CN103497919B - 一种复合微生物秸秆降解菌剂及其制备方法和应用 - Google Patents

一种复合微生物秸秆降解菌剂及其制备方法和应用 Download PDF

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本发明涉及一种复合微生物秸秆降解菌剂,其特征在于,包括:长柄木霉1.0×103-5.0×104cfu/mL,假单胞菌属菌株B6-155.0×108-1.0×1010cfu/mL。本发明所得复合微生物秸秆降解菌剂在20-25℃,15天左右就可使秸秆基本腐解,降解率可达58%。本发明微生物复合菌剂适应北方地区,能够在较低温度环境下,秸秆降解率高,并且具有菌体生长速率快,培养条件温和的特点。

Description

一种复合微生物秸秆降解菌剂及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及一种复合微生物秸秆降解菌剂,具体地说,涉及一种用于玉米等农作物秸秆的快速腐熟降解的菌剂。本发明还涉及所述复合微生物秸秆降解菌剂的制备方法以及应用。
背景技术
我国是农业大国,每年产生的秸秆6亿吨以上,20世纪90年代后期以来,随着农作物单产提高,秸秆总量迅速增加,广大农民为赶农时、抢播种、图省事,多数地区就开始集中出现秸秆焚烧现象。大面积焚烧秸秆的现象不仅造成了极大的环境污染,而且浪费了宝贵的生物资源。
环境中的微生物具有增殖速度快、功能丰富多样、适应性强等特点,应用微生物学方法腐解处理秸秆具有其他物理化学方法不可替代的优点,应用前景广阔。秸秆中纤维素结构及其复杂,单一微生物对纤维素的分解能力非常弱。由于分解秸秆的“三素酶”是多酶体系,酶组分之间存在着明显的协同作用,所以,要求多菌株的配合、相互补充,才能促进纤维素类物质的分解,尤其是细菌与真菌之间具有比较强的相互作用。纤维素分解菌与木质素分解菌对稻草和小麦的联合分解能力明显高于任何一个单一菌株。所以充分利用自然界多种微生物的协同关系,人工筛选构建能够产生多种纤维素酶的高效稳定菌株复合系,不仅能够解决环境污染问题,还能够为作物土壤提供大量的矿物质和有机质,改良土壤结构,促进农业生产。秸秆还田的作用归纳为:“当年增产,常年改土,灾年保苗,切实可行,简便有效”。
国内现有的秸秆腐熟剂很多,但大都由于环境温度或菌体生长速度的限制而对秸秆的降解效果大打折扣,因此针对于北方低温环境而研发的复合菌剂非常必要。
发明内容
本发明针对北方低温环境下玉米等农作物秸秆降解困难,降解时间长的问题,提供一种适合北方环境的复合微生物秸秆降解菌剂,促进秸秆的快速腐熟并起到改良土壤特性的目的。
本发明从126株细菌、真菌中挑选的纤维素降解率、生长速度和酶活较高的菌株,长柄木霉(Trichoderma longibrachiatum)和假单胞菌属(Pseudomonas sp.)菌株B6-15,经过配比优化后组成微生物复合菌剂,用以促进低温环境下秸秆的快速降解。
一种复合微生物秸秆降解菌剂,其组成为:
长柄木霉                 1.0×103-5.0×104cfu/mL,
假单胞菌属菌株B6-15      5.0×108-1.0×1010cfu/mL。
总菌数达到1.0×108cfu/mL以上即可。
优选地,所述复合微生物秸秆降解菌剂,其组成为:
长柄木霉                 1.0×104-3.0×104cfu/mL,
假单胞菌属菌株B6-15      1.0×109-8.0×109cfu/mL。
更进一步优选,所述复合微生物秸秆降解菌剂,其组成为:
长柄木霉                 2.0×104cfu/mL,
假单胞菌属菌株B6-15      5.0×109cfu/mL。
本发明所述的长柄木霉(Trichoderma longibrachiatum)为北京沃土天地生物科技有限公司所出售的产品;
所述的假单胞菌属(Pseudomonas sp.)菌株B6-15,保藏号CGMCCNO.5851。
本发明还提供上述复合微生物秸秆降解菌剂的制备方法,包括如下步骤:
