlBr) 及びコロニーは不透明であり、起毛状であり繊維
状であって、ゴムのごとき柔軟なものである。コロニー
表面は外見上つやがなく、ざらざらした形である。気中
菌糸は培養後４日後に出現し黄白色を有する（９２yWhi
te) 。胞子集団はそれが存在する場合、深い黄茶色であ
る（７５deep yBr) 。ＭＡ−６７６３ 基質菌糸体は、中程度の茶色がかった黒色（６５brBlac
k)であり、コロニーは不透明であり、起毛状であり繊維
状であり、ゴム状である。コロニー表面は、ざらざらし
た形である。気中菌糸体は培養後４日後に出現し黄白色
である（９２yWhite) 。胞子集団は存在する場合、黄白
色である（９２yWhite) 。
１ｄ上において） ＭＡ−６７６２ 基質菌糸体は、中程度のオリーブブラウン色（９５ｍ．
OlBr) 及びコロニーは不透明であり、起毛状であり繊維
状であって、ゴムのごとき柔軟なものである。コロニー
表面は外見上つやがなく、ざらざらした形である。気中
菌糸は培養後４日後に出現し黄白色を有する（９２yWhi
te) 。胞子集団はそれが存在する場合、深い黄茶色であ
る（７５deep yBr) 。ＭＡ−６７６３ 基質菌糸体は、中程度の茶色がかった黒色（６５brBlac
k)であり、コロニーは不透明であり、起毛状であり繊維
状であり、ゴム状である。コロニー表面は、ざらざらし
た形である。気中菌糸体は培養後４日後に出現し黄白色
である（９２yWhite) 。胞子集団は存在する場合、黄白
色である（９２yWhite) 。
【００１１】微小形態 ＭＡ−６７６２ 気中菌糸（０．７６μｍ dia.)は基質菌糸から発生し、
枝分れし屈曲している。分化培地においては、気中菌糸
は直鎖にて生ずる胞子の鎖にて終結する。ＭＡ−６７６３ 気中菌糸（０．７６μｍ dia.)は基質菌糸から放射状に
発生し、直線状である。分化培地においては気中菌糸は
屈曲鎖で生ずる胞子の鎖にて終結する。
枝分れし屈曲している。分化培地においては、気中菌糸
は直鎖にて生ずる胞子の鎖にて終結する。ＭＡ−６７６３ 気中菌糸（０．７６μｍ dia.)は基質菌糸から放射状に
発生し、直線状である。分化培地においては気中菌糸は
屈曲鎖で生ずる胞子の鎖にて終結する。
【００１２】種々の生理学的反応 ＭＡ−６７６２ トリプトン酵母エキスブロスにおける培養においては、
その中にメラニン色素を生ぜず、デンプンは加水分解さ
れ、Ｈ2 Ｓはペプトン−鉄寒天上に生成する。拡散性黄
色色素は１％セルビオース又はＤ−マンノースを補足し
たプリドハム−ゴットリーブ（Pridham-Gottlieb) 基礎
培地上に生じ、赤茶色拡散性色素は１％Ｄ−フルクトー
ス、α−Ｄ−グルコース、β−Ｄ−ラクトース、Ｄ−マ
ルトース、Ｄ−マンニトール、Ｌ−ラムノースを補足し
たプリドハム−ゴットリーブ基礎培地上に生じる。炭素
源利用パターンは以下のごときである。セロビオース、
Ｄ−フルクトース、α−Ｄ−ラクトース、β−Ｄ−ラク
トース、Ｄ−マルトース、Ｄ−マンニトール、Ｄ−マン
ノース、Ｌ−ラムノース、Ｄ−キシロースを適量利用す
る。イノシトール、スクロースを微量利用するＤ−アラ
ビノース、Ｌ−アラビノース、Ｄ−ラフィノース、Ｌ−
キシロースを利用しない。ＭＡ−６７６３ トリプトン酵母エキスブロス、酵母エキス寒天及びペプ
トン酵母エキス鉄寒天（２−７ｄ）における培養におい
ては、メラニン色素を生ずる。デンプンはわずかに加水
分解されＨ2 Ｓはペプトン−鉄寒天上に生成する。拡散
性紫色素は、１％セロビオース、Ｄ−フルクトース、α
−Ｄ−グルコース、β−Ｄ−ラクトース、Ｄ−マルトー
ス、Ｄ−マンニトール、Ｄ−マンノース、Ｌ−ラムノー
スを補足したプリドハム−ゴットリーブ基礎培地におい
て生ずる。炭素源利用パターンは以下のごときである。
セロビオース、Ｄ−フルクトース、α−Ｄ−ラクトー
ス、β−Ｄ−ラクトース、Ｄ−マルトース、Ｄ−マンニ
トール、Ｄ−マンノース、Ｌ−ラムノース、Ｄ−キシロ
ースは適量の利用。Ｄ−アラビノース、Ｌ−アラビノー
ス、イノシトール、Ｄ−ラフィノース、スクロース、Ｌ
−キシロースは利用せず。ＭＡ−６７６２及びＭＡ−６
７６３についての炭水化物利用パターンは表１に要約
し、ＭＡ−６７６２及びＭＡ−６７６３の培養特性は表
２に要約する。
その中にメラニン色素を生ぜず、デンプンは加水分解さ
れ、Ｈ2 Ｓはペプトン−鉄寒天上に生成する。拡散性黄
色色素は１％セルビオース又はＤ−マンノースを補足し
たプリドハム−ゴットリーブ（Pridham-Gottlieb) 基礎
培地上に生じ、赤茶色拡散性色素は１％Ｄ−フルクトー
ス、α−Ｄ−グルコース、β−Ｄ−ラクトース、Ｄ−マ
ルトース、Ｄ−マンニトール、Ｌ−ラムノースを補足し
たプリドハム−ゴットリーブ基礎培地上に生じる。炭素
源利用パターンは以下のごときである。セロビオース、
Ｄ−フルクトース、α−Ｄ−ラクトース、β−Ｄ−ラク
トース、Ｄ−マルトース、Ｄ−マンニトール、Ｄ−マン
ノース、Ｌ−ラムノース、Ｄ−キシロースを適量利用す
る。イノシトール、スクロースを微量利用するＤ−アラ
ビノース、Ｌ−アラビノース、Ｄ−ラフィノース、Ｌ−
キシロースを利用しない。ＭＡ−６７６３ トリプトン酵母エキスブロス、酵母エキス寒天及びペプ
トン酵母エキス鉄寒天（２−７ｄ）における培養におい
ては、メラニン色素を生ずる。デンプンはわずかに加水
分解されＨ2 Ｓはペプトン−鉄寒天上に生成する。拡散
性紫色素は、１％セロビオース、Ｄ−フルクトース、α
−Ｄ−グルコース、β−Ｄ−ラクトース、Ｄ−マルトー
ス、Ｄ−マンニトール、Ｄ−マンノース、Ｌ−ラムノー
スを補足したプリドハム−ゴットリーブ基礎培地におい
て生ずる。炭素源利用パターンは以下のごときである。
セロビオース、Ｄ−フルクトース、α−Ｄ−ラクトー
ス、β−Ｄ−ラクトース、Ｄ−マルトース、Ｄ−マンニ
トール、Ｄ−マンノース、Ｌ−ラムノース、Ｄ−キシロ
ースは適量の利用。Ｄ−アラビノース、Ｌ−アラビノー
ス、イノシトール、Ｄ−ラフィノース、スクロース、Ｌ
−キシロースは利用せず。ＭＡ−６７６２及びＭＡ−６
７６３についての炭水化物利用パターンは表１に要約
