DD278359A1 - Verfahren zur gewinnung von cellulase-enzymkomplexen - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung von Cellulase-Enzymkomplexen. Moegliche Anwendungen bestehen in Produktionsanlagen, wo solche Enzyme erzeugt werden. Die hergestellten Cellulase-Enzymkomplexe sind beispielsweise fuer den Einsatz in der Nahrungsgueter- und Getraenkeindustrie, der Landwirtschaft und Textilindustrie geeignet. Die Gewinnung der Cellulase-Enzymkomplexe erfolgt durch aerobe Submerszuechtung einer neuen Penicillium verruculosum-Mutante, welche eine reduzierte Katabolitrepression der Cellulasebildung aufweist. Als Kohlenstoffquelle bei der Fermentation dienen induzierende Substrate allein oder in Kombination mit nichtinduzierenden Substraten. Durch Wahl des Substrates sowie des p H-Profiles wird die Zusammensetzung des Cellulase-Enzymkomplexes gezielt beeinflusst. Mittels einer fed-batch-Technik werden insbesondere loesliche Substrate fuer die Cellulasegewinnung dem Fermentationsmedium zugegeben.

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung von Cellulase-Enzymkomplexen und/oder zellwandlytischen Enzymen durch aerobe Submerszüchtung von Pilzmutanten. Die gewonnenen Enzymkomplexe können zum teilweisen oder vollständigen Abbau von Cellulose sowie Hemicellulose in industriellen Produkten, Abfallstoffen, Abwässern oder beim Abbau von lebenden oder toten pflanzlichen Zellwänden verwendet werden.

Mögliche Anwendungsgebiete betreffen beispielsweise die Obst- und Gemüseverarbeitungsindustrie, die Brennerei- und Brauereiindustrie, die Extraktion pflanzlicher Zellinhaltsstoffe sowie die Silierung von Futtermitteln in der Landwirtschaft. Die gewonnenen Cellulase-Enzymkomplexe können auch als Biochemikalie Anwendung finden, beispielsweise bei der Herstellung von Protoplasten, der Behandlung oder analytischen Bewertung von Futtermitteln.

Charakteristik des bekannten Standes der Technik

Es ist bekannt, Enzyme des Cellulasekomplexes durch aerobe Submerszüchtung von Pilzen herzustellen. Die bekannten Verfahren unterscheiden sich hauptsächlich in bezug auf die eingesetzten Pilzstämme, die verwendeten Substrate beim Fermentationsprozeß sowie die Prozeßführung. Die Wirtschaftlichkeit bei der Cellulasegewinnung wird wesentlich bestimmt durch die im Fermentationsmedium erzielte Enzymaktivität, durch die p>o Zeiteinheit gebildete Enzymmenge (Enzymproduktivität), durch die bezogen auf das eingesetzte Substrat gebildete Enzymmenge (Enzymausbeute) sowie durch die Zusammensetzung des Enzymkomplexes. Als geeignete Cellulasebildner sind besonders Pilzstämme der Gattungen Aspergillus, Penicillum und Trichoderma bekannt.

Die aus Patent- und Fachliteratur bekannten Cellulasebildner mit dem bisher höchsten Cellulasebildungsvermögen gehören zur Art Trichoderma reesei. Die Cellulose-Enzymkomplexe von T. reesei sind durch einen besonders hohen Anteil an Cellobiohydrolase gekennzeichnet und sind besonders für den Abbau mikrokristalliner Cellulose geeignet. Mit dem Ziel einer Verbesserung des Cellulasebildungsvermögens wurden verschiedene T.reesei-Mutanten hergestellt. So wird in der Patentschrift WO 80/01080 die Cellulasebildung mit der Mutante T. reesei MCG 77 beschrieben. Die Cellulasebildung wird durch Glucose reprimiert, nicht jedoch durch Glycerol; Lactose wirkt induzierend auf die Cellulasebildung. Die mit 1 % Cellulose im Nährmedium erhaltene Cellulaseaktivität beträgt 1 ...1,8 U/ml FPA, die mit 1% Lactose erhaltene Aktivität beträgt. 1,35U/ml FPA und die mit 1 % Lactose plus 1 % Cellulose beträgt 1,75U/ml FPA.

In der Patentschrift US 4,472,504 wird die Cellulasebildung mit der Mutante T. reesei MCG 80 beschrieben, welche aus der Mutante T. reesei Rut C30 gewonnen wurde. Bei Verwendung eines Nährmediums mit 8% Cellulose und Zusatz von Biotin wird in diskontinuierlicher Fermentation eine Cellulaseaktivität von 17,2 U/ml FPA erreicht, was einer Ausbeute von 215U FPA/g Cellulose entspricht.

