JPS625597B2

JPS625597B2 -

Info

Publication number: JPS625597B2
Application number: JP16323884A
Authority: JP
Inventors: Mitsuyuki Wakunaga; Yasushi Nishimura
Original assignee: Wakunaga Kono KK
Current assignee: Wakunaga Kono KK
Priority date: 1984-08-02
Filing date: 1984-08-02
Publication date: 1987-02-05
Also published as: JPS6140787A

Description

【発明の詳細な説明】

発明の背景技術分野本発明は、ストレプトマイセス属の新種による
キチナーゼの生産に関する。一般に、キチン分解酵素はキチナーゼおよびキ
トビアーゼなどと呼ばれる多様な酵素成分からな
る複合酵素系を指しており、その作用としてはキ
チンを分解してこれをＮ―アセチルグルコサミン
あるいはオリゴ糖にまで糖化することが挙げられ
る。キチンは、下等動物、特に節足動物、に多く含
まれる、アミノ糖に属する多糖類の一種である。
その生合成される量は莫大なものであつて、年間
数十億トンと推定されており、そのようなところ
からキチンは未利用の天然資源として最近脚光を
浴びているものの一つである。キチンは反応性に乏しく、セルロースより更に
安定であるので、これを酵素、すなわちキチナー
ゼ、で分解して低分子化することが考えられる。先行技術キチナーゼはカタツムリの消化液等の中に含ま
れているとともに、糸状菌や細菌によつても生成
することが知られている（たとえば、「化学大辞
典」、第２巻、第745頁（共立出版(株)）。微生物によるものとしては、市販品のカタログ
によれば、ストレプトマイセス・グリセウスおよ
びセラチア・マルセセンスから得られており、ま
た最近の発表によれば、アエロモナス属の菌から
も得られるようである。発明の概要要旨本発明者らは粉末キチンの分解力がすぐれかつ
Ｎ―アセチルグルコサミンへの糖化能力の強いキ
チナーゼ生産菌を広く土壌中から検索した結果、
ストレプトマイセス・sp・WAK―83株が強力な
キチン分解活性とＮ―アセチルグルコサミン生成
能を有するキチナーゼを培地中に産生蓄積する事
実を見出して、本発明を完成するに到つた。従つて、本発明による微生物は、ストレプトマ
イセス属のWAK―83株が属する種の、淡黄色の
ピクニデイウム形成能を有し、キチナーゼ生産能
を有するストレプトマイセス属新種の微生物、で
ある。効果本発明によつて提供されるキチナーゼは、キチ
ン分解活性およびＮ―アセチルグルコサミン生成
能が大きい。従つて、このキチナーゼによればキチンを有利
に分解することができる。発明の具体的説明微生物本発明に関与する微生物は、ストレプトマイセ
ス属のWAK―83株が属する種のものである。この種（Species）の微生物の代表例はストレ
プトマイセス・sp・WAK―83株である。この菌
は、1983年12月に広島県高田群甲田町糘地の土壌
から分離されたものであつて、工業技術院微生物
工業技術研究所に、昭和59年７月13日に「微工研
菌寄第7714号（FERMP―7714）として受託され
ており、またその菌学的性質は以下の通りであ
る。なお、以下において色の記載は、日本色採研
究所の色名帖（新寿堂）によつたものである。形態学的性質本菌株は各種培地上で気菌糸を形成し、菌糸は
分枝する。胞子のうは形成しない。胞子に運動性
はない。気菌糸上に成熟した胞子の色は黄色で、
その胞子鎖は真直ぐからやや曲つている
（Rectus Flexibilisに属する）。胞子は円筒形（２
〜３μ×0.8〜1.2μ）で胞子鎖中に20個ないしそ
れ以上形成される。胞子の表面は平滑である。ま
た、本菌株の著しい特徴は、ベンネツト培地／28
℃／14日間培養でピクニデイウムを作ることであ
る。各種培地上の性状１しよ糖・硝酸塩寒天培地生育：よく胞子形成する。コロニー表面はクリ
ーム色を呈する。裏面は錆赤色。２グリコース・アスパラギン寒天培地生育：非常によく胞子形成する。コロニー表面
は肉色、裏面は鮭色。３グリセリン・アスパラギン寒天培地生育：胞子形成するが、コロニーはあまり広が
らない。淡黄色コロニー、裏面は鮭色。４殿粉・無機塩寒天培地生育：よく胞子形成する。コロニー表面は淡黄
色、裏面は灰桃色。５チロシン・寒天培地生育：胞子形成は少ないが、気菌糸は形成す
る。コロニーはシワ状にはならない。表
面は白色から淡黄色、裏面は鈍赤黄橙色
である。可溶性色素：なし６栄養寒天培地生育：黄色の基生菌糸上に白色の気菌糸が広が
る。胞子形成はあまり良くない。裏面は
黄橙色。７イースト・麦芽寒天培地生育：シワ状に生育し、反り返つた状態とな
る。コロニー表面は肌色から淡黄色、裏
面は鈍赤黄橙色である。８オートミール・寒天培地生育：シワ状には生育しない。コロニー表面は
白色から淡黄色、裏面は淡黄色である。９ペプトン・イースト鉄培地生育：シワ状に生育するが気菌糸をほとんど形
成せず、胞子形成もしない。コロニー表
面は淡橙褐色で裏面も同色である。生理的性質１生育温度範囲：20〜37℃。最適生育温度は28
℃。37℃ではあまり良くない２ゼラチンの液化：陽性３殿粉の加水分解：陽性４ミルクに対する作用：生育しない５メラニン様色素の生成：陰性炭素源の資化性プリドハム・ゴツトリーブ寒天培地に培養して
