DE2603889A1 - Verfahren zur enzymatischen hydrolyse von cellulose zu wasserloeslichen zuckern - Google Patents

Verfahren zur enzymatischen hydrolyse von cellulose zu wasserloeslichen zuckern

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Description

DR. KURT JACOBSOHN D - 8042 OBERSCHLEISSHEIM
PATENTANWALT Freisinger Straße 29 · Postfach / P.O.B. 58
2. Februar 1 976
3 PF
BIO RESEARCH CENTER COMPANY, LIMITED Tokio, Japan
Verfahren zur enzymatischen Hydrolyse von Cellulose zu wasserlöslichen Zuckern
Für diese Anmeldung werden die Prioritäten vom 28. April 1975
aus der USA-Patentanmeldung Serial No. 572 428
und vom 18. September 1975 aus der USA-Patentanmeldung
Serial No. 614 490 in Anspruch genommen.
Die Erfindung betrifft die enzymatische Hydrolyse von Cellulose zu wasserlöslichen Zuckern.
Es sind bereits umfangreiche Versuche unternommen worden, um ein Verfahren zu entwickeln, das das reichliche Vorkommen von Cellulose in der Natur ausnutzt und von den milden Reaktionsbedingungen bei der enzymatischen Hydrolyse oder Verzukkerung von Cellulose zu einfachen Zuckern, wie Glucode, Gebrauch macht. So beschreibt z.B. die US-PS 3 642 580 ein Verzuckerungsverfahren, bei dem eine konzentrierte Cellulase-Enzymlösung verwendet wird, um feinteilige trockene Cellulose zu einer Cellulose-Cellulase-Zuckeraufschlämmung zu hydrolysieren, die dann unter Druck ultrafiltriert wird, um den Zuckersirup von der unlöslichen Cellulose und löslichen Enzymbestandteilen zu trennen und dadurch die Wiederverwendung des Enzyms zu ermöglichen. Die US-PS 3 764 475 beschreibt ein ähnliches Verfahren, bei dem die in der US-PS 3 642 580 vorgeschriebene Ultrafiltration vermieden wird, indem man während
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der Hydrolyse kontinuierlich trockene Cellulose zusetzt, um das Cellulase-Enzym durch Adsorption an überschüssige, nichthydrolysierte Cellulose unbeweglich zu machen. In neuerer Zeit haben Mandels, Hontz und Nystrom in einer Arbeit in "Biotechnology and Bioengineering", Band XVI, November 1974, Seite 1471-1493, über die Verwendung von reiner Cellulose und Abfallcellulose aus verschiedenen Quellen als Substrat für die Enzymerzeugung und für die enzymatische Verzuckerung berichtet. Aus diesen Veröffentlichungen ist zu entnehmen, dass man es für notwendig gehalten hat, das Cellulase-Enzym vor seiner Verwendung zum Hydrolysieren von Cellulose von der Umgebung, in der es erzeugt worden ist, zu trennen.,
Toyama und Mitarbeiter berichten in "Proc. IV IFS: Ferment. Technology Today", 1972, Seite 743-757, über die Möglichkeit der Erzeugung von Zuckern durch enzymatische Verzukkerung von Celluloseabfallen unter Verwendung von Trichoderma viride-Cellulaseo Auf Seite 753 und 754 dieser Arbeit wird die Entwicklung von Enzym in festen Kulturen auf Schalen (japanischer Koji-Kulturtyp) und die Verwendung der ganzen, so erhaltenen festen Kultur als Enzymquelle für eine nachfolgende enzymatische Verzuckerung der von Lignin befreiten Cellulosesubstrate beschrieben. Es wird auch die Verwendung eines wässrigen Extraktes des Enzyms aus den gleichen festen Kulturen zur Verzuckerung der gleichen, von Lignin befreiten Cellulosesubstrate beschrieben. Tabelle 23 auf Seite 753 zeigt die mit diesen ganzen festen Kulturen erhaltenen Ergebnisse. Tabelle 24 auf Seite 754 zeigt die mit den aus den festen Kulturen gewonnenen wässrigen Enzymextrakten erhaltenen Ergebnisse. Aus einem Vergleich der Tabellen 23 und 24 in 'bezug auf die Zuckerausbeuten ergibt sich, dass eine feste Kultur, nämlich Reisstroh, niedrigere Ausbeuten als der wässrige Enzymextrakt aus der gleichen festen Kultur liefert, während für eine andere feste Kultur, nämlich rohes Druckpapier, das Gegenteil gilt.
