JPS5822198B2 - 新規抗生物質ａｎｓ−１２７ａ物質及びその製造法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、新規抗生物質ＡＮＳ−１２７Ａ物質及びその
製造法に関するものである。

更に詳しくは、本発明は、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅ
ｐｔｏｍｙｃｅｓ）属に属するＡＮＳ−１２７Ａ物質生
産菌を培養して得られる培養物よりＡＮＳ−１２７Ａ物
質を分離、採取することを特徴とする新規抗生物質ＡＮ
Ｓ−１２７Ａ物質の製造法及び該ＡＮＳ−１２７Ａ物質
に係るものであり、前記ＡＮＳ−１２７Ａ物質は既知文
献未載の新規物質である。

本発明者らは、ある種の動物培養癌細胞に対して細胞分
化誘導作用を示す新規活性物質の探索を目的として多数
の土壌中よシ微生物を分離し、その産生ずる二次代謝物
質を分離、探索した結果、ストレプトミセス属に属する
微生物の培養物中に文献未載の新規活性物質か産生、蓄
積されることの新たな知見を得て、ここに本発明を完成
するに至った。

以下に、本発明の新規抗生物質ＡＮＳ−１２７Ａ物質（
以下、単に「ＡＮｓ−１２７Ａ物質」という。

）及びその製造法について詳述する。本発明方法におい
て用いる微生物は、ＡＮＳ−１２７Ａ物質の生産能を有
するストレプトミセス属に属する菌種である。

（−（Ｄ−例として、ストレプトミセス・エスピー７９
−ＡＮＳ−１２７（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｓｐ。

７９−ＡＮＳ−１２７）と呼称される微生物か前記の特
性を有する新菌株で、本発明のＡＮＳ−１２７Ａ物質を
有利に生産するものであシ、本発明方法に有効に利用し
得る微生物として挙げられる。

また、前記ストレプトミセス・エスピー・７９−ＡＮＳ
−１２７の自然的及び人工的変異株は勿論ストレプトミ
セス属に属する菌種で、ＡＮＳ−１２７Ａ物質の生産菌
を有する微生物は、すべて本発明方法において使用する
ことができる。

前記ストレプトミセス・エスピー°７９−ＡＮＳ−１２
７（以下、単に「ＡＮＳ−１２７株」という。

）は、本発明者によって埼玉県和光市で採取された土壌
試料中より発見された微生物であシ、工業技術院微生物
工業技術研究所に昭和５６年３月６日付寄託され、その
微生物受託番号は、微工研菌寄第５９０１号である。

ＡＮＳ−１２７株は、次の菌学的性質を有する。

（、Ｉ）形態 イーストエキス・マルトエキス寒天培地及び無機塩澱粉
寒天培地上の生育について顕微鏡観察を行った結果、Ａ
ＮＳ−１２７株は、ストレプトミセス属に属する形態を
示し、その形態的特徴は次のとおシである。

］）基生菌糸 寒天中に良く生育し、良く分岐している。

２）気菌糸 色は灰色系で、短かぐ、ゆるやかに屈曲し、時にゆるい
不完全ならせん糸を形成する。

分岐は少なく、輪生枝を形成しない。

電子顕微鏡によると、胞子の形状は、長円形又は楕円形
で、その大きさは０．９〜１．２μ×０．７〜１．０μ
であり、表面は平滑である。

（Ｉ）各種培地上の性質 特許庁産業別審査基準に従い、各種培地を調整し、接種
後、２〜３週間後に観察した結果を次に記載する。

なお、色調の記載において０内の記号はディスクリブチ
イブ・カラー・ネームズ・ディクショナリー（Ｄｅｓｃ
ｒｉｐｔｉｖｅＣｏｌｏｒＮａｍｅｓＤｉｃｔｉｏｎａ
ｒｙ）第４版色名記号に従ったものである。