調べた結果は、下記のとおりである。生育※ Ｌ―アラビノース＋Ｄ―キシロース＋Ｄ―グルコース＋Ｄ―フラクトース＋シユークロース＋ｉ―イノシトール＋Ｌ―ラムノース − ラフイノース − Ｄ―マンニトール＋無添加 − ※ ＋生育する、−生育しない同定以上の諸性質からWAK―83株はストレプトミ
セス属に属するものと考えられ、胞子鎖が直線状
からややカーブし、気菌糸が白色ないし黄色で、
胞子表面が平滑で可溶性色素を産生しないことか
ら、バージーズ・マニユアル・オブ・デイターミ
ネイテイブ・バクテリオロジー第８版（1975年）
の中から検索すると、イエロシリーズの46菌種が
該当する。しかし、46菌種の中には本菌種の著し
い特徴の一つであるピクニデイウムを形成するも
のはなく、従つて本菌は46菌種とは異なる。ピク
ニデイウムを形成する菌種を、バージーズ・マニ
ユアル・オブ・デイターミネイテイブ・バクテリ
オロジー第８版（1975年）、シヤーリング及びゴ
ツトリーブのISP菌株、ならびにワツクスマン著
「ザ、アクチノマイセテス」に記載の既知菌株の
中から検索すると、ストレプトマイセス・シンデ
ネンシス（ISP5255）の１株のみがあげられる。
しかし、ストレプトマイセス・シンデネンシスは
ピンク色のピクニデイウムを形成するがWAK―
83株は淡黄色のピクニデイウムを作ることから、
両者は全く異なる菌種である。これらの結果から、本菌株に該当する既知菌株
は存在せず、本菌株は新菌種であると認められ、
本発明者らはこれをストレプトマイセス・sp・
WAK―83株と命名した。微生物の培養本菌株の培養には、通常の放線菌の培養方法が
用いられる。培養基の炭素源としては種々のもの
が用いられるが、例えばブドウ糖、殿粉、果糖、
グリセリン、マンニトール、などを単独でまたは
組み合せて用いることができる。窒素源として
は、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、硝酸
ナトリウム、大豆粉、酵母エキス、ペプトン、肉
エキス、カザミノ酸などが単独でまたは組み合せ
て用いられる。その他必要に応じて無機塩、例えば食塩、硝酸
塩、炭酸カルシウム、塩化カリウム、塩化コバル
ト、硫酸鉄など、ならびに微量の重金属を添加す
ることができる。更に、菌の発育を助けてキチナ
ーゼの生産を促進する有機物質を適宜に添加する
ことができる。培養方法としては、固体培地上での培養も可能
であるが、一般酵素生産の方法と同様に液体培養
を用いることが好ましい。培養は好気的条件下で
行われ、培養温度は一般に20〜30℃であつて、28
℃付近が好ましい。キチナーゼの生産は、たとえばタンク培養によ
つて行なうことができる。その場合は、２〜４目
間培養を行うとキチナーゼが培養液中に生産蓄積
される。培養液中の生産量が最大に達した時点で
培養を停止し、培養物から目的のキチナーゼを単
離精製する。得られた培養液を遠心分離するか、
過助剤を加えて過すれば、粗酵素液が得られ
る。得られた培養液を遠心分離、濾過等に付して菌
体を分離して得られる培養液は、そのまま粗酵素
液として使用することもできるが、濾液を濃縮し
てアセトン、エタノールなどの有機溶剤を加えて
沈降させるか、硫安などの塩析剤で沈澱させるな
どして、強力な活性を有する粗酵素剤を得ること
ができる。このようにして得られる粗酵素剤は、
公知の方法によつて精製結晶化して精製酵素とす
ることができる。生産される酵素上記のようにして得られる粗酵素剤は、下記の
性質を有する。 (1) 作用および基質特異性粉末キチン、キチンフレーク、コロイダルキチ
ン、エチレングリコールキチン等に作用し、これ
を分解させて、Ｎ―アセチルグルコサミンを生成
する。後記第１表をも参照されたい。 (2) 至適PHおよび安定性 37℃における至適PHは5.5〜6.0である。また、
この酵素はPH3.5〜8.0の範囲で安定である。 (3) 最適作用温度および安定性 PH5.5／３時間反応で至適作用温度は37℃であ
つた。また、30℃以下では24時間以上安定であつ
た。 (4) 精製粗酵素剤中の夾雑物質はキチンカラムによる吸
着クロマトグラフイー、および通常のイオン交換
クロマトグラフイー、バイオゲルによるゲル濾過
等により除くことができ、それによつて高度に精
製された酵素剤を得ることができる。本発明により生産されるキチナーゼはキチン粉
末に対して従来の酵素より一層よく作用する特徴
がある。例えば市販されているシグマ社製キチナ
ーゼは48時間の反応でゆつくり還元糖を生成する
が、本酵素では３時間の反応で同等量の還元糖を
生成することができる。第１表は、本発明により
得られるキチナーゼの種々の基質に対する活性を
示すものである。なお、活性の測定は、エチレン
グリコールキチンについてはツカモト等の方法
（アグリカルチヤ・オブ・バイオロジカル・ケミ
ストリー、第48巻、第931ページ、1984年）に準
じて行い、粉末キチンおよびキチンゲルは１％入
れたものを基質とした。酵素活性は、次に示すよ
うな酵素反応によるＮ―アセチルグルコサミンの
増加を測定する方法（例えば、モルガン・エルソ
ン法など）で測定した。１％粉末キチン（半井化
学製）１mlを基質とし、これに適当濃度の酵素液
１mlを加え、更に0.025Mリン酸―酢酸緩衝液PH
5.5を３ml加え、37℃で３時間反応させた。この
条件で１分間に１μmolのＮ―アセチルグルコサ
ミンを生成する酵素量を１単位とした。

