JPH047191B2 - - Google Patents

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JPH047191B2
JPH047191B2 JP58137256A JP13725683A JPH047191B2 JP H047191 B2 JPH047191 B2 JP H047191B2 JP 58137256 A JP58137256 A JP 58137256A JP 13725683 A JP13725683 A JP 13725683A JP H047191 B2 JPH047191 B2 JP H047191B2
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SHINNENRYOYU KAIHATSU GIJUTSU KENKYU KUMIAI
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Description

【発明の詳細な説明】
本発明はセルラーゼの製造方法に関する。 本発明の目的は、高価なアビセルやセルロース
パウダーなどの代りに農林業廃棄物を用いて、セ
ルラーゼを安価に製造できる方法を提供すること
にある。本発明により提供される方法は、トリコ
デルマ属に属し、ソルボースによるセルラーゼの
誘導生成能の高いセルラーゼ生産菌株を培地に培
養し、培養物中に、セルラーゼを生成蓄積させ、
これを採取することを特徴とするセルラーゼの製
造方法である。 本明細書においてセルラーゼとは、β−グルカ
ナーゼ(エンド−β−グルカナーゼおよびエキソ
−β−グルカナーゼの両者を含む)およびβ−グ
ルコシダーゼをいう。これらの酵素は、セルロー
スの加水分解に関与する公知の酵素である。 トリコデルマ属に属しかつセルラーゼ生産能を
有する微生物の発酵によつて得られた培養物また
はこれから抽出した酵素製剤をセルロース加水分
解によつて糖液を得るための酵素源とすることは
公知である。また培養物中に蓄積されるセルラー
ゼの活性値および前記の三つの酵素成分の比率の
観点から、トリコデルマ・リーセイに属する微生
物が賞用されている。しかし、この種の菌株を用
いるセルラーゼ酵素源の製造法にはなお改良の余
地がある。たとえば、代表的なセルラーゼ生産菌
株トリコデルマ・リーセイQM 9414(ATCC
26921)を用いた場合にさえも、セルロースの種
類によりセルラーゼ蓄積量が異なり、脱リグニン
されたバガスや稲わらなどの農林業廃棄物を炭素
源として培養した場合、セルラーゼ生産によく使
用されている結晶性の部分の多いセルロースであ
るアビセルやセルロースパウダーなどに比べて、
セルラーゼ蓄積量はかなり低下する。また工業的
にセルラーゼを生産する際にアビセルを炭素源と
すると非常に高価であり、安価な農林業廃棄物を
炭素源としてセルラーゼを生産する方法の開発が
求められている。 本発明者はセルラーゼ生産能の高い突然変異株
を研究した結果、トリコデルマ属に属するセルラ
ーゼ生産菌を変異処理することによつて、ソルボ
ースによるセルラーゼの誘導生成能の高い突然変
異株が見い出された。本発明は、この種の突然変
異株を培養することによつて収率よくセルラーゼ
を得ることができるという知見に基いている。 本発明の方法によると、通常のセルラーゼ生産
菌と同様な培養条件で多量のセルラーゼを蓄積す
ることができるので、セルロース資源から燃料用
エタノールを製造する場合などのセルラーゼのコ
ストを低減させることができる。 以下に、本発明を詳細に説明する。本発明の方
法に用いられる微生物は、トリコデルマ属に属
し、ソルボースによるセルラーゼの誘導生成能の
高いセルラーゼ生産菌株であればよい。この種の
菌株の例は、突然変異株トリコデルマ・リーセイ
PC−1−4(NRRL 15499)、同PC−3−7
(NRRL 15500)、同X−30(NRRL 15501)およ
び同X−31(NRRL 15502)であり、これらは米
国NRRLにブダペスト条約の規定により国際寄
託されている。なおトリコデルマ・リーセイの菌
学的性質はE.G.Simmons、Abst.2nd Intl.Mycel.
Cong.Tampa、Florida、August 1977、page
61Aに記載されている。上記突然変異株は例えば
次の方法で得られる。 セルラーゼ生産能を有しかつトリコデルマ・リ
