DE4017522A1

DE4017522A1 - Exo- und endocellulasefreie xylanase, verfahren zu ihrer herstellung und deren verwendung

Info

Publication number: DE4017522A1
Application number: DE19904017522
Authority: DE
Inventors: Wolfgang Dipl Ing Wizani; Hermann Prof Dr Esterbauer; Walter Dr Steiner; Joseph Dr Gomes
Original assignee: Chemie Linz Deutschland GmbH
Current assignee: Chemie Linz Deutschland GmbH
Priority date: 1990-05-31
Filing date: 1990-05-31
Publication date: 1991-12-05

Description

Die Erfindung betrifft exo- und endocellulasefreie Xylanase, ein Verfahren zu deren Herstellung, sowie deren Verwendung in der Zellstofferzeugung. Der Abbau von Hemicellulose, die bei Laubhölzern vorwiegend aus Xylan besteht, ist ein in der Zellstofferzeugung notwendiger Schritt. Dieser Abbau kann entweder auf chemischem Weg, beispielsweise durch alkalische Heißextraktion oder auf enzymatischem Weg durch Behandlung mit substratspezifischen Enzymen, im speziellen mit Xylanasen erfolgen. Durch die enzymatische Behandlung des ungebleichten oder halbgebleichten Zellstoffs mit Xylanasen werden Hemicellulosebindungen aufgebrochen und Xylan abgebaut. Es können dazu jedoch nur reine Xylanasen eingesetzt werden, die keine Verunreinigungen an Cellulase enthalten, da sonst auch Cellulose gespalten und abgebaut wird, was äußerst unerwünscht ist.

Xylanasen werden unter anderem von einer Reihe mesophiler und thermophiler Mikroorganismen gebildet, um im Nährmedium vorhandene xylanhältige Rohstoffe zu Xylose abzubauen, die als C-Quelle verwertbar ist. In Abhängigkeit von den weiteren im Nährmedium vorhandenen Rohstoffen, vorwiegend Cellulose werden aber auch die für dieses Substrat spezifischen Cellulasen ge bildet. Um exo- und endocellulasefreie Xylanase zu erhalten, muß die Xylanase von den gebildeten Cellulasen in einem aufwendigen Verfahren getrennt und gereinigt werden. Um die Bildung von Cellulasen bei der Fermentation zu verringern, können die Mikroorganismen auch auf gereinigtem Xylan kultiviert werden. In D. J. Senior et al., Biotechnology Letters, Vol 10, No. 12, p. 907-912 (1988) wird die Verwen dung von Xylanasen, die aus auf gereinigtem Xylan kultiviertem Trichorderma harzianum erhalten wurden, zum selektriven Abbau von Xylan beschrieben. Die Kultivierung auf hochreinem Xylan kommt aber wegen der hohen Rohstoffkosten für eine industrielle Anwendung nicht in Betracht.

Es konnte nun unerwarteterweise gefunden werden, daß ein Pilz der Klasse Fungi imperfecti, Gattung Monylialis, Thermomyces lanuginosus fähig ist, exo- und endocellulasefreie Xylanase in lignocellulosehältigem Nährmedium zu bilden, ohne daß die im Nährmedium vorhandene Cellulose angegriffen wird.

Gegenstand der Erfindung ist daher eine exo- und endo-cellula sefreie Xylanase, die durch Kultivieren von Fungi imperfecti der Gattung Monylialis auf lignocellulasehältigem Nährmedium erhalten wird.

