DE60119941T2 - Verfahren zur herstellung von glucose mit ein ermodifizierten zellulase - Google Patents

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Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft die enzymatische Umwandlung von Cellulose in Glucose. Spezieller stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren für die Umwandlung von vorbehandelten Lignocellulose-haltigen Substraten unter Verwendung von modifiziertem CBHI-Protein und die Zurückgewinnung und Wiederverwendung des modifizierten CBHI-Proteins bereit.
  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Eine vollständige Liste der Literaturstellen kann am Ende der Beschreibung gefunden werden.
  • Cellulose ist eines der am häufigsten in der Natur gefundenen Polymere und besteht aus Glucose-Einheiten, die über beta-1,4-Verknüpfungen verbunden sind. Die beta-1,4-Verknüpfungen, welche die einzelnen Glucose-Einheiten verbinden, werden nicht leicht abgebaut oder depolymerisiert. Jedoch gibt es eine Vielfalt von Cellulase-Enzymen, die enzymatisch Cellulose hydrolysieren können.
  • Cellulasen sind Enzyme, welche von einer Anzahl von Mikroorganismen produziert werden und die Hydrolyse von Cellulose zu Produkten wie Glucose, Cellobiose und anderen Cellooligosacchariden katalysieren. Cellulase ist gewöhnlich ein generischer Ausdruck, der eine Multienzymmischung bezeichnet, die Exocellobiohydrolasen (CBH), Endoglucanasen (EG) und β-Glucosidasen umfasst. Cellulase, die von dem filamentösen Pilz Trichoderma longibrachiatum produziert wirden, umfasst mindestens zwei Cellobiohydrolase-Enzyme, die als CBHI und CBHII bezeichnet werden, und mindestens 4 EG-Enzyme.
  • Cellulase-Enzyme arbeiten synergistisch, um Cellulose zu Glucose abzubauen. CBHI und CBHII wirken allgemein auf die Enden der Glucose-Polymere in Cellulose-Mikrofibrillen unter Freisetzung von Cellobiose ein (Teeri und Koivula, 1995), während die Endoglucanasen an statistischen Orten auf die Cellulose einwirken. Zusammen hydrolysieren diese Enzyme Cellulose zu kleineren Cellooligosacchariden, wie Cellobiose. Cellobiose wird durch β-Glucosidase zu Glucose hydrolysiert.
  • Die Gene, welche CBHI, CBHII (Shoemaker et al., 1983; Teeri et al., 1987), EG I und EG II (Penttila et al., 1986; Saloheimo et al., 1988) kodieren, sind aus filamentösen Pilzen wie T. reesei und T. longibrachiatum kloniert und isoliert worden. CBHI, CBHII und die meisten der Haupt-EG-Enzyme umfassen eine katalytische Kerndomäne und eine Cellulose-bindende Domäne (CBD), die durch eine flexible Linkerregion getrennt sind. Die Cellulose-bindende Domäne (CBD) fördert die Adsorption des Enzyms an Regionen des Cellulose-haltigen Substrats (Tomme et al., 1988; Gilkes et al., 1992), während die Kerndomäne für die Katalyse der Spaltung von Cellulose verantwortlich ist. Die Linkerregion kann einen optimalen Zwischendomänen-Abstand zwischen der Kerndomäne und der Cellulose-bindenden Domäne sicherstellen (Teeri et al., 1992).
  • Proteine, die entweder aus der isolierten CBD oder dem Kernprotein bestehen, sind erzeugt und untersucht worden. Kernproteine von CBHI werden auch in Mengen von weniger als etwa 10% in Cellulase-Mischungen gefunden, die aus natürlichen Quellen erhalten wurden. Untersuchungen über die isolierte fungale katalytische Domäne (Kernprotein) legen nahe, dass dieses Protein an Cellulose binden kann, wenn auch mit verringerter Affinität im Vergleich zu nativem (Holo-)Protein (Tomme et al., 1988). Die starke Bindung, die Cellulasen durch ihre CBD verliehen wird, legt nahe, dass die Adsorption von mehreren Cellulasen an Cellulose im Wesentlichen irreversibel ist (Beldman et al., 1987; Kyriacou et al., 1989).