1).斜面培养:将长柄木霉、假单胞菌属菌株B6-15两种原始菌种在无菌条件下分别接种于固体培养基表面,活化菌株;
2).一级种子培养:将步骤1)活化的菌种在无菌条件下分别接种于液体培养基,150-180rpm摇床培养;
3).混合发酵培养:将步骤2)一级种子接种于液体培养基中,进行复合菌剂摇床培养,得到复合微生物秸秆降解菌剂。
上述制备方法中,在步骤1)中,将长柄木霉在15-38℃条件下接种于PDA固体培养基上培养3-5天;假单胞菌属菌株B6-15在15-30℃条件下接种于NA固体培养基上,培养2-3天。
在步骤2)中,长柄木霉15-38℃条件下接种PDA液体培养基中摇床培养2-4天;假单胞菌属菌株B6-15在15-30℃条件下接种于NA液体培养基中摇床培养3-5天;
在步骤3)中,接种量为液体培养基的体积的0.5-2%,优选1%;
在步骤3)中,所述混合发酵培养条件:温度15-25℃;150-200rpm,优选160rpm;培养3-5天。
本发明所述PDA培养基成分表如下:
本发明所述NA培养基成分表如下:
本发明还提供了所述复合微生物秸秆降解菌剂在促进玉米等农作物秸秆腐熟、改良作物土壤特性方面的应用。具体方法是将复合微生物秸秆降解菌剂以2-3kg/亩洒于秸秆中,在环境温度20-25℃下进行快速腐熟。
本发明所得复合微生物秸秆降解菌剂在20-25℃,15天左右就可使秸秆基本腐解,降解率可达58%。本发明微生物复合菌剂适应北方地区,能够在较低温度环境下,秸秆降解率高,并且具有菌体生长速率快,培养条件温和的特点。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明,但不用来限制本发明的范围。
实施例1
复合微生物秸秆降解菌剂的组成:
长柄木霉                 2.0×104cfu/mL;
假单胞菌属菌株B6-15      5.0×109cfu/mL。
上述复合微生物秸秆降解菌剂的制备方法,包括如下步骤:
1).斜面培养:将长柄木霉、假单胞菌属菌株B6-15两种原始菌种在无菌条件下分别接种于固体培养基表面,活化菌株;
2).一级种子培养:将步骤1)活化的菌种在无菌条件下分别接种于液体培养基,160rpm摇床培养;
3).混合发酵培养:将步骤2)一级种子接种于液体培养基中,进行复合菌剂摇床培养,得到复合微生物秸秆降解菌剂。
上述制备方法中,在步骤1)中,将长柄木霉在30℃条件下接种于PDA固体培养基上培养4天;假单胞菌属菌株B6-15在30℃条件下接种于NA固体培养基上,培养3天。
在步骤2)中,长柄木霉25℃条件下接种PDA液体培养基中摇床培养3天;假单胞菌属菌株B6-15在25℃条件下接种于NA液体培养基中摇床培养3天;
在步骤3)中,接种量为液体培养基的体积的1%;
在步骤3)中,所述混合发酵培养条件:温度25℃;160rpm;培养5天。
实施例2
复合微生物秸秆降解菌剂的组成:
长柄木霉                 1.0×104cfu/mL;
假单胞菌属菌株B6-15      1.0×109cfu/mL。
所述菌剂制备方法同实施例1。区别在于:
在步骤1)中,将长柄木霉在15℃条件下接种于PDA固体培养基上培养5天;假单胞菌属菌株B6-15在15℃条件下接种于NA固体培养基上,培养3天。
在步骤2)中,长柄木霉15℃条件下接种PDA液体培养基中摇床培养3天;假单胞菌属菌株B6-15在15℃条件下接种于NA液体培养基中摇床培养3天;
在步骤3)中,接种量为液体培养基的体积的0.5%;
在步骤3)中,所述混合发酵培养条件:温度15℃;200rpm;培养4天。
实施例3
复合微生物秸秆降解菌剂的组成:
长柄木霉                 3.0×104cfu/mL;
假单胞菌属菌株B6-15      8.0×109cfu/mL。
所述菌剂制备方法同实施例1。区别在于:
在步骤1)中,将长柄木霉在38℃条件下接种于PDA固体培养基上培养3天;假单胞菌属菌株B6-15在38℃条件下接种于NA固体培养基上,培养2天。