Es wurden auch T. reesei-Mutanten hergestellt, welche auf Basis von Glucose als Kohlenstoffq al¹-: Cellulaso bilden können. Über das Cellulasebildungsvermögen von T. reesei-Mutanten bei Einsatz von Glucose als Substrat wurde auf dem 3.Europäischen Kongreß über Biotechnologie berichtet (München, BRD; 10.-14.Sept. 1984; M.Baily: „Cellulase Production by Mutant Strains of Trichoderma reesei on non-Cellulosic Media"): Die höchste beschriebene Cellulaseaktivität wird mit der Mutante T. reesei VTT-D-79125 auf Basis von 4% Glucose plus 4% Brennerei-Treber erhalten und beträgt 6,4U/ml FPA. Mit Cellulose anstatt Glucose wurde bei diesem Stamm etwa die gleiche Cellulaseaktivität erhalten.

Es wurde auch vorgeschlagen (1986), die Mutanten T. reesei tIMET 43803 und T. reesei ZIMET43804 für die Cellulaseherstellung einzusetzen, um auch mit löslichen Substraten hohe Cellulaseaktivitäten bei gleichzeitig hohen Cellulaseproduktivitäten erzielen zu können.

Alle bekannten Trichoderma-Cellulasekomplexe haben jedoch den Nachteil, daß der ß-Glucosidaseanteil gering ist, was beim enzymatischen Abbau von Cellulose zu einer stärkeren Inhibierung der Cellulase durch die gebildete Cellobiose führt. Dieser Nachteil ist seit langem bekannt.

So wurde ein Verfahren beschrieben, wo ß-Glucosidase mit Aspergillus phoenicis hergestellt wird, um T. reesei-Cellulasekomplexe zu supplementieren (Biotechnol. Bioeng. Symp. 10 [1980), 189). Für zahlreiche Cellulaseapplikationen in der Nahrungsgüter- und Getränkeindustrie sowie der Landwirtschaft werden Cellulase-Enzymkomplexe benötigt, welche neben der cellulosespaltenden Aktivität noch Nebenaktiv'täten aufweisen, beispielsweie Hemicellulose- und Amylaseaktivität. Die

T. reesei-Cellulasekomplexe verfügen zwar über eine hohe Aktivität gegenüber Cellulose, jedoch sind die Nebonaktivitäten geringer als bei verschiedenen Cellulasekomplexen anderer Pilzgattungen (z. B.: Phil. Trans. R. See. Lond. B 300, "783-291,1983).

Deshalb wurden · ich Verfahren entwickelt, in denen Penicillium-Stämme für die Cellulasegewinnung eingesetzt werden.

Beispielsweise \ lemäß DD-WP 225712 Penicillium janthinellum als Cellulasebildner eingesetzt, wobei Cellulose in Kombination m.. jehandeltem Grünmehl als Substrat für die Cellulasefermentation dient. In einer fed-batch-Kultivierung wird bei Einsatz von insgesamt 6% Cellulose zuzüglich Grünmehlmedium nach 8 Tagen eine Cellulaseaktivität von 6 U/ml Filterpapieraktivität erreicht, was einer Ausbeute von 100U FPA je Gramm Cellulose entspricht; die Cellobiuse-Aktivität beträgt 2 bis4U/ml.

Das Grünmehlmedium wird durch mechano-chemische Vorbehandlung von Grünmehl hergestellt.

Darüber hinaus wurden auch andere Penicillium-Stämme für die Cellulasegewinnung eingesetzt, beispielsweise gemäß DE-OS 2133 544 und DE-OS 1767 737. All diesen Verfahren liegen batch- oder fed-batch-Techniken zugrunde, in denen Cellulose oder pflanzliche cellulosehaltige Substrate einzeln oder in Kombination als C-Quelle dienen und in denen jeweils unterschiedliche definierte pH- und Temperaturprofile zur Erzielung günstiger Enzymkomplexe eingestellt werden.

So wird mit Penicillium funiculosum (Enzyme Microb. Technol. 1983, Vol. 5, 22-24) auf Basis von 6% Cellulose eine Cellulase-Aktivität von 3,5U/ml FPA und eine ß-Glucosidase-Aktivität 12U/ml (gemessen durch Abbau von 4-Nitrophenyl-ß-D-glucosid) erzielt.

Es wird auch die Cellulasegewinnung mit einem Penicillium verruculosum Wildstamm beschrieben (Euruopean J. Appl.

Microbiol. 11 [1981), 2,120-124); bei Verwendung eines Nährmediums mit Zuckerrübenextraktionsrückständen sowie entfattetem Sonnenblumensamenmehl wurde die günstigste Collulasebildung beobachtet. Mit Mandels-Reese-Medium (1957) und 7,5g/l reiner Cellulose plus 1 g/l Weizenkleie wurde eine Filterpapieraktivität von 0,3 U/ml erzielt.

Alle bekannten Verfahren zurCellulasegewinnung haben den Nachteil, daß die bezogen auf das eingesetzte Substrat erhaltenen Cellulaseausbeuten relativ niedrig sind oder daß die im Fermentationsmedium erzielten Cellulase-Aktivitäten niedrig sind oder daß eine proportionale Erhöhung der Cellulase-Aktivität mittels Substratzugabe nicht möglich ist oder aber daß der Cellulase-Enzymkomplex eine wenig günstige Zusammensetzung aufweist.