Die erfindungsgemäße exo- und endocellulasefreie Xylanase weist folgende Eigenschaften auf:

a) pH-Stabilität (Fig. 1)

Das Enzym wurde in Pufferlösungen bei verschiedenen pH-Wer ten 66 Stunden bei 20°C inkubiert. Die Aktivität wurde im 1% Hemicellulose bei pH 4,8 wie folgt bestimmt. 1 ml 1% Substratlösung in Na-Citratpuffer (pH 4,8), (Xylan aus Ha ferspelzen; Sigma X-0376;) wurden 2 min bei 50°C und nach Zufügen von 0,5 ml Enzymlösung weitere 15 min bei 50°C in kubiert. Anschließend werden 3 ml DNA-Reagens (wie FPU-Test nach IUPAC) und 0,5 ml 2,5 N NaOH zugemischt und 5 min im kochenden Wasserbad erhitzt. Anschließend wird in einem kalten Wasserbad rasch abgekühlt und die Extinktion bei 575 nm gegen den Leerwert (Citratpuffer) gemessen. Von diesen Wert muß die Extinktion des Enzyms (0,5 ml Enzym + 1,0 ml Citratpuffer) und der Substratlösung 1 ml 1% Substratlö sung in Citratpuffer abgezogen werden. Die Eichkurve wird mit 1,0 ml Citratpuffer und 0,5 ml Standardlösung (enthaltend 0,5 - 1,5 mg Xylose/ml) erstellt. Berechnung der Xylanaseaktivität: XU/ml = mg reduzierender Zucker (als Xylase). 0,888 In einem pH-Bereich von 5,0-7,0 wurden 97-100% der ur sprünglichen Aktivität erhalten.

b) Optimaler pH-Wert (Fig. 2)

Die Enzymaktivität wurde durch Inkubieren (15 min, 50°C) mit 1% Hemicellulase-Suspension in Citratpuffer (pH 3,0- 6,5), TrisHCl-Puffer (pH 7,0-9,0) und Phosphatpuffer (pH 6,5-8,0), ermittelt,
optimaler pH-Bereich: 6,0-7,5.

c) Thermostabilität (Fig. 3)

Die Enzymlösung wurde in 0,05 molaren Citratpuffer (pH 4,8) bei Temperaturen von 45-60°C 0-72 Stunden inkubiert. Die Aktivität des Enzyms wurde mit 1% Hemicellulose bei 50°C gemessen. Nach 20 Stunden wurden bei einer Temperatur von 45°C 93% und bei einer Temperatur von 50°C 65% der ursprünglichen Aktivität gemessen.

d) Optimale Temperatur (Fig. 4)

Die Enzymaktivität wurde durch Inkubieren mit einer 1% He micellulosesuspension in 0,05 molaren Citratpuffer bei pH 4,8 15 min bestimmt,
optimale Temperatur: 65°C.

e) Gehalt an exo- und endo-Cellulasen, an β-Glucosidase und an Carboxymethylcellulasen i) exo- und endo-Cellulasen

Im FPU-Test nach IUPAC wurde keine Cellulaseaktivität nachgewiesen.

ii) β-Glucosidase

0,6 ml 0,5 molarer Natriumcitratpuffer (pH 4,8) und 0,3 ml Enzymlösung wurden 3 min bei 50°C vorinkubiert. Anschlie ßend wurden 0,3 ml p-Nitrophenol-β-D-Glucosid (4 mg/ml Na triumcitratpuffer) zugegeben und 10 min bei 50°C inkubiert. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 2,4 ml 1 molarer Na₂CO₃-Lösung gestoppt und die Extinktion bei 405 mm gegen den Leerwert gemessen. Die Aktivität an β-Glucosidase wurde wie folgt berechnet:

E . . . Extinktion
t . . . Reaktionszeit

Die erfindungsgemäße Xylanase wies eine β-Glucosidase-Akti vität von 0,2-0,9 IU/ml auf.

Der Gehalt an β-Glucosidase, die Cellubiose in Glukose spaltet, hat keinen Einfluß auf das Verhalten der erfindungsgemäßen Xylanase in der Zellstoffherstellung, da aufgrund der Abwesenheit von exo- und endo-Cellulasen keine Abbauprodukte der Cellulose entstehen, die durch β-Glucosi dase angreifbar sind.

iii) Carboxymethylcellulase

Die erfindungsgemäße Xylanase wies bei einer Nachweis grenze von 0,1 Unit/ml keine Aktivität an Carboxymethylcel lulase auf und ist daher auch bei der Viskoseherstellung einsetzbar.

