CN1326995C - 一种利用生物表面活性剂提高绿色木霉纤维素酶活的方法 - Google Patents

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本发明涉及一种利用生物表面活性剂提高纤维素酶活的方法。本发明以绿色木霉(Trichoderma viride AF93252)生产纤维素酶，纤维素酶的生产以粉碎的稻草为碳源，加入适量无机营养盐，将铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa AB93066)产生的生物表面活性剂鼠李糖脂以0.1%～0.3%或0.01%～0.05%(w/v)的比例加入到绿色木霉的固态或者液态发酵培养基中，可以提高纤维素酶活力(以滤纸酶活计)，固态发酵酶活提高60%～70%，液态发酵酶活提高100%～120%。此方法简单、提高纤维素酶活的幅度较大，且具有能显著降低表面和界面张力，对生态系统的毒性较低，最终会被微生物降解等诸多优点，应用前景良好。

Description

一种利用生物表面活性剂提高绿色木霉纤维素酶活的方法
技术领域
本发明涉及提高酶活的方法，具体涉及一种利用生物表面活性剂提高纤维素酶活的方法。
背景技术
纤维素作为植物光合作用的主要多糖类产物，是地球上最为丰富的可再生性天然资源。无论是从资源利用的角度来说，还是从环保的角度出发，对纤维素的研究都具有积极而深远意义。利用纤维素酶将大量纤维素资源和纤维素废料转变成人类所需的物质是非常有效的途径。到目前为止，纤维素酶已广泛应用于工、农、畜、医、环境保护等领域中，并取得了初步成效。但由于纤维素酶活性不高，生产成本过高而导致其应用仍受到限制，因此研究提高纤维素酶活的方法意义重大。
从公开报道的文献中可以看到人们对纤维素酶的研究大多集中在高纤维素酶活菌株的培养、鉴定和筛选上以及研究在培养基加入促长剂如氮源、碳源、营养盐等，同时优化适合菌株生长的培养条件等。绿色木霉(Trichoderma viride)是一种纤维素酶系较全的真菌，分解纤维素类物质能力突出。但是，用于纤维素酶的生产，其所产的纤维素酶活力仍然不够高，一直是阻碍其大规模生产应用的瓶颈问题，因而有待于不断提高其产纤维素酶的活力。
鉴于木霉的纤维素酶是胞外酶，因此纤维素酶的分泌显然与细胞膜的透性有密切的关系，有人认为加入表面活性剂改变细胞膜的透性，加速酶的释放。目前已有在木霉培养基中加入化学合成的表面活性剂如Tween 80增加酶的产量的报道，但传统的化学表面活性剂不易被微生物降解，可能对环境造成新的污染，因此研究利用一种既能显著降低表面和界面张力，又对生态系统的毒性较低，最终会被微生物降解的表面活性剂则是提高纤维素酶活的重要途径。
发明内容
本发明旨在研究一种用生物表面活性剂提高纤维素酶活的方法。
本发明是通过以下技术方案实现上述发明目的的。
利用生物表面活性剂提高纤维素酶活的方法为由铜绿假单胞菌制备鼠李糖脂、绿色木霉生产纤维素酶，本发明在产纤维素酶的绿色木霉(Trichoderma viride)CCTCCAF93252的固态或液态培养基中加入生物表面活性剂—鼠李糖脂，鼠李糖脂的加入量，固态发酵为0.1％～0.3％(w/v)，液态发酵为0.01％～0.05％(w/v)。
下面结合附图进一步详述本发明。
附图说明：
图1为液态发酵过程中加入鼠李糖脂及Tween 80对滤纸酶活(FPA)的影响；
图2固态发酵过程中加入鼠李糖脂及Tween 80对滤纸酶活(FPA)的影响。
生物表面活性剂鼠李糖脂是由铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginose)经液态发酵培养产生，培养温度为36～38℃，经萃取及旋转蒸发提纯得到鼠李糖脂产品。
