JPH0379987B2

JPH0379987B2 -

Info

Publication number: JPH0379987B2
Application number: JP12302185A
Authority: JP
Inventors: Keiji Takeuchi; Takashi Nishino; Motoyasu Oodera; Tahee Negi
Original assignee: Lion Corp
Current assignee: Lion Corp
Priority date: 1985-06-06
Filing date: 1985-06-06
Publication date: 1991-12-20
Also published as: JPS61280268A

Description

【発明の詳細な説明】

〔産業上の利用分野〕本発明は、土壌より分離して得られた、バチル
ス属に属する新規微生物に関する。更に詳しく
は、洗剤に安定配合できる新規のアルカリプロテ
アーゼを産生する新規微生物に関する。〔従来技術とその問題点〕近年、洗浄剤の洗浄力を更に向上させるため
に、蛋白質、糖質、脂質等を分解する各種の加水
分解酵素の配合が検討されている。特に、蛋白質
分解酵素は洗浄剤のみでは落ちづらい蛋白汚垢を
分解し、洗浄力の改善に寄与するため、洗浄剤に
アウカリプロテアーゼを配合することが不可欠で
ある。一般的には、バチルス・リケニフオルミ
ス、バチルス・ズブチリス等が生産するアリカラ
ーゼ（ノボ社）、マキサターゼ（ギスト社）、ナガ
ーゼ（長瀬産業）が使用されている。しかし、こ
れら酵素は高PHの洗浄剤溶液中で直ちに失活する
ため、液体洗浄剤に配合することは困難である。
その他、ストレプトマイセス属、アスペルギルス
属、アースロバクター属、フザリウム属等の微生
物により産生されるアルカリプロテアーゼも知ら
れているが、前述と同様、安定性に問題があるた
め利用できない。〔問題点を解決するための手段〕本発明者らは、洗浄剤成分共存下の高アルカリ
条件において優れた安定性を有し、尚且つ洗浄力
の改善に寄与するアルカリプロテアーゼを産生す
る菌を広く自然界より検索した結果、バチルス属
に属するＹ株、Ｐ株、Ｋ株およびＸ株が公知のア
ルカリプロテアーゼより性質に優れたアルカリプ
ロテアーゼを培地中に産生することを見出し、本
発明を完成した。すなわち、本発明はバチルス属に属し、洗浄剤
成分共存下の高アルカリ条件において優れた安定
性を有し、尚且つ洗浄力の改善に寄与するアルカ
リプロテアーゼを産生する能力を有する新規なバ
チルス・エスピーＹ株（微工研菌寄第8088号）、
同Ｐ株（第8090号）、同Ｋ株（第8091号）、同Ｘ株
（第8092号）を提供することを目的とする。次に、本発明者らが自然界より分離採取した本
菌株の菌学的性質を詳述する。尚、菌学的性質および分類方法は、Bargey's
Manual of Determinative Bacteriology第８版
（1974）、R.E.Gordonの検索表（1972）に準じて
行なつた。PH10の培地は、炭酸ナトリウム１％を
加えて調整した。温度およびPHに関する生育最適
範囲の測定は、温度勾配バイオフオトレコーダー
で行なつた。させ、ここで本発明が提供するバチルス・エス
ピー（Bacillus sp）Ｙ株（微工研条寄第1029
号）、バイルス・エスピーＰ株（微工研条寄第
1030号）、バチルス・エスピーＫ株（微工研条寄
第1031号）およびバナルス・エスピーＸ株（微工
研条寄第1032号）の菌学的性質を列挙する。Ａ形態的性質肉汁寒天培地上で35℃にて２日間培養したと
き、以下の形態的特徴が観察される。 (1) 細胞の形および大きさ：いずれの株も桿
菌、大きさは、Ｙ株：0.4−0.5μｍ×1.7−1.9μｍＰ株：0.4−0.5μｍ×1.7−2.0μｍＫ株：0.4−0.5μｍ×1.6−1.8μｍＸ株：0.4−0.5μｍ×1.8−2.0μｍ (2) 多形性：いずれの株もなし。 (3) 運動性：いずれの株も周鞭毛を有し運動性
