JPS5917984A - セルラ−ゼの製造方法 - Google Patents
セルラ−ゼの製造方法Info
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- JPS5917984A JPS5917984A JP12723882A JP12723882A JPS5917984A JP S5917984 A JPS5917984 A JP S5917984A JP 12723882 A JP12723882 A JP 12723882A JP 12723882 A JP12723882 A JP 12723882A JP S5917984 A JPS5917984 A JP S5917984A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
微生物の発酵によるセルラーゼの製造方法に関する。
セルロースを酵素的に加水分解し、主とじてヘキソース
からなる糖を生成させる方法は、たとえば燃料用エタノ
ールの製造等に工業的に利用されている。この種の加水
分解に多数の酵素が関与することが知られているが、そ
の代表的。
からなる糖を生成させる方法は、たとえば燃料用エタノ
ールの製造等に工業的に利用されている。この種の加水
分解に多数の酵素が関与することが知られているが、そ
の代表的。
な酵素には、β−グルカナーゼ（エンド−β−グルカナ
ーゼおよびエキソ−β−グルカナーゼの両者を含む）お
よびβ−グルコシダーゼがある。この明細書で杜、これ
らの三つの酵素を総称してセルラーゼという。
ーゼおよびエキソ−β−グルカナーゼの両者を含む）お
よびβ−グルコシダーゼがある。この明細書で杜、これ
らの三つの酵素を総称してセルラーゼという。
トリコデルマ属に属しかつセルラーゼ生産能を有する微
生物の発酵によって得られた培養物またはこれから抽出
した酵素製剤をセルロース加水分解のための酵素源とす
ることも公知であって、培養物中に蓄積されるセルラー
ゼの活性。
生物の発酵によって得られた培養物またはこれから抽出
した酵素製剤をセルロース加水分解のための酵素源とす
ることも公知であって、培養物中に蓄積されるセルラー
ゼの活性。
値および前記の三つの酵素成分の比率の観点からトリコ
デルマ・リーセイに属する微生物が賞月されている。し
かし、公知のこの種の菌株を用いるセルラーゼ酵素源の
製造法にはなお改良の余地がある。たとえば、代表的な
セルラーゼ生産菌株トリコデルマ・リーセイＱＭ９４１
４（ＡＴＣＣ２６９２１）を用いた場合にさえも、培養
物に蓄積される三つの酵素成分のなかで、β−グルコシ
ダーゼの活性が比５較的低いので、これを補なうために
、たとえばアスペルギルス・ホエニクスの発酵によって
得られた別のβ−グルコシダーゼをＱＭ９４１４株の発
酵によって得られた酵素源に添加することが提案されて
いるが、この方法は複雑で費用がかかる。
デルマ・リーセイに属する微生物が賞月されている。し
かし、公知のこの種の菌株を用いるセルラーゼ酵素源の
製造法にはなお改良の余地がある。たとえば、代表的な
セルラーゼ生産菌株トリコデルマ・リーセイＱＭ９４１
４（ＡＴＣＣ２６９２１）を用いた場合にさえも、培養
物に蓄積される三つの酵素成分のなかで、β−グルコシ
ダーゼの活性が比５較的低いので、これを補なうために
、たとえばアスペルギルス・ホエニクスの発酵によって
得られた別のβ−グルコシダーゼをＱＭ９４１４株の発
酵によって得られた酵素源に添加することが提案されて
いるが、この方法は複雑で費用がかかる。
公知のトリコデルマ・リーセイに属する微生物の発酵に
よって蓄積されるβ−グルコシダーゼ活性の低い原因と
して、一方では、β−グルカナーゼの生産至適ｐＨが３
〜１５であるのに対して、他方ではβ−グルコシダーゼ
の生産至適ｐＨが４〜４．５であシ、しかも培養液のｐ
Ｈが５．５以下になると、後者は失活することがあげら
