JPS583676B2 - 新規抗生物質ムコペプチンｃ及びその製造法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、新規抗生物質ムコペプチンＣ （Ｍｕｃｏｐｅｐｔｉｎ Ｃ）及びその製造法に関する
ものである。

更に詳しくは、本発明はストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐ
ｔｏｍｙｃｅｓ）属に属する抗生物質ムコペプチンＣ生
産菌を培養して得られる培養物より新規抗生物質ムコペ
プチンＣを分離、採取することを特徴とする新規抗生物
質ムコペプチンＣの製造法並びに該抗生物質ムコペプチ
ンＣに係るものであり、ムコペプチンＣは既知文献未載
の新規抗生物質である。

本発明者らは、先に、ダラム陰性菌の細胞壁ペプチドグ
リカンの生合成阻害活性を示す新規抗生物質の探索を目
的として多数の土壌中より微生物を分離し、その産生す
る抗生物質を分離、探索した結果、ストレプトミセス属
に属する微生物の培養液及び培養菌体中に文献未載の新
規抗生物質が産生質ムコペプチンＢ（Ｍｕｃｏｐｅｐｔ
ｉｎ Ｂ）を分離、採取することに成功し、その製造法
を確立した（特公昭５７−７１６０号公報参照）が、更
に前記生産菌の培養物の有効成分を分離し、研究を進め
た結果、前記ムコベプチンＢとは明らかに別異の有効成
分を純粋に単離することに成功して該成分をムコペプチ
ンＣと命名し、こゝに本発明を完成するに至った。

以下に、本発明の新規抗生物質ムコペプチンＣ並びにそ
の製造法について詳述する。

本発明方法において用いる微生物は、新規抗生物質ムコ
ペプチンＣの生産能を有するストレプトミセス属に属す
る菌種である。

その一例として、ストレプトミセス・エスピー・Ｋ−６
４（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．Ｋ−６４）と呼
称される微生物が前記の特性を有する新菌株で、本発明
の新規抗生物質ムコペプチンＣを有利に生産するもので
あり、本発明方法に有効に利用し得る微生物として挙げ
られる。

また、前記ストレプトミセス・エスピー・Ｋ−６４の自
然的及び人工的変異株は勿論、ストレプトミセス属に属
する菌種で、後述の新規抗生物質ムコペプチンＣの生産
能を有する微生物は、すべて本発明方法において使用す
ることができる。

前記ストレプトミセス・エスピー・Ｋ−６４（以下、単
に「Ｋ−６４株」という。

）で、本発明者によって茨城県筑波郡谷田部町で採取し
た土壌試料中より発見された微生物であり、工業技術院
微生物工業技術研究所に昭和５５年１月２６日付寄託さ
れ、微生物受託番号は、微工研菌寄第５３８７号である
。

Ｋ−６４株は、次の菌学的性質を有する。

Ｋ−６４株の各種培地上の性状は、特許庁−産業別審査
基準「応用微生物工業」に従って各種培地を調製し、２
〜３週間後に観察した。

また、以下の色調の記載において（ ）内の色名は、デ
スクリプテイブ・カラー・ネーム・ディクショナリー（
Ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｖｅ ｃｏｌｏｒ ｎａｍｅ ｄｉ
ｃｔｉｏｎａｒｙ）に従った。