Ziel der Erfindung

Es ist das Ziel der Erfindung, hohe Cellulase-Aktivitäten im Fermentationsmedium und gleichzeitig hohe substratbezogene Enzymausbeuten zu erreichen, um somit eine effektive Ausnutzung von Fermentorvolumen und Substrat zu gewährleisten. Darüber hinaus besteht das Ziel darin, einen Cellulasekomplex zu gewinnen, welcher eine hohe Abbauleistung sowohl gegenüber reiner Cellulose als auch gegenüber cellulosehaltigen pflanzlichen Substraten aufweist.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, eine leistungsverbesserte Cellulase-Mutunte zu gewinnen und in einem Kultivierungsverfehren einzusetzen, wobei in einer Fermentationsstufe mit hoher Cellulaseproduktivität und hoher Cellulase-Aktivität ein solcher Cellulase-Enzymkomplex gebildet wird, welcher über einen ausreichenden Anteil ß-Glucosidase verfügt und welcher einen höheren Anteil an Nebenaktivitäten aufweist, die für den Abbau cellulosehaltiger pflanzlicher Substanzen erforderlich sind.

Erfindungsgemäß wird die Aufgabe so gelöst, daß die Pilz-Mutante Penicillium verruculosum IMET 43857 aerob und submers nach an sich bekannter Weise in einem Nährmedium kultiviert wird, welches ein oder mehrere die Cellulasebildung und/oder die Bildung zellwandlytischer Enzyme induzierende Substrate allein eic in Kombination mit einem oder mehreren nichtinduzierenden Substraten enthält.

Es wurde gefunden, daß diese Mutante bei geeignetem pH bzw. geeignetem pH-Profil einen höheren Anteil ß-Glucosidase und einen höheren Anteil Nebenaktivitäten, insbesondere Hemicellulase, Pektinase und Amylase, ins Kulturmedium ausscheidet. Der Stamm verfügt über eine reduzierte Katabolitrepression der Cellulasebildung gegenüber Glycerol und Galactose. Der erfindungsgemäße Stamm wurde durch Mutation und Selektion in mehreren Stufen aus dem Wildstamm Penicillium verruculosum ltC71 gewonnen und in der Hinterlegungsstelle der ZIMET-Kultuiensammlung im Zentralinstitut für Mikrobiologie und experimentelle Therapie der Akademie der Wissenschaften der DDR hinterlegt und unter der Nummer IMET 43857 registriert.

Der Stamm ist durch folgende Merkmale charakterisiert: Starnmbeschreibup.g/Morphologie, Physiologie

Der Stamm weist die für Penicillium typischen morphologischen ' lerkmale auf und unterscheidet sich vom Ausgangsstamm hauptsächlich in physiologischen Eigenschaften, insbesondere in bezug auf die Cellulasebildung.

Die Erhaltung des Stammes ist auf den für Penicillium-Stämme gebräuchlichen Nährmedien möglich. Beispielsweise sind Kartoffel-Dextrose-Agar, Czapek-Dox-Agar, Sporulationsjgar (Ammoniumsulfat 0,2%; Kaliumdihydrcgenphosphat 0,5%, Glucose 2%, Hefeextrakt 0,7%; Agar 2%) oder CM-Agar (Kaliumhydrogenphosphat 1 %, Glucose 1 %; Hefeoxtrakt 0,5%; Agar 2 %) hierfür geeignet. Die Bebrütungstemperatur beträgt zweckmäßig 28 bis 32⁰C, die Bebrütungsdauer etwa 5-71 age und weitere 5-7 Tage bei Raumtemperatur bis zur vollen Entwicklung der Stämme. Die Uberimpfung wird mittels Konidien vorgenommen; die Farbe der Konidien ist in Abhängigkeit des Nährmediums grün bis graugrün, mitunter auch gelbgrün.

Der Stamm ist prototroph (z. B. bezügl. Wachstum auf Glucose, Fructose, Glycerol, Lactose), darüber hinaus resistant gegenüber 2-Deoxy-D-glucose und 2-Deoxy-D-galactose sowie partiell resistent gegenüber 5-Thio-D-glucoso.