れる。しかし、酸性条件に強いβ−グルコシダーゼ生産
能を有するセルラーゼ生産菌やβ−グルカナーゼ生産至
適ｐＨが３．５以上であるセルラーゼ生産菌はまだ知ら
れていない。
よって蓄積されるβ−グルコシダーゼ活性の低い原因と
して、一方では、β−グルカナーゼの生産至適ｐＨが３
〜１５であるのに対して、他方ではβ−グルコシダーゼ
の生産至適ｐＨが４〜４．５であシ、しかも培養液のｐ
Ｈが５．５以下になると、後者は失活することがあげら
れる。しかし、酸性条件に強いβ−グルコシダーゼ生産
能を有するセルラーゼ生産菌やβ−グルカナーゼ生産至
適ｐＨが３．５以上であるセルラーゼ生産菌はまだ知ら
れていない。
本発明は、本発明者が公知のトリコデルマ・リーセイに
属する変異株から変異誘導処理によって作出しまた変異
株が、培養液のｐＨ！＋、５以上で著量のセルラーゼを
蓄積することができ、セルラーゼ中のβ−グルコシダー
ゼ活性値が高い比率を示すという知見に基いている。
属する変異株から変異誘導処理によって作出しまた変異
株が、培養液のｐＨ！＋、５以上で著量のセルラーゼを
蓄積することができ、セルラーゼ中のβ−グルコシダー
ゼ活性値が高い比率を示すという知見に基いている。
本発明の目的は、培養物中に多量のセルラーゼを蓄積す
ることができ、しかもセルラーゼ中のβ−グルコシダー
ゼの比率の高い、この種のセルラーゼの製造方法を提供
することにある。
ることができ、しかもセルラーゼ中のβ−グルコシダー
ゼの比率の高い、この種のセルラーゼの製造方法を提供
することにある。
本発明は、トリコデルマ・リーセイに属する微生物の発
酵によるセルラーゼの製造方法に関し、セルラーゼ生産
至適ｐ）（が五５以上である菌株を用いることを特徴と
する。
酵によるセルラーゼの製造方法に関し、セルラーゼ生産
至適ｐ）（が五５以上である菌株を用いることを特徴と
する。
本発明の方法によると、通常のセルラーゼ生産菌の発酵
と同様の培養条件で、培養物中にセルラーゼを蓄積する
ことができ、培養液のｐＨが３５以上であっても、セル
ラーゼとくにβ−グルカナーゼの比率は低下しない。ま
たある種の公知菌から得られた培養物の場合のように、
セルロース加水分解の酵素源として用いる際に、β−グ
ルコシダーゼを補なうために、別の酵素源を添加する必
要もない。
と同様の培養条件で、培養物中にセルラーゼを蓄積する
ことができ、培養液のｐＨが３５以上であっても、セル
ラーゼとくにβ−グルカナーゼの比率は低下しない。ま
たある種の公知菌から得られた培養物の場合のように、
セルロース加水分解の酵素源として用いる際に、β−グ
ルコシダーゼを補なうために、別の酵素源を添加する必
要もない。
本発明を次に詳しく説明する。
本明細書において、セルラーゼの生産至適ｐＨが５．５
以上であるというのは、培養物中に蓄積されるセルラー
ゼ（上記の三つの酵素成分の総称）の活性値がｐＨｓ、
５以上で最大になることを意味する。前述のように、公
知のトリコデルマ畢リーセイに属するセルラーゼ生産菌
の発酵では、β−グルカナーゼおよびβ−グルコシダー
ゼの生産至適ｐＩ（は、それぞれ３〜５．５および４〜
４．５であるが、これに対して、本発明の方法に用いら
れるセルラーゼ生産菌の、対応する生産至適ｐＨはそれ
ぞれ３．５〜４．５および４〜６．０であることが認め
られる。従って、β−グルコシダーゼの失活を避けるこ
とができるので、その比率を増大することができ、全体
としてのセルラーゼの活性値も増大する。
以上であるというのは、培養物中に蓄積されるセルラー
ゼ（上記の三つの酵素成分の総称）の活性値がｐＨｓ、
５以上で最大になることを意味する。前述のように、公
知のトリコデルマ畢リーセイに属するセルラーゼ生産菌
の発酵では、β−グルカナーゼおよびβ−グルコシダー
ゼの生産至適ｐＩ（は、それぞれ３〜５．５および４〜
４．５であるが、これに対して、本発明の方法に用いら