（１）形態的特徴 Ｋ−６４株は、ストレプトミセス属に属する形態を示し
、その形態的特徴は次のとおりである。

１）基生菌体：寒天中に良く生育し、良く分岐している
。

２）気菌糸：気菌糸は各種培地上に良く着生し、ゆるや
かに屈曲し、らせん糸は観 察されない。

胞子は卵形又は楕円形で、その大きさは１．４〜１．７
μ ×０．５〜０．７μであり、電子顕微 鏡による胞子表面の状態は平滑で ある。

（２）各培地における生育状態 色調の記載は、カラー・ハーモニー・マニュアル第４版
を対照として色番、色名を記載した。

１）シュークロース・硝酸塩寒天培地 生育：極めて良好で、表面に拡がった生育をする。

裏面の色は明かるい小麦色（２ｅａ）である。

気菌糸：良く着生し、粉状で、淡い黄緑色（２４ １／
２）である。

可溶性色素：生成しない。

２）グリコース・アスパラギン寒天培地 生育：極めて良好で、表面に拡がった生育をする。

裏面の色は明かるい小麦色である。

気菌糸：良く着生し、粉状で、淡い黄色 （１ｄｂ）を呈する。

可溶性色素：生成しない。

３）グリセリン・アスパラギン寒天培地 生育：極めて良好で、表面に拡がった生育をする。

裏面の色は薄い黄色（２ｇａ）を呈する。

気菌糸：良く着生し、粉状で、薄い黄色 （１ｄｂ〜１１／２ｄｂ）を呈する。

可溶性色素：生成しない。

４）無機塩・澱粉寒天培地 生育：平滑で良く生育する。

裏面の色は薄い黄色（２ｇｃ）を呈する。

気菌糸：良く着生し、粉状で、薄い黄色 （１１／２ｄｂ）を呈する。

可溶性色素：生成しない。

５）チロシン寒天培地 生育：良く生育し、表面に拡がった生育をする。

裏面の色は薄い黄色（２ｇａ）を呈する。

気菌糸：良く着生し、粉状で、薄い黄色 （１１／２ｄｂ）を呈する。

可溶性色素：生成しない。

６）栄養寒天培地 生育：普通の生育をし、表面は平滑、裏面の色はメロン
色（３ｇａ）を呈する。

気菌糸：ベルベット状の白色で、胞子の形成はない。

可溶性色素：生成しない。

７）イースト・麦芽寒天培地 生育：旺盛な表面に拡がった生育を示し、裏面の色は明
かるい黄褐色（３ｇｃ〜 ４ｉｃ）を呈する。

気菌糸：着生が良く、粉状で、象牙色（２ｄｂ）を呈す
る。

可溶性色素：生成しない。

８）オートミール寒天培地 生育：極めて良好な生育をし、表面に拡がる。

裏面の色は明かるい小麦色（２ｅａ） を示す。

気菌糸：良く着生し、粉状で、薄い黄色 （１ｄｂ）を呈する。

可溶性色素：生成しない。

９）ペプトン・イースト・エキストラクト・鉄寒天培地 生育：生育しない。

１０）脱脂粉乳 生育：徐々に生育し、ペプトン化は遅い。

１１）グルコース・ペプトン・ゼラチン培地生育：生育
遅く、ゼラチン液化は徐々に進行する。

（３）各生理的性質 １）生育温度 ２７〜３０℃で最も良好な生育がみられる。

２）ゼラチンの液化 弱い。

３）澱粉の加水分解 強い。

４）脱脂粉乳のペプトン化 徐々にペプトン化する。

５）メラニン様色素の生成 生成しない。

（４）炭素源の同化性 プリドハム・ゴドリーブ寒天培地の糖利用試験培地〔デ
イフコ（Ｄｉｆｃｏ）製〕に各種の糖を添加して、Ｋ−
６４株を培養した結果は次のとおりである。