纤维素酶的生产培养基是Mandels无机营养液和稻草粉或玉米秸秆粉的组合。液态发酵培养基为Mandels无机营养液中添加1.0％～1.5％的稻草粉(粉碎后过40目筛)，同时加入0.01％～0.05％(w/v)的鼠李糖脂，初始pH值5.0～5.5。固态发酵培养基是稻草粉，加入强化Mandels无机营养液，使含水率达到65％～75％，初始pH值5.0～5.5，同时加入0.1％～0.3％(w/v)的鼠李糖脂。
Mandels无机营养液成份：KH2PO4 2.0g/L、(NH4)2SO4 1.4g/L、CaCl2 0.3g/L、尿素0.3g/L、MgSO4·7H2O 0.3g/L、FeSO4·7H2O 5.0×10-3g/L、MnSO4·H2O1.6×10-3g/L、ZnSO4 1.4×10-3g/L、CoCl2 2.0×10-3g/L
强化Mandels无机营养液除(NH4)2SO4为10g/L外，其它成分同Mandels无机营养液。
1、鼠李糖脂的制备
1)铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginose)购自中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏号为AB93066，菌种转接保藏在牛肉膏蛋白胨斜面培养基上，培养基成分为：牛肉膏2.0g/L，蛋白胨5.0g/L，NaCl 5.0g/L，琼脂20.0g/L，pH7.0。将铜绿假单胞菌从斜面培养基接种至种子培养基中，进行摇瓶培养，500ml的三角瓶装培养液100ml，37℃、200rpm振荡培养24小时；
2)在5L的全自动发酵罐中装入3L以植物油为碳源的发酵培养基；接种铜绿假单胞菌种子培养液100mL，温度37℃，搅拌转速500转/分，通气量为1.2vvm，用HCl和NaOH控制pH值6.5，发酵时间为76小时，得到含表面活性剂的培养液，经测定发酵液的表面张力为33.3mN/m；
3)将发酵液离心(8000rpm)除去菌体，得到上清液为鼠李糖脂溶液。
4)将得到的上清液的pH值调至2.0；用氯仿/甲醇＝2/1的萃取液等体积萃取，静置分层；取下层萃取液置于旋转蒸发器中，在低压、40℃条件下蒸干溶剂，得到鼠李糖脂产品。
种子培养基与发酵培养基成分如下：
  种子培养基  发酵培养基
  葡萄糖   18.0g/L   -
  植物油   -   50g/L
  NaNO3   2.00g/L   4.5g/L
  KH2PO4   1.00g/L   2.5g/L
  Na2HPO4.2H2O   1.00g/L   2.5g/L
  MgSO4.7H2O   1.00g/L   1.00g/L
  FeSO4.7H2O   0.01g/L   0.01g/L
  pH   6.5   6.5
2、纤维素酶的生产
1)绿色木霉(Trichoderma viride)购自中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏号为AF93252，菌种转接保藏在土豆葡萄糖琼脂培养基上，培养基成分为：土豆500g/L、葡萄糖20g/L、琼脂20g/L，pH自然。
2)液态发酵
液态发酵培养基：Mandels无机营养液中添加1.0％～1.5％的稻草粉(粉碎后过40目筛)，同时加入0.01％～0.05％(w/v)的鼠李糖脂，初始pH值5.0～5.5。培养基灭菌后接种绿色木霉种子液，28℃～30℃培养4～5天。离心去除固形物得到纤维素酶液。
3)固态发酵
固态发酵培养基：稻草粉，加入强化Mandels无机营养液，使含水率达到65％～75％，初始pH值5.0～5.5，同时加入0.1％～0.3％(w/v)的鼠李糖脂。培养基灭菌后接种绿色木霉种子液，28℃～30℃培养5～6天。将得到的固体曲加水置于摇床上浸提2h，离心除去固形物，上清液即纤维素酶液。