（１）シュークロース・硝酸寒天培地 生育：極めて悪く、薄く表面に生育する。

基生菌糸の色は無色である。

気菌糸：着生しない。

可溶性色素：生成しない。

（２）グリコース・アスパラギン寒天培地生育：普通の
生育か見られ、裏面の菌体の色はクリーム色（１／２ｃ
ａ）である。

気菌糸二着生しないか、僅かに灰色（２ｉｈ）の気菌糸
を着生する。

可溶性色素：生成し々い。

（３）グリセリン・アスパラギン寒天培地生育：良好な
生育を示し、裏面の菌体の色け明るい茶灰色（２ｇｅ）
を経て濃い 褐色（２ｐｎ）となる。

気菌糸：まばらに着生し、ベルベット状でベージュ・グ
レー（３ｉｈ）ないし 灰色（５ｉｈ）を呈する。

可溶性色素：生成しない。

（４）無機塩・澱粉寒天培地 生育：良好な生育を示し、裏面の菌体の色は濃い褐色（
２ｐｎ）を呈する。

気菌糸：豊富に着生し、粉状で灰色（５Ｉｈ、〜５ｆｅ
）を呈する。

可溶性色素：生成しない。

（５）チロシン寒天培地 生育：良好な生育が見られ、裏面の菌体の色はオリーブ
灰色（１１／２ｉｇ）な いしオリーブ黒色（１１／２ｐｎ）を 呈する。

気菌糸：良く着生し、粉状で明るい茶灰色（２ｆｅ〜３
ｉｈ）を呈する。

可溶性色素：生成しない。

（６）栄養寒天培地 生育：やや不良で、表面は平滑、透明の生育が見られ、
菌体の色は淡黄色（２ ｇｃ）を示す。

気菌糸二着生しない。

可溶性色素：生成しない。

（７）イースト・エキストラクト、マルト・エキストラ
クト寒天培地 生育：極めて良好な生育を示し、裏面の菌体の色は明る
い褐色（３ｎｉ）よシ暗 い褐色（３ｐｎ）を呈する。

気菌糸：良く着生し、粉状で灰色（３ｉｈ）を呈する。

可溶性色素二褐色の可溶性色素を生成する。

（８）オートミール寒天培地 生育：極めて良好な生育を示し、平滑、拡がった生育が
見られ、菌体の色は灰 黒色（５ｍｉ）を呈する。

気菌糸：豊富に着生し、粉状で灰色（３ ｉｈ〜５ｉｈ）を呈する。

可溶性色素：生成しない。

（９）ペプトン・イーストエキストラクト・鉄寒天培地 生育：生育は不良、表面は平滑で透明である０ 気菌糸二着生しない。

可溶性色素二生成しない。

（ＩＩＩ）生理的性質 （１）生育温度＝２７°Ｃ最適の生育が見られる。

（２）澱粉分解カニ強い。

（３）脱脂粉乳：徐々にペプトン化する。

（４）メラニン様色素の生成： 栄養寒天培地、チロシン寒天培地、ペプトン・イースト
エキストラクト・鉄寒天培地上では、メラニン様色素の
生成は見られないが、イースト・エキストラクト・マル
ト・エキストラクト寒天培地上でメラニン様の褐色の色
素を生成する。

（５）ゼラチンの液化カニ液化しない。

（６）硝酸塩還元：還元しない。

（ＩＶ）各種炭素源の利用性 ブリダハムによる糖料用培地〔ディフコ （Ｄｉｆｃｏ）製〕に各種の糖を添加してＡＮＳ−１２
７株を培養した結果は次のとおシである。

（糖類）（生育） Ｌ−アラビノース丑 Ｄ−キシロース＋ Ｄ−グルコース廿 Ｄ−フラクトース± シュークロース± Ｌ−イノシトール− Ｌ−ラムノース± ラフィノース− Ｄ−マンニトール士 無添加− 丑：良く生育する。

＋：生育する。±：生育するが、極めて悪い。

一：生育しない。

ＡＮＳ−１２７株の菌学的性質は上記の如くであるか、
ＡＮＳ−１２７株は、■灰色系の短い波状に屈曲した気
菌糸を形成し、胞子の表面は平滑であること、■基生菌
糸の色は褐色ないし濃褐色であること、■メラニン様色
素は生成しないが、イースト・エキストラクト、マルト
・エキストラクト寒天培地上においてメラニン様色素の
生成が見られること、■可溶性色素は生成しないこと、
■糖の利用性は、グルコース、アラビノース、キシロー
スを良く利用するが、他の糖は利用しないか、僅かに利
用すること等の特徴を有する。

この特徴的性質につき、野々村氏による「ジャーナル・
オブ・ファーメンテ−ジョン・テクノロジー」第５２巻
、第２号記載の放線菌１．Ｓ、Ｐ、株４５８菌種の分類
法の記載〔キイ・フォア・クラシフィケーション・アン
ド・アイデンティフィケーション・オブ・４５８スペシ
ス・オブ・ザ・ストレプトミセス・インクルーテッド・
イン・Ｉ、Ｓ、Ｐ、（！（ｅｙｆｏｒｃｌａｓｓｉｆｉ
ｃａｔｉｏｎａｎｄｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆ
４５８ｓｐｅｃｉｅｓｏｆＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｉ
ｎｃｉｕｄｅｄｉｎＩ、Ｓ、Ｐ、））及びワックスマン
著「ザ・アクチノミセテス」１９６１年版第２巻の分類
法により類似の放線菌の菌種を照合し、比較した結果、
糖の利用性、メラニン色素の形成等の性質において差異
がみられるが、気菌糸及び胞子の形態並びに各種培地上
の性質の所見が類似するので、ＡＮＳ−１２７株はスト
レプトミセス・アンチビオティカス （Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｕｓ
）に近似するものと考えられる。