【表】表から明らかなように本発明により生成するキ
チナーゼはエチレングリコールキチンとキチンゲ
ルをよく分解する。実験例実施例ストレプトマイセス・sp・WAK―83株をベン
ネツト培地スラント上で28℃で４日間培養し、
2.5mlの殺菌水をスラントに加えて胞子懸濁液を
作る。その2.5mlを100ml／500ml容のフラスコの
次の組成の培地に接種し、温度28℃で３日間往復
振盪培養した。培地組成酵母エキス 3.0ｇ／リツトルポリペプトン 3.0ｇ／リツトルグリコース 2.0ｇ／リツトルコロイダルキチン 4.0ｇ／リツトルこの培養液を遠心分離して残渣を除去して得ら
れる粗酵素液は、キチン粉末に対して1.12mU／
mlの酵素活性を示した。参考例コロイダルキチンの調製法は、下記の通りであ
る。 100mlの蒸留水に４ｇの粉末キチンを加えたも
のと、別に濃硫酸100mlとを用意し、それぞれ氷
中で３時間あらかじめ冷やしておく。３時間後、
両方をゆつくり混ぜ合わせる。口一斗の中にグラ
スウールをつめたもので過する。過したもの
を180mlの蒸留水に加える。そののち、3000rpm
で遠心し、残渣に蒸留水を加えて再び遠心する。
この操作を繰り返し、洗浄液がPH６になるまで繰
り返す。

【図面の簡単な説明】

第１図は本菌ストレプトマイセス．Sp.WAK
―83の胞子の透過型電子顕微鏡写真、第２図は本
菌によつて作られるピクニデイウムの光学顕微鏡
写真、第３図は本菌の胞子鎖の光学顕微鏡写真で
ある。第４図は生産された酵素の至適PH、第５図
は作用至適温度、第６図は安定温度範囲をそれぞ
れ示したグラフである。

Claims

【特許請求の範囲】１ストレプトマイセス属のWAK―83株が属す
る種の、淡黄色のピクニデイウム形成能を有し、
キチナーゼ生産能を有するストレプトマイセス属
新種の微生物。２微生物がストレプトマイセス・sp・WAK―
83株である、特許請求の範囲第１項記載の微生
物。