在步骤2)中,长柄木霉38℃条件下接种PDA液体培养基中摇床培养2天;假单胞菌属菌株B6-15在30℃条件下接种于NA液体培养基中摇床培养3天;
在步骤3)中,接种量为液体培养基的体积的2%;
在步骤3)中,所述混合发酵培养条件:温度20℃;150rpm;培养5天。
实验例1   菌株筛选
假单胞菌属菌株B6-15的生长曲线测定方法如下:将一级种子液在无菌条件下按液体培养基体积的1%接种于NA液体培养基中,于25℃,160rpm条件下培养,每隔4h于无菌环境中取培养液1ml,在600nm下测定其吸光度。同时以枯草芽孢杆菌为对照例1、地衣芽孢杆菌为对照例2。测定结果如表1所示。
表1  菌株B6-15的生长测定
由表1可知,假单胞菌属菌株B6-15最先进入对数期并且到达稳定期的吸光度最大,为2.37,而枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌的最大吸光度分别为1.38和1.522。因此,假单胞菌属菌株B6-15的生长速率最快。
长柄木霉的生长曲线测定方法如下:将培养于固体平板上的木霉菌株,用灭过菌的打孔器,于无菌环境下取直径为0.3cm的培养基块,接种于PDA固体平板上,每隔8h测定其菌落直径。并以绿色木霉为对照例1、康氏木霉为对照例2。测定结果如表2所示。
表2  长柄木霉的生长测定
菌落直径 0h 8h 16h 24h 32h 40h 48h 56h
长柄木霉 0.3 0.36 1.00 1.16 3.43 4.41 4.5 4.5
绿色木霉 0.3 0.33 0.60 0.60 2.20 4.23 4.36 4.5
康氏木霉 0.3 0.36 0.46 0.533 2.06 4.15 4.37 4.5
由表2可知,长柄木霉16h后生长速率明显快于对照例1和对照例2,在48h即达到最大菌落直径4.5cm,而对照例1和对照例2达到最大菌落直径的时间均为56h,因此,长柄木霉的生长速率比较快。
实验例2   微生物复合菌剂的酶活测定
将实施例1-3所得的复合菌剂分别按照培养基体积1%的量接种于纤维素发酵培养基中,于25℃、160rpm下培养3天后测定其纤维素酶活力。按照此方法做对比试验。
其中,纤维素发酵培养基具体成分表如下:
对照例1组成:长柄木霉2.0×104cfu/mL;
对照例2的组成:假单胞菌属菌株B6-155.0×109cfu/mL。
测定方法:以滤纸为底物,利用3,5-二硝基水杨酸(DNS)法测定纤维素酶活力,并于540nm处测定吸光值。将每分钟水解纤维素产生1μg葡萄糖所需要的酶量定义为1个酶活力单位(U)。结果见表3。
表3  实施例1-3及对照例1-2的纤维素水解酶活力测定
实施例1 实施例2 实施例3 对照例1 对照例2
540nm吸光度 18.5U/ml 15.7U/ml 16.5U/ml 8.3U/ml 9.6U/ml
由表3所示,实施例1-3的纤维素酶活力均明显高于对照例,更够有效降解秸秆。
实验例3   微生物复合菌剂的降解率
将实施例1-3所得复合菌剂按培养基体积1%的比例分别接种于NA液体培养基中,培养基中加入长度为6cm的玉米秸秆,分别于20℃、22℃、25℃,160rpm下培养15天,洗净烘干玉米秸秆后测定其失重率即为降解率。按照此方法做对比试验。降解结果如表4。
对照例1组成:长柄木霉2.0×104cfu/mL;
对照例2组成:假单胞菌属菌株B6-155.0×109cfu/mL。
表4  实施例1-3及对照例1-2的降解率测定
降解率 实施例1 实施例2 实施例3 对照例1 对照例2
20℃ 43% 38% 51% 20% 17%
22℃ 45% 38% 55% 24% 21%
25℃ 51% 42% 58% 34% 27%
由表4所示,实施例1-3对玉米秸秆的降解率在20-25℃低温环境下依然显著高于对照例,最大可达到对照例的2.22倍,说明本发明所得复合微生物菌剂能够在北方低温地区实现促进秸秆快速腐熟的目的。
将本发明所得复合菌剂以2kg/亩洒于秸秆地中,在环境温度20-25℃下同样能够实现秸秆快速腐熟的效果。