し、ＭＡ−６７６２及びＭＡ−６７６３の培養特性は表
２に要約する。
【００１３】識別 これらの株の化学分類及び形態学的特性については、ス
トレプトマイセス属の公表されているメンバーと比較す
る。これらの株は互いに非常高い相同性を有し、ペプト
ン−鉄寒天上におけるメラニンの生成及び酵母麦芽エキ
ス、グルコースアスパラギン及び無機塩−デンプン寒天
上における拡散性紫色素の生成に関して主に異なる。ス
トレプトマイセス種に関する合法的に公表された記載に
よれば、これらの株の間には、非常高い相同性が認めら
れ、これらは共通して、ストレプトマイセスグリセウス
複合体として位置づけられる。従って、ＭＡ−６７６
２、及びＭＡ−６７６３は、いずれもストレプトマイセ
スグリセウスの株として仮に認識される。
トレプトマイセス属の公表されているメンバーと比較す
る。これらの株は互いに非常高い相同性を有し、ペプト
ン−鉄寒天上におけるメラニンの生成及び酵母麦芽エキ
ス、グルコースアスパラギン及び無機塩−デンプン寒天
上における拡散性紫色素の生成に関して主に異なる。ス
トレプトマイセス種に関する合法的に公表された記載に
よれば、これらの株の間には、非常高い相同性が認めら
れ、これらは共通して、ストレプトマイセスグリセウス
複合体として位置づけられる。従って、ＭＡ−６７６
２、及びＭＡ−６７６３は、いずれもストレプトマイセ
スグリセウスの株として仮に認識される。
【００１４】 表 １ ２１日目でのＭＡ−６７６２及び−ＭＡ−６７６３株の炭水化物利用パターン 炭素源 ＭＡ−６７６２による利用 ＭＡ−６７６３による利用 Ｄ−アラビノース ０ ０ Ｌ−アラビノース ０ ０ セロビオース ２ ２ Ｄ−フルクトース ２ ２ イノシトール １ ０ α−Ｄ−ラクトース ２ ２ β−Ｄ−ラクトース ２ ２ Ｄ−マルトース ２ ２ Ｄ−マンニトール ２ ２ Ｄ−マンノース ２ ２ Ｄ−ラフィノース ０ ０ Ｌ−ラムノース ２ ２ スクロース １ ０ Ｄ−キシロース ２ ２ Ｌ−キシロース ０ ０ ａ−Ｄ−グルコース（コントロール）２ ２ ３＝良好利用、２＝適度な利用、１＝わずかな利用、０＝利用せず。
【００１５】 表 ２ ２１日目のＭＡ−６７６２及びＭＡ−６７６３の培養特性 培地 生長度 気中菌糸 可溶性色素 基質菌糸 MA-6762 MA-6763 MA-6762 MA-6763 MA-6762 MA-6763 MA-6762 MA-6763 酵母 良 良 黄白色 黄白色 否 紫色 深茶黄色 黒茶色 エキス (92,yWhite)(92,yWhite) (75深yBr) (65Br.Bl) 麦芽 担胞子体 担胞子体 縁は暗茶黄色 エキス 屈曲、群生 屈曲、群生 (78d.yBr) グルコ 良 良 黄白色 黄白色 否 紫色 淡オレン 暗灰紫色 ース (92,yWhite)(92,yWhite) ジ黄色 (47d.gy. アスパ 担胞子体 担胞子体 (73p.OY) rBr) ラギン 屈曲、群生 屈曲、群生 無機塩 良 良 黄白色 黄白色 否 紫色 灰黄色 暗オリー デンプ (92,yWhite)(92,yWhite) (90g.Y) ブ茶色 ン コロニーの縁 担胞子体 (96d.OlBr) は灰- 緑黄色 屈曲、群生 (105gy.gY) 担胞子体 屈曲、群生 オート 良 良 黄白色 黄白色 否 否 灰黄色 灰黄色 ミール (92,yWhite) (92,yWhite) (90g.Y) (90g.Y) 担胞子体 担胞子体 屈曲、群生 屈曲、群生 シグマ まば まば 黄白色 非気中菌糸 否 否 黄白色 黄白色 水 ら ら (92,yWhite) (92yWhite)(92yWhite) 担胞子体 屈曲、群生 クザペ 中良 中良 黄白色 白色 否 否 黄白色 黄白色 ック (92,yWhite) (263White) (92yWhite)(92yWhite) (Czapek) 担胞子体 担胞子体 屈曲、群生 屈曲、群生 ヘプト 良 良 メラニ メラニ ン鉄 ン、陰 ン、陽 性 性 H2S 、 H2S 、 陽性 陽性
【００１６】加えて新規製法は、ストレプトマイセスラ
ベンジュレとして同定された既知の微生物株を制御した
条件下で増殖させ、上記基質を醗酵ブロス中に包含させ
ることにより行われる。この微生物は、ＭＡ−６５５５
としてメルクカルチャーコレクションにおいて確認で
き、ＡＴＣＣ（アメリカ合衆国、２０８５２メリーラン
ド州、ロックビル、パークラーンドライブ、１２３０
１、受託番号ＡＴＣＣ１４１５９）から公に入手可能で
ある。培養物ストレプトマイセスラベンジュレＭＡ−６
５５５、ＡＴＣＣ１４１５９については、ジャーナル
オブザ アメリカン ケミカル ソサィティー（Journa
l of the American Chemical Society) 第７５巻、第５
７６４頁（１９５３年）に記載されている。
ベンジュレとして同定された既知の微生物株を制御した
条件下で増殖させ、上記基質を醗酵ブロス中に包含させ
ることにより行われる。この微生物は、ＭＡ−６５５５
としてメルクカルチャーコレクションにおいて確認で
き、ＡＴＣＣ（アメリカ合衆国、２０８５２メリーラン
ド州、ロックビル、パークラーンドライブ、１２３０
１、受託番号ＡＴＣＣ１４１５９）から公に入手可能で
ある。培養物ストレプトマイセスラベンジュレＭＡ−６
５５５、ＡＴＣＣ１４１５９については、ジャーナル
オブザ アメリカン ケミカル ソサィティー（Journa
l of the American Chemical Society) 第７５巻、第５
７６４頁（１９５３年）に記載されている。
【００１７】ストレプトマイセスラベンジュレＡＴＣＣ
１４１５９の公に入手可能な寄託に関しては、特許の全
存続期間について入手可能であることを保証する旨が、
補足されている。
１４１５９の公に入手可能な寄託に関しては、特許の全
存続期間について入手可能であることを保証する旨が、
補足されている。
【００１８】本化合物は、以下に記載される条件下で、
適切な水性栄養培地の好気的醗酵の際に、ＭＡ−６７６
２、ＡＴＣＣ５５０６９又はＭＡ−６７６３、ＡＴＣＣ
５５０７０の生成株と共に、又、ストレプトマイセスラ