Es wurde nun gefunden, dass Cellulose sich mit höherem Wirkungsgrad enzymatisch zu wasserlöslichen Zuckern hydrolysieren lässt, wenn das Enzym bei der Hydrolysereaktion in Form
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einer wässrigen Kulturmasse eingesetzt wird, die man erhält, wenn man einen extrazellulären cellulolytischen Enzymkomplex, der die Fähigkeit hat, natürliche (deh„: nicht chemisch veränderte) Cellulose abzuhauen, in einer gesonderten Enzymherstellungsstufe durch Züchten eines cellulolytischen Mikroorganismus, der befähigt ist, einen solchen Enzymkomplex zu entwikkeln, in einem wässrigen Nährmedium in Gegenwart von Cellulosematerial herstellt. Mit anderen Worten: Als Enzymquelle wird das rohe wässrige Enzympräparat oder ein Teil desselben direkt für die Verzuckerungsreaktion verwendet, ohne dass irgendwelche Bestandteile davon abgetrennt werden. Abgesehen von der etwaigen Notwendigkeit, den pH-Wert der Kulturmasse auf den bei der enzymatischen Verzuckerung von Cellulose üblichen Wert einzustellen, bedarf es keiner sonstigen Vorbehandlung des Enzympräparates. Dadurch werden nicht nur Arbeitsstufen, wie die Filtration und Konzentrierung des Enzyms, überflüssig, sondern es wird auch eine überraschende Erhöhung der Hydrolysegeschwindigkeit und der Ausbeute an wasserlöslichen Zuckern erzielt.'
Zur weiteren Erläuterung der Erfindung wird auf die Zeichnung Bezug genommen, die in graphischer Darstellung einen Vergleich der Hydrolysegeschwindigkeiten und der Ausbeuten an wasserlöslichen reduzierenden Zuckern bei der enzymatischen Hydrolyse von Cellulose mit Hilfe des erfindungsgemäss verwendeten Enzympräparates und mit Hilfe der bisher verwendeten Enzymkulturfiltrate zeigt.
Der für die enzymatische Hydrolyse von Cellulose gemäss der Erfindung verwendete cellulolytische Enzymkomplex ist imstande, natürliche Cellulose abzubauen. Als solcher enthält er die sogenannten Komponenten C^ und C1 die in der US-PS 3 764 475 und in der oben genannten Arbeit von Mandels und Mitarbeitern erwähnt werden. Diese Enzymkomplexe werden bekanntlich durch bekannte und der Öffentlichkeit zur Verfügung stehende Mikroorganismen, wie Trichoderma viride, Trichoderma koningii, Fusarium solani, Fusarium javanicum und dergleichen, entwickelt. Typische Stämme sind T.viride QM6a (ATCC 13631), T.koningii (ATCC 18649), F.solani (ATCC 16372) und F.javanicum
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(ATCC 22403). T. viride QM9123 (ATCC 24449) und T.viride QM9414 (ATCC 26921) werden bevorzugt. Der Ausdruck "cellulolytischer Mikroorganismus" bezieht sich auf einen Mikroorganismus, der einen cellulolytischen Enzymkomplex entwickelt, welcher imstande ist, natürliche, kristalline Cellulose abzubauen.
Die den cellulolytischen Enzymkomplex enthaltende wässrige Kulturmasse selbst wird in herkömmlicher Weise hergestellt, indem der cellulolytische Mikroorganismus in an sich bekannter Weise in einem wässrigen Nährmedium in Gegenwart von Cellulosematerial in Schüttelkolben in Submerskultur gezüchtet wird« Typische Methoden sind in einer Arbeit von Mandels und Weber in "Advances in Chemistry, Series ACS 95", 1969, auf Seite 391-414 beschrieben. Nach beendeter Züchtung wird die wässrige Kulturmasse oder ein Teil derselben direkt ohne weitere Behandlung in der Celluloseverzuckerungsstufe eingesetzt, wobei höchstens eine Einregelung des pH-Wertes erforderlich sein kann. Es ist also unnötig und unerwünscht, das Mycel oder das Cellulosematerial abzufiltrieren.