＋：利用する。

±：僅かに利用する。−：利用しない。

上記の菌学的性質の特徴を要約すれば次のとおりである
。

（１） 形態：Ｋ−６４株はストレプトミセス属に属
し、気菌糸は屈曲し、らせん糸を形成 しない。

電子顕微鏡による胞子表面は平滑である。

（２）各培地の生育状態：各培地上に良く生背し、裏面
の色は薄い黄色で特徴のある色は 観察されない。

薄い黄色系の粉状の気菌糸を形成し、可溶性色素は生成
しな い。

（３）各生理的性質：２７〜３０℃で最も良く生育し、
ゼラチンの液化及び脱脂粉乳のペ トン化は弱く、澱粉の分解力は強い。

メラニン様色素は生成しない。

（４）炭素源の同化性：Ｌ−アラビノース、Ｄ−キシロ
ース、Ｄ−グルコースを利用する。

Ｄ−フラクトース、Ｌ−ラムノースは、 長期間培養すると生育がみられる。

シュークロース、ラフイノースは、僅か に利用する。

ｉ−イノシトール、マンニトール、サリシンは利用しな
い。

Ｋ−６４株の前記の菌学的性質を「インターナショナル
・ジャーナル・オブ・システマチック・バクテリオロジ
ー」、第２２巻、第３号（１９７２年）〔Ｅｂｅｒｈａ
ｒｄ Ｅｕａｔｅｒ：“ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＪ
ｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｂａｃｔ
ｅｒｉｏｇｙ”，Ｎｏ．３，Ｖｏｌ ２２（１９７２）
〕に記載の分類法（シンプルワーキング・キイ・オブ・
ザ・クラシフイケーション・アンド・アイデンテイフイ
ケーション・ネームド・タクサ・インクルーデツド・イ
ン・ザ・インターナショナル・ストレプトミセス・プロ
ジェクト）及び「フエルメント・テクノロジー」・第５
２巻、第２号（１９７４年）〔Ｎｏｎｏｍｕｒａ：Ｆｅ
ｌｍｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｎｏ．２，Ｖｏｌ
．５２（１９７４）〕に記載の分類法（キイ・フォア・
クラシフイケーション４５８スペシス・オブ・ザ・スト
レプトミセス・インクルーデット・イン・Ｉ．Ｓ．Ｐ．
）に従って比較すると、Ｋ−６４株は（１）薄い黄色の
気菌糸を形成すること、（２）メラニン様色素を形成し
ないこと、（３）気菌糸はゆるやかに屈曲し、らせん糸
を形成しないこと、（４）胞子の表面は平滑であること
及び（５）炭素源の同化性よりストレプトミセス・フラ
ビドビレンス （ＳＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｆｉａｖｉｄｏｖｉｒ
ｅｎｓ）に近似するものと考えられる。

しかしながら、抗生物質の生産能において明らかに相異
が認められるため、Ｋ−６４株はストレプトミセス・フ
ラビドビレンスに属する新菌株とすることが妥当と結論
された。

次に、本発明を実施するに当っては、ストレプトミセス
属に属する抗生物質ムコペプチンＣ生産菌を、抗生物質
を生産する通常の方法で培養することができる。

培養の形態は、液体培養でも固体培養でもよく、工業的
に有利に培養するためには、前記生差菌の胞子懸濁液又
は培養液を培地に接種し、通気攪拌培養を行えばよい。

培地の栄養源としては特に限定されることになく、微生
物の培養に通常用いられる炭素源、窒素源その他の培地
中に含有させることができる。

炭素源としては、澱粉、デキストリン、グリセリン、グ
ルコース、シュークロース、ガラクトース、イノシトー
ル、マンニトールなどが、また窒素源としては、ペプト
ン、大豆粉、肉エキス、米ぬか、皺、尿素、コーンステ
イープリカー、アンモニウム塩、硝酸塩、その他の有機
または無機の窒素化合物が用いられる。

その他、無機塩類、たとえば、食塩、燐酸塩類、カリウ
ム、カルシウム、亜鉛、マンガン、鉄等の金属塩類等を
適宜に添加してもよく、必要に応じて消泡剤として、動
・植・鉱物油等を添加してもよい。

培養温度、培養時間等の培養条件は使用菌の発育に適し
、しかもムコペプチンＣの生産が最高となるような条件
が選ばれる。

たとえば、培地のｐＨは４〜９、特に中性付近がよく、
培養の適温は２５°−３５℃程度がよい。

しかし、これらの培養組成物、培地の水素イオン濃度、
培養温度、攪拌条件などの培養条件は使同する菌株の種
類や、外部の条件などに応じて好ましい結果が得られる
ように適宜調節されるべきであることはいうまでもない
。

このようにして得られる培養物から、ムコペプチンＣを
得るには代謝産物を採取するのに通常用いられる手段を
適宜利用して採取し得る。

たとえば、ムコペプチンＣと不純物との溶解度差を利用
する手段、吸着親和力の差を利用する手段、イオン結合
力の差を利用する手段のいずれも、それぞれ単独で、ま
たは組合わせて、あるいは反復して使用される。