ベンジュレＭＡ−６５５５、ＡＴＣＣ１４１５９と共に
生成される。多くの抗生物質の生成の為に使用される水
性培地は、酸化されたエピマー化大環状化合物の製法に
おいて使用することが適している。
適切な水性栄養培地の好気的醗酵の際に、ＭＡ−６７６
２、ＡＴＣＣ５５０６９又はＭＡ−６７６３、ＡＴＣＣ
５５０７０の生成株と共に、又、ストレプトマイセスラ
ベンジュレＭＡ−６５５５、ＡＴＣＣ１４１５９と共に
生成される。多くの抗生物質の生成の為に使用される水
性培地は、酸化されたエピマー化大環状化合物の製法に
おいて使用することが適している。
【００１９】このような栄養培地は、微生物により同化
される炭素及び窒素源を含み、一般的に低レベルの無機
塩を含む。加えて醗酵培地は、微生物の増殖の為に必要
な微量の金属を含み、所望の化合物の生成物を含む。こ
れらは栄養源として使用でき、又もちろん必要な場合に
培地へ分離して加えることができ、炭素及び窒素源の複
合体の充分な濃度で通常存在する。
される炭素及び窒素源を含み、一般的に低レベルの無機
塩を含む。加えて醗酵培地は、微生物の増殖の為に必要
な微量の金属を含み、所望の化合物の生成物を含む。こ
れらは栄養源として使用でき、又もちろん必要な場合に
培地へ分離して加えることができ、炭素及び窒素源の複
合体の充分な濃度で通常存在する。
【００２０】一般的に、デキストロース、スクロース、
マルトース、ラクトース、デキストラン、セレロース
（cerelose) 、コーンミール、オート麦粉のごとき糖の
ような炭水化物及びデンプンは栄養培地における同化可
能な炭素源に適している。培地において利用される炭素
源の適切な量は、ひとつには培地中の他の成分に依存す
るが、通常培地中において炭水化物１及び１０ｇ／リッ
トルの間が適量であることがわかる。これらの炭素源は
独立に使用することもできるが、種々のそのような炭素
源を同一の培地中に合せることもできる。
マルトース、ラクトース、デキストラン、セレロース
（cerelose) 、コーンミール、オート麦粉のごとき糖の
ような炭水化物及びデンプンは栄養培地における同化可
能な炭素源に適している。培地において利用される炭素
源の適切な量は、ひとつには培地中の他の成分に依存す
るが、通常培地中において炭水化物１及び１０ｇ／リッ
トルの間が適量であることがわかる。これらの炭素源は
独立に使用することもできるが、種々のそのような炭素
源を同一の培地中に合せることもできる。
【００２１】酵母水解物、酵母自己分解物質、酵母細
胞、トマトペースト、コーンミール、オート麦粉、大豆
ミール、カゼイン水解物、酵母エキス、コーン浸漬リキ
ュール、ディスティラーズ ソリューブルズ（distille
rs solubles)、綿実ミール、肉エキス等の種々の炭素源
は、本化合物の生成の際にＭＡ−６７６２、ＡＴＣＣ５
５０６９、ＭＡ−６７６５、ＡＴＣＣ５５０７０又はス
トレプトマイセスラベンジュレＭＡ−６５５５、ＡＴＣ
Ｃ１４１５９により容易に同化される。種々の窒素源は
単独で又は組み合わせて、培地中１〜５ｇ／リットルの
範囲の量で使用することができる。
胞、トマトペースト、コーンミール、オート麦粉、大豆
ミール、カゼイン水解物、酵母エキス、コーン浸漬リキ
ュール、ディスティラーズ ソリューブルズ（distille
rs solubles)、綿実ミール、肉エキス等の種々の炭素源
は、本化合物の生成の際にＭＡ−６７６２、ＡＴＣＣ５
５０６９、ＭＡ−６７６５、ＡＴＣＣ５５０７０又はス
トレプトマイセスラベンジュレＭＡ−６５５５、ＡＴＣ
Ｃ１４１５９により容易に同化される。種々の窒素源は
単独で又は組み合わせて、培地中１〜５ｇ／リットルの
範囲の量で使用することができる。
【００２２】培養培地に包含させることができる栄養無
機塩は、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、アンモ
ニウム、カルシウム、リン酸塩、硫酸塩、塩化物、炭酸
塩などのイオンを生ぜしめることができる通常の塩であ
る。又、包含させることができる物としては、コバル
ト、マンガン等の微量金属もあげられる。
機塩は、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、アンモ
ニウム、カルシウム、リン酸塩、硫酸塩、塩化物、炭酸
塩などのイオンを生ぜしめることができる通常の塩であ
る。又、包含させることができる物としては、コバル
ト、マンガン等の微量金属もあげられる。
【００２３】以下の記載及び実施例中の記載における培
地は、使用できる広い範囲の培地の例示にすぎず、限定
されるものではない。
地は、使用できる広い範囲の培地の例示にすぎず、限定
されるものではない。
【００２４】以下は、ＭＡ−６７６２、ＡＴＣＣ５５０
６９、ＭＡ−６７６３、ＡＴＣＣ５５０７０又はストレ
プトマイセスラベンジュレ、ＭＡ−６５５５、ＡＴＣＣ
１４１５９の株の増殖に適した培地の例である。 培地の組成 培地１ デキストロース ２０ｇ． ペプトン ５ｇ． 肉エキス ５ｇ． 一次酵母 ３ｇ． ＮａＣｌ ５ｇ． ＣａＣＯ3 （ｐＨ調整後） ３ｇ． 蒸留水 １０００ml． ｐＨ７．０ 培地２ トマトペースト ２０ｇ． 改質デンプン（ＣＰＣ） ２０ｇ． 一次酵母 １０ｇ． ＣｏＣｌ2 ６Ｈ2 Ｏ ０．００５ｇ． 蒸留水 １０００ml． ｐＨ７．２−７．４ 培地３（斜面培地） デキストロース １０．０ｇ． バクトアスパラギン ０．５ｇ． Ｋ2 ＨＰＯ4 ０．５ｇ． バクト寒天 １５．０ｇ． 蒸留水 １０００ml． ｐＨ７．０ 培地４（シード培地） 可溶性デンプン １０．０ｇ． アルダミン（Ardamine) ｐＨ ５．０ｇ． ＮＺアミンＥ ５．０ｇ． ビーフエキス ３．０ｇ． ＭｇＳＯ4 ７Ｈ2 Ｏ ０．５ｇ． セレロース １．０ｇ． Ｎａ2 ＨＰＯ4 ０．１９０ｇ． ＫＨ2 ＰＯ4 ０．１８２ｇ． ＣａＣＯ3 ０．５ｇ． 蒸留水 １０００ml． ｐＨ７．０−７．２ 培地５ トマトペースト ４０．０ｇ． オート麦粉 １０．０ｇ． セレロース １０．０ｇ． コーン浸漬リキュール ５．０ｇ． 微量元素混合物 １０．