JPS6027385A - セルラ−ゼの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はセルラーゼの製造法に関する。

本発明はトリコデルマ属に属し、グルコースの存在下で
もセルラーゼを生成させる能力を有するセルラーゼ生産
菌を培地に培養し、培養物中にセルラーゼを生成蓄積さ
せ、蓄積したセルラーゼを採取することを特徴とするセ
ルラーゼの製造法を提供する。

本明細書においてセルラーゼとけ、β−グルカナーゼ（
エンド−β−グルカナーゼおよびエキソ−β−グルカナ
ーゼの両者を含む）およびβ−グルコシダーゼをいう。

これらの酵素は、セルロースの加水分解に関与する公知
の酵素群である。

セルラーゼ生産能を有する細菌を用いた発酵法によるセ
ルラーゼの製造法は公知であるが、なかでも糸状菌トリ
コデルマ属に属する菌株たとえばトリコデルマ・リーセ
イは、セルラーゼの蓄積量が最も大きいといわれている
。しかし、この場合でも、培養物中に充分な量のセルラ
ーゼを蓄積するには、１週間以上の培養期間を必要とす
るので、セルラーゼの蓄積量を高めることが要求されて
いる。セルラーゼ生産においてはその培地中に誘導物質
であるセルロースを存在させることが必要である。しか
しセルロースの分解産物であるグルコース等が培養物中
に存在すると、これがセルラーゼの生産を抑制する。従
ってグルコースノ存在下テモセルラーゼ生産能の抑制さ
れないセルラーゼ生産菌がめられている。

本発明者はトリコデルマ属に属するセルラーゼ生産菌を
変異処理することによって、グルコースの存在下でもセ
ルラーゼを生成する能力をもっ突然変異株を見出した。

本発明は、この種の突然変異株を培地に培養することに
よって収率よ〈セルラーゼを得ることができる。という
知見に基づくものである。

以下に、本発明の詳細な説明する。本発明に用いられる
微生物は、トリコデルマ属に属し、グルコースの存在下
でもセルラーゼを生成する能力をもつ菌株であればよい
。好適な菌株の例は、突然変異株トリコデルマ・リーセ
イＫＤＤ　−１０（ＮＲＲＬ１５４９７　）およびＤＧ
Ｄ　−１６−７（ＮＲＲＬ　１５４９８　）であり、こ
れらの菌株は米国ＮＲＲＬにブタペスト条約の規定によ
り国際寄託されている。トリコデルマ。

リーセイの菌学的性質はＥ、　Ｇ、　Ｓｉｍｍｏｎｓ　
、　Ａｂｓｔ。

２ｎｄ　Ｉｎｔ’１．Ｍｙｃｏｌ、　ｃｏｎｇ、　、　
Ｔａｍｐａ　、１Ｆｌｏｒｉｄａ　、　Ａｕ　−ｇｕｓ
ｔ　１９７７、ｐ６１８　Ｋ記載されている。上記の突
然変異株はたとえば次の方法によって得られる。

親株として、グルコース存在下でセルラーゼ生産が抑制
されるＱＭ　９４１４　（ＡＴＣＣ２６９２１）を用い
、とれをポテトデキストローズ寒天斜面培地上で、５℃
、７日間培養し、胞子を十分形成させた。生成した胞子
を生理的食塩水に懸濁しく約１〜３×１０７個／ｄ）、
Ｎ−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジンと
反応させた（　３００γ／耐、ｐＨ７，０，３０℃、３
０〜１２０分）。この胞子懸濁液を平板あたり１００〜
３００胞子／４になるよう希釈し、第２表に示す組成の
培地（グルコース濃度は５条）を有する寒天平板に塗布
して、３０℃で３〜５日間培養し、生育してきたコロニ
ーを釣菌した。グルコース存在下でのセルラーゼ生産能
はコロニーの周囲に生成する透明帯の直径で評価できる
。この手法で５優グルコース存在下でもセルラーゼ生産
能の高まった変異株を選択した。このようにしてグルコ
ース存在下でもセルラーゼ生産能の高まった変異株ＫＩ
Ｍ）　−１０ｊｌ？よびＤＧＤ　−１６−７を作出した
。