具体的には、ムコペプチンＣを含有するムコペプチン複
合体（他に、例えばムコペプチンＡ及びＣを含有してい
る）は、培養Ｆ液にその大部分が存在するが、その吸着
性の性質を利用して、活性炭或いはイオン交換樹脂など
を用いて培養濾液より吸着させることが出来る。

水洗後、吸着体より含水メタノール、含水アセトン等で
溶離することが出来る。

溶出液を減圧下に濃縮して得た濃縮液に約４倍量のアセ
トンを加え、分別沈澱により沈澱物を除く。

上澄液を減圧濃縮後、シリカゲルの吸着力ラムクロマト
グラフィーによって精製することができる。

例えば、クロロホルム−メタノールの溶剤系を用いてメ
タノールの含量を順次増大しながら溶出すると、ムコペ
プチン複合体が溶出される。

活性区分を集め、減圧濃縮することによりムコペプチン
複合体の粗粉末が得られる。

このムコペプチン複合体には少なくとも数種の活性成分
が含まれるが、これよりムコペプチンＣを純粋に単臨す
るためにはイオン交換クロマトグラフイー及び分配クロ
マトグラフイーが有効である。

例えば、上記複合体粗粉末を０．０５Ｍの重炭酸アンモ
ニウム溶液を用いてＤＥＡＥセルロースのクロマトグラ
フイーを行う。

重炭酸アンモニウムの濃度を０．０５Ｍより順次上昇さ
せて展開溶出を行うと、活性区分は三つのピークとなっ
て順次溶出される。

第二の活性区分を集めて減圧濃縮した後、凍結乾燥する
とムコペプチンＡ及びムコペプチンＣを含む粗粉末が得
られる。

更に精製するために、例えばブタノール−メタノール−
水の溶剤系を用いてスルロースカラムクロマトグラフイ
ーを行うと、ムコベプチンＡ、次いでムコペプチンＣが
分離溶出される。

紫外部吸収及び生物活性による分析で単一の画分を集め
て濃縮乾固する。

残渣を熱水より再結晶操作を行うと、ムコペプチンＣは
微黄色粉末として析出する。

かくして得られたムコペプチンＣの理化学的性質及び生
物学的性状は次のとおりである。

〔ムコペプチンＣの理化学的性質及び生物学的生状〕

（１）元素分析値： 炭素；５１．２７％，水素；５．８８％，窒素；１１．
８６％，硫黄；３．３７％ （２）分子量（滴定当量による）： ８００ （３）融点： １７８℃より１８２℃で溶融分解する。

（４）比旋光度： 〔α〕２０Ｄ−３９．７°（Ｃ＝１．００，５０％メタ
ノール） （５）紫外線吸収スペクトル： 第１図のとおり。

λｍａ×ｍμ（Ｅ１％１ｃｍ） 水及び０．０１Ｎ塩酸中；２５３（１４１）０．０１Ｎ
苛性ソーダ中； ２４１（２７７），２９０肩（９３） （６）赤外線吸収スペクトル： 第２図に示すとおり。

臭化カリ錠剤中の主な極大値を次に示す。

３３８０，２９２０，１６５０，１５５０，１５３０，
１４８０，１４４０，１３８０，１２７５，１２４５，
１２１０，１１７０，１１００，１０４０， ８７０，
７７０，６８５， ６０５， ５２５ｃｍ−１ （７） 溶解性： 水、メタノール、含水アセトン、ジメチルスルホキシド
に溶ける。

アセトン、酢酸エチル、クロロホルム、ベンゼン、エー
テル、石油エーテルに難溶である。

（８）呈色反応： ニンヒドリン反応は陽性、過マンガン酸カリを脱色（陽
性）し、ライドン・スミス反応は陽性である。

塩化鉄、２，４−ジニトロフエニルヒドラジン、フエー
リング、トレンス、過沃素酸−ベンジジン反応は陰性で
ある。

（９）塩基性、酸性、中性の区別： 酸性側（ｐＨ４．０附近）に等電点をもの両性物質であ
る。

（１０）物質の色： 微黄色粉末である。

（１１） ｐＫａ´値： ３．４，７．６，９．７，１０．７ （１２） Ｒｆ値（ブタノール−メタノール−水（４：
１：２）の溶剤系でセルロース薄層クロマトグラフイー
での値）： ０．３９ （１３）抗菌スペクトル： ブイヨン寒天培地を用い、倍数希釈法によって生育最少
阻止濃度を求めた結果を以下に示す。