Abgesehen von dem Erfordernis, dass die wässrige Kulturmasse als Enzymquelle verwendet werden soll, sind die enzymatischen Hydrolysebedingungen die herkömmlichen. Zu diesen Bedingungen gehört gewöhnlich ein wässriges Medium mit einem pH-Wert im Bereich von etwa 4,8 bis 5,2, wobei der optimale pH-Wert 5 beträgt, eine Temperatur im Bereich von 25 bis 50° C, vorzugsweise von 45 bis 50° C, eine Konzentration des cellulolytischen Enzymkomplexes von 0^01 bis 5 Gewichtsprozent des Reaktionsgemisches und eine Konzentration des Cellulosesubstrats von etwa 1 bis 30 Gewichtsprozent,
Als Quellen für Cellulose sowohl für die Herstellung der wässrigen Enzymkulturmasse als auch für die enzymatische Hydrolyse kann verhältnismässig reine Cellulose oder Abfallcellulose verwendet werden, wie es in den Arbeiten von Toyama und Mitarbeitern und von Mandels, Hontz und Nystrom beschrieben ist. So kann man z.B0 mit Erfolg gereinigte Fichtenholzcellulose ("Solka Floc"), mikrokristalline Cellulose ("Avicel"), Zeitungsdruckpapier, Zeitungspapier, Hartfaser-
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FeSO4 . 7H2O
MnSO4 . H2O
ZnSO4 ο 7H2O
CoCl2 . 6H2O
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platten, Milchkartons, Abfall von Papierfabriken, Cellulosefasern von der Nass- oder Trockenzerkleinerung von städtischem Müll und dergleichen verwenden.
Beispiel 1
Eine wässrige Enzymkulturmasse wird folgendermassen hergestellt:
Zu zwei Kartoffeldextrose-Agar-Schrägröhrchen mit T.viride QM9123 werden je 5 ml sterilisiertes Wasser zugesetzt. Nach dem Schütteln werden die erhaltenen Suspensionen vereinigt und zu 10 ml einer Spurenmetallösung der folgenden Zusammensetzung zugesetzt:
250 mg . 80 mg 70 mg
100 mg Entmineralisiertes Wasser 500 ml
1 ml dieses Gemisches wird dann zu 1,5 g nasser roher Fasern zugesetzt, die mit 29 ml entmineralisiertem Wasser verdünnt worden sind.
Die nassen rohen Fasern sind durch Nasszerfaserung und Einstampfen von städtischem Müll gewonnen worden und haben einen Feststoffgehalt von 30,1 Gewichtsprozent. Auf Trockenbasis haben die Fasern einen Ligningehalt vom 10,3 und einen Cellulosegehalt von 68,1 Gewichtsprozent. Vor dem Verdünnen mit dem entmineralisierten Wasser sind die nassen rohen Fasern mit 100 ml Wasser gemischt und dann abzentrifugiert worden.
Das Gemisch aus T.viride, der Spurenelementlösung, den nassen rohen Fasern und dem entmineralisierten Wasser wird mit 20 ml eines wässrigen Nährmediums versetzt, das hergestellt worden ist, indem 70 g Ammoniumsulfat, 100 g Monokaliumphosphat (KH2PO4)., 15 g Harnstoff, I5 g CaCl2 . 2H2O, 15 g MgSO4 . 7H2O und 37,5 g Pepton gründlich in einem Mörser gemischt und 5,05 g dieses Gemisches in 400 ml entmineralisiertem Wasser gelöst wurden.
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Vor dem Beimpfen mit T.viride werden, die Nährlösung und die nassen rohen Fasern durch 15 Minuten langes Erhitzen auf 121° C sterilisierte Dann erfolgt die Inkubation in einer rotierenden Schüttelvorrichtung bei 24 C im Verlaufe von 7 Tagen. Der pH-Wert der so erhaltenen Kulturmasse beträgt 5,22; vor ihrer Verwendung als Enzymquelle zum Hydrolysieren von Cellulose wird die Kulturmasse mit Salzsäure auf einen pH-Wert von 5,0 eingestellt.
