JPH02435A

JPH02435A - アルカリセルラーゼ製造法

Info

Publication number: JPH02435A
Application number: JP27981387A
Authority: JP
Inventors: Yoshiharu Kimura; 義晴木村; Akira Takei; 章武井; Susumu Yamazawa; 進山澤; Hiroshi Hagiwara; 浩萩原; Atsushi Suzumatsu; 涼松　淳; Shigeo Ishii; 茂雄石井
Original assignee: Kao Corp
Current assignee: Kao Corp
Priority date: 1987-11-05
Filing date: 1987-11-05
Publication date: 1990-01-05
Also published as: JPH02265479A

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明は好アルカリ性セルラーゼの製造法に関し、更に
詳しくは、バチルス属に属する好アルカリ性生産菌を特
定条件下に培養し、その培地から好アルカリ性セルラー
ゼを採取することを特徴とする好アルカリ性セルラーゼ
の製造法に関する。

〔従来の技術〕

従来、セルラーゼはセルロースをグルコース、又はセロ
ビオース、或いはセロオリゴ糖まで分解する酵素反応を
触媒する複雑な酵素群として理解されており、その作用
機構によ’）、ｃｌ酵素、Ｃ，＃素とβ−グルコシダー
ゼ、或いはエキソ−β−グルカナーゼ、エンド−β−グ
ルカナーゼ、セロビオースなどの名称で呼ばれる酵素を
含有すると言われる。過去数十年のセルラーゼの研究は
専らバイオマス資源の有効利用を図るという観点から、
例えばトリコデルマ属、アスペルギルス属、アクレモニ
ウム属、フミコーラ属等のカビ類にその供給源を求めら
れてきた。

最近、セルラーゼの新規産業的用途として、例えば衣料
用洗剤組成物に関するものがあるが、上記のカビを含め
て微生物が生産するセルラーゼは、その大部分が中性乃
至酸性ｐＨにおいて最適且つ安定な酵素活性を有する、
所謂中性若しくは酸性セルラーゼであって、衣料用洗浄
剤組成物としての要件を満たす、アルカリ性ｐＨで最高
活性を示し、且つ安定な、所謂アルカリセルラーゼの存
在は極めて少ない。即ち衣料用洗浄剤組成物として使用
し得るアルカリセルラーゼの生産法としては、僅かに、
好アルカリ性バチルスに属する細菌を培養して培地よシ
セルラーゼＡを生産する方法（特公昭５０−２８５１５
号公報）、セルロモナスに属する細菌を培養してアルカ
リセルラーゼ３０１−Ａを生産する方法（特開昭５８−
２２４６８６号公報）、好アルカリ性バチルスＮ１１１
３９株を培養してカルボキシメチルセルロースを生産す
る方法（Ｆｕｋｕｍｏｒｉ　Ｆ、、　Ｋｕｄｏ　Ｔ、　
ａｎｄ　Ｈｏｒｉｋｏｓｈｉ　Ｋ、、　Ｊ、　Ｇｅｎ。

Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、、　　１３１　、３３３９　、　
（１９８５）　）及びストレフ’）マイセス属の一種を
用いてアルカリセルラー　−ｔ７　ｆ生産する方法（＃
！ｊ開昭６１−１９４８３号公報）が知られているに過
ぎない。しかしながら、これらの生産菌に於いてはその
生産性が乏しく、工業的生産にかなう発酵技術は未だ皆
無である。ところが、ごく最近になって本発明者らは好
アルカリ性細菌の一種であるバチルス・エスビー（Ｅａ
ｃｉｌｌｕｓ　　ｓｐ、）ＫＳＭ　−６３５（ＰＥＲＭ
　　Ｐ　−８８７２）が衣料用洗浄剤組成物として適し
たアルカリセルラーゼＫを著量に生産することを見出し
、先に特許出願した（特願昭６１−２５７７７６号）。

〔発明の解決しようとする問題点〕

しかしながら、工業的スケールでアルカリセルラーゼ生
産菌を培養し、アルカリセルラーゼを高生産性にて生産
した例はなく、高生産性の培譬法の技術の開発が急がれ
ている。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明者らは工業的に有利にセルラーゼ、特にアルカリ
セルラーゼを有利に製造すべく鋭意研究をおこなった結
果、培地中に鉄含有物質を含有せしめることによりセル
ラーゼの生産性が著しく向上することを見い出し、本発
明を完成した。