０ml． 蒸留水 １０００ml． ｐＨ６．８ １０００ml． 微量元素混合物 １０００ml． ＦｅＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ １０００mg． ＭｎＳＯ4 ・４Ｈ2 Ｏ １０００mg． ＣｕＣｌ2 ・２Ｈ2 Ｏ ２５．０ｇ． ＣａＣｌ2 １００．０mg． Ｈ2 ＢＯ3 ５６．０mg． （ＮＨ4 ）2 ＭｏＯ4 ・４Ｈ2 Ｏ １０．０mg． ＺｎＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ ２００．０mg． 蒸留水 １０００ml． ｐＨ 培地６ ＣＰＣ工業用改質デンプン ４０．０ｇ． （ＣＰＣ社から入手） ディスティラーズソルューブルズ ７．０ｇ． 自己分解酵母 ５．０ｇ． （イーストプロダクツ社から入手可能なアルダミンｐＨ．） ＣｏＣｌ2 ・６Ｈ2 Ｏ ５０．０mg． 蒸留水 １０００ml． ｐＨ７．３
６９、ＭＡ−６７６３、ＡＴＣＣ５５０７０又はストレ
プトマイセスラベンジュレ、ＭＡ−６５５５、ＡＴＣＣ
１４１５９の株の増殖に適した培地の例である。 培地の組成 培地１ デキストロース ２０ｇ． ペプトン ５ｇ． 肉エキス ５ｇ． 一次酵母 ３ｇ． ＮａＣｌ ５ｇ． ＣａＣＯ3 （ｐＨ調整後） ３ｇ． 蒸留水 １０００ml． ｐＨ７．０ 培地２ トマトペースト ２０ｇ． 改質デンプン（ＣＰＣ） ２０ｇ． 一次酵母 １０ｇ． ＣｏＣｌ2 ６Ｈ2 Ｏ ０．００５ｇ． 蒸留水 １０００ml． ｐＨ７．２−７．４ 培地３（斜面培地） デキストロース １０．０ｇ． バクトアスパラギン ０．５ｇ． Ｋ2 ＨＰＯ4 ０．５ｇ． バクト寒天 １５．０ｇ． 蒸留水 １０００ml． ｐＨ７．０ 培地４（シード培地） 可溶性デンプン １０．０ｇ． アルダミン（Ardamine) ｐＨ ５．０ｇ． ＮＺアミンＥ ５．０ｇ． ビーフエキス ３．０ｇ． ＭｇＳＯ4 ７Ｈ2 Ｏ ０．５ｇ． セレロース １．０ｇ． Ｎａ2 ＨＰＯ4 ０．１９０ｇ． ＫＨ2 ＰＯ4 ０．１８２ｇ． ＣａＣＯ3 ０．５ｇ． 蒸留水 １０００ml． ｐＨ７．０−７．２ 培地５ トマトペースト ４０．０ｇ． オート麦粉 １０．０ｇ． セレロース １０．０ｇ． コーン浸漬リキュール ５．０ｇ． 微量元素混合物 １０．０ml． 蒸留水 １０００ml． ｐＨ６．８ １０００ml． 微量元素混合物 １０００ml． ＦｅＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ １０００mg． ＭｎＳＯ4 ・４Ｈ2 Ｏ １０００mg． ＣｕＣｌ2 ・２Ｈ2 Ｏ ２５．０ｇ． ＣａＣｌ2 １００．０mg． Ｈ2 ＢＯ3 ５６．０mg． （ＮＨ4 ）2 ＭｏＯ4 ・４Ｈ2 Ｏ １０．０mg． ＺｎＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ ２００．０mg． 蒸留水 １０００ml． ｐＨ 培地６ ＣＰＣ工業用改質デンプン ４０．０ｇ． （ＣＰＣ社から入手） ディスティラーズソルューブルズ ７．０ｇ． 自己分解酵母 ５．０ｇ． （イーストプロダクツ社から入手可能なアルダミンｐＨ．） ＣｏＣｌ2 ・６Ｈ2 Ｏ ５０．０mg． 蒸留水 １０００ml． ｐＨ７．３
【００２５】ストレプトマイセスグリセウスＭＡ−６７
６２、ＡＴＣＣ５５０６９、ＭＡ−６７６３、ＡＴＣＣ
５５０７０又はストレプトマイセスラベンジュレＭＡ−
６５５５、ＡＴＣＣ１４１５９を用いる醗酵は、約２０
℃から約４０℃の温度範囲で行うことができる。最良の
結果を得る為には約２４℃から約３０℃の範囲の温度
で、これらの醗酵を行うことが最も都合がよい。約２７
℃〜２８℃の温度が最も好ましい。本化合物を生成する
為に適した栄養培地のｐＨは約５．０から８．５の範囲
で、変化させることができ、約６．０から７．５の範囲
が、好ましい。
６２、ＡＴＣＣ５５０６９、ＭＡ−６７６３、ＡＴＣＣ
５５０７０又はストレプトマイセスラベンジュレＭＡ−
６５５５、ＡＴＣＣ１４１５９を用いる醗酵は、約２０
℃から約４０℃の温度範囲で行うことができる。最良の
結果を得る為には約２４℃から約３０℃の範囲の温度
で、これらの醗酵を行うことが最も都合がよい。約２７
℃〜２８℃の温度が最も好ましい。本化合物を生成する
為に適した栄養培地のｐＨは約５．０から８．５の範囲
で、変化させることができ、約６．０から７．５の範囲
が、好ましい。
【００２６】基質化合物を醗酵培地１ml当り０．０１〜
１．０mgの量でストレプトマイセスグリセウスＭＡ−６
７６２、ＡＴＣＣ５５０６９、ＭＡ−６７６３、ＡＴＣ
Ｃ５５０７０又はストレプトマイセスラベンジュレＭＡ
−６５５５、ＡＴＣＣ１４１５９の醗酵物へ加える。ml
当り０．０５〜０．５mgを用いることが好ましい。基質
化合物は醗酵サイクルのいずれの時においても加えう
る。化合物は培養物が加えられ、醗酵が開始する前に、
培地成分へ加えられるか、又はそれらは醗酵の進行過程
において加えられうる。充分な時間培養を行うことによ
り、生物的形質転換がなされる為には、サイクルの５０
％が完了する前、好ましくはサイクルの２５％が完了す
る前に基質化合物を醗酵物へ加えることが望ましい。
１．０mgの量でストレプトマイセスグリセウスＭＡ−６
７６２、ＡＴＣＣ５５０６９、ＭＡ−６７６３、ＡＴＣ
Ｃ５５０７０又はストレプトマイセスラベンジュレＭＡ
−６５５５、ＡＴＣＣ１４１５９の醗酵物へ加える。ml
当り０．０５〜０．５mgを用いることが好ましい。基質
化合物は醗酵サイクルのいずれの時においても加えう
る。化合物は培養物が加えられ、醗酵が開始する前に、
培地成分へ加えられるか、又はそれらは醗酵の進行過程
において加えられうる。充分な時間培養を行うことによ
り、生物的形質転換がなされる為には、サイクルの５０
％が完了する前、好ましくはサイクルの２５％が完了す
る前に基質化合物を醗酵物へ加えることが望ましい。
【００２７】少量での醗酵は、以下の手段により都合よ
く行なわれる。まず既知の無菌技術を用いてフラスコに
適量の栄養培地を加えストレプトマイセスグリセウスＭ