ーセイに属する微生物を、紫外線照射やニトロソ
グアニジンのような変異誘発剤の使用など、公知
の変異誘導処理し、処理ずみの菌株からL−ソル
ボースによるセルラーゼ誘導能の高い菌株を選
ぶ。このための実用的な手法として、たとえば、
親株として、QM 9414(ATCC 26921)を用い、
ポテトデキストロース寒天斜面培地上で25℃、7
日間培養し、胞子を十分形成させた。生成した胞
子を生理的食塩水に懸濁し(約1〜3×107個/
ml)、N−メチル−N′−ニトロ−N−ニトロソグ
アニジンと反応させた(300γ/ml、PH7.0、30℃、
30〜120分)。この胞子懸濁液から遠心分離により
胞子を集め、よく洗浄し、平板あたり100〜300胞
子/mlになるよう希釈し、第1表に示したソルボ
ース寒天平板に塗布して、30℃で2日間培養し、
生育してきたコロニーの上に50mM酢酸緩衝液PH
5.0を含む0.5%ワルセスセルロース寒天を加え
て、45℃で10〜24時間保温する。ソルボース寒天
平板で培養した場合、セルラーゼを生成している
コロニーのまわりは透明帯が生成するので、これ
によつてセルラーゼ生成能の高まつた突然変異株
を選んだ。 こうして得られた突然変異株と親株との性状の
比較を第1表に示す。
【表】
【表】 次に、酵素活性の測定について説明する。 エンド−β−グルカナーゼの測定は、カルボキ
シメチルセルロース・ナトリウム塩を基質とし生
成する還元糖の量で測定した。すなわち、カルボ
キシメチルセルロース・ナトリウム塩10gをPH5
の0.1M酢酸緩衝液1に溶解する。この溶液
500μに蒸留水450μおよび測定する酵素液を
適当に希釈したもの50μを添加し、45℃で30分
間反応させる。反応液を沸騰水中に10分間放置し
て反応を停止させる。生成した還元糖とソモジ・
ネルソン法により定量する。1分間にグルコース
換算で1μmolの還元糖を生成する酵素活性を1単
位と表示した。エキソ−β−グルカナーゼの測定
にはアビセルSF(旭化成社製)を基質とし生成す
る還元糖の量で測定した。すなわち、0.15gのア
ビセルSFをPH5の0.2M酢酸緩衝液4mlに均一に
懸濁して、測定すべき酵素液を適当に希釈したも
の1mlをこの懸濁液に加え、45℃で60分間反応さ
せる。以下の操作はエンド−β−グルカナーゼの
場合と同様である。 β−グルコシダーゼの測定にはp−ニトロフエ
ニル−β−D−グルコピラノシドを用いる方法で
実施した。すなわち、p−ニトロフエニル−β−
D−グルコピラノシドをPH5の0.05M酢酸緩衝液
に溶解し、2mMの溶液を作る。この溶液1mlに
測定すべき酵素液を適当に希釈したもの20μを
加え、45℃で10分間反応させ、1M炭酸ナトリウ
ム2mlを添加し反応を停止した。生成したp−ニ
トロフエノール量をOD 405nmで比色定量する。
1分間に1μmolのp−ニトロフエノールを生成す
る酵素活性を1単位とした。 本発明に用いられる菌株の培養法は、公知のト
リコデルマ・リーセイに属する菌株の培養法と同
様である。培地は炭素源、窒素源のほか所望によ
り無機塩類その他の栄養物を含有する天然培地ま
たは合成培地を用いる。炭素源としては、ろ紙、
紙類、バガス、もみがら、稲わら、大豆粕、木材
などの植物繊維質およびその含有物を用いること
ができる。シユークロース、グルコース、ケーン
モラセス、グリセロース、セロビオースなどセル
ラーゼ生産力価の低下を生じない濃度の糖源を上
記炭素源と併用することもできる。窒素源として
は、硫安などの無機アンモニウム塩および尿素、
アミノ酸、肉エキス、ペプトンなどの有機窒素源
が使用できる。無機塩類としてはKH2PO4
MgSO4、CaCl、CuCl2、FeSO4、MnSO4
ZnSO4などが用いられる。セルラーゼ活性は温度
が20℃〜32℃の範囲で、菌体が良く生育できる通
気条件ならば通常4日〜10日で最大となる。 培養終了後、培養物またはそれから調製された
酵素製剤をセルロース加水分解等に、公知の手法
で使用することができる。 下記の実施例において用いた培地の組成は、第
2表の通りである。
【表】
【表】 以下に実施例を示す。 実施例 1 トリコデルマ・リーセイQM 9414、PC−1−
4、PC−3−7、X−30およびX−31の5株を
ポテトデキストロース寒天培地上で25℃、7日間
培養する。生成した胞子を第2表に示した培地組