すなわち、本発明は、アルカリセルラーゼ生産菌を鉄含
有物質を含む培地中で培養することを特徴とするアルカ
リセルラーゼ製造法を提供するものである。

本発明方法において用いる、培地中に加えられる鉄含有
物質としては、鉄分、酸化鉄、ＦｅＳＯ４、ＦｅＣｌ２
　、Ｆｅ（ＯＨ）２、Ｆｅ３　（ＰＯ４）１などの２価
鉄；Ｆｅｚ（Ｓｏｔ＞３、ＦｅＣ４５、Ｆｅ（ＯＨ）３
、ＦｅＰＯ４、ＦｅＮＨ＜（８０４）２　　などの３価
鉄；スレオニン鉄；ヘモグロビン、ミオグロビン、チト
クローム類、カタラーゼ等のヘム鉄たんばく質などが挙
げられる。これら鉄含有物質は、培地中にＦｅとして０
．ｌｐｐｍ以上、好ましくは１　ｐｐｍ〜１０００　ｐ
ｐｍ配合される。

また、本発明方法において用いられるアルカリセルラー
ゼ生産菌は、アルカリセルラーゼを産生ずるものであれ
ば何れでも良いが、バチルス属に属するアルカリセルラ
ーゼ生産菌が好ましく、その例としては、本発明者らが
先に見出したバチルスａ　：Ｌ　スピー（Ｂａｃｉｌｌ
ｕｓ　ｓｐ、　）　Ｋ　Ｓ　Ｍ　−６３５ＦＥＲＭ　Ｐ
−８８７２）、同Ｋ　Ｓ　Ｍ　−６３５ｎＦＥＲＭ　Ｐ
−９０８３）、同ＫＳＭ−６３５ｖＦＥＲＭ　Ｐ−９０
８４）、同ＫＳＭ−６３５ｒＦＥＲＭ　Ｐ−９０８５）
、同Ｋ　Ｓ　Ｍ　−６３５ｎｖＦＥＲＭ　Ｐ−９０８６
）、同ＫＳＭ−４２５（ＦｇＲＭ　Ｐ−９００７）、同
ＫＳＭ−５３４（ＦＦＪＲＭ　Ｐ−９０１０）、同ＫＳ
Ｍ−５２１（ＦＥＲＭ　Ｐ−９００９）、同ＫＳＭ−５
８０（ＦＥＲＭ　Ｐ−９０１３）、同ＫＳＭ−３４４（
ＦＥＲＭ　Ｐ−９００８）、同ＫＳＭ−５３９（ＦＩＥ
ＲＭ　Ｐ−９０１１）、同ＫＳＭ−５７７（ＦＥＢＭ　
Ｐ−９０１２）、四ＫＳＭ−５２２（ＦｇＲＭ　Ｐ−９
３７０）、同ＫＳＭ−５８８（ＦｇＲＭ　Ｐ−９３７１
）等が挙げられる。このうち、特にバチルス・エスピー
ＫＳＭ−６３５及びそのアンモニウム耐性株ＫＳＭ−６
３５ｎｓさらにバンコマイシン耐性を付与したＫＳＭ−
６３５ｎｖ等が好ましい。このうちバチルス−エスピー
ＫＳＭ−６３５ｎｖの菌学的性状を例示すれば次の通り
である。

菌学的性状：（１）顕微銅的観察菌の大きさは、０．５〜１．２μ（ｒｌ　ｘ　１．５〜
４．０μｍの桿菌で、菌体の一端に内生胞子（０，７〜
１．２μｍ　ｘ　１．　Ｏ〜２．０μｍ）を形成する。

周鞭毛を有し運動性があり、ダラム染色は陽性である。

（２）各種培地における生育状態生育のｐＨ範囲は８〜ＩＩＫあり、通常、炭酸ソーダ（
Ｎａ２ＣＯ３）が０．５〜１．０％添加された培地で生
育が妙も良好である。以下に示した諸性質は、全て１．
０重ｉ％のＮａ２ＣＯ３存在下での菌学的性状である。