Wachstum (Einzelkolonien) von P. verruculosum IMET 43857 auf Minimalmedium mit verschiedenen C-Quellen (Agarplatten): 7 Tage Qebrütung bei 3O⁰C

Mini- (NH₄I₂SO₄:5g/l

mal- KH₂PO₄:1 g/l

me- MgSO₄-7aq:0,5g/l

dium: Agar:20g/l

C-Quelle

Koloniedurchmesser (mm) Charakterisierung

1%	Fructose	25
1%	Lactose	30
1%	Glycerol	38
1%	Glucose	40
1%	Glucose + 0,5%	38
	2-Deoxy-D-glucose
1% '	Glucose + 0,5%	40
	2-Deoxy-D-galactose
1%	Glucose + 0,5%	35
	2-Deoxy-D-ribose
1%	Glucose + 0,5%	9
	5-Thio-D-glucose
0,5%	2-Deoxy-D-glucose	14
0,5%	2-Deoxy-D-galactose	4
0,5%	2-Deoxy-D-ribose	7
0,5%	5-Thio-D-glucose	0
0,5%	Fructose-6-Phosphat	23

weißlich-gelb; samtig, schwache radiale Faltung

graugrün; dünnes Mycel, keine Faltung

graugrün; dünnes Mycel, keine Faltung

radiale Faltung; Sporulation gelb

gelb, Sporulation

grau; Sporulation gelb; Sporulation

gelb-braun; kompakt-koloniales Wachstum

grau-gelb; kompakt-koloniales Wachstum, starke radiale Faltung dünne Mycelschicht, Sektorenbildung

dünne Mycelschicht, keine Sporulation (kein Wachstum) dünne Mycelschicht, im Zentrum Sporulation

Wachstum von Einzelkolonien auf CM-Agar, 6 Tage Bebrütung bei 3O⁰C

IMET 43857 40mm Koloniedurchmesser; grün, gelber Rand, starke Sporulation; schwache Faltung

Die Erhaltung des Stammes in lyophilisierter Form oder über bzw. in flüssigem Stickstoff ist mittels der allgemein praktizierten Methoden möglich, ohne daß ein Rückgang des Cellulasebildungsvermögens bisher beobachtet werden konnte. Der Stamm besitzt ein partiell-katabolitdereprimiertes Cellulasebildungsvermögen, d. h. in Gegenwart einiger leicht verwertbarer Substrate wie beispielsweise Glycerol oder verschiedene Zucker werden bis zu einer bestimmten Substratkonzentraiion Enzyme des Cellulase-Komplexes gebildet.

Die reduzierte Katabolitrepression des Cellulasebildungbvermögens läßt sich in Anlehnung an die Methode von B.S.Montenecourt und D.E.Eveleigh (Applied and Environmental Microbiology 33,1977,178-183) testen. Als Substrate im Agarmedium dienen säuregequollene Cellulose in Kombination mit dem jeweils untersuchten Repressor, insbesondere Glycerol, Galactose, Glucose und Xylose. Zur Begrenzung der Koloniegröße wird Bengalrosa in einer Konzentration von 30 mg/l dem Agarmedium zugesetzt. Die Dicke der Agarschicht wird auf 4mm eingestellt. Bei einem Plattendurchmesser von 9cm werden zweckmäßig 100 bis 200 Konidien je Platte aufgeimpft. In Anlehnung an die genannte Methode wird die Ausbildung der Klarzone als Folge des Celluloseabbaues durch eine an die Bebrütung sich anschließende Inkubation bei 45...47⁰C über 20 Stunden vorgenommen, wobei die Lebensfähigkeit der Konidien des erfindungsgemäßen Stammes erhalten bleibt. Der Stamm IMET 43857 bildet Klarzonen bei den Substratkombinationen 0,5% säuregequollene Cellulose plus 5% Glycerol und 0,5% säuregequollene Cellulose plus 5% Galactose.

Der Ausgangsstamm P. verruculosum ItC 71 bildet auf keinem dieser Medien Klarzonen, da bei diesem die Cellulasebildung einer starken Katabolitrepression unterworfen ist. Mit dieser Methode kann auch die Klonselektionierung vorgenommen werden. Die Testung des katabolitdereprimierten Cellulasebildungsvermögens des beschriebenen Stammes ist auch in Röhrchen möglich. Beispielsweise werden Konidien auf ein Agarmedium mit säuregequollener Cellulose in Kombination mit dem jeweils untersuchten Repressor, jedoch ohne Zusatz von Bengalrosa, überimpft. Der Röhrchendurchmesser beträgt zweckmäßig 9 mm. Als Maß für das Cellulasebildungsvermögen dient die Tiefe der Klarzone im Röhrchen unterhalb der Mycelschicht; die Bebrütung und Inkubation bei 45°C werden wie bei dem beschriebenen Plattentest vorgenommen.

Cellulosebildungsvermögen im Röhrchentest	1%AC	C-Üuelle (Klarzonen in mm) 0,5% AC + 0,5% AC + 5% Glycerol 5% Galactose	0 4	0,5AC + 0,5% Glucose	-4-	278 359
Stamm	2 5	0 6		0 0
P. v. ItC 71 P.V.IMET43857

AC: Amorphe Cellulose

Kultivierung und Fermentation des Cellulasebildners und Gewinnung des Enzymkomplexes

Die Kultivierungstemperatur der Mutante P. verruculosum IMET 43857 beträgt 22 bis 38°C, vorzugsweise 30 bis 35°C für das Mycelwachstum und 26 bis 32°C für die Enzymbildung. Der pH-Wert für die Kultivierung liegt im Bereich von 2 bis 7, vorzugsweise von 2,5 bis 5,5 für das Mycelwachstum und von 3,1 bis 6,2 für die Enzymbildung.