Die erfindungsgemäße exo- und endocellulasefreie Xylanase kann durch Kultivieren von Fungi imperfecti der Gattung Monylialis auf lignocellulosehältigem Nährmedium hergestellt werden. Die Fungi imperfecti, die nach der vorliegenden Erfindung angewen det werden, sind jedoch nicht auf diesen Stamm beschränkt, so lange sie die erfindungsgemäße Xylanase produzieren können. Ein Beispiel für solche Stämme ist Thermomyces lanuginosus. Der verwendete Stamm der Gattung Monylialis wurde aus einem Juteabfallhaufen einer Jutefabrik in Bangladesh, in der Jutefasern mit einer Ölemulsion behandelt werden, isoliert. Die Temperatur im Juteabfallhauften betrug 65-70°C. Dieser Stamm wurde bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen unter DSM 5826 hinterlegt. Der Stamm produziert die erfindungsgemäße exo- und endocellulasefreie Xylanase in einem hemicellulose- und cellulosehältigen Nährmedium, das noch übliche Stickstoffquellen, anorganische Salze, sowie gegebenenfalls oberflächenaktive Mittel und Spurenelemente enthalten kann.

Als hemicellulose- und cellulosehältiges Nährmedium kommen li gnocellulosehältige Rohstoffe, beispielsweise gemahlenes Wei zenstroh, gemahlene Gerstenspelzen, Maiskolben oder ungebleichter Zellstoff in Betracht. Diese Rohstoffe können gegebenenfalls durch Erhitzen auf 110-130°C sterilisiert werden. Geeignete Stickstoffquellen sind beispielsweise Fleischpepton, Harnstoff, Ammoniumsulfat, Malzextrakt, Fleischextrakt, Sojamehl u. dgl. Dem Nährmedium werden anorganische Salze, beispielsweise Kaliumhydrogensulfat, Dinatriumhydrogenphosphat, Calciumchlorid, Magnesiumsulfat u. dgl. zugesetzt.

Um die Abgabe der exo- und endocellulasefreien Xylanase in das Nährmedium zu beschleunigen, kann es vorteilhaft sein, oberflächenaktive Substanzen zuzusetzen. Es werden üblicherweise nicht ionische oberflächenaktive Substanzen, beispielsweise Tween 40, Tween 60 oder Tween 80 in einer Menge von 0,05-0,5 Gew.-% bezogen auf die Gesamtmenge des Mediums eingesetzt. Dem Medium können gegebenenfalls auch Spurenelemente, beispielsweise seltene Metalle wie Mn²⁺, Zn²⁺ oder Fe²⁺ u. dgl. zugegeben werden. Das Medium wird gegebenenfalls vorteilhafterweise mit Ammoniak bzw. Phosphorsäure auf einen pH-Wert von 6,0 bis 7,0 einge stellt. Der Pilz wird anschließend bei einer Temperatur von etwa 30- 70°C, vorzugsweise bei 45-60°C kultiviert. Ein Konstanthalten des zu Beginn der Fermentation eingestellten pH-Wertes ist nicht nötig. Er kann jedoch gegebenenfalls durch Zudosieren von beispielsweise Ammoniak bzw. Phosphorsäure auch konstant gehalten werden. Nach 1 bis 6 Tagen, üblicherweise nach 2 bis 5 Tagen ist eine beträchtliche Menge an exo- und endo-cellulasefreier Xylanase in das Medium abgegeben worden. Nach Beendigung der Fermenta tion kann die exo- und endocellulasefreie Xylanase auf übliche Weise aus der Fermentationsbrühe isoliert werden. Dazu werden beispielsweise durch Zentrifugieren oder Filtrieren Pilzmycel, Sporen und verbleibendes festes Nährmedium abgetrennt. Die weitere Reinigung des Enzyms kann auf übliche Weise, beispielsweise durch Aussalzen mit Ammoniumsulfat oder durch Lösungsmittelfällung mit Aceton, Alkohol u. dgl. erfolgen. Das so erhaltene Rohenzym kann gegebenenfalls weiter, beispielsweise durch Gelfiltration, Ionenaustauschchromatographie, Gelelektropharese u. dgl. gereinigt werden.

