JPS6178384A - セルラ−ゼの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明はセルラーゼの製造方法に関する。本明細書にお
いてセルラーゼとは、β−グルカナーゼ（エンｒ−β−
グルカナーゼおよびエキソ−β−グルカナーゼの両者を
含む）およびβ−グルコシダーゼをいう。これらの酵素
は、セルロースの加水分解に関与する公知の酵素である
。

トリコデルマ属、チェラビア属またはスポロトリクム属
に属しかつセルラーゼ生産能を有する微生物の発酵によ
って得られたセルラーゼは、セルロース加水分解によっ
て糖液を得るための酵素源として有用である。

従来の技術 セルラーゼ生産能を有する微生物な用いてセルラーゼを
製造する方法において、培地にラクトースを添加する方
法（特開昭５５−５００８９０号公報）、ソホロースを
添加する方法（Ｊ−Ｂａｃｔ＊−ｒｌｏｌ、、　１３９
．７６１　（１９７９））等が知られている。

しかし、この種の菌株を用いるセルラーゼ酵素源の製造
法にはなお改良の余地がある。

発明の目的 本発明は、このｆｌの製造法において、炭素源として公
知のソホロースまたはラクトースのよりな二糖類な用い
るのではなく、Ｌ−ソルボースのような単糖類を含有す
る培地を用いることにより、著量のセルラーゼを得るこ
とができるという知見に基いている。本発明の目的は、
この種のセルラーゼの製造法を改良することにある。

問題点を解決するための手段 本発明によ抄提供される方法は、トリコデルマ属、チェ
ラビア属丑たはスポロトリクム属に属Ｌ、Ｔ、−ソルボ
ースからのセルラーゼの生産能を有する微生物を培地に
培養し、培養物中にセルラーゼを生成蓄積させ、これを
採取することを特徴とするセルラーゼの製造方法である
。

本発明の方法によると、通常のセルラーゼ生産菌と同様
な培養条件で多量のセルラーゼを蓄積することができる
ので、セルロース資源から燃料用エタノールを製造する
場合などのセルラーゼのコストを低減させることができ
る。

以下に本発明の詳細な説明する。本発明の方法に用いる
微生物としては、トリコデルマ属、ナエラビアｙＡ舊た
はスポロトリクム属に属し、■、−ソルボースをセルラ
ーゼに変換する能力を有する微生物の野生株またけ突然
変喝株であればいずれも用いられる１、実用的な微生物
の例として、トリコデルマ・　リーセイ（Ｔ’ｒｌｃｈ
ｏｄｅｒｍａｒｅａｉｅｌ）　　ＱＭ　　９４１４　　
　（ＡＴＣＧ　　２６９２１　　）　　、　　ト　リ　
コデルマ・リーセイＰＣ−１−４（ＮＲＲＬ　１５４９
９　）、トリコデルマ・リーセイＰＣ−３−７（ＮＲＲ
Ｌ１５５００　）、トリコデルマ・リーセイＸ−３０（
ＮＲＲＬ　１５５０１　）、トリコデルマ・リーセイＸ
−３１（ＮＲＲＬ　１５５０２　）　、チェラビア・テ
レストリス（Ｔｈｉ＊１ａｖｌｔ　ｔ＠ｒｒ＠５ｔｒｌ
ｓ）　ＮＲＲＬ　８１２６、スポロトリクム・セルロフ
イラム（Ｓｐｏｒｏｔｒｌａｈｕｍａ＊１１ｕｌｏｐｈ
ｉｌｕｍ　）　ＡＴＣＣ２０４９４等があげられる、上
記各微生物の菌学的性質は次の文献に記載されて゛いる
。