Ａ−６７６２、ＡＴＣＣ５５０６９、ＭＡ−６７６３、
ＡＴＣＣ５５０７０又はストレプトマイセスラベンジュ
レＭＡ−６５５５、ＡＴＣＣ１４１５９の増殖的細胞生
長物又は胞子をフラスコに接種し、次いで綿でフラスコ
をゆるく栓をし醗酵を約２〜１０日間、９５〜３００ｒ
ｐｍで回転シェーカー上で約２８℃の一定の室温におい
て進行させる。大量に行う場合は、攪拌機及び醗酵培地
に通気させる為の手段を有する適切なタンクにおいて醗
酵を行うことが好ましい。栄養培地をタンク中で構成
し、無菌処理の後ストレプトマイセスグリセウスＭＡ−
６７６２、ＡＴＣＣ５５０６９、ＭＡ−６７６３、ＡＴ
ＣＣ５５０７０又はストレプトマイセスラベンジュレＭ
Ａ−６５５５、ＡＴＣＣ１４１５９の増殖的細胞生長物
の源を植えつける。醗酵は約２４℃〜３７℃の範囲の温
度で、栄養培地を攪拌及び／又は通気しながら１〜８日
継続して行なわれる。通気の程度は、培養槽の大きさ、
通気速度などの種々のファクターに依存する。一般的に
大規模な醗酵の場合には、約９５〜３００ｒｐｍで攪拌
し、通気は１分当り約５０〜５００リッター（ＬＰＭ）
で行なわれる。
く行なわれる。まず既知の無菌技術を用いてフラスコに
適量の栄養培地を加えストレプトマイセスグリセウスＭ
Ａ−６７６２、ＡＴＣＣ５５０６９、ＭＡ−６７６３、
ＡＴＣＣ５５０７０又はストレプトマイセスラベンジュ
レＭＡ−６５５５、ＡＴＣＣ１４１５９の増殖的細胞生
長物又は胞子をフラスコに接種し、次いで綿でフラスコ
をゆるく栓をし醗酵を約２〜１０日間、９５〜３００ｒ
ｐｍで回転シェーカー上で約２８℃の一定の室温におい
て進行させる。大量に行う場合は、攪拌機及び醗酵培地
に通気させる為の手段を有する適切なタンクにおいて醗
酵を行うことが好ましい。栄養培地をタンク中で構成
し、無菌処理の後ストレプトマイセスグリセウスＭＡ−
６７６２、ＡＴＣＣ５５０６９、ＭＡ−６７６３、ＡＴ
ＣＣ５５０７０又はストレプトマイセスラベンジュレＭ
Ａ−６５５５、ＡＴＣＣ１４１５９の増殖的細胞生長物
の源を植えつける。醗酵は約２４℃〜３７℃の範囲の温
度で、栄養培地を攪拌及び／又は通気しながら１〜８日
継続して行なわれる。通気の程度は、培養槽の大きさ、
通気速度などの種々のファクターに依存する。一般的に
大規模な醗酵の場合には、約９５〜３００ｒｐｍで攪拌
し、通気は１分当り約５０〜５００リッター（ＬＰＭ）
で行なわれる。
【００２８】全醗酵ブロスからのエピマー化化合物の分
離及び該化合物の回収は、溶媒抽出及び種々のクロマト
グラフィー技術及び溶媒システムを用いるクロマトグラ
フィーによる分画化の適用により行なわれる。
離及び該化合物の回収は、溶媒抽出及び種々のクロマト
グラフィー技術及び溶媒システムを用いるクロマトグラ
フィーによる分画化の適用により行なわれる。
【００２９】本化合物は、水に対しては、わずかな溶解
性しか示さないが、有機溶媒においては可溶である。こ
の特性は、醗酵ブロスから化合物を回収する為に都合よ
く利用される。従って、一つの回収法においては、全醗
酵ブロスは、おおよそ等量の有機溶媒と混合される。い
ずれの有機溶媒も使用しうるが、酢酸エチル、塩化メチ
レン、クロロホルムなどの水に不溶の溶媒を用いること
が好ましい。一般的に数回の抽出は最大の回収率を達成
するために望ましい。溶媒は本化合物と共に本化合物の
抗寄生虫活性を失わせる他の物質をも取り除く。溶媒が
水と混和しない物である場合には、層を分離し有機溶媒
は減圧下で蒸発させられる。残渣を好ましくはシリカゲ
ルを含むクロマトグラフィーカラムに置く。カラムは所
望の生成物、及びいくらかの不純物を残すが、多くの不
純物、特に非極性不純物は通過する。カラムを塩化メチ
レン又はクロロホルムのごとき適度な極性を有する有機
溶媒で洗浄し、さらに不純物を除去し次いで塩化メチレ
ン、又はクロロホルムと、好ましくはアセトン、メタノ
ール及びエタノール等の有機溶媒との混合物で洗浄す
る。溶媒を蒸発させ、残渣を更に、クロマトグラフィー
媒介としてシリカゲル、酸化アルミニウム、イオン交換
樹脂、デキストランゲルなどを用い、溶離剤として種々
の溶媒及び溶媒の混合物を用いるカラムクロマトグラフ
ィー、薄層クロマトグラフィー、分析的薄層クロマトグ
ラフィー、高圧液体クロマトグラフィーなどを用いてク
ロマトグラフィー分離する。薄層、高圧、液体及び分析
的層クロマトグラフィーは、本化合物の存在を検出する
為及び単離する為に使用しうる。上記技術に加え、当業
者に既知の他の技術を用いることにより、本化合物を含
む精製された組成物をうることができる。所望の化合物
の存在は、物理化学的特性の生物学的活性について、そ
れぞれのクロマトグラフィー分画を解析することにより
決定される。本化合物の構造は、化合物の種々のスペク
トル特性、特に、核磁気共鳴、質量、紫外線、赤外線ス
ペクトルを分析することによって詳細に決定される。
性しか示さないが、有機溶媒においては可溶である。こ
の特性は、醗酵ブロスから化合物を回収する為に都合よ
く利用される。従って、一つの回収法においては、全醗
酵ブロスは、おおよそ等量の有機溶媒と混合される。い
ずれの有機溶媒も使用しうるが、酢酸エチル、塩化メチ
レン、クロロホルムなどの水に不溶の溶媒を用いること
が好ましい。一般的に数回の抽出は最大の回収率を達成
するために望ましい。溶媒は本化合物と共に本化合物の
抗寄生虫活性を失わせる他の物質をも取り除く。溶媒が
水と混和しない物である場合には、層を分離し有機溶媒
は減圧下で蒸発させられる。残渣を好ましくはシリカゲ
ルを含むクロマトグラフィーカラムに置く。カラムは所
望の生成物、及びいくらかの不純物を残すが、多くの不
純物、特に非極性不純物は通過する。カラムを塩化メチ
レン又はクロロホルムのごとき適度な極性を有する有機
溶媒で洗浄し、さらに不純物を除去し次いで塩化メチレ
ン、又はクロロホルムと、好ましくはアセトン、メタノ
ール及びエタノール等の有機溶媒との混合物で洗浄す
る。溶媒を蒸発させ、残渣を更に、クロマトグラフィー
媒介としてシリカゲル、酸化アルミニウム、イオン交換
樹脂、デキストランゲルなどを用い、溶離剤として種々