れるセルラーゼ生産菌の、対応する生産至適ｐＨはそれ
ぞれ３．５〜４．５および４〜６．０であることが認め
られる。従って、β−グルコシダーゼの失活を避けるこ
とができるので、その比率を増大することができ、全体
としてのセルラーゼの活性値も増大する。
とはできない。実施例において用いた菌株は、本発明者
が、公知のトリコデルマ・リーセイに属する変異株から
人工的変異誘導処理によって作出したものであるが、そ
の他の自然的または人工的に誘導された変異株も、本発
明の目的に利用することができる。
が、公知のトリコデルマ・リーセイに属する変異株から
人工的変異誘導処理によって作出したものであるが、そ
の他の自然的または人工的に誘導された変異株も、本発
明の目的に利用することができる。
本発明の目的に利用される変異株を、たとえば次の方法
によって作出することができる。セルラーゼ生産能を有
しかつトリコデルマ・リーセイに属する適宜の変異株を
、紫外線照射やニトロソグアニジンのような変異誘発剤
の使用など、それ自体公知の変異誘導処理（〜、処理ず
みの菌株からセルラーゼ生産活性の大きい菌株を選ぶ。
によって作出することができる。セルラーゼ生産能を有
しかつトリコデルマ・リーセイに属する適宜の変異株を
、紫外線照射やニトロソグアニジンのような変異誘発剤
の使用など、それ自体公知の変異誘導処理（〜、処理ず
みの菌株からセルラーゼ生産活性の大きい菌株を選ぶ。
このための実用的な手法として、たとえば、ワルセスセ
ルロース（リン酸塩膨潤セルロース）寒天平板培地（ｐ
Ｈ５，５、温度３０℃、７２時間）で菌株を培養した時
に得られるクリヤゾーンの大きい菌株を選んで分離し、
純粋培養する。所望により、変異誘導、選別、分離をく
シ返すこともできる。このようにして得られ９写Ｍ い
Ｏイルし／−ヒー） た菌株を、各種培地上で継代培養しても逆変異へ および他の変異株の出現を認めなかった。これ・らの菌
株の性状安定性、とくにクリヤゾーンの大きさ、コロニ
ーの性状、胞子形成能、色素生産性の安定性の観点から
、変異株であることを確認した。
ルロース（リン酸塩膨潤セルロース）寒天平板培地（ｐ
Ｈ５，５、温度３０℃、７２時間）で菌株を培養した時
に得られるクリヤゾーンの大きい菌株を選んで分離し、
純粋培養する。所望により、変異誘導、選別、分離をく
シ返すこともできる。このようにして得られ９写Ｍ い
Ｏイルし／−ヒー） た菌株を、各種培地上で継代培養しても逆変異へ および他の変異株の出現を認めなかった。これ・らの菌
株の性状安定性、とくにクリヤゾーンの大きさ、コロニ
ーの性状、胞子形成能、色素生産性の安定性の観点から
、変異株であることを確認した。
こうして得られた変異株をそれぞれトリコデルマ・リー
セイに−１４、Ｊ−３７およびＨ−３（微工研菌寄第乙
乙−ｙｌＺ号、第 Ｚ７り、Ｊ＞Ｌ号および第 ６４９
号）と命名した。
セイに−１４、Ｊ−３７およびＨ−３（微工研菌寄第乙
乙−ｙｌＺ号、第 Ｚ７り、Ｊ＞Ｌ号および第 ６４９
号）と命名した。
これらの変異株と親株との性状の比較は表１の通シであ
る。
る。
秦ワルセスセルロース寒天平板培地の組成は次の辿っで
ある。
ある。
ＦｅＳＯ４＊７Ｈ２０１Ｗ
ＣａＣ１２・２Ｈ２０１４
本発明の目的に利用式れる菌株の培養法は、ｐＨ条件以
外は、公知のトリコデルマ・リーセイに域する菌株の培
養法と同様である。すなわち培地は天然培地でも合成培
地でもよく、炭素源、窒素源のを１か所望により無機塩
類その他の栄養物を含有していてもよい。炭素源として
は、ろ紙、−紋紙類、バガス、もみがら、稲わら、大豆
粕などの植物繊維質およびその含有物を用いることがで
き、シュークロス、グルコース。
外は、公知のトリコデルマ・リーセイに域する菌株の培
養法と同様である。すなわち培地は天然培地でも合成培
地でもよく、炭素源、窒素源のを１か所望により無機塩