产纤维素酶的微生物很多，绿色木霉是产纤维素酶最高的菌种之一，但是产酶菌株酶活力不高，造成纤维素物质不能得以充分利用和分解。本发明在绿色木霉的液态或固态发酵培养基中分别添加0.01％～0.05％或0.1％～0.3％(w/v)的生物表面活性剂鼠李糖脂，从而改变细胞膜的透性，或者改变膜的选择性，加速纤维素酶的释放，提高酶的产量。此方法简单、提高绿色木霉所产纤维素酶活的幅度达60％～100％，且具有能显著降低表面和界面张力，对生态系统的毒性较低，最终会被微生物降解等诸多优点，有良好的应用前景。
具体实施方式
实施例1固态发酵过程中提高纤维素酶活的方法
1、发酵原料准备
用植物粉碎机将稻草粉碎，放入大型灭菌锅中，在121℃下蒸煮1h，烘干备用。
2、发酵培养基的制备
将0.3％的鼠李糖脂加入配好的强化Mandels无机营养液中，再加入到准备好的发酵原料稻草粉中，混合均匀。其中，固液比为1∶2，pH值5.5，制得固态发酵培养基。121℃，0.1Mpa下灭菌30min。
3、接种及发酵
在无菌环境下将绿色木霉液体种子接入固态培养基，接种量为相对于固体料重的5％。混合均匀，送入密闭容器进行固态发酵，接压缩机提供无菌空气，通气量为0.1m3/(h·kg)。培养温度为28℃，发酵周期为5天。
绿色木霉液体种子液为10％麸皮种子液，配制方法：10g麸皮+100g水煮沸20min，过滤后稀释到100mL。配好的种子液在115℃下灭菌20min。冷却后，接入斜面孢子，28℃下150rmp摇床培养2天。
4、酶液的制备与酶活
将得到的固体曲分装，分别加入相对于发酵产物重的20倍蒸馏水，置于摇床上以200rpm的速度浸提2h，以8000rmp离心除去固形物，上清液即纤维素酶液。
相同的培养基，将加入的0.3％生物表面活性剂鼠李糖脂用化学合成的表面活性剂Tween 80替换，其他步骤同上述的1～4步，用以对比加入两种类型表面活性剂对滤纸酶活(FPA)的影响，结果见图1。
实施例2液态发酵过程中提高纤维素酶活的方法
1、发酵原料的准备
用植物粉碎机将稻草粉碎，放入大型灭菌锅中，在121℃下蒸煮1h，烘干备用。
2、发酵培养基的制备
将0.04％的鼠李糖脂加入配好的Mandels无机营养液中，加入准备好的原料稻草粉1.5％，pH值5.5，得到液态发酵培养基。121℃，0.1Mpa下灭菌30min。
3、接种及发酵
在无菌环境下，在5L的全自动发酵罐中装入3L液体发酵培养基，接种绿色木霉液体种子即10％麸皮种子液，接种量为5％(v/v)，搅拌转速400rpm，通气量为1.2vvm。培养温度为28℃，发酵周期为4天。
10％麸皮种子液配制方法：10g麸皮+100g水煮沸20min，过滤后稀释到100mL。配好的种子液在115℃下灭菌20min。冷却后，接入斜面孢子，28℃下150rmp摇床培养2天。
4、酶液的制备与酶活
将得到发酵液以8000rmp离心除去固形物，上清液即纤维素酶液。
相同的培养基，将加入的0.04％生物表面活性剂鼠李糖脂用化学合成的表面活性剂Tween 80替换，其他步骤同上述的1～4步，用以对比加入两种类型表面活性剂对滤纸酶活(FPA)的影响，结果见图2。

Claims (1)

1、一种利用生物表面活性剂提高纤维素酶活的方法，包括由铜绿假单胞菌制备鼠李糖脂、纤维素酶的生产，其特征在于在产纤维素酶的绿色木霉(Trichoderma viride)CCTCC AF93252的固态或液态培养基中加入生物表面活性剂—鼠李糖脂，鼠李糖脂的加入量，按其加入的重量与培养基体积比，固态发酵为0.1％～0.3％，液态发酵为0.01％～0.05％。
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