の溶媒及び溶媒の混合物を用いるカラムクロマトグラフ
ィー、薄層クロマトグラフィー、分析的薄層クロマトグ
ラフィー、高圧液体クロマトグラフィーなどを用いてク
ロマトグラフィー分離する。薄層、高圧、液体及び分析
的層クロマトグラフィーは、本化合物の存在を検出する
為及び単離する為に使用しうる。上記技術に加え、当業
者に既知の他の技術を用いることにより、本化合物を含
む精製された組成物をうることができる。所望の化合物
の存在は、物理化学的特性の生物学的活性について、そ
れぞれのクロマトグラフィー分画を解析することにより
決定される。本化合物の構造は、化合物の種々のスペク
トル特性、特に、核磁気共鳴、質量、紫外線、赤外線ス
ペクトルを分析することによって詳細に決定される。
【００３０】本発明の酸化及びエピマー化化合物は、ヒ
ト及び動物において及び農業において駆虫薬、殺虫薬、
及びダニ駆除薬として充分な駆虫活性を有する。加えて
１３−酸化されたエピマー化化合物は、１３−β−置換
−１３−デオキシアベルメクチン化合物を製造する為の
出発物質として使用できる。アベルメクチン化合物の１
３位での置換方法は当業者に既知である。
ト及び動物において及び農業において駆虫薬、殺虫薬、
及びダニ駆除薬として充分な駆虫活性を有する。加えて
１３−酸化されたエピマー化化合物は、１３−β−置換
−１３−デオキシアベルメクチン化合物を製造する為の
出発物質として使用できる。アベルメクチン化合物の１
３位での置換方法は当業者に既知である。
【００３１】以下の実施例は、本発明を更に説明する為
のものであって、発明を限定するものではない。
のものであって、発明を限定するものではない。
【００３２】実施例１ 形質転換 選択培養のＬ−チューブを２５０mlバッフル付エルレン
メイヤーフラスコ中の培地Ａ３０mlに無菌的に移す。シ
ードフラスコをシードが発育するまで２７℃で回転シェ
ーカー（２２０ｒｐｍ）上で培養する。このシード１ml
を１３−デオキシ−２２，２３−ジヒドロアベルメクチ
ンＢ１ａ／Ｂ１ｂアグリコン０．０５mg／mlを含む培地
Ｂ１０mlに植えつける。培地Ａ デキストロース １．０ｇ／リッター デキストリン １０．０ ビーフエキス ３．０ アルダミン（Ardamin)ｐＨ ５．０ ＮＺ アミン タイプＥ ５．０ ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ ０．０５ Ｋ2 ＨＰＯ4 ０．３ ｐＨ ７．１に調整 ＣａＣＯ3 添加 ０．５培地Ｂ グルコース １０．０ｇ／リッター ヒカーゼ（Hycase) ＳＦ ２．０ ビーフエキス １．０ コーン浸漬リキュール ３．０ ｐＨ７．０に調整 チューブを７日間回転シェーカー（２２０ｒｐｍ）上で
２７℃で培養し、全ブロスを等量の塩化メチレンで抽出
する。抽出物を乾燥させ、残渣を既知の量のメタノール
に溶解する。高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬ
Ｃ）により、アッセイを行なう。
メイヤーフラスコ中の培地Ａ３０mlに無菌的に移す。シ
ードフラスコをシードが発育するまで２７℃で回転シェ
ーカー（２２０ｒｐｍ）上で培養する。このシード１ml
を１３−デオキシ−２２，２３−ジヒドロアベルメクチ
ンＢ１ａ／Ｂ１ｂアグリコン０．０５mg／mlを含む培地
Ｂ１０mlに植えつける。培地Ａ デキストロース １．０ｇ／リッター デキストリン １０．０ ビーフエキス ３．０ アルダミン（Ardamin)ｐＨ ５．０ ＮＺ アミン タイプＥ ５．０ ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ ０．０５ Ｋ2 ＨＰＯ4 ０．３ ｐＨ ７．１に調整 ＣａＣＯ3 添加 ０．５培地Ｂ グルコース １０．０ｇ／リッター ヒカーゼ（Hycase) ＳＦ ２．０ ビーフエキス １．０ コーン浸漬リキュール ３．０ ｐＨ７．０に調整 チューブを７日間回転シェーカー（２２０ｒｐｍ）上で
２７℃で培養し、全ブロスを等量の塩化メチレンで抽出
する。抽出物を乾燥させ、残渣を既知の量のメタノール
に溶解する。高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬ
Ｃ）により、アッセイを行なう。
【００３３】実施例２ アッセイ ＨＰＬＣ分析を、６０℃において、メタノール：水（８
０：２０）を１分当り１mlで溶出する分析的デュポン
ソルバックス（Dupont Sorbax)ＯＤＳ４．６mm×２５cm
カラム上で行なった。アベルメクチン生成物の存在を確
認する為にカラムを２４３ｎｍの紫外線でモニターし
た。
０：２０）を１分当り１mlで溶出する分析的デュポン
ソルバックス（Dupont Sorbax)ＯＤＳ４．６mm×２５cm
カラム上で行なった。アベルメクチン生成物の存在を確
認する為にカラムを２４３ｎｍの紫外線でモニターし
た。
【００３４】実施例３ 生成 培養物ストレプトマイセスグリセウスＭＡ−６７６２、
ＡＴＣＣ５５０６９、ＭＡ−６７６３、ＡＴＣＣ５５０
７０又はストレプトマイセスラベンジュレＭＡ−６５５
５、ＡＴＣＣ１４１５９の凍結バイアル（２ml）を培地
Ａ５０mlを含む２５０mlバッフル付エルレンメイヤーフ
ラスコに接種した。シードフラスコを２４時間２７℃で
回転シェーカー（２２０ｒｐｍ）上で培養した。発育し
たシード５mlを形質転換培地Ｂ５０mlを含む２５０mlエ
ルレンメイヤーフラスコに植えつけた。メタノールに溶
解した１３−デオキシ−２２，２３−ジヒドロアベルメ
クチンＢ１ａ／Ｂ１ｂアグリコンを最終濃度０．０５mg
／mlになるまで０時間で形質転換物へ加えた。形質転換
フラスコ（５）を５日間２７℃で培養し、実施例４に記
載されるごとく抽出した。
ＡＴＣＣ５５０６９、ＭＡ−６７６３、ＡＴＣＣ５５０
７０又はストレプトマイセスラベンジュレＭＡ−６５５
５、ＡＴＣＣ１４１５９の凍結バイアル（２ml）を培地
Ａ５０mlを含む２５０mlバッフル付エルレンメイヤーフ
ラスコに接種した。シードフラスコを２４時間２７℃で
回転シェーカー（２２０ｒｐｍ）上で培養した。発育し