類その他の栄養物を含有していてもよい。炭素源として
は、ろ紙、−紋紙類、バガス、もみがら、稲わら、大豆
粕などの植物繊維質およびその含有物を用いることがで
き、シュークロス、グルコース。
ケーンモラセス、グリセロール、セロビオースなどセル
ラーゼ生産力価の低下につながらない濃度の糖源ならば
上記炭素源との併用も可能である。窒素源としては、硫
安などの無機アンモニウム塩および尿素、アミノ酸、肉
エキス、ペプトンなどの有機窒素源が使用できる。その
他ＫＨ２ＰＯ４，Ｍｇ８０４． Ｃａ Ｃ１２、Ｃｏｃ
１２ 、 Ｉｉ’ｅＳＯ４、ＭｎＳＯ４、ＺｎＳＯ４
などの無機塩類を含有する栄養培地（ｐＨ３〜６．５）
で行われる。温度は２０℃〜６２℃の範囲でよく、菌体
が良く生育できる通気条件ならば通常４日〜１０日でセ
ルラーゼ活性は最大となる。
ラーゼ生産力価の低下につながらない濃度の糖源ならば
上記炭素源との併用も可能である。窒素源としては、硫
安などの無機アンモニウム塩および尿素、アミノ酸、肉
エキス、ペプトンなどの有機窒素源が使用できる。その
他ＫＨ２ＰＯ４，Ｍｇ８０４． Ｃａ Ｃ１２、Ｃｏｃ
１２ 、 Ｉｉ’ｅＳＯ４、ＭｎＳＯ４、ＺｎＳＯ４
などの無機塩類を含有する栄養培地（ｐＨ３〜６．５）
で行われる。温度は２０℃〜６２℃の範囲でよく、菌体
が良く生育できる通気条件ならば通常４日〜１０日でセ
ルラーゼ活性は最大となる。
培養終了後、培養物またはそれから自製された酵素製剤
をセルロース加水分解等に、それ自体公知の手法で使用
することができる。
をセルロース加水分解等に、それ自体公知の手法で使用
することができる。
下記の実施例および試験例において用いた培地囚の組成
は表２の通りである。
は表２の通りである。
表２ トリコデルマ・リーセイの培地組成セルラーゼ酵
素活性の測定法は試験例１記載の通υである。
素活性の測定法は試験例１記載の通υである。
実施例１
トリコデルマ・リーセイＱ Ｍ ９４１４ （ＡＴＣＣ
２６９２１）をポテトデキストロース寒天斜面培地（ｐ
Ｈ５，５，８ｍ）で２５℃、７日間培養し、着生した胞
子を−かきとシ、胞子濃度が約１０７個／ｄになるよう
に生理的食塩水に浮遊させ、紫外線照射（東芝殺菌ラン
プＧＬ−１５、距離３５３．４０分間）後、残りの生菌
を表１に示したワルセスセルロース寒天平板培地で５０
℃、５日間培養し、黄色色素生産能が低く、セルラーゼ
生産能の高いコロニーを選ぶ。所望により以上の手法を
くシ返してもよい。こうし−ＣＩＡばれたコロニーを用
いて、ワルセスセルロース含有寒天斜面培地で１０代以
上継代し、他の変異株の出現や、黄色色素生産能の欠失
およびセルラーゼ生産能その他の諸性状が安定であるも
のを選んで純粋培養した。
２６９２１）をポテトデキストロース寒天斜面培地（ｐ
Ｈ５，５，８ｍ）で２５℃、７日間培養し、着生した胞
子を−かきとシ、胞子濃度が約１０７個／ｄになるよう
に生理的食塩水に浮遊させ、紫外線照射（東芝殺菌ラン
プＧＬ−１５、距離３５３．４０分間）後、残りの生菌
を表１に示したワルセスセルロース寒天平板培地で５０
℃、５日間培養し、黄色色素生産能が低く、セルラーゼ
生産能の高いコロニーを選ぶ。所望により以上の手法を
くシ返してもよい。こうし−ＣＩＡばれたコロニーを用
いて、ワルセスセルロース含有寒天斜面培地で１０代以
上継代し、他の変異株の出現や、黄色色素生産能の欠失
およびセルラーゼ生産能その他の諸性状が安定であるも
のを選んで純粋培養した。
実施例２
トリコデルマ・リーセイＱＭ９４１４（ＡＴＣＣ２６９
２１） 、 Ｋ −１ａ （Ｆ Ｅ ＲＭ−ｐ４
乙ｅ／）、Ｊ−５７（ＦＩＲＭ−Ｐ 乙６Ｊ工 ）、Ｈ
−５＜ ＦｍｕＭ−ｐ ｌｙ乙ノ９ ）の４株をポテト
デキストロース寒天培地上で２５℃、７日間培養する。
２１） 、 Ｋ −１ａ （Ｆ Ｅ ＲＭ−ｐ４
乙ｅ／）、Ｊ−５７（ＦＩＲＭ−Ｐ 乙６Ｊ工 ）、Ｈ
−５＜ ＦｍｕＭ−ｐ ｌｙ乙ノ９ ）の４株をポテト