  • CBHI-Kernprotein aus Trichoderma reesei bindet sich nicht so fest an Cellulose wie CBHI. Das CBHI-Kernprotein ist gegenüber kleinen löslichen Substrate, wie den chromophoren Glycosiden, die von den Cyclodextrinen und Lactose abgeleitet sind, voll aktiv. Jedoch ist seine Aktivität gegenüber einem unlöslichen Cellulose-Substrat, wie Avicel (einem kristallinen Typ von Cellulose), im Vergleich zu CBHI in großem Maß verringert (Van Tilbeurgh et al., 1986). Van Tilbeurgh zeigte, dass CBHI-Kern weniger als 1% so aktiv wie CBHI war. Dies wurde der Tatsache zugeschrieben, dass 88% der CBHI an der Cellulose adsorbierten, gegenüber lediglich 36% des CBHI-Kernproteins. Kim et al. (1997) überprüften die Absorption und Aktivitäten von CBHI, CBHI-Kern und anderen Protein-Mischungen auf Avicel. Sie offenbaren, dass CBHI-Kern weniger als 1/4 der Menge an reduzierendem Zucker aus Avicel im Vergleich zu CBHI produzierte. Die höhere Hydrolysegeschwindigkeit durch CBHI wurde dessen besserer Bindung zugeschrieben. Kotiranta et al. (1999) beobachteten in ähnlichen Experimenten mit Wasserdampf-vorbehandelter Weide eine drastisch verringerte Hydrolysegeschwindigkeit bei CBHI-Kern im Vergleich zu intakter CBHI und schlossen, dass CBHI eine CBD für eine effiziente Adsorption und Hydrolyse benötigt. Nidetsky et al. (1994) beobachteten ähnliche Trends zwischen CBHI-Kern und CBHI. Über 80% der CBHI adsorbierten auf Cellulose-Filterpapier, verglichen mit lediglich 40% von CBHI-Kern. Die Hydrolysegeschwindigkeit des Kerns und von CBHI waren direkt proportional zu der Menge an adsorbiertem Protein, wobei CBHI mehr als zweimal so aktiv wie CBHI-Kern war. Diese Untersuchungen zeigen, dass es keinen Vorteil bei der Verwendung von CBHI-Kern anstelle von CBHI bei der Cellulose-Hydrolyse gibt, da die Aktivität von CBHI-Kern gegenüber kristalliner Cellulose viel langsamer ist als die von CBHI.
  • Die Umwandlung von Cellulose aus Cellulose-haltigem Material in Glucose ist in vielen industriellen Verfahren, wie der Bioumwandlung von Cellulose in Treibstoff-Ethanol, wichtig. Leider ist Cellulose, die in dem meisten Pflanzenmaterial enthalten ist, nicht leicht in Glucose überführbar, und dieser Schritt stellt eine Haupthürde bei der Kommerzialisierung eines derartigen Verfahrens dar. Ursprünglich glaubte man, dass die effiziente Umwandlung von Cellulose aus Cellulose-haltigem Material in Glucose die Freisetzung von Cellulose und Hemicellulose aus ihrem Komplex mit Lignin beinhaltet. Jedoch konzentrieren sich neuere Verfahren auf die Steigerung der Zugänglichkeit zu Cellulose innerhalb der Lignocellulose-haltigen Biomasse, gefolgt von der Depolymerisation von Cellulose-Kohlenhydratpolymeren zu Glucose. Die Steigerung der Zugängigkeit zu Cellulose wird am häufigsten durch eine Vorbehandlung des Cellulose-haltigen Substrats bewerkstelligt.
  • Das Ziel der meisten Vorbehandlungsverfahren besteht darin, eine ausreichende Kombination von mechanischer und chemischer Einwirkung zuzuführen, um die Faserstruktur zu zerstören und die Zugängigkeit des Ausgangsmaterials zu Cellulose-Enzymen zu verbessern. Die mechanische Einwirkung umfasst typisch die Verwendung von Druck, Zerreiben, Mahlen, Rühren, Zerfasern, Kompression/Expansion oder andere Arten mechanischer Einwirkung. Die chemische Einwirkung umfasst typisch die Verwendung von Wärme (häufig Wasserdampf), Säure und Lösungsmitteln. Zum Beispiel ist einer der führenden Ansätze zur Vorbehandlung mittels Wasserdampfexplosion unter Verwendung der Verfahrensbedingungen, die in der U.S. 4,461,648 und auch in Foody et al., 1980, beschrieben werden, welche beide hierin durch Bezugnahme aufgenommen werden. In diesem Verfahren wird Lignocellulose-haltige Biomasse in eine Wasserdampfkanone geladen, und bis zu 5% Säure werden gegebenenfalls zu der Biomasse in der Wasserdampfkanone oder bei einem Voreinweichen vor dem Beladen der Wasserdampfkanone gegeben. Die Wasserdampfkanone wird dann sehr rasch mit Wasserdampf gefüllt und über eine eingestellte Spanne der Kochzeit bei hohem Druck gehalten. Wenn die Kochzeit verstrichen ist, wird der Druck im Gefäß rasch abgelassen, um die vorbehandelte Biomasse auszustoßen.