たシード５mlを形質転換培地Ｂ５０mlを含む２５０mlエ
ルレンメイヤーフラスコに植えつけた。メタノールに溶
解した１３−デオキシ−２２，２３−ジヒドロアベルメ
クチンＢ１ａ／Ｂ１ｂアグリコンを最終濃度０．０５mg
／mlになるまで０時間で形質転換物へ加えた。形質転換
フラスコ（５）を５日間２７℃で培養し、実施例４に記
載されるごとく抽出した。
【００３５】実施例４ 分離及び精製 各媒養物のプールされた全ブロス（２５０ml）を遠心
し、清澄化されたブロスを塩化メチレンで３回（３×１
００ml）抽出した。細胞集団をアセトンで３回（３×１
００ml）抽出した。抽出物を合わせ真空下、乾燥させ、
油状残渣をメタノールに溶解し、ＨＰＬＣを行なった。
ＨＰＬＣをワットマン パーティシル（Whatman Partis
il) １０ＯＤＳ−３、９．４mm×２５cm上において６０
℃で行い、２４３ｎｍの紫外線でモニターした。カラム
はメタノール：水（８０：２０）を１分当り３mlで２０
分間展開させた。化合物を上記抽出物をくり返して注入
する間に集めた。７．６分でのフラクションをプール
し、溶媒を蒸発乾固させた。
し、清澄化されたブロスを塩化メチレンで３回（３×１
００ml）抽出した。細胞集団をアセトンで３回（３×１
００ml）抽出した。抽出物を合わせ真空下、乾燥させ、
油状残渣をメタノールに溶解し、ＨＰＬＣを行なった。
ＨＰＬＣをワットマン パーティシル（Whatman Partis
il) １０ＯＤＳ−３、９．４mm×２５cm上において６０
℃で行い、２４３ｎｍの紫外線でモニターした。カラム
はメタノール：水（８０：２０）を１分当り３mlで２０
分間展開させた。化合物を上記抽出物をくり返して注入
する間に集めた。７．６分でのフラクションをプール
し、溶媒を蒸発乾固させた。
【００３６】実施例５ 特性 上記醗酵により得られた生成物を核磁気共鳴により、そ
して正確なサンプルとの比較により１３−β−２２，２
３−ジヒドロアベルメクチンＢ１ａ／Ｂ１ｂアグリコン
として特定した。
して正確なサンプルとの比較により１３−β−２２，２
３−ジヒドロアベルメクチンＢ１ａ／Ｂ１ｂアグリコン
として特定した。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:56） (Ｃ１２Ｐ 17/18 Ｃ１２Ｒ 1:545） (72)発明者 レイモンド エフ．ホワイト アメリカ合衆国，07726 ニュージャーシ ィ，イングリッシュタウン，ベケット ロ ード 12
Claims (20)
- 【請求項１】 ストレプトマイセスグリセウスＭＡ−６
７６２、ＭＡ−６７６３、又はストレプトマイセスラベ
ンジュレＭＡ−６５５５の培養物及び加えられた化合物
１３−デオキシ−２２，２３−ジヒドロアベルメクチン
Ｂ１ａ／Ｂ１ｂを炭素、窒素及び無機塩の同化可能な源
と共に水性栄養培地中で醗酵させることよりなる１３−
β−２２，２３−ジヒドロアベルメクチンＢ１ａ／Ｂ１
ｂアグリコンの製造方法。 - 【請求項２】 微生物が、ストレプトマイセスグリセウ
スＭＡ−６７６２である請求項１記載の方法。 - 【請求項３】 微生物が、ストレプトマイセスグリセウ
スＭＡ−６７６２、ＡＴＣＣ５５０６９である請求項２
記載の方法。 - 【請求項４】 微生物が、ストレプトマイセスグリセウ
スＭＡ−６７６３である請求項１記載の方法。 - 【請求項５】 微生物が、ストレプトマイセスグリセウ
スＭＡ−６７６３、ＡＴＣＣ５５０７０である請求項４
記載の方法。 - 【請求項６】 微生物が、ストレプトマイセスラベンジ
ュレＭＡ−６５５５、ＡＴＣＣ１４１５９である請求項
１記載の方法。 - 【請求項７】 当該加えられた化合物が醗酵培地１ml当
り０．０１〜１．０mgの範囲で添加される請求項１記載
の方法。 - 【請求項８】 当該加えられた化合物が醗酵培地１ml当
り０．０５〜０．５mgの範囲で添加される請求項１記載
の方法。 - 【請求項９】 炭素源が炭水化物の形で存在する請求項
１記載の方法。 - 【請求項１０】 炭水化物源が醗酵培地１リッター当り
１〜１０ｇの範囲で存在する請求項９記載の方法。 - 【請求項１１】 窒素源が醗酵培地１リッター当り５〜
１０ｇの範囲で存在する請求項１記載の方法。 - 【請求項１２】 醗酵が２０℃〜４０℃で及びｐＨ５．
０〜０．５で行なわれる請求項１記載の方法。 - 【請求項１３】 醗酵が２４℃〜３０℃で及びｐＨ６．
０〜７．５で行なわれる請求項１２記載の方法。 - 【請求項１４】 醗酵が２７℃〜２８℃で行なわれる請
求項１３記載の方法。 - 【請求項１５】 当該加えられた化合物が、醗酵サイク
ルの５０％が完了する前に醗酵ブロスへ添加される請求
項１記載の方法。 - 【請求項１６】 当該加えられた化合物が、醗酵サイク
ルの２５％が完了する前に醗酵ブロスへ加えられる請求
項１５記載の方法。 - 【請求項１７】 培養物ストレプトマイセスグリセウス
ＭＡ−６７６２。 - 【請求項１８】 ＭＡ−６７６２、ＡＴＣＣ５５０６９
である請求項１７記載の培養物。 - 【請求項１９】 培養物ストレプトマイセスグリセウス
ＭＡ−６７６３。 - 【請求項２０】 ＭＡ−６７６３、ＡＴＣＣ５５０７０
である請求項１９記載の培養物。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US587290 | 1990-09-24 | ||
| US07/587,290 US5225338A (en) | 1990-09-24 | 1990-09-24 | Microbial preparation of 13β-13-deoxy-22,23-dihydro avermectin-B1A/B1B aglycone |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04261180A JPH04261180A (ja) | 1992-09-17 |
| JPH0691831B2 true JPH0691831B2 (ja) | 1994-11-16 |
Family
ID=24349196