デキストロース寒天培地上で２５℃、７日間培養する。
生成した胞子を表２に示した培地およびこれに０．０１
〜０．０６チのＣａｃｏｓを添加した培地５ｏｄ（？１
００−容三角フラスコ）に接種し、２８℃、７日間振盪
培誉した。その結果を表３に示した。
〜０．０６チのＣａｃｏｓを添加した培地５ｏｄ（？１
００−容三角フラスコ）に接種し、２８℃、７日間振盪
培誉した。その結果を表３に示した。
表３ 各種菌株のセル−ラーゼ生成量
表から明らかなように、Ｋ−１４、Ｊ−３７、Ｈ−５の
３株はＣａＣ０１無添加の場合においてもβ−グルカナ
ーゼ活性はＱＭ９４１４よシも高く、セルラーゼ蓄積量
の増大した変異株であることがわか夛、ＣａＣ０１を添
加し培養終了ｐＨを詞整すると更にセルラーゼ蓄ｆ＊量
が増大し、エンド−β−グルカナーゼで２１〜２６ Ｕ
／ ｍｅ、エキソ−β−グルカナーゼで１．５〜２．
ＩＵ／ｄとなった。一方β−グルコシダーゼがｐＨ５，
６でＱＭ９４１４の０．５４ Ｕ ／−であったのに対
し、０．６２〜ｔ５Ｕ／−と増大し、ＱＭ９４１４では
三成分の比率が揃いしかもβ−グルカナーゼ活性の高い
セルラーゼが得られないのに対１−１他の四株ではＣａ
ＣＯ３を添加することによシ三成分の比率が向上し、し
かもＱＭ９４１４よりもすべて活性が増大したものを得
ることが可能であった。
３株はＣａＣ０１無添加の場合においてもβ−グルカナ
ーゼ活性はＱＭ９４１４よシも高く、セルラーゼ蓄積量
の増大した変異株であることがわか夛、ＣａＣ０１を添
加し培養終了ｐＨを詞整すると更にセルラーゼ蓄ｆ＊量
が増大し、エンド−β−グルカナーゼで２１〜２６ Ｕ
／ ｍｅ、エキソ−β−グルカナーゼで１．５〜２．
ＩＵ／ｄとなった。一方β−グルコシダーゼがｐＨ５，
６でＱＭ９４１４の０．５４ Ｕ ／−であったのに対
し、０．６２〜ｔ５Ｕ／−と増大し、ＱＭ９４１４では
三成分の比率が揃いしかもβ−グルカナーゼ活性の高い
セルラーゼが得られないのに対１−１他の四株ではＣａ
ＣＯ３を添加することによシ三成分の比率が向上し、し
かもＱＭ９４１４よりもすべて活性が増大したものを得
ることが可能であった。
実施例３
トリコデルマ・リーセイＱＭ９４１４および実施例１に
用いた四株を表２の組成で４日間実施例１と同様に培養
した培養液５０−を同じ組成の培地４５０ｍｇ（２を容
三角フラスコ）に接種し、２８℃で振盪培養した。４目
抜アビセルｐＨ５０１を６０ ｆ／を以外は表２と同じ
組成の培地２．５１（５１ジヤーフアメンター）に接種
し２８℃で通気ｊｔ ０．８ ｖｖｍ 、攪拌数４５
Ｏｒｐｍで培養した。培地のｐＨｔｉ約６〜１２時間に
ｐＨ４，０以下に低下するので、１５ＮＮＨ４０Ｈで２
日間ｐＨ４，０に制御し、その後はｐＨ５，０または４
．０に制御した。７日間培養した結果を表４に示した。
用いた四株を表２の組成で４日間実施例１と同様に培養
した培養液５０−を同じ組成の培地４５０ｍｇ（２を容
三角フラスコ）に接種し、２８℃で振盪培養した。４目
抜アビセルｐＨ５０１を６０ ｆ／を以外は表２と同じ
組成の培地２．５１（５１ジヤーフアメンター）に接種
し２８℃で通気ｊｔ ０．８ ｖｖｍ 、攪拌数４５
Ｏｒｐｍで培養した。培地のｐＨｔｉ約６〜１２時間に
ｐＨ４，０以下に低下するので、１５ＮＮＨ４０Ｈで２
日間ｐＨ４，０に制御し、その後はｐＨ５，０または４
．０に制御した。７日間培養した結果を表４に示した。
表４ 各種菌株のセルラーゼ蓄積量
表から明らかなように、ＱＭ９４１４株を使用した場合
は、β−グルカナーゼおよびβ−グルコシダーゼの三成
分の比率のよいものは得られないが、一方に−１４、Ｊ
−３７お“よびＨ−３の５１Ｉ株を使用した場合は、培
養液のｐＨを五〇で制御するよりもｐＨ４，０で制御す
る方がいずれの活性も高くな）、β−グルコシダーゼの
比率もＱＭ９４１４株より向上した。
は、β−グルカナーゼおよびβ−グルコシダーゼの三成