あり。 (4) 胞子：いれずれの株も胞子を形成し、形成
途上で細胞は先端近くから膨張する。成熟し
た胞子はレモン型であり、大きさは、Ｙ株：0.7−0.9μｍ×1.0−1.2μｍＰ株：0.8−1.0μｍ×1.3−1.5μｍＫ株：0.8−1.0μｍ×1.5−1.8μｍＸ株：0.9−1.0μｍ×1.0−1.2μｍ (5) グラム染色性：いずれの株も陽性。 (6) 抗酸性：いずれの株も陰性。Ｂ培養的性質 (1) 肉汁寒天平板培養：Ｙ株：PH7.0にて生育して、円形、偏平状、
全縁のコロニーを形成する。該コロニーの
表面は滑らかで光沢有り、該周辺部は淡褐
色、該中心部は半透明の淡褐色。 PH10.0にて生育して、円形、偏平状、全
縁のコロニーを形成する。該コロニーの表
面は滑らかで光沢が有り、クリーム色。Ｐ株：PH7.0にて生育して、円形、偏平状、
全縁のコロニーを形成する。該コロニーの
表面は滑らかで光沢有り、半透明のクリー
ム色。 PH10.0にて生育して、円形、偏平状、全
縁のコロニーを形成する。該コロニーの表
面は滑らかで光沢が有り、クリーム色。Ｋ株：PH7.0にて生育して、円形、中心凹状、
波状のコロニーを形成する。該コロニーの
表面は滑らかで光沢が有り、透明。 PH10.0にて生育して、円形、偏平状、全
縁のコロニーを形成する。該コロニーの表
面は滑らかで光沢が有り、クリーム色。Ｘ株：PH7.0にて生育して、円形、偏平状、
全縁のコロニーを形成する。該コロニーの
表面は滑らかで光沢有り、該周辺部はクリ
ーム色、該中心部は淡褐色。 PH10.0にて生育して、円形、偏平状、全縁
のコロニーを形成する。該コロニーの表面
は滑らかで光沢が有り、クリーム色ないし
淡褐色。 (2) 肉汁寒天斜面培養Ｙ株：PH7.0およびPH10.0にて拡帯状に生育
し、光沢のあるクリーム色ないし淡褐色の
コロニーを形成する。赤褐色の色素を僅か
に生成する。Ｐ株：PH7.0およびPH10.0にて帯状に生育し、
光沢のあるクリーム色の半透明なコロニー
を形成する。色素は生成しない。Ｋ株：PH7.0にて帯状に生育し、光沢のある
透明なコロニーを形成する。色素は生成し
ない。 PH10.0にて拡帯状に生育し、光沢のある
クリーム色のコロニーを形成する。色素は
生成しない。Ｘ株：PH7.0およびPH10.0にて拡帯状に生育し、
光沢のあるクリーム色のコロニーを形成す
る。色素は生成しない。 (3) 肉汁液体培養：Ｙ，Ｐ，Ｋ，Ｘ株：PH7.0にていずれも生育
するが、菌膜は形成しない。 PH10.0にていずれも生育が良好で、菌膜
は形成しない。 (4) 肉汁セラチン穿刺培養：Ｙ，Ｐ，Ｋ，Ｘ株：PH7.0にていずれも僅か
に液化する。 PH10.0にていずれも液化する。 (5) リトマス・ミルクＹ，Ｐ，Ｋ，Ｘ株：PH7.0にていずれも生育
が非常に悪い。 PH10.0にていずれも生育する。ミルクの
凝固は見られない。培地がアルカリ性のた
め、リトマスの変色は不明。Ｃ生理的性質〔Ｙ，Ｐ，Ｋ，Ｘ株とも同じ〕 (1) 硝酸塩の還元：陽性。 (2) 脱窒反応：陰性。 (3) MRテスト：陰性。 (4) VPテスト：陰性。 (5) インドールの生成：陰性。 (6) 硫化水素の生成：陰性。 (7) デンプンの加水化分解：陽性。 (8) クエン酸の利用：Koserの培地では利用し
ない。Christensenの培地では僅かに利用す
る。 (9) 無機窒素源の利用：硝酸塩は利用しない。
アンモニウム塩は利用しない。 (10) 色素の生成：色素は生成しない。 (11) ウレアーゼ：陽性 (12) オキシダーゼ：陽性 (13) カタラーゼ：陽性 (14) 生育の温度範囲：33ないし35℃付近（20
ないし47℃）が良好。 (15) 生育のPH範囲：10.0付近（6.0ないし12.0）
が良好。 (16) 酸素に対する態度：好気性 (17) Ｏ−Ｆテスト：陰性。 (18) 糖類から酸およびガスの生成：（＋；生
成する −；生成しない）