Als Kultivierungsgefäße sind alle unter Ausschluß von Fremdinfektionen betreibbaren Fermentoren geeignet, welche eine ausreichende Versorgung mit Sauerstoff gewährleisten und in welchen keine lang andauernden extrem hohen Scherfelder auftreten, denen große Teile des Fermentationsmediums ständig ausgesetzt sind.

Ausgangspunkt für die Kultivierung sind Konidien von Emerskulturen, insbesondere von Schrägagarkulturen auf Kartoffel-Dextrose-Agar.

Als Inokulurn für das Fermentationsmedium dienen Konidien, vorzugsweise in einer Konzentration von 10⁷ bis 10⁹ je Liter Fermentationsmedium, oder Suspensionen vegetativen Mycels, vorzugsweise in einer Menge von 1 bis 15VoI.-% des zu beimpfenden Mediums.

Für die Beimpfung großer Fermentoren wird das Inokulum zweckmäßig in mehreren Stufen nacheinander angezogen.

Die Prozeßführung bei der Züchtung der Mutante P. verruculosum IMET 43857 zur Gewinnung des Cellulase-Enzymkomplexes

ist in' Abhängigkeit der verwendeten Substrate oder Substratkombinationen und der zu erzielenden Enzymzusammensetzung verschieden.

Zur Bildung des Cellulase-Enzymkomplexes ohne erhöhten Anteil an Nebenaktivitäten kann reine Cellulose als induzierendes Substrat eingesetzt werden. Bis zu einer Konzentration von etwa 2% Cellulose ist in diskontinuierlicher Fermentation die im Fermentationsmedium gebildete Cellulaseenzymmenge der eingesetzten Cellulosemenge proportional. Höhere Cellulosekonzentrationen führen zu einer höheren Cellulaseaktivität im Fermentationsmedium, wobei die Zunahme der Cellulaseaktivität dann jedoch nicht mehr der eingesetzten Cellulosemenge proportional ist, so daß die Cellulaseausbeute absinkt. Eine der eingesetzten Cellulosemenge proportionale Erhöhung der Cellulasebildung ist gemäß einer beschriebenen fed-batch-Technik möglich, bei welcher die Zuführung der Cellulose mittels einer Regeleinrichtung oder einer rechnergestützten Prozeßsteuerung von der spezifischen Kohlendioxidentwicklung des Mycels angesteuert wird.

Mittels Weizenkleie, Brennereischlempe oder anderer komplexor Nährmediumsbestandteile kann die Bildung von Nebenaktivitäten wie beispielsweise Hemicellulase, Amylase und Pektinase erhöht werden.

Für die Herstellung zellwandlytischer Enzyme werden zweckmäßig Pilzzellwände als induzierendes Substrat eingesetzt. Der gebildete Enzymkomplex hat eine Zusammensetzung auf Grund derer er beispielsweise zur Herstellung von lebenden Pilzprotoplasten geeignet ist.

Die Bildung des Cellulase-Enzymkomplexes kann auch auf Basis löslicher induzierender Substrate oder löslicher nichtinduzierender Substrate in Kombination mit induzierenden Substiaten erfolgen. Dafür ist eine fed-Technik geeignet, bei welcher die löslichen induzierenden Substrate oder die löslichen nichtinduzierendon Substrate oder eine Kombination löslicher induzierender und löslicher nichtinduzierender Substrate in einer solchen Weise dem Fermentationsmedium zugeführt werden, daß die nich im Fermentationsmedium einstellende aktuelle Konzentration der löslichen Substrate in einem Bereich liegt, in welchem die Cellulasebildung induziert aber nicht reprimijrt wird. Die obere Grenze dieses Bereiches wird durch die Katabolhrepression des Cellulasebildungsvermögens bestimmt, welche dem jeweils eingesetzten Substrat entspricht.

Der Fermentationsprozeß bei der fed-batch-Technik besteht aus einem diskontinuierlichen Abschnitt (batch) und der Substratzuführungsphase (fed-batch-Abschnitt). Die batch-Phase dient der Anzucht vor. Mycel, während in der Substratzuführungsphase vorwie- ,end die Enzymbildung erfolgt. Die Substratzuführung wird entweder mittels der Kohlendioxidkonzentra'.ion des Furmentationsabgases angesteuert oder aber nach einem empirisch ermittelten Zeitregime vorgenommen. Werden nichtinduzierte Substrate wie beispielsweise Glycerol oder Gaiuctost zugeführt, so muß das Grundnährmedium mindestens ein induzierendes Substrat enthalten, wie z. B. Cellulose, Weizenkleie oder Brennereischlempe.

Es ist möglich, das Mycel im batch-Abschnitt der Fermentation auf Basis nichtinduzierender Substrate, wie z. B. Glucose, Glycerol, Fructose, anzuziehen, da die Katabolitrepression bei der Mutante IMET 43857 nach Verbrauch des reprimierenden Substrates nicht nachwirkt.