分の比率のよいものは得られないが、一方に−１４、Ｊ
−３７お“よびＨ−３の５１Ｉ株を使用した場合は、培
養液のｐＨを五〇で制御するよりもｐＨ４，０で制御す
る方がいずれの活性も高くな）、β−グルコシダーゼの
比率もＱＭ９４１４株より向上した。
試験例１
酵素活性の測定 エンド−β−グルカナーゼの測定は、
カルボキシメチルセルロース拳ナトリウム塩を基質とし
生成する還元糖の量で測定した。すなわち、カルボキシ
メチルセルロース・ナトリウム塩１０ｆをｐＨ５の０．
１ Ｍ酢酸緩衝液１ｔに溶解する。この溶液ＳＯＯμｔ
に蒸留水４５０μｔおよび測定する酵素液を適当に希釈
した４の５０μｔを添加し、４５℃で３０分間反応させ
る。反応液を沸騰水中に１０分間放置して反応を停止さ
せる。生成した還元糖をソモジ・ネルフン法により定量
する。１分間にグルコース換算で１μｍｏｌ の還元糖
を生成する酵素活性を１単位と表示した。エキソ−β−
グルカナーゼの測定にはアビセルＳＦを基質とし生成す
る還元糖の量で測定し九。すなわち、。
カルボキシメチルセルロース拳ナトリウム塩を基質とし
生成する還元糖の量で測定した。すなわち、カルボキシ
メチルセルロース・ナトリウム塩１０ｆをｐＨ５の０．
１ Ｍ酢酸緩衝液１ｔに溶解する。この溶液ＳＯＯμｔ
に蒸留水４５０μｔおよび測定する酵素液を適当に希釈
した４の５０μｔを添加し、４５℃で３０分間反応させ
る。反応液を沸騰水中に１０分間放置して反応を停止さ
せる。生成した還元糖をソモジ・ネルフン法により定量
する。１分間にグルコース換算で１μｍｏｌ の還元糖
を生成する酵素活性を１単位と表示した。エキソ−β−
グルカナーゼの測定にはアビセルＳＦを基質とし生成す
る還元糖の量で測定し九。すなわち、。
０．１５Ｆのアビセル８Ｆｆ：ｐＨ５の０．２Ｍ酢酸緩
衝液４−に均一に懸濁して、この懸濁液に測定すべき酵
素液を適当に希釈したもの１−を加え、４５℃で６０分
間反応させる。以下の操作はエンド−β−グルカナーゼ
の場合と同様である。
衝液４−に均一に懸濁して、この懸濁液に測定すべき酵
素液を適当に希釈したもの１−を加え、４５℃で６０分
間反応させる。以下の操作はエンド−β−グルカナーゼ
の場合と同様である。
β−グルコシダーゼの測定にはｐ−ニトロフェニル−β
−Ｄ−グルコピラノシドを用いる方法で実施した。すな
わち、ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−グルコピラノシド
をｐＨ５の０．０５Ｍ酢酸緩衝液に溶解し、２ｆｉＭの
溶液を作る。
−Ｄ−グルコピラノシドを用いる方法で実施した。すな
わち、ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−グルコピラノシド
をｐＨ５の０．０５Ｍ酢酸緩衝液に溶解し、２ｆｉＭの
溶液を作る。
この溶液１−に測定すべき酵素液管適当に希釈したもの
２０μｔを加え、４５℃で１０分間反応し、１Ｍ炭酸ナ
トリウム２μＬを添加し反応を停止した。生成したｐ−
ニトロフェノール量をＯＤ４０５ｎｍで比色定量する。
２０μｔを加え、４５℃で１０分間反応し、１Ｍ炭酸ナ
トリウム２μＬを添加し反応を停止した。生成したｐ−
ニトロフェノール量をＯＤ４０５ｎｍで比色定量する。
１分間に１μｍｏｌのｐ−二トロフェノールを生成する
酵素活性を１単位とした。
酵素活性を１単位とした。
試験例２
（１） 代表的なセルラーゼ生産菌であるトリコデル
マ・リーセイＱＭ９４１４（Ａ’ｌ’ＣＣ２６９２１）
は表２に示し九培地組成で５０ｒｔｒｌ／ ５００ｍ容
三角フラスコにて７日間培養した場合、４〜５日でｐＨ
２，６〜五〇に低下する。この時β−グルカナーゼは生
産最適ｐＨがこの付近にあるため活性は高いが、β−グ
ルコシダーゼの活性は極端に低い。これを改善する丸め
８ｔｅｍｂｅｒｇ が報告（Ａｐｐｌ、 ｇｎｖｉｒ
ｏｗ、）４１ｃｒｏｂｉｏｌ。