Die ganze wässrige Enzymkultur wird dann für die nachfolgende enzymatische Hydrolyse von Cellulose in vier Teile geteilt. Ein Teil (A) wird direkt ohne weitere Behandlung zur Hydrolyse verwendet. Ein zweiter Teil (B) wird durch Glaswolle filtriert, um das Mycel und sonstige unlösliche Stoffe zu entfernen; das so erhaltene Kulturfiltrat wird für die Hydrolyse verwendet. Der dritte Teil (C) wird in einem Zellenzerreiss-Beschallungsgerät (Heat Systems - Ultrasonics, Inc., Plainview, N.Y., Modell W185) mit Ultraschallwellen behandelt, wofür eine Standard-Mikrospitze (Bronson Sonic Power Co., Danbury, Connecticut) verwendet wird, und dann für die Hydrolyse eingesetzt. Die Beschallung erfolgt viermal mit Ultraschallstößen von je 15 Sekunden bei einer Gerätablesung von 55 bis 75 Watt. Der Zweck dieser Behandlung ist der Versuch, etwa an die Zellwandungen des T.viride-Mycels gebundenes Enzym in Freiheit zu setzen. Der vierte Teil (D) wird der gleichen Ultraschallbehandlung unterworfen wie der dritte Teil, aber dann durch Glaswolle filtriert, um die unlöslichen Stoffe zu entfernen. Das so erhaltene Kulturfiltrat wird für die Hydrolyse verwendet.
Für die Hydrolyse werden durch Zusatz von vier gesonderten Anteilen von je 300 mg eines in der Kugelmühle auf Teilchengrössen unter 74 u vermahlenen Fichtenholzcellulose-Zellstoffs (»Solka Floe BW 200» der Brown Company, Berlin, N.H.) zu 4 ml eines jeden der obigen Enzympräparate vier wässrige Cellulosesuspensionen mit einer Konzentration von 7,5 g/100 ml hergestellt. Jedes der vier Gemische wird mit 0,05-molarem Acetatpuffer auf einen pH-Wert von 5,0 einge-
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stellt und bei 45 C inkubiert. Aus jedem Gemisch werden nach 1, 2 und 3 Tagen Proben entnommen, 5 Minuten in einem siedenden Wasserband gehalten, um das Enzym zu entaktivieren und dann auf reduzierende Zucker, bestimmt als Glucose, nach der Dinitrosalicylsäuremethode analysiert. [Vgl. G.L.· Miller, "Analytical Chemistry", Band 31, Seite 426 (1959)]. Die Ergebnisse finden sich in der folgenden Tabelle:
% reduzierender Zucker, als Glucose
nach
Enzymquelle 1 Tag 2 Tagen 3 Tagen
A ■ 3,53 • 4,70 5,04
B 2,72 3,53 4,22
C 3,00 3,93 4,30
D 2,51 3,41 3,81
Die Werte der obigen Tabelle sind in der Zeichnung in graphischer Form dargestellt.
Aus den Werten der Tabelle und der Zeichnung ergibt sich, dass durch Verwendung einer vollständigen wässrigen Kulturmasse als cellulolytische Enzymquelle gemäss der Erfindung eine Erhöhung sowohl der Hydrolysegeschwindigkeit der Cellulose als auch der Ausbeute an wasserlöslichen Zuckern erzielt wirdο Wenn die Kulturmasse z.B. nur einfach filtriert und das KuIturfiltrat als Enzymquelle verwendet wird (Enzymquelle B, Kurve B), wie es bisher üblich war, erhält man eine bedeutend niedrigere Hydrolysegeschwindigkeit und Zuckerausbeute als bei Verwendung der ganzen Kulturmasse als Enzymquelle (Enzymquelle A, Kurve A). Obwohl die Beschallung mit Ultraschallwellen die enzymatisch^ Aktivität vermindert (Enzymquelle C, Kurve C), erhält man in diesem Falle immer noch eine günstigere Hydrolysegeschwindigkeit und Zuckerausbeute als mit einer anderweitig gleichen Enzymquelle, die aber ausserdem filtriert und in Form des Kulturfiltrats für die Hydrolyse eingesetzt
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worden ist (Enzymquelle D, Kurve D).