虽然,上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述,但在本发明基础上,可以对之作一些修改或改进,这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此,在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进,均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种复合微生物秸秆降解菌剂,其特征在于,由如下组分组成:
长柄木霉                 1.0×103-5.0×104cfu/mL,
假单胞菌属菌株B6-15      5.0×108-1.0×1010cfu/mL。
2.根据权利要求1所述的菌剂,其特征在于,由如下组分组成:长柄木霉                    1.0×104-3.0×104cfu/mL,
假单胞菌属菌株B6-15     1.0×109-8.0×109cfu/mL。
3.权利要求1或2所述菌剂的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:
1).斜面培养:将长柄木霉、假单胞菌属菌株B6-15两种原始菌种在无菌条件下分别接种于固体培养基表面,活化菌株;
2).一级种子培养:将步骤1)活化的菌种在无菌条件下分别接种于液体培养基,150-180rpm摇床培养;
3).混合发酵培养:将步骤2)一级种子接种于液体培养基中,进行复合菌剂摇床培养,得到复合微生物秸秆降解菌剂。
4.根据权利要求3所述的制备方法,其特征在于,在步骤1)中,将长柄木霉在15-38℃条件下接种于PDA固体培养基上培养3-5天。
5.根据权利要求3所述的制备方法,其特征在于,在步骤1)中,假单胞菌属菌株B6-15在15-30℃条件下接种于NA固体培养基上,培养2-3天。
6.根据权利要求3所述的制备方法,其特征在于,在步骤2)中,长柄木霉在15-38℃条件下接种PDA液体培养基中摇床培养2-4天。
7.根据权利要求3所述的制备方法,其特征在于,在步骤2)中,假单胞菌属菌株B6-15在15-30℃条件下接种于NA液体培养基中摇床培养3-5天。
8.根据权利要求3所述的制备方法,其特征在于,在步骤3)中,接种量为液体培养基的体积的0.5-2%。
9.根据权利要求3所述的制备方法,其特征在于,在步骤3)中,所述混合发酵培养条件:温度15-25℃;150-200rpm;培养3-5天。
10.权利要求1或2所述菌剂在促进农作物秸秆腐熟、改良作物土壤特性方面的应用。
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Denomination of invention: Compound microorganism straw-degrading bacteria agent and preparation method and application thereof

Effective date of registration: 20180518

Granted publication date: 20150408

Pledgee: Zhongguancun Beijing technology financing Company limited by guarantee

Pledgor: BEIJING VOTO BIOTECH Co.,Ltd.

Registration number: 2018990000378

PC01 Cancellation of the registration of the contract for pledge of patent right
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Date of cancellation: 20231023

Granted publication date: 20150408

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