しかしながら、ＡＮＳ−１２７株は、ＡＮＳ−１２７Ａ
物質の生産能を有するという点においてストレプトミセ
ス・アンチビオティカスに属する４他の菌株と明らかに
相異が認められるため、ストレプトミセス・アンチビオ
ティカスに属する新菌株とすることが妥当であると結論
された。

次に、本発明方法を実施するに当っては、ストレプトミ
セス属に属するＡＮＳ−１２７Ａ物質生産菌を、抗生物
質を生産する通常の方法で培養することかできる。

培養の形態は、液体培養でも固体培養でもよく、工業的
に有利に培養するためには、前記生産菌の胞子懸濁液又
は培養液を培地に接種し、通気攪拌培養を行えばよい。

培地の栄養源としては特に限定されることばなく、敏生
物の培養に通常用いられる炭素源、窒素源その他を培地
中に含有させることができる。

炭素源としては、澱粉、デキストリン、グリセリングル
コース、シュークロース、ガラクトース、イノシトール
、マンニトールなどが、また窒素源としてはペプトン、
大豆粉、肉エキス、米ぬか、皺。

尿素、コーンステイープリカー、アンモニウム塩、硝酸
塩、その他の有機または無機の窒素化合物が用いられる
。

その他、無機塩類、たとえば、食塩、燐酸塩類、カリウ
ム、カルシウム、亜鉛、マンガン、鉄等の金属塩類等を
適宜に添加してもよく、必要に応じて消泡剤として、動
・植・鉱物油等を添加してもよい。

培養温度、培養時間等の培養条件は使用菌の発育に適し
、しかもＡＮＳ−１２７Ａ物質の生産が最高となるよう
な条件か選ばれる。

たとえば、培地のｐＨは４〜９、特に中性付近がよく、
培養の適温は２５°−３５℃程度がよい。

しかし、これらの培養組成物、培地の水素イオン濃度、
培養温度、攪拌条件などの培養条件は使用する菌株の種
類や、外部の条件などに応じて好ましい結果が得られる
ように適宜調節されるべきであることはいうまでもなり
０このようにして得られる培養物から、ＡＮＳ−１２７
Ａ物質を得るには、代諸産物を採取するのに通常用いら
れる手段が適宜利用される。

たとえば、ＡＮＳ−１２７Ａ物質と不純物との溶解度差
を利用する手段、吸着親和力の差を利用する手段のいす
わも、それぞれ単独で、または組合わせて、あるいは反
復して使用される。

具体的には、Ａ、ＭＳ−１，２７Ａ物質は培養ｐ液にそ
の大部分が存在するが、その有機溶剤への溶解性の差を
利用して酢酸エチル、酢酸ブチル、クロロホルム、ブタ
ノールなどを用いて培養ろ液より抽出することかできる
。

抽出液を減圧下に濃縮すると、ＡＮＳ−１２７Ａ物質の
粗抽出物が得られる。

このものは多量の不純物を含んでいるので、シリカゲル
、アルミナ等の吸着クロマトグラフィーに付して、更に
精製する。

例えば、シリカゲルのカラムをクロロホルムで調製して
おき、これに前記粗抽出物をクロロホルム−メタノール
の混合溶剤の少量に溶かしたものを流し込む。

引き続き同じ溶剤系を用いて展開溶出を行う。

溶出液をフラクションコレクターにて一定量づつ分取す
る。

生物活性を示すフラクションを集めて濃縮すると精製粉
末か得られる。

更に精製を行うために、同様のシリカゲルクロマトグラ
フィーをくり返して行う。

分取フラクションを高速液体クロマトグラフィー、或い
は薄層クロマトグラフィーによシ紫外部吸収によシ分析
しながら単一画分を集める。

この濃縮物を更に精製するだめに、６０％アセトニルを
用いた逆層カラムを用いて高速液体クロマトを行い、単
一ピークの両分を分取する。

これを減圧濃縮して残渣を含水メタノールの少量に溶解
し、冷蔵することによ、りＡＮＳ−１２７Ａ物質は無色
の結晶として析出する。

これを沢取乾燥することによってＡＮＳ−１２７に物質
の純品を得ることができる。

かくして得られたＡＮＳ−１，２７Ａ物質の理化学的性
質及び生物学的性質は次のとおりである。

（ＡＮＳ−１２７Ａ物質の理化学的性質及び生物学的性
質〕 （１）元素分析値 炭素：６６．６７％、水素：３．７２％、酸素：２９．
５８％、窒素二〇％、 （２）分子量（ＦＤマススペクトルによる）７０ （３）融点 ３０７°Ｃ （４）旋光分散 メタノール中、２２０−？６００ｍμの範囲で光学不活
性である。