Durch gezielte Veränderung des pH-Wertes während der Fermentation läßt sich die Zusammensetzung des Collulose-Enzymkomplexes beeinflussen. Einige Nebenaktivitäten, wie beispielsweise Xylanase, Amylase und ß-Glyccsidase, werden bei höheren pH-Werten stärker gebildet; so ist es auch möglich, mittels pH-Abfall auf pH = 3,1 einen Cellulase-Enzymkomplex herzustellen, der keine ß-Glucosidase-Aktivität enthält.

Die Abtrennung und Reinigung der gewonnenen Enzyme kann mittels bekannter Verfahren vorgenommen werden. Je nach Applikation können das nichtaufgearbeitete Fermontationsmedium, das Kulturfiltrat, getrocknete Rohenzyme oder gereinigte Enzyme eingesetzt werden.

Ausführungsbeispiele Beispiel 1:

In einem Rührfermentor mit einem Bruttovolumen von 30 Litern wird der Stamm IMET 43857 für die Gewinnung des Cellulase-Enrymkomplexes kultiviert.

Als Substrat wird der HolzzeHstoff Heweten 10Hz in Kombination mit Weizenkleie eingesetzt; die Fermentation wird mittels fed-batch-Technik durchgeführt.

Fermentor

Der Fermentor ist mit einem allgemein gebräuchlichen Sechsblatt-Scheibenrührer versehen, dessen Gesamtdurchmesser etwa ein Drittel des Fermentorinnendurchmessers beträgt. Die Einbauhöhe des Rührers im Fermentor beträgt etwa ein Fünftel der Gesamthöhe ded Fermentorinnenraumes. Die Begasung des Fermentors erfolgt über einen unterhalb des Rührers befindlichen Ring, welcher etwa den gleichen Durchmesser wie der Rührer aufweist und mit je 1 mm breiten Öffnungen im Abstand von je 8mm versehen ist. Der Fermentor ist mit der allgemein gebräuchlichen Meß- und Regeltechnik ausgestattet, insbesondere mit einer Temperatur-, Meß- und Regeleinrichtung, einer pH-Meß- und Regeleinrichtung, einer Gelöst-Sauerstoff-Messung und einer Meßeinrichtung für die C0₂-Konzentration des Fermentorabgases gekoppelt mit einem Steuersignal, beispielsweise zur Ansteuerung von Dosierpumpen. Mittels einer automatisch geregelten Schaumbekämpfung wird eine überschüssige Entschäumerzugabe vermieden.

Das Anfangsvolumen beträgt 10 Liter, bestehend aus 9 Liter Grundnährmedium plus 1 Liter Inokulum.

Bestandteile des Grundnährmediums:

KH2PO4	30 g
(NH4I2SO4	50 g
MgSO4-7 H2O	3g
CaCI2	3g
Cellulosepulver'.Heweten 10Hz)	180g
Weizenkleie	70 g

Diese Bestandteile werden in geeigneter Weise in 9 Litern Leitungswasser gelöst bzw. suspendiert, sterilisiert und unter Ausschluß von Fremdkeimen in den sterilisierten Fermentor gegeben. Anschließend wird der Fermentor mit 1 Liter frischer Mycelsuspension (Inokulum) beimpft.

Inokulum

Das Inokulum wird in Schüttelkulturen hergestellt. Es werden die gleichen Nährmediumsbestandteile wie für den 30-l-Fermentor verwendet, jedocn wird die Konzentration des KH₂PO₄ zweckmäßig auf 15g/l erhöht, um eine stärkere Pufferwirkung zu erzielen.

Die Konzentration der übrigen angegebenen Nährmediumsbestandteile ist die gleiche, wie im Nährmedium für den Fermentor.

Es werden 10 Schüttelkolben mit je 100ml dieses Nährmediums hergestellt und unter Ausschluß von Fremdkeimen wird jeder Kolben mit etwa 10⁷Konidien einer 10 bis 20 Tage alten Abimpfung des hinterlegten Stammes IMET 43857 beimpft. Die Kultivierung erfolgt auf einer für die Kultivierung von Mikroorganismen allgemein gebräuchlichen Schüttelmaschine bei 3O⁰C.

Die Kultivierungsdauer beträgt 30 bis 48h bis zur Beimpfung des Fermentors.

Fermentation

Die Kultivierungstemperatur wird zu Beginn der Fermentation auf 32°C eingestellt; die Regelgrenzen für den pH werden auf 4,0 (untere Regelgrenze) und 5,5 (obere Regelgrenze) eingestellt; die Rührerdrehzahl beträgt 500U/min und die Begasungsmenge 350 Norm-Liter-Luft je Stunde. Als Antischaummittel wird Silikonentschäumer NM40 verwendet.