【表】Ｄその他の性質 (1) 塩化ナトリウムに対する耐性：いずれ株も
10％NaCl下で生育する。 (2) Ｙ株、Ｐ株、Ｋ株およびＸ株は、いずれも
至適PHが10以上で洗浄剤成分共存下の高アル
カリ条件において優れた安定性を有し、尚か
つ洗浄力の改善に寄与するアルカリプロテア
ーゼを産生する。以上の性質を総括すると、まず、本菌株らは、
いずれともカタラーゼ陽性、好気性で耐熱胞子を
有するグラム陽性の桿菌であることにより、バチ
ルス属の細菌である。更に、本菌株らは、周鞭毛を有する桿菌であ
る。また、胞子形成途上で細胞は、先端の近くか
ら膨張してくる。成熟した胞子は、レモン型であ
る。Ｙ株およびその胞子の電子顕微鏡写真を第４図
に示す。Ｐ株およびその胞子の電子顕微鏡写真を第５図
に示す。Ｋ株およびその胞子の電子顕微鏡写真を第６図
に示す。Ｘ株およびその胞子の電子顕微鏡写真を第７図
に示す。尚、本菌株らは、20℃以下および50℃以上では
生育できず、最適生育温度が33ないし35℃付近に
ある中温性細菌（mesophile）である（第１図）。また、本菌株らは、PH６以下およびPH12.5以上
では生育できず、最適生育PHが10.0付近にある好
アルカリ性細菌（alkalophile）である（第２
図）。更に、本菌株らは、単糖類のなかでもアルドヘ
キソース系統のものから、二糖類は乳糖以外のも
のから、また、糖アルコール類ではマンニツトだ
けから酸を生成する性質がある。ガスは発生しな
い。尚更に、本菌株らが、バチルス・アルカロフイ
ルスに属すると思われるため、理研、堀越らのバ
チルス・アルカロフイルスNo.221（ATCC21522）、
No.58（＊ａ）、およびNo.Ｄ−６（＊ｂ）と菌学的性
質を比較した。本菌株らとバチルス・アルカロフ
イルスNo.221、No.58、No.Ｄ−６とは、アルカリ性
の培地（PH10）で良く生育する点で一致するが、
無機窒素源の利用に関して、本菌株らが、硝酸塩
およびアンモニウム塩を利用できないのに対し
て、上記公知の菌株らは、利用できる。また、生
育PHの範囲において、本菌株らがPHからPH12であ
るの対して、No.221は、PH７からPH11であり、No.
58、No.Ｄ−６は、PH7.5からPH11であり、上記公
知の菌株は、PH7.0以下では生育できない点で異
なる。生育温度の範囲においても、本菌株らが20
℃から47℃であり、最適温度範囲が33℃から35℃
であるのに対して、No.221は55℃、No.58は45℃ま
で生育でき、最適温度が37℃から40℃であり、No.
Ｄ−６も最適温度が35℃から40℃と高く、本菌株
らとは異なる。また、本菌株らと、糖類からの酸
の生成をNo.Ｄ−６と比較すると、本菌株らがＬ−
アラビノース、Ｄ−キシロース、Ｄ−ガラクトー
ス、グリセリンから酸を生成しないのに対して、
No.Ｄ−６は生成する。更に、本菌株らは、10％食
塩下でも生育し、上記公知の菌株とは区別され
る。このように本菌株らは公知のバチルス・アルカ
ロフイルスの菌株とは異なるが、上述の菌学的性
質からバチルス・アルカロフイス類緑菌と判断す
ることが妥当である。以上の結果を総括して第１
表に示す。