こうして得られた変異株の性状を親株と比較すると、第
１表の通りである。

第　１　表 Ｃ）ｔ、４　９４１４　掛　廿　十 ＫＴ）Ｄ−１０＋　４什　− Ｄ（）Ｄ−１６−７千　十　− 次に、これら３株のグルコース存在下でのセルラーゼの
生産能力を調べた。実験￥ｉ第２表の培地を含む寒天平
板を用いる方法と、液体培養法の２通り−ｒ実ｍｔ、た
。ＱＭ　９４１４、ＫＤＤ　−１０オｊ：びＤＧＤ−１
６−７の３株をポテトデキストローズ寒天斜面培地上で
５℃、７日間培養し、胞子を充分形成させ、この胞子を
白金耳で第２表の組成の培地の殊天平板上に植菌し、（
資）℃、３日間培養した結果を第３表に示す。

第　２　表 Ｎａ２ＨＰＯ４５，９ Ｍｇ５ｏ、−７ＨａＯ２００Ｗ　１１　（ｐＨ５，０）
ＦｅＳＯ４４Ｈ２０１ｍ９ ＣａＣ１２・２Ｈ２０１■ トリメンＸ−１，００，１１１ 元の親株がグルコースの存在でセルラーゼの生産が阻害
されるのに対し、ＫＤＤ　−１０およびＤＱＩ〕−１６
−７の２株とも、グルコースの存在下でもセルラーゼの
生産能を有している。

この場合のセルラーゼは、寒天平板にて評価゛され、エ
ンド−β−グルカナーゼ、エキソ−β−グルカナーゼ及
びβ−グルコシダーゼのＩＩ／合作用の結果を示す。所
望により、液体培養を用いると、これらを個別に評価で
尊る。

この結果の詳細は実ｔＡ例中に記す。Ｋｌ’）ｌ）　−
１１’）およびＤＧＤ　−１６−７を液体培養すると、
エンド−β−グルカナーゼ、エキソ−β−グルカナーゼ
シｊ１グルコースが０．５〜３チ培地中に存在しても、
その生産能力は抑制を受けず、むしろグルコース無添加
の培地の場合よりも上記２つの酵素活性は増大した。さ
らに、グルコースを添加すると、０Ｍ９４１４ではグル
コース無添加の場合よりもセルラーゼの生産開始時期が
大巾に遅れる。しかし、ＫＩＴｌＴ’）　−１０および
ＤＧＤ−１６−７の２株では、グルコース無姉加の場合
と嫌とんど同時期からセルラーゼの生成を開始した。こ
れらの菌株のエンド−β−グルカナーゼとエキソ−β−
グルカナーゼは親株の１．３〜１．７倍の活性を得たが
、β−グルコシターゼの活性は親株とほとんど同程度で
あった。

セルラーゼ活性を次の方法で、エンド−β−グルカナー
ゼの測定如はカルボキシメチルセルロース・ナトリウム
塩を基質とし、生成する還元糖の葉で測定した。すなわ
ち、カルボキシメチルセルロース・ナトリウムｉｉｏｇ
をｐＨ５の０．１　Ｍ酢酸緩衝液１１に溶解する。この
溶液５００μ！に蒸留水４５０μｅ及び測定される酵素
液を適当に希釈したもの（７）μｌを添加し、４５℃で
（資）分間反応させる。反応液を沸騰水中ＶＣ１０分間
放置して反応を停市させる。

生成した還元糖をソモジ・ネルノン法により定清する。

１分間にグルコース換算で１μｍｏｌの還元糖を生成す
る酵素活性を１単位と表示する。

エキソ−β−グルカナーゼの測定には、アビセルｓｐ（
旭化成社製）を基質とし生成する還元糖の量で測定した
。すなわち、０．１４ＶのアビセルＳＦをｐＨ５の０．
２Ｍ酢酸緩衝液４ｄに均一に懸濁して、この懸濁液に測
定する酵素液を適当に希釈したもの１ゴを加え、４５℃
でω分間反応させる。以下、エンド−β−グルカナーゼ
の場合と同様である。

β−グルコシダーゼの測定には、ｐ−ニド調フェニルー
β−Ｄ−グルコピラノシドを用いる方法で実施した。す
なわち、ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−グルコピラノシ
ドをｐＨ５の０．０５Ｍ酢酸緩衝液に溶解し、２ｍＭの
溶液を作る。この溶液１−に測定する酵素液を適当に希
釈したものを加μｊを加え、４５℃で１０分間反応し、
１Ｍ炭酸ナトリウム２−を添加し反応を停止した。生成
したＤ−ニトロフェノールの量を０Ｄ４０５　ｎｍで比
色定−ｍ：　スル。