Der pH-Wert liegt zu Beginn der Fermentation innerhalb des Sollbereiches, je nach Zustand und Alter des Inokulums bei etwa 4,2 bis 5,4. Während der Fermentation tritt ein Abfall des pH ein; bei Erreichen der unteren Regelgrenze wird mittels 12%iger Ammoniaklösung der pH bei 4,0 konstant geregelt. Mitunter ist - bedingt durch den Weizenkleie-Zusatz - in der Anfangsphase ein zwischenzeitlicher Anstieg des pH zu verzeichnen, der im Falle des Erreichens der oberen Regelgronze eine Konstantregelung des pH mittels 10%iger Schwefelsäure bei 5,5 erfordert.

Die Kohlendioxidkonzentration im Fermentationsabgas steigt mit zunehmender Mycelkonzentration an, erreicht einen Maximalwert und fällt dann wieder ab. Der Maximalwert ist nach etwa 48 h erreicht, die Temperatur wird auf 29°C abgesenkt und es werden 12g Tween 80 dem Fermentationsmedium zugesetzt. Der Maximalwert der Kohlendioxidkonzentration liegt bei etwa 0,5 bis 0,7VoI.-% im getrockneten Fermentationsabgas; ein mitunter zeitlich vorgelagertes und schwächer ausgeprägtes Maximum der Kohlendioxidkonzentration im Fermentationsabgas ist durch die Utilisation von Weizenkleiebestandteilen verursacht und wird für die Prozeßsteuerung nicht berücksichtigt.

Nachdem die Kohlendioxidkonzentration im Fermentationsabgas das Maximum überschritten hat und auf etwa 80% des Maximalwertes abgesunken ist, wird mit der Zugabe von Cellulose begonnen.

Es werden 40g Cellulosepulver Heweten 10Hz, suspendiert in 200ml Wasser, dem Fermentationsmedium zugegebun. Die Kohlendioxidkonzentration im Fermentationsabgas steigt nach der Cellulosezugabe zunächst an und fällt dann wieder ab, nachdem die Cellulose weitgehend verbraucht ist. Nach Absinken der Kohlendioxidkonzentration auf 80% des letzten Maximalwertes erfolgt die nächste Zugabe von 40g Heweten 10 Hz (in 200 ml Wasser suspendiert). Auf die gleiche Weise werden die weiteren Zugaben von Cellulose vorgenommen. Der zeitliche Abstand der Cellulosezugaben beträgt 5 bis 10 Stunden.

Nach einer Gesamtfermentationszeit von 140 Stunden wird die Fermentation beendet. Die während der fed-batch-Periode zugeführte Cellulosemenge beträgt 400g, der Ammoniakverbrauch 330ml (12%ige Lösung) und das findvolumen des Fermentationsmediums 12 Liter.

Die Enzymaktivität beträgt 6,5U/ml FPA und 9,0U/ml μ-Glucosidase.

Mittels bekannter Verfahren der Mikrofiltration und Ultrafiltration wird der Enzymkomplex von den übrigen Nährmediumskomponenten des Fug?tes abgetrennt und gefriergetrocknet.

Das gefriergetrocknete Rohenzym weist folgende Zusammensetzung bzw. Aktivitäten auf:

- Filterpapieraktivität (FPA): 0,73 U/mg Protein,

- Endoglucanase: 5,20 U/mg Protein,

- ß-Glucosidase: 1,13 U/mg Protein,

- Xylanase: 5,07 U/mg Protein,

- Aktivität gegenüber

p-Nitrophenyl-Lactosid (p-NPL): 0,02 U/mg Protein

Die Bestimmung von FPA und ß-Giucosidase erfolgte nach den Empfehlungen der IUPAC (Pure and Appl. Chem., Vol. 59, Nr.2, pp 257-268,1987).

Die Endoglucanaseaktivität wurde nach Rabinovitsch bestimmt (Rabinovi'.sch, M. L.; Klyosov, A.A.; Berezin, I. V.; Bioorg.

Chimija 3.3,405-414,1977).

Die Aktivität gegenüber p-NPL wurde nach Rabinovitsch et al. (Bioorg. Chimija, 12,11,1549-1560,1986) ermittelt. Die Bestimmung der Xylanaseaktivität erfolgte nach einer Methode der Universität Neu-Süd-Wales, Kensington, Australien (Pure and Appl. Chem., Vol. 59, Nr. 12, pp 1739-1752,1987).

Beispiel 2:

Der Stamm IMET 43857 wird auf verschiedenen Nährmedien für die Gewinnung des Cellulase-Enzymkomplexes kultiviert. Es werden Schüttelkolben mit je 100ml des jeweiligen Nährmediums in drei Parallelversuchen hergestellt. Sämtliche Schüttelkolben werden mit der gleichen Menge einer Konidiensuspension beimpft, welche von einer 10 bis 20 Tage alten Abimpfung des Stammes IMET 4385Tgewonnen wird. Die Konidiensuspension wird unter Ausschluß von Fremdkeimen über eine G2-Glasfritte filtriert, um Reste noch vorhandenen Mycels zu entfernen.