Die Fermentationsbrühe weist eine hohe Xylanaseaktivität auf. Es ist jedoch im Filterpaper Unit Test (FPU-Test) keinerlei Aktivität an exo- und endo-Cellulase nachweisbar. Ferner zeigt die Fermentationsbrühe eine nur geringe Aktivität an β- Glucosidase. Die erfindungsgemäße exo- und endocellulasefreie Xylanase ist daher für die Anwendung in der Zellstoffindustrie zur enzymatischen Behandlung des ungebleichten, halbge bleichten oder gebleichten Zellstoffs oder Papiers ausgezeichnet geeignet. Die geringe β-Glucosidaseaktivität stört diese Anwendung nicht, da durch die Abwesenheit von exo- und endo-Cellulase bei der Behandlung keine Cellobiose entstehen kann, die durch β-Glucosidase wäre.

Für die Anwendung zur enzymatischen Behandlung des Zellstoffs muß die erfindungsgemäße exo- und endocellulasefreie Xylanase nicht gereinigt werden, es genügt die Abtennung des festen Nährmediums. Wurde der Pilz auf Zellstoff kultiviert, kann die nach der Fermentation erhaltene Fermentationsbrühe direkt ein gesetzt werden.

Es kann sowohl der ungebleichte als auch der halbgebleichte Zellstoff mit der erfindungsgemäßen exo- und endocellulase freien Xylanase behandelt werden. Durch die Behandlung des un gebleichten Zellstoffs werden Hemicellulosebindungen aufgebro chen, im anschließenden Bleichverfahren wird daher weniger Bleichmittel (Cl₂ oder O₃) verbraucht. Bei der Behandlung des halbgebleichten Zellstoffs wird nach der Vorbleiche verbliebe nes Xylan abgebaut, wodurch reinere und hellere Pulpen entste hen. Die Wirkung der Enzymbehandlung wird mit Hilfe der Kappa- Zahl (K), die den Gehalt an oxidierbarer Substanz, also zum Beispiel an Lignin angibt, bestimmt.

Beispiel 1

300 ml Medium bestehend aus 9 g gemahlenen und getrockneten Gerstenspelzen, 3,3 g Fleischpepton, 0,6 g (NH₄)₂ SO₄, 0,45 g Harnstoff, 0,09 g MgSO₄ · 7H₂O, 0,09 g CaCl₂ · 2H₂O, 4,5 g KH₂PO₄, 0,3 ml Tween 80, 0,3 ml S₁ (1,6 g/l MnSO₄ · H20; 3,45 g/l ZnSo₄ · 7H₂O; 2,0 g/l CaCl₂ · 6H₂O) und 0,3 ml S₂ (5g/l FeSO₄ · 7 H₂O) wurden auf einen pH-Wert von 6 gestellt und in einem Schüttel kolben 60 min bei 128°C autoklaviert. Thermomyces lanuginosus (DSM 5826)-Vorkultur wurde in dieses Medium inokuliert und 4,5 Tage bei 50°C unter Schütteln (140 rpm) kultiviert. Nach 4,5 Tagen wurde filtriert und die Aktivität an Xylanase (XU/ml), β-Glucosidase, (IU/ml) Carboxymethylcellulase (CMC- ase/ml) und Glucanase (FPU/ml) bestimmt.

Beispiel 2

Thermomyces lanuginosus (DMS 5826) wurde entsprechend Beispiel 1 kultiviert, wobei statt Gerstenspelzen 9 g gemahlenes Weizenstroh eingesetzt wurde.

Beispiel 3

Thermomyces lanuginosus wurde entsprechend Beispiel 1 kulti viert, wobei statt Gerstenspelzen gemahlene Maiskolben einge setzt wurden.