１分間に１μｍｏｌのｐ−ニトロフェノールを生成させ
る酵素活性を１単位とする。

本発明に利用される菌株の培養法は、公知のトリコデル
マ・リーセイに属する菌株の培養法と同様である。培地
としては炭素源、窒素源のほか所望により無機塩類その
他の栄養物を含有する天然培地や合成培地が用いられる
。炭素源としてはろ紙、紙類、バガス、もみがら、稲わ
ら、大豆粕などの植物繊維質およびその含有物を用いる
ことができる。またシュークロース、クルコース、ケー
ンモラセス、グリセロール、セロビオースなどセルラー
ゼ生産ＶＣ力価の低下につながらない濃度の糖源ならば
上記炭素源との併用も可能である。窒素源としては、硫
安などの無機アンモニウム塩および尿素、アミノ酸、肉
エキス、ベゾトンなどの有機窒素源が使用できる。その
他、ＫＴ（２ＰＯいＩＪ１７ＳＯ，、ＣａＣＡ！２、Ｆ
ｅＳ［）、　、　ＺｎＳＯ４などの無機塩類が使用され
る。培養温度朗℃〜３２℃の範囲で、通気条件下では通
常４日〜１０日でセルラーゼ活性が最大となる。

培養終了後、培養物またはそれから調製された酵素製剤
をセルロース加水分解等に公知の手法で使用することが
できる。

実施例１ トリコデルマ・リーセイＱＭ　９４１４　、ＫＤＤ　−
１０およびＩ’１Ｇｒ）　−１６−７の３株をポテトデ
キストローズ寒天培地（ｐＨ５゜５）上で５℃、７日間
それぞれ培養する。生成した胞子を下記の組成の培地及
びこれに３チグルコースを添加した培地５０ｄ（３００
１Ｅｊ容三角フラスコ）に接種し、四℃、８日間振盪培
養した。なお、本実施例において、ｐＨコントロールの
ため５０　ｍＭの酒石酸緩衝液（ｐＨ４）をあらかじめ
培地に添加した。

アゼビルｐＨ３０１１０ＩＩ ＫＨａＳＯ４２９ （ＮＨ４）２ＳＯ４１、４ｇ Ｉリペプトン　１ｇ 酵母エキス　０．５９ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２００，３，！９ Ｃａ（Ｊ２−２Ｈ２００，３ｇ ツイーン８０１ｇ 微量金属液　ＩＩ！／ ＩＪ（ｐ）（４，０） 微量金属液 Ｉ（３ＢＯ，’　６ツ （ＮＨａ　）６ＭＯ７０２４・４Ｔ（２０２６■ＦｅＣ
Ａｔ３・６Ｈ２０１００１１９ ＣＩＩＳＯ，・５１４２０　４０　ｍ’！ＭｎＣＪｇ　
・４’Ｈ２０８”Ｑ ＺｎＣｈ　２００　”９１ ００　ｄ 培養の経時変化の例を第１図に示したが、ＱＭ９４１４
はグルコースが完全に消費されたのち、１日後ニセルラ
ーゼ（エンド−β−グルカナーゼ）を生成しはじめ、グ
ルコース無添加の場合よりもセルラーゼの生産開始が約
２日関連れてｂた。それに対し、ＫＤＤ　−１０および
ＤＧＤ　−１６’　−７はグルコースがまだ多量に存在
している培養開始後１〜１．５日でセルラーゼを生産は
じめ、グルコース無添加の場合とほとんど差がなかった
。

培養の結果、第４表に示したセルラーゼ活性を得だが、
Ｑ）Ｊ９４１４はグルコースの添加効果が認められなか
ったのに対し、ＫＤＤ　−１０およびＴ）ＧＤ　−１６
−７はグルコースの無添加の場合の１．３〜１．６倍の
エンド−β−グルカナーゼおよびエキソ−β−グルカナ
ーゼの活性が得られた。β−グルコシダーゼについては
３株ともグルコース添加−により活性は低下していた。

第　４　表 ＱＭ　９４１４　２８．　２．０　１．０−：に、ＤＤ
　−１０３２２，６０，６ＱＭ　９４１４　２９　１．
８　０．５＋　ＫＤＤ−１０４８３，６０，５ ＤＧＤ−１６−７３９３，２０，６

【図面の簡単な説明】

第１図は実施例１においてＱＭ９４１４、ＫＤＤ　−１
０およびＤＧ、Ｄ　−１，６−７を用いて培養した場合
のグルコースの消費とセルラーゼの生産開始時期の関係
を示す。 ・・・・・　：クルコース無添加 一：〃　添加

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. トリコデルマ属に属し、グルコースの存在下でもセルラ
   ーゼを生成する能力を有するセルラーゼ生産菌を培地に
   培養し、培養物中にセルラーゼを生成蓄積させ、蓄積し
   たセルラーゼを、採取することを特徴とするセルラーゼ
   の製造法。