Die Menge der für die Beimpfung eines jeden Schüttelkolbens verwendeten Konidiensuspension wird so bemessen, daß die Kolben mit jeweils 10⁷ Konidien beimpft werden.

Die Kultivierung wird 7 Tage bei 3O⁰C und ohne Korrektur des pH durchgeführt.

Nährmedienzusammensetzung:

Substrat:	10g/IHeweten10Hz +
Variante 1.:	1,5g/IPepton
	(zuzüglich 0,3 g/l Harnstoff)
	10g/IHeweten10Hz +
Variante 2.:	10 g/l Weizenkleie
	10g/IHeweten10Hz +
Variante 3.:	10g/l(TS)Brauereitreber
anorganische Stickstoffquelle:	3,5g/l(NH4)2SO4
Variantea:	4,5 g/l NaNO3
Variante b:
Bestandteile des Grundmediums:	15g/l
KH2PO4	0,4 g/l
MgSO4 -7 H2O	0,3g/l
CaCI2	1 g/l
Tween 80 (dest. Wasser)

Es werden 6 verschiedene Nährmedien hergestellt, welche die Kombinationen der unterschiedlichen Substratvarianten mit denen der Stickstoffsalze darstellen. Nach Beendigung der Fermentation werden die Medien der Parallelversuche vereinigt. In den Kulturfiltraten wird die Enzymaktivität bestimmt. Es ergeben sich folgende Enzymaktivitäten:

Enzymaktivität U/ml	La.	1.b.	Nährmedium 2.a. 2.b.	1,93 2,94 1,66 0,31	la.	3.b.
FPA ß-Glucosidase Xylanase -Amylase	1,64 0,28 1,43 0,03	1,04 1,03 1,23 0,02	1,46 0,21 1,46 0,11	6,1	1,77 0,46 1,32 0,14	1,90 2,53 1,52 0,07
End-pH	3,6	5,4	3,0	3,1	6,0

Der Ausgangsstamm Penicillium verruculosum ItC71 bildet bei gleichen Bedingungen mit dem Nährmedium 1.a. eine Filterpapieraktivität von 0,35 U/ml und mit dem Nährmedium 2.a. eine Filterpapieraktivität von 0,45 U/ml.

Beispiel 3:

Die Stämme Penicilliumverrucolosum ltC71 und IMET 43857 werden in Schüttelkolben wie im Beispiel 2 7 Tage und ohne Korrektu des pH kultiviert.

Das Nährmedium hat folgende Zusammensetzung:

KH2PO4	15g/l
(NH4I2SO4	4,8 g/l
CaCI2	0.3g/l
MgSO4 7H2O	0,5 g/l
Tween 80	1 g/l
HewetenlOHz	10g/l
Weizenkleie	5 g/l

Die zwei Kulturfiltrate wirden mittels Ultrafiltration etwa 10:1 aufkonzentriert. Die analytischen Uni ersuchungen der Konzentrate ergeben folgende Werte:

	/mg/ml/ /U/mg Protein/ /U/mg Protein/ /U/mg Protein/	IMET43857	ItC 71
Protein Xylanase Endo- glucanase ß-Glucosidase		15,0 2,94 4,25 0,0	3,2 2,75 1,07
End-pH	3,0	4,3

Der Cellulase-Enzymkomplex der hinterlegten Mutante ist in diesem Beispiel frei von ß-Glucosidase, da infolge des hohen Celluloseumsatzes während der Fermentation der pH-Wert zwischenzeitlich auf Werte kleiner pH 3 absinkt.

Claims (4)

1. Verfahren zur Gewinnung von Cellulase-Enzymkomplexen und/oder zellwandtypischen Enzymen durch Pilze im Submersverfahren, gekennzeichnet dadurch, daß die neue Pilzmutante Penicillium verruculosum IMET 43857 nach an sich bekannter Weise in einem Nährmedium kultiviert wird, welches ein oder mehrere die Cellulasbildung und/oder die Bildung zellwandtypischer Enzyme induzierende Substrate allein oder in Kombination mit einem oder mehrerer nichtinduzierenden Substraten enthält.

2. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß lösliche induzierende Substrate und/ oder lösliche nichtinduzierende Substrate verwendet werden und daß die Zugabe dieser Substrate in das Fermentationsmedium mittels fed-batch-Technik in einer solchen Weise erfolgt, daß die zugeführten Substrate im Fermentationsmedium die Enzymbildung induzieren oder nicht reprimieren.

3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, gekennzeichnet dadurch, daß als induzierende Substrate sowohl lösliche, wie wäßriger Weizenkleie-Auszug und/oder Zuckerlösungen als auch unlösliche, wie Cellulose, cellulosehaltige Abfallprodukte oder Zellwände von Pflanzen oder Pilzen verwendet werden.

4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, gekennzeichnet dadurch, daß Getreidekleie und/oder Brennereischlempe und/oder Brauereitreber als induzierendes Substrat in Kombination mit löslichen Kohlenhydraten wie beispielsweise Glucose, Xylose oder Lactose verwendet werden.