Beispiel 4

Thermomyces lanuginosus wurde entsprechend Beispiel 1 kulti viert, wobei statt Gerstenspelzen 3% ungebleichter Kiefern zellstoff eingesetzt wurden.

XU/ml sofort 400

Beispiel 5

Thermomyces lanuginosus wurde in 300 ml des folgenden Mediums vorkultiviert. 11 g/l Sojamehl, 2 g/l (NH₄)₂SO₄, 1,5 g/l Harnstoff, 0,3 g/l MgSO₄ · 7H₂O, 0,3 g/l CaCl₂ · 2H₂O, 15 g/l KH₂PO₄, 1 ml/l Tween 80, 33 g/l Xylansubstrat (76,3% Xylan, 9,7% Mannan, 9,1% Glucan). Diese Vorkultur wurde in einem 300 l Fermenter mit folgendem Medium inokuliert. 10 g/l Sojamehl, 1,1 g/l (NH₄)₂SO₄, 1,5 g/l Harnstoff, 0,4 g/l MgSO₄ · 7H₂O, 0,3 g/l CaCl₂, 3 g/l KH₂,PO₄, 30 g/l gemahlene Maiskolben (Trockensubstanz). Es wurde ein pH-Wert von 6 eingestellt und 5 Tage bei 50°C fermentiert.

XU/ml (sofort)
268
IU/ml	0,25
FPU/ml	nicht nachweisbar

Beispiel 6 Behandlung von Sulfat-Zellstoff

Getrockneter Sulfatzellstoff aus Ruzomberok (Hartholz) wurde mit Wasser 1,5 Stunden auf 45°C erwärmt und geschüttelt. An schließend wurde Xylanase, hergestellt analog Beispiel 5 (198XU/ml), zugegeben und bei 230 rpm geschüttelt.

a) 30 g Fermentationsbrühe
220 g Zellstoff (K=19,97)
350 g Wasser XU/g = 100
b) 90 g Fermentationsbrühe
220 g Zellstoff (K = 19,97)
290 g Wasser XU/g = 300

Nach dem Abfiltrieren des Zellstoffs wurde die Kappa-Zahl, so wie die Xylanaseaktivität bestimmt.

Claims

1. Exo- und endocellulasefreie Xylanase, erhalten durch Kul tivieren von Fungi imperfecti der Gattung Monylialis auf lignocellulosehältigem Nährmedium.

2. Exo- und endocellulasefreie Xylanase erhalten durch Kulti vieren von Thermomyces lanuginosus auf lignocellulosehälti gem Nährmedium.

3. Exo- und endocellulasefreie Xylanase erhalten durch Kulti vieren von Thermomyces lanuginosus DSM 5826 auf lignocellu losehältigem Nährmedium.

4. Verfahren zur Herstellung exo- und endocellulasefreier Xylanase, dadurch gekennzeichnet, daß man Thermomyces la nuginosus auf lignocellulosehältigem Nährmedium kultiviert und die exo- und endocellulasefreie Xylanase abtrennt.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß man Thermomyces lanuginosus auf Weizenstroh, Gerstenspelzen, Maiskolben oder Zellstoff kultiviert.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, daß man Thermomyces lanuginosus bei einer Temperatur von 30-70°C und bei einem pH-Wert von 6,0-7,0 kultiviert.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 6, dadurch gekenn zeichnet, daß man Thermomyces lanuginosus bei einer Tempe ratur von 45-60°C und bei einem pH-Wert von 6,0-7,0 kultiviert.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 7, dadurch gekenn zeichnet daß man Thermomyces lanuginosus DSM 5826 bei einer Temperatur von 45-60°C und bei einem pH-Wert von 6,0- 7,0 kultiviert.

9. Verwendung von exo- und endocellulasefreier Xylanase aus Fungi imperfecti der Gattung Monylialis zur enzymatischen Behandlung des ungebleichten, halbgebleichten oder ge bleichten Zellstoffs oder Papiers.