（１４） 毒性： マウスに対する静脈内投与で２５０ｍｇ／ｋｇで全く毒
性を示さなかった。

以上のムコペプチンＣの理化学的性質及び生物学的性状
を既知の抗生物質と比較すると、唯一の類似物質として
、抗生物質ＦＲ３３８３（特開昭５１−５４，９８８、
特開昭５２−９３，７０１公報参照）が挙げられる。

しかしながら、該物質は、比旋光度、元素分析値、赤外
機吸収スペクトル等において明らかに相異が認められる
。

更に、実際にＦＲ３３８３物質の標準試料を入手して、
セルロース薄層クロマトグラフイーによって両者の比．
較を試みたところ、ブタノール−メタノール−水（４：
１：２）の溶剤系でＦＲ３３８３物質のＲｆ値は０．２
４であるのに対してムコペプチンＣのＲｆ値は０．３９
を示し、明らかに異なる物質であることが証明された。

また、先に分離、採取されたムコペプチンＢとも明らか
に別異の物質であることが証明された。

よって、ここに本発明の抗生物質を新規抗生物質と結論
し、「ムコペプチンＣ（ＭｕｃｏｐｅｐｔｉｎＣ）」と
命名した。

ムコペプチンＣは、試験管内（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）試験
においてグラム陰性菌及び抗酸性菌に対して阻害活性を
示し、更にマウスに対する毒性が認められないことから
医薬としての利用が期待されるものである。

以下に、本発明方法を実施例によって詳述する。

実施例 市販の栄研ブイヨン培地（肉エキス０．３％、ペプトン
１％、食塩０．５％）に３％のグリセリンを添加した培
地に、前記Ｋ−６４株（微工研菌寄第５３８７号）を接
種して２８℃で４８時間振盪培養する。

この培養液１４０ｍｌを、グルコース２％、可溶性澱粉
１％、肉エキス０．１％、乾燥酵母０．４％、食塩０．
２％、第二燐酸カリ０．００５％、大豆粉２．５％より
成る培地１８ｌを含む内容３０ｌのジャーファーメンタ
ーに接種し、３０℃で１２０時間、通気攪拌培養を行う
。

このときの通気量は毎分１８ｌ、攪拌回転数は３００ｒ
ｐｍである。

培養終了後、培養液（ｐＨ８．０）に濾過助剤として硅
藻土２％を加えて濾過する。

濾液４８ｌ（ジャーファーメンター３基分）を、ダイヤ
イオンＨＰ−１０（商品名）５ｌの樹脂塔に通過し、吸
着させる。

２０ｌの水を用いて洗滌後、２０％含水メタノール２０
ｌを用いて溶出を行うと、不純物が溶出される。

次いで、６０％の含水メタノール１３０ｌを用いて溶出
を行うと、活性部分が溶出される。

これを減圧下に濃縮し、濃縮液２００ｍｌを得る。

これに８００ｍｌのアセトンを加えると、沈殿を生ずる
。

沈殿を濾過して除き、濾液を減圧下に濃縮乾固する。

残渣をクロロホルム−メタノールの溶剤系を用いてシリ
カゲルのカラム（６．５×１５０ｃｍ）によりクロマト
グラフイーを行う。

活性はクロロホルム−メタノール（１：１）より（１：
２）の溶出区分に現われる。

活性画分を濃縮乾固すると、ムコペプチン複合体の粗粉
末７．５ｇを得る。

前記複合体粗粉末を少量の０．０５Ｍ重炭酸ソーダ溶液
に溶解し、予め同一溶液で調製したホワットマンＤＥ５
２（商品名）のカラム（４５×２４０ｍｍ）にチャージ
し、重炭酸アンモニウムの濃度を０．０５Ｍより０．１
Ｍ、０．３Ｍと順次段階的に高めながら展開溶出を行う
。