マ・リーセイＱＭ９４１４（Ａ’ｌ’ＣＣ２６９２１）
は表２に示し九培地組成で５０ｒｔｒｌ／ ５００ｍ容
三角フラスコにて７日間培養した場合、４〜５日でｐＨ
２，６〜五〇に低下する。この時β−グルカナーゼは生
産最適ｐＨがこの付近にあるため活性は高いが、β−グ
ルコシダーゼの活性は極端に低い。これを改善する丸め
８ｔｅｍｂｅｒｇ が報告（Ａｐｐｌ、 ｇｎｖｉｒ
ｏｗ、）４１ｃｒｏｂｉｏｌ。
３１、６４８（１９７６） ） しているように、クエ
ン酸緩衝液（クエン酸とクエン酸三ソーブで調製ｐＨ５
，４）を添加しｐＨを３．５以上に制御すルト、β−グ
ルコシダーゼの活性は上昇するものの、β−グルカナー
ゼの活性は低下する。
ン酸緩衝液（クエン酸とクエン酸三ソーブで調製ｐＨ５
，４）を添加しｐＨを３．５以上に制御すルト、β−グ
ルコシダーゼの活性は上昇するものの、β−グルカナー
ゼの活性は低下する。
（２）本発明の実施例２に記載されたトリコデルマ・リ
ーセイＫ −１４＜ ＦＥＲＭ ｐ−ＡＩＪ／ ）を
、同じ培地で同じ条件で培養した結果、ＱＭ９４１４株
の場合にくらべて、β−グルカナーゼ活性は高くなるが
、しかしｐ）Ｉが低いのて、β−グルコシダーゼ活性は
改良されない。しかし上記培地に培養前に０．０２〜０
・２チのＣａＣＯ３を添加することによジ、培養中のｐ
Ｈを５．５〜５．０に保つと、β−グルカナーゼおよび
β−グルコシダーゼの三成分ともに、ＱＭ９４１４株の
場合よりも、高い活性値が得られる。
ーセイＫ −１４＜ ＦＥＲＭ ｐ−ＡＩＪ／ ）を
、同じ培地で同じ条件で培養した結果、ＱＭ９４１４株
の場合にくらべて、β−グルカナーゼ活性は高くなるが
、しかしｐ）Ｉが低いのて、β−グルコシダーゼ活性は
改良されない。しかし上記培地に培養前に０．０２〜０
・２チのＣａＣＯ３を添加することによジ、培養中のｐ
Ｈを５．５〜５．０に保つと、β−グルカナーゼおよび
β−グルコシダーゼの三成分ともに、ＱＭ９４１４株の
場合よりも、高い活性値が得られる。
（３）ＱＭ９４１４株の場合１ｊｃａｃＯ３の添加によ
ってβ−グルカナーゼ活性の低下を防ぐこと蝶困難であ
る。即ち０．０２ ％のｅｓｃ０３ ′ｔ−添加して培
養してもｐＨが５以上に上昇しβ−グルコシダーゼ活性
は上昇するが、β−グルカナーゼは低下してしまう。こ
れはＱＭ９４１４と上記変異株とでは酸の生成の程度が
異なるあるいは生成した酸の資化性の程度が異なること
による。
ってβ−グルカナーゼ活性の低下を防ぐこと蝶困難であ
る。即ち０．０２ ％のｅｓｃ０３ ′ｔ−添加して培
養してもｐＨが５以上に上昇しβ−グルコシダーゼ活性
は上昇するが、β−グルカナーゼは低下してしまう。こ
れはＱＭ９４１４と上記変異株とでは酸の生成の程度が
異なるあるいは生成した酸の資化性の程度が異なること
による。
（４）Ｑ）Ｊ４牛１４株を用いて、表２の組成で５００
ｍ／２Ｌ容三角フラスコで４日間振盪培養した培養液を
種培養として、表２の組成のアビセルを１チかも６％に
変えた培地に移し、”５ｔ１５１容ジヤーフアーメンタ
ーヲ用いて培養し、温度（２８℃）、通気量（１ｖｖｍ
）、およびｐＨ（３〜４５）を連続的に制御（ｐＨ制
御は０．５Ｎ〜２ Ｎ ＮＨ，ＯＨを用いる）した。
ｍ／２Ｌ容三角フラスコで４日間振盪培養した培養液を
種培養として、表２の組成のアビセルを１チかも６％に
変えた培地に移し、”５ｔ１５１容ジヤーフアーメンタ
ーヲ用いて培養し、温度（２８℃）、通気量（１ｖｖｍ
）、およびｐＨ（３〜４５）を連続的に制御（ｐＨ制
御は０．５Ｎ〜２ Ｎ ＮＨ，ＯＨを用いる）した。
ＱＭ９４１４はＢ、Ｊ、Ｇａ１ｌｏ Ｓの文献（Ｂｉｏ
ｔｅｃｂｎｏｌＢｉｏｅｎｇ Ｓｙｍｐ間８．８９ （
１９７８） ） ［示されているように、ｐＨ３〜５
５に制御することにより最大のβ−グルカナーゼが生産
される。
ｔｅｃｂｎｏｌＢｉｏｅｎｇ Ｓｙｍｐ間８．８９ （