成のうち、アビセルPH301(旭化成社製)のかわり
にグルコース3gを加えた培地の接種し、28℃、
2日間振盪培養した。培養液から集めた菌体をよ
く洗浄し、以下の組成を持つ培地に加え、28℃、
21時間振盪培養を行い、セルラーゼの誘導生成を
試みた。
【表】 その結果を第3表に示す。
【表】
【表】 表から明らかなように、親株QM 9414もソル
ボースによりセルラーゼの誘導を受けるが、PC
−1−4、PC−3−7、X−30およびX−31の
4株はいずれもQM 9414に比べてセルラーゼの
誘導能が20倍以上高まつていた。表には、エンド
−β−グルカナーゼしか示さなかつたが、すべて
の菌株がエキソ−β−グルカナーゼ、およびβ−
グルコシダーゼも収率よく産生した。 実施例 2 実施例1と同様にして調製した胞子を、第2表
に示した培地、およびアビセルのかわりにバガス
(アルカリ処理により脱リグニンしたもの)を用
いた培地50ml(300ml三角フラスコ)に接種し、
28℃、7日間振盪培養した。その結果を第4表に
示す。
【表】 表から明らかなように、QM 9414以外の4株
はパガスを炭素源にした場合にQM 9414の、2.6
〜3.1倍のセルラーゼを蓄積しており、アビセル
を炭素源にした場合に比べてQM 9414は約4割
の生産性しか示さないのに対し、他の4株は炭素
源のちがいに拘らず、ほぼ同程度のセルラーゼを
蓄積した。表にはエンド−β−グルカナーゼしか
示さなかつたが、エキソ−β−グルカナーゼも同
程度に生産されていた。 実施例 3 実施例1と同様にして調製したQM 9414、PC
−3−7およびX−31の胞子を、第2表に示した
培地組成のアビセルのかわりに稲わら(アルカリ
処理により脱リグニンしたもの)を添加した培地
に植培し、実施例3と同様に培養した。その結果
を第5表に示す。
【表】 表から明らかなように、PC−3−7およびX
−31の2株はQM 9414の2倍以上のセルラーゼ
を生産し、バガスと同傾向を示した。 実施例 4 実施例1と同様に調製したQM 9414およびPC
−3−7の胞子を第2表に示した培地組成のう
ち、1%アビセルのかわりに3%のバガスを、
0.14%の硫安を0.42%、および50mM酒石酸緩衝
液を100mMにかえた培地に植菌し、実施例3と
同様に培養した。その結果を第6表に示す。
【表】 表から明らかなように、PC−3−7はQM
9414の3倍以上のセルラーゼを生産し、高濃度バ
ガスを炭素源にしてセルラーゼを多量蓄積した。

Claims (1)

    【特許請求の範囲】
  1. 1 トリコデルマ属に属し、かつソルボース1
    g/を含有する培地を用い28℃で21時間培養し
    たときに、ソルボースによるセルラーゼの誘導生
    成能が親株に比らべて20倍以上高められたセルラ
    ーゼ生成能をもつ微生物を培地に培養し、培養物
    中にセルラーゼを生成蓄積させ、これを採取する
    ことを特徴とするセルラーゼの製造方法。
JP58137256A 1983-07-27 1983-07-27 セルラ−ゼの製造方法 Granted JPS6027384A (ja)

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CA000459671A CA1230068A (en) 1983-07-27 1984-07-25 Process for the preparation of cellulase
US06/634,940 US4634670A (en) 1983-07-27 1984-07-27 Process for the preparation of cellulase
DE8484305116T DE3478470D1 (en) 1983-07-27 1984-07-27 Process for the preparation of cellulase
EP84305116A EP0133035B1 (en) 1983-07-27 1984-07-27 Process for the preparation of cellulase

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CA1230068A (en) 1987-12-08
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