【表】

〔実施例〕

本発明者らが自然界より分離採取した本菌株の
スクリーニング方法を詳述する。 (1) 好アルカリ性菌の分離イーストエキス0.5％、ポリペプトン0.05％、
リン酸二カリウム0.1％、硫酸マグネシウム
0.02％、炭酸ナトリウム１％を含むPH11の液体
培地５mlを分注した試験管（φ16.5×165mm）に
各地の土壌約100mgを入れ、37℃にて５日間培
養した。その培養液を上記培地に寒天1.5％含
むプレートに接種後、37℃にて３日間インキユ
ベートし、プレート上に生育した好アルカリ性
細菌を得た。 (2) アルカリプロテアーゼ産生菌の分離 (1)の方法で得た好アルカリ性細菌をスキムミ
ルク１％、イーストエキス0.025％、ペプトン
0.05％、炭酸ナトリウム１％、寒天1.5％を含
むPH10のスキムミルク培地プレート上に穿刺し
た。37℃にて24時間インキユベート後、ハロー
を形成するものをアルカリプロテアーゼ産生菌
として得た。 (3) 界面活性剤耐性を有するアルカリプロテアー
ゼ産生菌の分離 (1)の培地、培養条件で得られた培養液を
8000rpmにて５分間遠心分離し、培養上清を得
た。その培養上清およびその培養上清に洗浄剤
を300ppmになるように添加し、40℃にて１時
間処理したものを、抗生物質検定用ペーパーデ
イスク（φ8mm）に20μ加え、更に上記PH10の
スキムミルク培地上にのせた。これを37℃にて
24時間インキユベートし、ハローの径を測定し
た。ハローの径が洗浄剤未処理、処理品とも同
じものを、界面活性剤に耐性があるアルカリプ
ロテアーゼ産生菌として採取した。 (4) 高PH洗浄剤原液中での安定性および洗浄力試
験による産生菌の選定酵素は、可溶性デンプン２％、イーストエキ
ス0.5％、ポリペプトン0.5％、リン酸二カリウ
ム0.1％、硫酸マグネシウム0.02％、炭酸ナト
リウム１％を含む液体培地で30℃にて３日間培
養後、遠心分離、70％硫安塩析、透析し調整し
た。高PH洗浄財原液中での安定性試験は、市販
の液体洗浄剤100ｇに対して、グリシンを6.6
ｇ、NaOHを3.3ｇ加え（PH11）、更に上記酵素
液を約10ml（カゼイン基質で300000APU）加
え、40℃にて１週間保存後残存活性を評価し
た。50％以上活性が残存したものを選んだ。また、洗浄力試験は、油化学、30、432
（1981）に示された方法に準じて行ない、洗浄
の対象となる布は、蛋白質配合人工湿式汚垢布
を使用した。評価は、酵素無添加品を基準にし
て、それ以上の洗浄力を有するものを選定し
た。以上のスクリーニング工程によりふるい分
けられた菌株数を第２表に示す。

〔効果〕

Ｙ株、Ｐ株、Ｋ株およびＸ株が産生するアルカ
リプロテアーゼの高PH洗浄剤原液（PH11）中での
安定性を第３図に示す。また、上記本菌株らの産生するアルカリプロテ
アーゼを洗浄剤に配合させて、その洗浄力の改善
度を調べた。その結果を第３表に示す。洗浄力試
験は、油化学、30、432（1981）に示された方法に
準じて行ない、洗剤の対象となる布は、蛋白質配
合人工汚垢布を使用した。

【表】これらの結果から、本菌株らは洗浄剤成分共存
下の高アルカリ条下において優れた安定性を有し
尚かつ洗浄力の向上に寄与するアルカリプロテア
ーゼを産生するという点で有効であることが示さ
れた。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本菌株らの生育温度を示すグラフ
図。第２図は、本菌株らの生育PHを示すグラフ
図。第３図は、本菌株らの産生するアルカリプロ
テアーゼの高PH洗浄剤原液（PH11）中での安定性
を示す図。第４図はＹ株およびその胞子の電子顕
微鏡写真図。第５図はＰ株およびその胞子の電子
顕微鏡写真図。第６図はＫ株およびその胞子の電
子顕微鏡写真図。第７図はＸ株およびその胞子の
電子顕微鏡写真図。