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3239615A Expired - Lifetime JPH0691831B2 (ja) | 1990-09-24 | 1991-09-19 | １３β−１３−デオキシ−２２，２３−ジヒドロアベルメクチン−Ｂｌａ／Ｂｌｂアグリコンの微生物学的製造 |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5225338A (ja) |
| EP (1) | EP0478064B1 (ja) |
| JP (1) | JPH0691831B2 (ja) |
| AU (1) | AU644013B2 (ja) |
| CA (1) | CA2050826A1 (ja) |
| DE (1) | DE69116057D1 (ja) |
| NZ (1) | NZ239808A (ja) |
| ZA (1) | ZA917556B (ja) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5290804A (en) * | 1991-05-01 | 1994-03-01 | Merck & Co., Inc. | Anthelmintic milbemycin analogs of novel microorganisms |
| EP0524686A1 (en) * | 1991-07-23 | 1993-01-27 | Merck & Co. Inc. | A process for the 14a-hydroxylation of avermectin compounds |
| WO1999017760A2 (en) | 1997-10-02 | 1999-04-15 | Microcide Pharmaceuticals, Inc. | Fungal or mammalian cell efflux pump inhibitors for enhancing susceptibility of the cell to a drug |
| US20090159259A1 (en) * | 2006-06-30 | 2009-06-25 | Sunil Kumar Sinha | Modular heat pump liquid heater system |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4587247A (en) * | 1985-02-25 | 1986-05-06 | Merck & Co., Inc. | Substituted and unsubstituted 13-(alkoxy)methoxy derivatives of the avermectin aglycones, compositions and use |
| US4666937A (en) * | 1985-03-04 | 1987-05-19 | Merck & Co., Inc. | Avermectin bioconversion products |
| ES2053797T3 (es) * | 1987-02-04 | 1994-08-01 | Ciba Geigy Ag | Procedimiento microbiano para la obtencion de derivados de milbemicina. |
-
1990
- 1990-09-24 US US07/587,290 patent/US5225338A/en not_active Expired - Fee Related
-
1991
- 1991-09-06 CA CA002050826A patent/CA2050826A1/en not_active Abandoned
- 1991-09-16 NZ NZ239808A patent/NZ239808A/en unknown
- 1991-09-18 EP EP91202398A patent/EP0478064B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1991-09-18 DE DE69116057T patent/DE69116057D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1991-09-19 JP JP3239615A patent/JPH0691831B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1991-09-23 AU AU84709/91A patent/AU644013B2/en not_active Ceased
- 1991-09-23 ZA ZA917556A patent/ZA917556B/xx unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0478064A2 (en) | 1992-04-01 |
| JPH04261180A (ja) | 1992-09-17 |
| ZA917556B (en) | 1992-05-27 |
| EP0478064A3 (en) | 1993-04-07 |
| EP0478064B1 (en) | 1996-01-03 |
| CA2050826A1 (en) | 1992-03-25 |
| DE69116057D1 (de) | 1996-02-15 |
| AU644013B2 (en) | 1993-12-02 |
| US5225338A (en) | 1993-07-06 |
| NZ239808A (en) | 1993-11-25 |
| AU8470991A (en) | 1992-03-26 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
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