１９７８） ） ［示されているように、ｐＨ３〜５
５に制御することにより最大のβ−グルカナーゼが生産
される。
しかしβ−グルコシダーゼは低いレベルであった。また
、ｐＨ５，５〜４．５に制御することにより、β−グル
コシグーゼ活性は上昇するもののβ−グルカナーゼ活性
が低ドした。
、ｐＨ５，５〜４．５に制御することにより、β−グル
コシグーゼ活性は上昇するもののβ−グルカナーゼ活性
が低ドした。
（５） 本発明による菌株トリフチ′ルマ・リーセイ
Ｊ−３７（ＦｇＲＭ−Ｐ ６〜上 ）を用いて上記（４
）と同様の条件で培養し、ｐ！（を５５〜４．５に制御
すると、三成分ともにＱＭ９４１４よりも活性が上昇し
、三成分の比（特にβ−グルコシダーゼの比率）が向上
した。
Ｊ−３７（ＦｇＲＭ−Ｐ ６〜上 ）を用いて上記（４
）と同様の条件で培養し、ｐ！（を５５〜４．５に制御
すると、三成分ともにＱＭ９４１４よりも活性が上昇し
、三成分の比（特にβ−グルコシダーゼの比率）が向上
した。
４６２−
Claims (3)
- （１）トリコデルマ属に属し、セルラーゼ生成至適ｐＨ
が５．５以上であるセルラーゼ生産菌株を培地に培養し
、培養物中にセルラーゼを生成蓄積させ、プ生成蓄積し
たセルラーゼを採取することを特徴とするセルラーゼの
製造方法。 - （２） 該菌株がトリコデルマ・リーセイである特許
請求の範囲第１項記載の方法。 - （３） Ｍ菌株がトリコデルマ−リーセイに−１４（
ｙｚＲＭ−ｐ ｌｙ乙、？／）、 、Ｔ −５７（
ＦＩＲＭ−ＰＩ：、ム、；ｚ＞ またはＨ、−５（Ｆ’
ｇ）傷−Ｐ ４乙Ｊ２ ）である特許請求の範囲第１
項記載の方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP12723882A JPS5917984A (ja) | 1982-07-21 | 1982-07-21 | セルラ−ゼの製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP12723882A JPS5917984A (ja) | 1982-07-21 | 1982-07-21 | セルラ−ゼの製造方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5917984A true JPS5917984A (ja) | 1984-01-30 |
Family
ID=14955128
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP12723882A Pending JPS5917984A (ja) | 1982-07-21 | 1982-07-21 | セルラ−ゼの製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS5917984A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4885075A (en) * | 1987-01-27 | 1989-12-05 | Machine Technology, Inc. | Cooling device for a sputter target and source |
-
1982
- 1982-07-21 JP JP12723882A patent/JPS5917984A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4885075A (en) * | 1987-01-27 | 1989-12-05 | Machine Technology, Inc. | Cooling device for a sputter target and source |
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