Claims

【特許請求の範囲】１以下の菌学的性質を有するバチルス・エスピ
ー（Bacillus sp）Ｙ株（微工研条寄第1029号）、
バチルス・エスピーＰ株（微工研条寄第1030号）、
バチルス・エスピーＫ株（微工研条寄第1031号）
およびバチルス・エスピーＸ株（微工研条寄第
1032号）からなる群から選択されたアルカリプロ
テアーゼ産生微生物。Ａ形態的性質肉汁寒天培地上で35℃にて２日間培養したと
き、以下の形態的特徴が観察される。 (1) 細胞の形および大きさ：いずれの株も桿
菌、大きさは、Ｙ株：0.4−0.5μｍ×1.7−1.9μｍＰ株：0.4−0.5μｍ×1.7−2.0μｍＫ株：0.4−0.5μｍ×1.6−1.8μｍＸ株：0.4−0.5μｍ×1.8−2.0μｍ (2) 多形性：いずれの株もなし。 (3) 運動性：いずれの株も周鞭毛を有し運動性
あり。 (4) 胞子：いれずれの株も胞子を形成し、形成
途上で細胞は先端近くから膨張する。成熟し
た胞子はレモン型であり、大きさは、Ｙ株：0.7−0.9μｍ×1.0−1.2μｍＰ株：0.8−1.0μｍ×1.3−1.5μｍＫ株：0.8−1.0μｍ×1.5−1.8μｍＸ株：0.9−1.0μｍ×1.0−1.2μｍ (5) グラム染色性：いずれの株も陽性。 (6) 抗酸性：いずれの株も陰性。Ｂ培養的性質 (1) 肉汁寒天平板培養：Ｙ株：PH7.0にて生育して、円形、偏平状、
全縁のコロニーを形成する。該コロニーの
表面は滑らかで光沢有り、該周辺部は淡褐
色、該中心部は半透明の淡褐色。 PH10.0にて生育して、円形、偏平状、全
縁コロニーを形成する。該コロニーの表面
は滑らかで光沢が有り、クリーム色。Ｐ株：PH7.0にて生育して、円形、偏平状、
全縁のコロニーを形成する。該コロニーの
表面は滑らかで光沢有り、半透明なクリー
ム色。 PH10.0にて生育して、円形、偏平状、全
縁のコロニーを形成する。該コロニーの表
面は滑らかで光沢が有り、クリーム色。Ｋ株：PH7.0にて生育して、円形、中心凹状、
波状のコロニーを形成する。該コロニーの
表面は滑らかで光沢が有り、透明。 PH10.0にて生育して、円形、偏平状、全
縁のコロニーを形成する。該コロニーの表
面は滑らかで光沢が有り、クリーム色。Ｘ株：PH7.0にて生育して、円形、偏平状、
全縁のコロニーを形成する。該コロニーの
表面は滑らかで光沢有り、該周辺部はクリ
ーム色、該中心部は淡褐色。 PH10.0にて生育して、円形、偏平状、全
縁のコロニーを形成する。該コロニーの表
面は滑らかで光沢が有り、クリーム色ない
し淡褐色。 (2) 肉汁寒天斜面培養Ｙ株：PH7.0およびPH10.0にて拡帯状に生育
し、光沢のあるクリーム色ないし淡褐色の
コロニーを形成する。赤褐色の色素を僅か
に生成する。Ｐ株：PH7.0およびPH10.0にて帯状に生育し、
光沢のあるクリーム色の半透明なコロニー
を形成する。色素は生成しない。Ｋ株：PH7.0にて帯状に生育し、光沢のある
透明なコロニーを形成する。色素は生成し
ない。 PH10.0にて拡帯状に生育し、光沢のある
クリーム色のコロニーを形成する。色素は
生成しない。Ｘ株：PH7.0およびPH10.0にて拡帯状に生育
し、光沢のあるクリーム色のコロニーを形
成する。色素は生成しない。 (3) 肉汁液体培養Ｙ，Ｐ，Ｋ，Ｘ株：PH7.0にていずれも生育
するが、菌膜は形成しない。PH10.0にてい
ずれも生育が良好で、菌膜は形成しない。 (4) 肉汁ゼラチン穿刺培養Ｙ，Ｐ，Ｋ，Ｘ株：PH7.0にていずれも僅か
に液化する。 PH10.0にていずれも液化する。 (5) リトマス・ミルクＹ，Ｐ，Ｋ，Ｘ株：PH7.0にていずれも生育
が非常に悪い。 PH10.0にていずれも生育する。ミルクの
凝固は見られない。培地がアルカリ性のた
め、リトマスの変色は不明。Ｃ生理的性質〔Ｙ，Ｐ，Ｋ，Ｘ株とも同じ〕 (1) 硝酸塩の還元：陽性。 (2) 脱窒反応：陰性。 (3) MRテスト：陰性。 (4) VPテスト：陰性。 (5) インドールの生成：陰性。 (6) 硫化水素の生成：陰性。 (7) デンプンの加水分解：陽性。 (8) クエン酸の利用：Koserの培地では利用し
ない。Christensenの培地では僅かに利用す
る。 (9) 無機窒素源の利用：硝酸塩は利用しない。
アンモニウム塩は利用しない。 (10) 色素の生成：色素は生成しない。 (11) ウレアーゼ：陽性。 (12) オキシダーゼ：陽性。 (13) カタラーゼ：陽性。 (14) 生育の温度範囲：33ないし35℃付近（20
ないし47℃）が良好。 (15) 生育のPH範囲：10.0付近（6.0ないし12.0）
が良好。 (16) 酸素に対する態度：好気性。 (17) Ｏ−Ｆテスト：陰性。 (18) 糖類から酸およびガスの生成：（＋；生
成する −；生成しない）【表】【表】Ｄその他の性質 (1) 塩化ナトリウムに対する耐性：いずれの株
も10％NaCl下で生育する。 (2) Ｙ株、Ｐ株、Ｋ株およびＸ株は、いずれも
至適PHが10以上で洗浄剤成分共存下の高アル
カリ条件において優れた安定性を有し、尚か
つ洗浄力の改善に寄与するアルカリプロテア
ーゼを産生する。