活性は０．１Ｍより０．３Ｍの画分にかけて３つのピー
クとして現われる。

第二の活性画分を集めて減圧濃縮し、最後に凍結乾燥す
ると、ムコペプチンＡおよびムコペプチンＣの混合粗粉
末が得られる。

これを更にブタノール−メタノール−水の溶剤系を用い
てアビセルセルロースのカラムクロマトグラフイーを行
う。

溶剤比を８：１：０．２より４：１：１に順次変化せし
めて展開溶出を行うと、ムコペプチンＡ、次いでムコペ
プチンＣが分離溶出される。

溶出フラクションを薄層クロマトグラフイーにより、紫
外部吸収、ニンヒドリン反応、抗菌活性を指標に単一の
画分を合わせて濃縮乾固する。

ムコペプチンＣの画分の残渣を数ｍｌの熱水に溶かし、
濾過冷却すると、微黄色粉末が析出する。

沈殿を濾取し、冷水で洗滌後、乾燥すると、ムコペプチ
ンＣの精製粉末３００ｍｇが得られる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明のムコペプチンＣの紫外線吸収スペク
トルを示す。 第２図は、本発明のムコペプチンＣの赤外線吸収スペク
トル（臭化カリ錠剤）を示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 下記の理化学的性質及び生物学的性質を有すること
   を特徴とする新規抗生物質ムコペプチンＣ（Ｍｕｃｏｐ
   ｅｐｔｉｎ Ｃ）。 （１）元素分析値 炭素：５１．２７％、水素：５．８８％、窒素：１１．
   ８６％、硫黄：３．３７％ （２）分子量（滴定当量による） ８００ （３）融点 １７８〜１８２℃（分解） （４）比旋光度 〔α〕２０Ｄ−３９．７°（Ｃ＝１．００、５０％メタ
   ノール） （５）紫外線吸収スペクトル λｍａ×ｍμ（Ｅ１％１ｃｍ） 水及び０．０１Ｎ塩酸中：２５３（１４１）０．０１Ｎ
   苛性ソーダ中：２４１（２７７）、２９０肩（９３） （６）赤外線吸収スペクトル （臭化カリ錠剤中の主な極大値） ３３８０，２９２０，１６５０，１５５０，１５３０，
   １４８０，１４４０，１３８０，１２７５，１２４５，
   １２１０，１１７０，１１００，１０４０， ８７０，
   ７７０，６８５， ６０５， ５２５ｃｍ−１ （７）溶解性 水、メタノール、含水アセトン、ジメチルスルホキシド
   に溶ける。 アセトン、酢酸エチル、クロロホルム、ベンゼン、エー
   テル、石油エーテルに難溶である。 （８）呈色反応 ニンヒドリン、ライドン・スミス反応は陽性、過マンガ
   ン酸カリを脱色（陽性）し、塩化鉄、２，４−ジニトロ
   フエニルセドラジン、フエーリング、トレンス、過沃素
   酸−ベンジジン反応は陰性である。 （９）塩基性、酸性、中性の区別 両性物質で、等電点はｐＨ４．０附近にある。 （１０） 物質の色 微黄色粉末 （１１） ｐＫａ´値 ３．４，７．６，９．７，１０．７ （１２）Ｒｆ値（ブタノール−メタノール−水（４：１
   ：２）の溶剤系でセルロース薄層 クロマトグラフィーでの値） ０．３９ （１３） 抗菌スペクトル グラム陰性菌、抗酸性菌に対して生育阻害活性を示す。 ２ ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属
   に属する抗生物質ムコペプチンＣ生産菌を培養し、その
   培養物から新規抗生物質ムコペプチンＣを分離、採取す
   ることを特徴とする新規抗生物質ムコペプチンＣの製造
   法。 ３ ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属
   に属する抗生物質ムコペプチンＣ生産菌がストレプトミ
   セス・エスピー・Ｋ−６４（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ
   ｓｐ．Ｋ−６４）である特許請求の範囲第２項記載の製
   造法。