トリコデルマ・リーセイ：　Ｅ、　Ｇ、　Ｓｉｍｍｏｎ
ｓ。

Ａｂｓｔ、　２ｎｄ　Ｉｎｔｌ、　Ｍｙｃ＠１．　Ｃｏ
ｎｇ、　Ｔａｍｐａ、　Ｆｌｏｒｌｄａ。

Ａｕｇｕｓｔ　１９’１７．　ｐａｇｅ　６１Ａ　６チ
エラビア・テレストリス：特開昭５３−９６３８６号公
報。

スポロトリクム・セルロフイラム；特公昭５６−２２２
７５　　号公報。

突然変異株であるトリコデルマ・リーセイＰＣ−１−４
（ＮＲＲＬ　１５４９９　）　、同ＰＣ−３−７（ＮＲ
Ｒ，Ｌ１５５００　）　、同Ｘ−３０（ｒｔｌＲＲＬ　
１１ｉ５０１１および同Ｘ−３１（ＮＲＲＬ　１５５０
２は米−ＮＲＲＬにブダペスト条約の規定により国際寄
託されている。

上記突然変異株は例えば次の方法で得られる。

親株としてＱＭ−９４１４（Ａ、ＴＣＣ２６９２１）を
用い、ポテトデキストローズ寒天斜面培地〔ポテトデキ
ストロースブロース（１ｌｌｆｃｏ社製）２４，９．寒
天２０ｇを水で１１にする（　ｐＨ５，５）。以下同じ
〕上で２５℃、７日間培養し、胞子を十分形成させた。

生成した胞子を生理的食塩水に懸濁しく約１〜３　Ｘ　
１０’個／ｍｊ）、Ｎ−メチル−Ｎ’−二トローＮ−二
トロソグアニジンと反応させた（　３００１／ｒｎｔ、
　ｐＨ７，０，３０℃、３０〜１２０分）。

この胞子懸濁液から遠心分離により胞子を集め、よく洗
浄し、平板あたり１００〜３００胞子／ｍノになるよう
に希釈し、第１表に示したソルボース寒天平板に塗布し
て３０℃で２日間培養し、生育してきたコロニーの上に
５０ｍＭ酢酸緩衝液ｐＨ５，０を含む０．５％ワルセス
セルロース寒天を加えて、４５℃で１０〜２４時間保温
する。ソルボース好天平板で培養した場合、′セルラー
ゼを生成しく　４　） ているコロニーは１わりに透明帯が生成する。

これによってセルラーゼ生成能の高まった突然変異株を
選んだ。

第　　１　　表 ソルボース寒天平板培地の組成 ソルボース　　３Ｆ　　Ｈ３１１１１０，１０μＩ酵母
エキスＩ　Ｊｌ’　　ＭｎＳＯ４・４ＨｇＯ”　−”１
（Ｎｉｌ）８０　　　２．？　　Ｚｎ５Ｏ，’７１１，
０　　　７０μｇＫＨ，ＰＯ４４ｊＩＣｕＳＯ４’５Ｈ
，０５０ＥＩＮａｆｆｉＨＰ０４６　ｇ（ＮＨ４）、Ｍ
Ｏ７０２４・４Ｈ２０１０μｇＭｇＳＯ４・７Ｈ２０２
００■ Ｐｅ５ｏ４’７Ｈ，０１ｑ　　　］　ｌ　（ｐＨ５，５
）Ｇ　ａ　Ｇｌ　ｚ　・２Ｈ２０１ｑ トリトンＸ−１００１，９ 本発明に用いられる菌株の培養法は、公知のトリコデル
マ属、チェラビア属またはスポロトリクム属に属する菌
株の培養法と同様である。

培地として、Ｌ−ソルボースを含有するほか、さらに窃
素源、所望により無機塩類その他の栄養物を含有する天
然培地オたは合成培地を用いる。■、−ソルボース以外
の炭素源としてセルロース、ノでガス等があげられる。

これらの炭素源とシュークロース、グルコース、ケーン
モラセス、グリセロール、セロビオースなどヲ併用スる
ことは実用的である。索素源としては硫安などの無機ア
ンモニウム塩および尿素、アミノ酸、肉エキス、滅プト
ンなどの有機窒素源が使用できる、無機塩類としてはＫ
Ｈ２ＰＯ４、ＭｇＳＯ４、ＣａＣｌ　２、Ｃｕ　Ｃ１２
、Ｆａ　Ｓｏ　４　、Ｍｎ５０４　、Ｚｎ　Ｓｏ　４な
どが用いられる。所望により、ツイーン８０などの界面
活性剤も用いられる。