  • Ein weiterer Ansatz, der in der U.S. 4,237,226 beschrieben ist, offenbart die Vorbehandlung von Eiche, Zeitungspapier, Pappel und Maisstroh durch einen kontinuierlichen Kolbenstromreaktor, eine Vorrichtung, die einem Extruder ähnlich ist. Rotationsschnecken fördern eine Ausgangsmaterial-Aufschlämmung durch eine kleine Öffnung, wo mechanische und chemische Einwirkung die Fasern zerbrechen.
  • Eine Vorbehandlung ist vorgeschlagen worden, um die Delignifizierung des Cellulose-haltigen Substrats zu fördern (Fan et al., 1981), Mikroporen durch die Entfernung von Hemicellulose zu schaffen, die Kristallinität des Substrats zu ändern und den Polymerisationsgrad der Cellulose zu verringern (Knappert et al., 1980) und die Oberfläche des Cellulose-haltigen Substrats zu erhöhen (Grethlein und Converse, 1991; Grohman et al., 1985).
  • Leider war bis heute der Ansatz einer Vorbehandlung, gekoppelt mit Enzym-Hydrolyse, nicht in der Lage, Glucose mit ausreichend geringen Kosten zu produzieren, um die Umwandlung von Cellulose in Ethanol kommerziell attraktiv zu machen. Selbst mit den effizientesten der derzeit bekannten Vorbehandlungsverfahren ist die erforderliche Menge an Cellulase-Enzym zur Umwandlung von Cellulose in Glucose hoch, und dies stellt signifikante Kosten bei der Ethanol-Erzeugung dar. Die Möglichkeit, weniger Cellulase zu dem System zu geben, verringert gewöhnlich die erzeugte Glucose-Menge in einem unannehmbaren Ausmaß. Der Ansatz der Verringerung der erforderlichen Enzym-Menge durch Erhöhen der Zeitspanne, über welche das Enzym auf die Cellulose einwirkt, führt zu einer unwirtschaftlichen Verfahrensproduktivität, welche von den hohen Kosten herrührt, die mit dem Halten der enzymatischen Mischungen in Hydrolyse-Tanks verbunden sind.
  • So gibt es einen Bedarf in der Technik, neue Verfahren zu identifizieren, welche die Umwandlung von Cellulose innerhalb eines Cellulose-haltigen Substrats zu Glucose verbessern. Weiter gibt es einen Bedarf in der Technik, Enzyme oder Mischungen von Enzymen zu identifizieren, welche die Umwandlung von Cellulose in Glucose verbessern und die zurückgewinnbar, wiedereinsetzbar und wiederverwendbar sind.
  • Es ist ein Ziel der vorliegenden Erfindung, die Nachteile des Standes der Technik zu überwinden.
  • Das obige Ziel wird durch eine Kombination der Merkmale der Hauptansprüche erreicht. Die Unteransprüche offenbaren weitere vorteilhafte Ausführungsformen der Erfindung.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft die enzymatische Umwandlung von Cellulose in Glucose.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Umwandlung von Cellulose in Glucose bereitgestellt, welches umfasst: Behandeln eines vorbehandelten Lignocellulose-haltigen Substrats mit einer Enzymmischung, die Cellulase-Enzym und eine modifizierte CBHI umfasst, wobei die modifizierte CBHI in der Enzymmischung in einer Menge von 55 bis 100% relativ zu allen Enzymen vom CBHI-Typ vorliegt und das vorbehandelte Lignocellulose-haltige Substrat mindestens 10% Lignin umfasst. Vorzugsweise beträgt die Menge an modifizierter CBHI in der Enzymmischung 70 bis 100%. Bevorzugter beträgt die Menge an modifizierter CBHI in der Enzymmischung 80 bis 100%. Weiter betrifft diese Erfindung das oben erwähnte Verfahren, in dem die modifizierte CBHI nach dem Behandlungsschritt zurückgewonnen wird. Diese Erfindung betrifft das obige Verfahren, in dem die modifizierte CBHI aus CBHI-Kern, CBHI-Kern plus -Linker und CBHI mit inaktivierter Cellulose-bindender Domäne und deren Kombinationen ausgewählt ist. Die vorliegende Erfindung betrifft auch das obige Verfahren, in dem das vorbehandelte Lignocellulose-haltige Substrat unter Verwendung eines Säure-Wasserdampfkochens vorbehandelt wird.