（５）紫外線吸収スペクトル 第１図（・・・線）に示すとおシ、メタノール及び０．
１規定塩酸メタノール中、２６２ｍμ（６３７，０００
）に極大吸収を、３３７ｍμ（ε３．６００）Ｋ肩の吸
収をそれぞれ示す。

また、同図中（・・・線）に示すとおり、０．１規定苛
性ソーダメタノール中、２７４ｍμ（ε。

３７．０００）に極大吸収を、３２６ｍμ（ε１５．２
００）に肩の吸収をそれぞれ示す。

（６）赤外線吸収スペクトル 第２図に示すとおり、臭化カリ錠剤で測定した主な極大
値は次のとおシである。

３４３０．２９２０，１６５０，１６１７゜１５７１．
１５１０，１４６５，１４３６゜１２４０．１１８８，
１１７０ＣＩＩＬ’（７）溶解性 アセトンに易溶、メタノール、酢酸エチル、クロロホル
ムに可溶、水に難容である。

（８）呈色反応 塩化鉄反応及び過マンガン酸カリ反応は陽性２．４−ジ
ニトロフェニルヒドラジン反応は陰性である。

（９）塩基性、中性、酸性の区別 弱酸性物質であり、６６．７％ジオキサン中におけるｐ
ｋａ′は８．６及び１０．７である。

００）物質の色 無色の結晶である。

ａυ癌細胞の分化誘導活性 フレンド白血病細胞Ｂ８（ＥｒｙｔｈｒｏｉｄＩｅｕｋ
ｅｍｉｃｃｅｌｌＢ８）に対し２０−４００２０−４Ｏ
０の濃度で分化誘導作用を示し、最大４５％の細胞を赤
血球細胞に分化させる。

また、マウス骨髄性白血病細胞Ｍ１（ＭｙｅｌｏｉｄＩ
ｅｕｋｅｍｉｃｃｅｌｌＭｌ）に対し１０〜６０ｍｃｇ
／ｍｌの濃度で分化誘導作用を示し、最大１＋１００ｕ
Ａｎｌのリゾチーム活性を誘導する。

（１２）抗菌活性 抗菌活性を有し、大腸菌高感受性変異株ＢＥ１１８６株
（ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＢＥ１１８６）、稲
白葉枯病菌（ＸａｎｔｈｏｍＯｎａＳｏｒｙｚａｅ）に
対し５〜／ｍｌ溶液のペーパーディスク寒天平板検定に
より、約１３ｍｍの阻止円を示す。

０３）毒性 マウスに対する腹腔内投与で１０１００７ｎ９７で全く
毒性を示さなかった。

以上のＡＮＳ−１２７Ａ物質の理化学的性質及び生物学
的性質を既知の抗生物質と比較すると、同−又は類似す
る物質を全く見出し得ないので、ＡＮＳ−１２７Ａ物質
を新規物質と結論した。

ＡＮＳ−１２７Ａ物質は、前述の如く、癌細胞に対して
正常細胞への分化誘導作用を示すことから、毒性の少々
ｂ抗腫瘍物質としての利用か期対さｎるものである。

以下に、本発明方法を実施例によって詳述する。

実施例 グリコース２％、可溶性澱粉１％、肉エキス０．１％、
乾燥酵母０．４％、食塩０．２％、第二燐酸カリ０．０
０５％、大豆粉２．５％の組成培地にＡＮＳ−１２７株
（微生物受託番号、微工研菌寄第５９０１号）を接種し
て９４時間、２８℃で振盪培養する。