培養条件は、トリコデルマ属微生物を用いた場合には２
０〜３２℃、チェラビア稿またはスポロトリクム属微生
物を用いた場合は２５〜５０℃の温度、ｐｉ　　２．５
〜７．０で通常４〜ＩＯ日間通気条件で培養する。

炭５！ｃ源として■、−ソルボース単独より、■、−ソ
ルボースと他の炭素源とを併用した方がセルラーゼの収
量は向上する。所望により、Ｌ−ソルボース以外の炭素
源を用いて上記条件で１〜３日間培養し、培養液中の菌
体濃度が増大した後に、集菌、洗浄し、菌体を■、−ソ
ルボース液〔例えばＬ−ソルボース０．２　％を含有す
る緩衝液（ＰＨ２，５〜５．０　＞　３と混合し、１〜
３日間同様の温度で保温すると、セルラーゼ活性が最大
になる。Ｌ−ソルボース液に、例えば硫酸アンモニウム
、界面活性剤等を加えることもできる。

培養終了Ｖ１培養物またはそれから調製された酵素製・
剤をセルロース加水分解等に、公知の手法で使用するこ
とができる。

酵素活性の測定法は次の通りである。

エンＰ−β−グルカナーゼの測定は、カルボキシメチル
セルロース・ナトリウム塩を基質とし生成する還元糖の
量で測定した。すなわち、カルボキシメチルセルロース
・ナトリウム塩１０ＩをｐＨ５の０．１Ｍ酢酸緩衝液１
１に溶解する。

この溶液５００μｌに蒸留水４５０μ！および測定する
酵素液を適当に希釈したもの５０μｌを添加し、４５℃
で３０分間反応させる。反応液を沸騰水中に１０分開放
置して反応を停止させる。生成した還元軸とソモジ・ネ
ルノン法により定量する。１分間にグルコース換算で１
μｍｏｌの還元糖を生成する酵素活性を１単位と表示し
た。エキソ−β−グルカナーゼの測定は、アビセル８Ｆ
（旭化成社製）を基質とし生成する還元糖の量で測定し
た。すなわち、０，１５ｊｌのアビセル８Ｆをハ をこの懸濁液に加え、４５℃で６０分間反応させる。

以下の操作はエンド−β−グルカナーゼの場合と同様で
ある。

β−グルコシダーゼの測定は、ｐ−ニトロフェニル−β
−Ｄ−グルコピラノシＰを用いル方法で実施した。すな
わち、ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−グルコぎラノシＰ
をｐ）１５の０．０５Ｍ酢酸緩衝液に溶解し、２ｍＭ　
　の溶液を作る。

この溶液１ｍ１Ｃ測定すべき酵素液を適当に希釈したも
の２０μノを加え、４５℃で１０分間反応させ、１Ｍ炭
酸ナトリウム２　ｔａｇを添加し反応を停止した。生成
したｐ−ニトロフエ／−ル量を０Ｄ４０５ｎｉｌｌで比
色定量する。１分間にＩμｍｏｌのｐ−二トロフェノー
ルを生成する酵素活性を１０ｉ位とした。

以下に実施例を示す。

実施例１ トリコデルマ・リーセイＱＭ　９４１４　、ＰＣ−］−
４、ＰＣ−３−７、Ｘ−３０、Ｘ−３１、チェラビア・
テレストリスＮＦｔＲＴ、　８１２６およびスポロトリ
クム・セルロフイラムＡＴＧＣ２０４９４０７株を別々
にポテトデキストローズ寒天斜面培地で、トリコデルマ
・リーセイは２５℃、他の菌株は４５℃で７日間培養し
た。生成した胞子を第２表に示した培地５０１を含んだ
３００１容量の三角フラスコに接種し、トリコデルマ・
リーセイは２８℃、他の菌株は４５℃で７日間振盪培養
した。培養液を遠心分離し、その上清中のセルラーゼ活
性を求めた。その結果を第３表に示す。