Beispiel 2
Eine andere wässrige Enzymkulturmasse wird gemäss Beispiel 1 hergestellt, wobei jedoch die Züchtung 18 Tage fortgesetzt wird. Die so erhaltene Kulturmasse hat einen pH-Wert von 5,58, der vor ihrer Verwendung zur enzymatischen Hydrolyse mit Salzsäure auf 5,0 eingestellt wird.
Aus zwei 4-ml-Proben dieser wässrigen Kulturmasse werden gesondert
(1) durch Zusatz von 300 mg des in Beispiel 1 beschriebenen Fichtenholzzellstoffs eine wässrige Zellstoffsuspension mit einer Konzentration von 7,5 g Feststoffen je 100 ml und
(2) durch Zusatz von 300 mg getrockneter roher Fasern, die aus den in Beispiel 1 beschriebenen nassen Fasern gewonnen worden sind, eine rohe Fasersuspension mit einer Konzentration von 7,5 g Fasern je 100 ml hergestellt. Vor dem Trocknen sind die nassen rohen Fasern mit Wasser gemischt und durch ein grobes Glasfrittenfilter abfiltriert worden, und der Filterkuchen ist dreimal mit je 5 1 destilliertem Wasser gewaschen worden.
Eine jede Cellulosesuspension wird mit 0,05-molarem Acetatpuffer auf einen pH-Wert von 5,0 eingestellt. Die beiden Gemische aus Kulturmasse und Cellulosematerial werden bei 45° C inkubiert. Aus jedem Gemisch werden nach 1, 2 und 3 Tagen Proben entnommen, 5 Minuten in siedendem Wasser gehalten, um das Enzym zu entaktivieren, und dann auf reduzierende Zucker, bestimmt als Glucose, nach der gleichen Dinitrosalicylsäuremethode wie in Beispiel 1 analysiert- Die Ergebnisse sind die folgenden:
% reduzierender Zucker, als Glucose nach
Substrat 1 Tag . 2 Tagen 3 Tagen
Fichtenholzzellstoff 3,74 . 4,93 5,39 Getrocknete rohe Faser 2,45 3,07 3,15
60°.?U R/0907
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Wie die obige Beschreibung zeigt, kann man eine vollständige wässrige Kulturmasse einschliesslich des cellulolytischen Mikroorganismus, der cellulosehaltigen Kohlenstoffquelle und des wässrigen Nährmediums erfolgreich als Enzymquelle für die enzymatische Hydrolyse von Cellulose einsetzen. Durch diese Maßnahme erzielt man erhöhte Hydrolysegeschwindigkeiten und Ausbeuten an wasserlöslichen Zuckern.
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Claims (1)

  1. Bio Research Center
    Company, Ltd.
    Patentansprüche
    /Ij Verfahren zur enzymatischen Hydrolyse von Cellulose zu wasserlöslichen Zuckern, bei dem
    (a) ein extrazellulärer cellulolytischer Enzymkomplex, der die Fähigkeit hat, natürliche Cellulose abzubauen, in einer Enzymherstellungsstufe durch Züchten eines cellulolytischen Mikroorganismus, der befähigt ist, diesen Enzymkomplex zu entwickeln, in einem wässrigen Nährmedium in Gegenwart von Cellulosematerial in Form einer wässrigen Kulturmasse hergestellt und
    (b) sodann ein Cellulosesubstrat in Gegenwart des Enzymkomplexes unter enzymatischen Hydrolysebedingungen zu den Zuckern hydrolysiert wird,
    dadurch gekennzeichnet, dass man für die Hydrolysestufe die wässrige Kulturmasse der Enzymherstellungsstufe verwendet, ohne irgendwelche Bestandteile daraus abzutrennen.
    2O Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man als cellulolytischen Mikroorganismus Trichoderma viride verwendet.
    3» Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man in der Enzymherstellungsstufe Cellulosematerial und in der Hydrolysestufe ein Cellulosesubstrat verwendet, die aus Abfallcellulöse gewonnen worden sind.
    - 10 609845/0907
DE2603889A 1975-04-28 1976-02-02 Verfahren zur enzymatischen Hydrolyse von Cellulose zu wasserlöslichen Zuckern Expired DE2603889C3 (de)

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