この培養液７０−を同一組成の培地１８７に接種し、ジ
ャーファーメンタ−を用いて９０時間、２８℃で通気攪
拌培養を行う。

このときの通気量は、毎分１８ｔ１攪拌回転数は３５０
ｒｐｍである。

培養終了後、培養液（ｐＨ８，５）Ｋけいそう土ｉ沢過
助剤として加えて沢過し、２８７のろ液（ジャ−２基分
）を得る。

この泥液をｐＨ７，０に調整し、各々１２ｔの酢酸エチ
ルで２回抽出する。

更に、ｐＨを９．０に調整し、各々９ｔの酢酸エチルで
２回抽出する。

この抽出液を減圧下に約１５０艷になるまで濃縮する。

この濃縮液に５０ｇのシリカゲルを加えて吸着させた後
、真空デシケータ−中で乾燥させる。

これをクロロホルムに懸濁し、予めクロロホルムで調整
したシリカゲルカラム（シリカゲル：１５０ｇ、カラム
：３Ｘ６０（１１７７１）の上層に充填する。

最初にクロロホルム（３ｔ）で、次すで１０％メタノー
ル−クロロホルム（１ｔ）で展開し、２２ｇづつの両分
に分取する。

両分／１６１９３−２０６の活性区分を集めて濃縮し、
１．６Ｉの残渣を得る。

この残渣の３００〜を高速液体クロマトグラフィー（ヌ
ークレオシル５Ｃ２１８を担体とする逆相カラム）にか
けて更に精製し、メタノール−水の系で結晶化すると、
無色の針状結晶ないし柱状結晶のＡＮＳ−１２７Ａ物質
が２０■得られる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明の新規抗生物質ＡＮＳ−１２７Ａ物質
の紫外線吸収スペクトルを、第２図は、赤外線吸収スペ
クトルをそれぞれ示すグラフである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １下記の理化学的性質及び生物学的性質を有することを
   特徴とする新規抗性物質ＡＮＳ−１２７Ａ物質。 ■）元素分析値 炭素：６６．６７％、水素：３．７２％、酸素：２９．
   ５８％、窒素二〇％ ２）分子量（ＦＤマススペクトルによる）７０ ３）融点 ３０７°Ｃ ４）旋光分散 メタノール中、２２０−６６０ｍμの範囲で光学不活性
   である。 ５）紫外線吸収スペクトル メタノール及び０．１規定塩酸メタノール中、２６２ｍ
   μ（ε、３７，０００）に極太吸収を。 ３３７ｍμ（ε、３，６００）に肩の吸収をそれぞれ示
   す。 また、０，１規定苛性ソーダメタノール中、２７４ｍμ
   （ε、３７，０００）に極大吸収を、３２６ｍμ（ε、
   １５，２００）に肩の吸収をそれぞれ示す。 ６）赤外線吸収スペクトル （臭化カリ錠剤中の主な極大値） ３４３０．２９２０，１６５０，１６１７゜１５７１．
   １５１０，１４６５，１４３６゜１２４０．１１８８，
   １１７０ｃｒＩＬ’７）溶解性 アセトンに易溶、メタノール、酢酸エチル、クロロホル
   ムに可溶、水に難溶である。 ８）呈色反応 塩化鉄反応及び過マンガン酸カリ反応は陽性、２．４−
   ジニトロフェニルヒドラジン反応は陰性である。 ９）塩基性、酸性、中性の区別 弱酸性物質であり、６６．７％ジオキサン中におけるｐ
   Ｋａ’ｌｄ、８．６及び１０，７である。 １０）物質の色 無色結晶 １１）癌細胞の分化誘導活性 フレンド白血病細胞Ｂ８（ＥｒｙｔｈｒｏｉｄＩｅｕｋ
   ｅｍｉｃｃｅｌｌＢ８）に対し２０−２０−４Ｏ０／ｍ
   ｅの濃度で分化誘導作用を示し、最大４５％の細胞を赤
   血球細胞に分化させる。 また、マウス骨髄性白血病細胞Ｍ１（ＭｙｅｌｏｉｄＩ
   ｅｕｋｅｍｉｃｃｅｌｌＭｌ）に対し１０−６１０−６
   Ｏ／ｒｎｌの濃度で分化誘導作用を示し、最大１．１０
   ０μ／ｒｎｌのりゾチーム活性を誘導する。 １２）抗菌活性 大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）高感受性株
   及び稲白葉枯病菌（Ｘａｎｔｂｏｍｏｎａｓｏｒｙｚａ
   ｅ）に対し抗菌活性を有する。 ２ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属に
   属するＡＮＳ−１２７Ａ物質生産菌を培養し、その培養
   物からＡＮＳ−１２７Ａ物質を分離、採取することを特
   徴とする新規抗性物質ＡＮＳ−１２７Ａ物質の製造法。 ３ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属に
   属するＡＮＳ−１２７Ａ物質生産菌かストレプトミセス
   ・エスピー・ＡＮＳ−ｉ２７（Ｓｔｒｅ、ｐｔｏｍｙｃ
   ｅｓｓｐ、ＡＮＳ−１２７）である特許請求の範囲第２
   項記載の製造法。