■　肉汁寒天培地集落の形状は円形、表面は偏平である。集落の色調は白
色乃至黄色の半透明であシ、光沢がある。

■　肉汁液体培地生育し、混濁する。培地のｐＨを中性にすると生育しな
い。

■　７％食塩肉汁液体培地で生育し、混濁する。

■　肉汁ゼラチン穿刺培養生育しない。

■　リドマスミルク培地ミルクの凝固、ペプトン化は陰性。

（３）生理学的性質 ■　硝酸還元能は有するが、脱窒反応はしない。

■　ＭＲ反応は不明であるがｖｐ反応は陽性。

■　インドールを生成しない。

■　硫化水素の生成は認められない。

■　澱粉の加水分解、資化性は無い。

■　クエンｒ１ｋを利用する。

■　硝酸、亜硝酸を資化する。塩化アンモニウムの利用
性は微弱であるが、リン酸アンモニウムは利用する。

■　キングＢ培地で淡黄色を示すが螢光性はない。

■　ウレアーゼは陰性。

Ｏオキシダーゼは凝陽性。

（０カララーゼは陽性 ■　生育の範囲。

生育の温度範囲は２０〜４５℃にあり、生育最適温度は
２９〜３７０゜生育ｐＨ範囲は８〜１１にあり、生育最
適ｐＨは９．５〜１０．２゜■　酸素に対する態度は好
気的である。

０　糖の利用性Ｄ−リボース、Ｌ−アラビノース、Ｄ−キシロース、Ｄ
−グルコース、Ｄ−マンノース、Ｄ−７ラクトース、マ
ルトース、シュークロース、トレハロース、Ｄ−マ／ニ
ットール、イノシトール、グリセロールを資化する。Ｄ
−ガラクトース、ラクトース、Ｄ−ソルビトール、スタ
ーチ、デキストリン、ラフイーノースは利用できない。

■　カゼイン、ゼラチンの加水分解性は陰性。

■　ビオチン（又はデスチオピオチン）を生育に必要と
する。

叙上のバチルス・エスピーＫＳＭ−６３５ｎｖの菌学的
性状は、親株バチルス・エスピーＫＳＭ−６３５のそれ
と同一である。しかしながら、アルカリセルラーゼ生産
能の点では、本変異株は、親株の約１０倍の生産能を有
し、著しく異なっている。

本発明方法において用いる培地には、前記した糖類のほ
か必要に応じて他の資化される適当な炭素源、窒素源又
は有機栄養源、無機塩等を添加することができる。

炭素源の例としては、籾殼、麩、濾紙、一般紙類、おが
屑、などの植物繊維質、廃糖蜜、転化糖、カルボキンメ
チルセルロースｆ　ＣＭＣ）、アビセル、セルロース綿
、キシラン、ヘクチンニ加工、頁化し得る炭素源、例え
ば、リボース、アラビノース、キシロース、グルコース
、マンノース、フラクトース、麦芽糖、シヨ糖、トレハ
ロース、マンニット、イノシツト、グリセリンや資化し
得る有機酸、例えば、酢酸、クエン酸などが挙げられる
。また、窒素源あるいは有機栄養源としては、例えば硝
酸ナトリウム、硝酸カリウム、硝酸アンモニウム等の硝
酸塩類；各種由来の酵母エキス、各種動物組織のエキス
、各種植物組織のエキス、ペプトンが挙げられる。無機
塩としては、例えば炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、炭
酸水素ナトリウム、炭酸水素カリウム等の炭酸塩；リン
酸ナトリウム、リン酸一水素ナトリウム、リン酸二水素
ナトリウム、リン酸カリウム、−ロリン酸カリウム、ピ
ロリン酸ナトリウム、トリピリリン酸ナトリウム、ヘキ
サメタリン酸ナトリウム等々のりン酸塩、硫酸マグネシ
ウム等の無機塩が使用できる。