第　　２　　表 Ｌ−ソルボ一ス　１０　ｇ Ｋ）１２Ｐ０４２　　Ｍ　　＊微量金属液（１００１Ｉ
ｔｌ中）（ＮＨ４）２Ｓｏ、　　　１．４＃　　ｌ−１
３Ｂ０．　　　　　　　６■ポリ滅プトン　　　１　　
ｇ（ＮＨ，）６ム１０．Ｏｓ＜・７Ｈ２０２６■酵母エ
キス　　０．５１　　Ｆ’ａＣＡ！３・６Ｈ２０１００
ダＭｇ５Ｏ，’７１１２０　０．３，９　　ＣｕＳＯ４
・５Ｈ２０４０ＱＣａ（Ｊ２−２Ｈ２０ｏ、３ｇＭｎ（
Ｊｚ−４１（２０８１１？ツイーン８０　　　１　　ｆ
、／　　　ＺｎＣｌ２２００１１１９微量金Ｍｇ＊　ｔ
ｙ 酒石酸駿摘液　５０　　ｍＭ イオン交換水で１１にする（　ｐＨ４，０）第　　３　
　表 実施例２ トリコデルマ・リーセイＰＣ−３−７およびＸ−３１の
２株をポテトデキストローズ寒天斜面培地で２５℃、７
日間培養した。生成した胞子を第２表に示した培地組成
のうち、Ｌ−ソルボース１０Ｉの代わ抄に、アビセルＰ
Ｈ３０１（旭化成社製）ｔｏｓｓアビセルＰ）Ｉ　３０
１１０ＩＩ並びにＬ−ソルボース０．１１を用いた培地
５０ｊｌｊを含む３００１容量の三角フラスコに接種し
、２８℃で７日間振盪培養した。培養液を遠心分離し、
その上清中のセルラーゼ活性を求めた。その結果を第４
表に示す。

第　　４　　表 実施例３ トリコデルマ・リーセイＸ−３１をポテトデキストロー
ズ寒天斜面培地で２５℃、７日間培養した。生成した胞
子を第２表に示した培地組成のうち、Ｌ−ソルボース１
０ＩＩＯ代わりに、グルコース１０ｇを用いた培地５０
Ｈｌを含む３０〇−容三角フラスコに接種し、２８℃、
１日間振盪培養した。

さらに、これを同組成の培地５００１を含む２１容三角
フラスコに接種し、２８℃、１日間振盪培養した。この
培養液を、第２表に示した培地組成のうち、Ｌ−ソルボ
ース１０Ｉｉの代わりに、グルコース４０ｇ、グルコー
ス４０１並ｒＦＫＬ−フルポース４Ｉを用いた培地３ノ
を含む５１容ジャーファーメンタ−に添加して培養を開
始した。

培養温度ハ２８℃、通気は１．ＯＶＶＭ、攪拌は６００
ｒｐｍ、またｐＨコントロールについては、培養直後は
１．ＯＮ　ＮＨ４ＯＨを添加して、さらに培養中期から
は１．０　Ｎ　Ｈ，８０４を添加して、ｐＨ４，０に保
持した。培養は５日間実施した。培養終了後、培養液を
遠心分離し、その上清中のセルラーぜ活性を求めた。そ
の結果を第５表に示す。

第　　５　　表 発明の効果 本発明により著量のセルラーゼが得られる。

ＡＯつ

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. トリコデルマ属、チエラビア属またはスポロトリクム属
   に属し、Ｌ−ソルボースからのセルラーゼの生産能を有
   する微生物をＬ−ソルボース含有培地に培養し、培養物
   中にセルラーゼを生成蓄積させ、これを採取することを
   特徴とするセルラーゼの製造方法。