さらに重金属塩類が使用されるが天然培地を含む培地で
は必ずしも添加を必要としない。

また、上記以外の栄養源を必要とする変異株を用いる場
合には、その栄養要求を満たす物質を培地に添加する。

本発明方法による培養は、前記条件によって通気攪拌す
る以外は常法に従って実施することができる。例えば培
地を加熱等によシ殺菌した後、アルカリセルラーゼ生産
菌を接種し、２５〜３７℃で半日ないし５日間、好まし
くは１〜３日間培養することにより実施できる。なお、
培地のｐＨは用いる微生物によシ相違するが、７〜１１
程度に調整すると良い結果が得られる。また、水に８ｍ
性の炭素源を使用する場合は、各種界面活性剤、例えば
？リオキシエチシンンルビタン脂肪酸エステル、ソルビ
タン脂肪酸エステル、？リオキシエチレンアルキルエー
テル等々の非イオン界面活性剤全添加することも可能で
あり、その添加量はＯ〜２チ、好ましくは０１〜１％で
ある。

〔発明の効果〕

本発明方法によれば、アルカリセルラーゼ全工業的規模
で生産することができる。

〔実施例〕

欠に実施例を挙げ、本発明を説明する。なお、実施例中
においてＣＭＣアーゼ活性は次の如くして測定し、緩衝
液としては次のものを用いた。

１）Ｈ３〜８　　マクルペイン緩衝液ｐＨ８〜１１　グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液ｐＨ１２〜１３　塩化カリウム−水酸化ナトリウム援＃
液ＣＭＣアーゼ活性測定法：１０〜ＣＭＣ（出湯国策）Ｑルデ社）、１００μｍｏｔ
各種緩衝液（マクルベイン、リン酸、グリジン−ＮａＯ
Ｈ等）を含む基質用ｆ’２Ｌ　Ｏ，９ｍｌに０．１　ｍ
ｌの酵素溶液を加え、３０℃、２０分反応した。反応＋
、ｆ、３．５−ジニトロ−サリチル酸（３，５ｄｉｎｉ
ｔｒｏ　−５ａｌｉｃｙｌｉｃ　ａｃｉｄ　（ＤＮＳ　
）　）法にて還元糖Ｏ定量を行った。すなわち、反応液
１．０　ｍｌにＤＮＳ試薬１．０　ｍｌ　ｆ加え、５分
間、１００℃で加熱発色させ、冷却後、４．０ｍｌの脱
イオン水を加えて希釈した。これを波長５３５　ｎｍで
比色定量した。

酵素力価は、上記の条件下で１分間に１μｍｏｔのグル
コースに相当する還元糖を生成する酵素量を１単位とし
た。

実施例１（１）下に示す培地にバチルス・エスピーＫＳＭ６３５
ｎｖ　（ＦＥＲＭ　Ｐ　−９０８６）　ｋｉｆＪｔ’ｌ
ｌし、３０℃で１〜２時間培養して種培地を得た。

味　　　　　液　　　　　８　　　％（味の素■製）グルコース　　　０．５　　％Ｃ別滅菌）魚肉エキス　
　　０．５　　％酵母エキス　　　０．０５％炭酸ナトリウム　０．５　　％（別滅菌）（ト）　次い
で（１）で得た徨培地を下に示す主培地に１チ接種し、
２００を培養槽を用いて３０ｍ：で２日間、培養した。

この培養によシ、培地ｌｔ当り５０．　ＯＯＯ単位のア
ルカリセルラーゼ？得た。

味　　　　　液　　　　　８　チフラクトース　　２．２％グルコース　　　０．３係ＦｅＳＯ４＊　７　Ｈ２Ｏ５ｐｐｍ酵母エキス　　　ｏ、ｉ％炭酸ナトリウム　　　　０５％実施例２〜１０主培地としてＦｅＳＯ４＠　７Ｈ２０３ｐｐｍのかわり
に下表成分を用いた以外は実施例１と同様にして培養ヲ
おこない、下表に示したアルカリセルラーゼを得た。

以下余白以上

Claims

【特許請求の範囲】１、鉄含有物質を鉄として０．１ｐｐｍ以上含有する培
地を用い、アルカリセルラーゼ生産菌を培養することを
特徴とするアルカリセルラーゼ製造法。２、アルカリセルラーゼ生産菌がバチルス属に属するも
のである特許請求の範囲第１項記載のアルカリセルラー
ゼ製造法。３、鉄含有物質が鉄粉、鉄の２価イオン、鉄の３価イオ
ン、酸化鉄、ヘム鉄たんぱく質及びスレオニン鉄から選
ばれたものである特許請求の範囲第１項記載のアルカリ
セルラーゼ製造法。４、ヘム鉄たんぱく質がヘモグロビン、ミオグロビン、
チトクローム類及びカタラーゼから選ばれたものである
特許請求の範囲第３項記載のアルカリセルラーゼ製造法
。５、培養を２５〜３７℃でおこなう特許請求の範囲第１
項記載のアルカリセルラーゼ製造法。６、培養を半日ないし５日間おこなう特許請求の範囲第
１項記載のアルカリセルラーゼ製造法。７、培地のｐＨが７〜１１である特許請求の範囲第１項
記載のアルカリセルラーゼ製造法。８、培地に０．１〜２％の非イオン界面活性剤を添加す
る特許請求の範囲第１項記載のアルカリセルラーゼ製造
法。９、アルカリセルラーゼ生産菌がバチルス・エスピーＫ
ＳＭ−６３５（ＦＥＲＭＰ−８８７２）、同ＫＳＭ−６
３５ｎ（ＦＥＲＭＰ−９０８３）、同ＫＳＭ−６３５ｖ
（ＦＥＲＭＰ−９０８４）、同ＫＳＭ−６３５ｒ（ＦＥ
ＲＭＰ−９０８５）、同ＫＳＭ−６３５ｎｖ（ＦＥＲＭ
Ｐ−９０８６）、同ＫＳＭ−４２５（ＦＥＲＭＰ−９０
０７）、同ＫＳＭ−５３４（ＦＥＲＭＰ−９０１０）、
同ＫＳＭ−５２１（ＦＥＲＭＰ−９００９）、同ＫＳＭ
−５８０（ＦＥＲＭＰ−９０１３）、同ＫＳＭ−３４４
（ＦＥＲＭＰ−９００８）、同ＫＳＭ−５３９（ＦＥＲ
ＭＰ−９０１１）、同ＫＳＭ−５７７（ＦＥＲＭＰ−９
０１２）、同ＫＳＭ−５２２（ＦＥＲＭＰ−９３７０）
及び同ＫＳＭ−５８８（ＦＥＲＭＰ−９３７１）のいず
れかである特許請求の範囲第１項記載のアルカリセルラ
ーゼ製造法。１０、アルカリセルラーゼ生産菌の培養において、炭素
源として籾殼、麩、濾紙、一般紙類、おが屑、廃糖蜜、
転化糖、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、アビ
セル、セルロース綿、キシラン、ペクチン、リボース、
アラビノース、キシロース、グルコース、マンノース、
フラクトース、麦芽糖、シヨ糖、トレハロース、マンニ
ット、イノシツト、グリセリン、酢酸及びクエン酸から
選ばれた化合物の一種又は二種以上を用いることを特徴
とする特許請求の範囲第１項記載のアルカリセルラーゼ
製造法。１１、アルカリセルラーゼ生産菌の培養において、窒素
源あるいは有機栄養源として硝酸ナトリウム、硝酸カリ
ウム、硝酸アンモニウム、酵母エキス、動物組織のエキ
ス、植物組織のエキス及びペプトンから選ばれる化合物
の一種又は二種以上を用いることを特徴とする特許請求
の範囲第１項記載のアルカリセルラーゼ製造法。１２、アルカリセルラーゼ生産菌の培養において、無機
塩として炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸水素ナト
リウム、炭酸水素カリウム、リン酸ナトリウム、リン酸
一水素ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸カ
リウム、ピロリン酸カリウム、ピロリン酸ナトリウム、
トリポリリン酸ナトリウム、ヘキサメタリン酸ナトリウ
ム及び硫酸マグネシウムから選ばれる塩類の一種又は二
種以上を用いることを特徴とする特許請求の範囲第１項
記載のアルカリセルラーゼの製造法。