  • Ein Aspekt dieser Erfindung betrifftt ein Verfahren zur Umwandlung von Cellulose innerhalb eines Cellulose-haltigen Substrats in Glucose, umfassend: Behandeln eines vorbehandelten Lignocellulose-haltigen Substrats mit einer Enzymmischung, die CBHI, CBHII, EG I, EG II, β-Glucosidase und modifizierte CBHI umfasst, wobei die modifizierte CBHI in der Enzymmischung in einer Menge von 55 bis 100% relativ zum ganzen Enzym vom CBHI-Typ vorliegt und das vorbehandelte Lignocellulose-haltige Substrat mindestens 10% Lignin umfasst. Bevorzugt beträgt die Menge an modifizierter CBHI in der Enzym-Mischung 70 bis 100%. Bevorzugter beträgt die Menge an modifizierter CBHI in der Enzymmischung 80 bis 100%. Weiter betrifft diese Erfindung das obige Verfahren, in dem die modifizierte CBHI nach dem Behandlungsschritt zurückgewonnen wird. Diese Erfindung betrifft das Verfahren, wie soeben beschrieben, in dem die modifizierte CBHI aus CBHI-Kern, CBHI-Kern plus -Linker und CBHI mit inaktivierter Cellulose-bindender Domäne und deren Kombinationen ausgewählt ist.
  • Die vorliegende Erfindung umfasst Verfahren, wie oben definiert, in denen das vorbehandelte Lignocellulose-haltige Substrat ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus landwirtschaftlichen Rückständen, Rückständen nach Stärke- oder Zuckerentfernung, für Ethanol bestimmten Feldfrüchten, Forstwirtschaftsprodukten und Zellstoff- und Papierprodukten oder deren Kombinationen. Vorzugsweise sind die landwirtschaftlichen Rückstände ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Maisstroh, Weizenstroh, Gerstenstroh, Sojabohnenstroh; sind die Rückstände nach Stärke- oder Zuckerentfernung ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Haferschalen, Reisschalen, Zuckerrohr-Bagasse und Maisfaser; sind die für Ethanol bestimmten Feldfrüchte ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Hirse, Chinaschilf, Spartgras und Roggengras; sind die Forstwirtschaftsprodukte ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Hartholz, Weichholz, Eukalyptus und Sägemehl; und sind die Zellstoff- und Papierprodukte Solka-Floc.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft auch die Verfahren zur Lignocellulose-Hydrolyse, wie oben definiert, bei denen das Lignocellulose-haltige Substrat dadurch charakterisiert ist, dass es einen EI von mindestens etwa 0,5 und einen RI von etwa 45 bis etwa 100 aufweist. Diese Erfindung umfasst auch die obigen Verfahren, in denen der EI etwa 1,0 bis etwa 4,0 beträgt und der RI etwa 60 bis etwa 100 beträgt.
  • Ebenfalls eingeschlossen in der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren, wie oben definiert, in dem ein vorbehandeltes Lignocellulose-haltiges Substrat in der Enzymmischung in einer Konzentration von etwa 1 Gew.-% bis etwa 25 Gew.-% in einer wässrigen Aufschlämmung vorliegt. Bevorzugt liegt das Lignocellulose-haltige Substrat in der Enzymmischung in einer Konzentration von etwa 10 Gew.-% bis etwa 16 Gew.-% in wässriger Aufschlämmung vor.
  • Ebenfalls hierin beschrieben ist ein Verfahren zur Hydrolyse von Cellulose in Glucose, welches die Behandlung eines vorbehandelten Lignocellulose-haltigen Substrats umfasst, das durch einen EI von etwa 0,5 bis etwa 4 gekennzeichnet ist, wobei eine Enzymmischung Cellulase-Enzym mit Enzymen vom CBHI-Typ umfasst, worin die Enzyme vom CBHI-Typ 20% bis 100% CBHI-Kern umfassen.
  • Ein Aspekt des Verfahrens der Erfindung kann Verfahren zur Umwandlung von Cellulose innerhalb eines Cellulose-haltigen Substrats in Glucose umfassen, welches umfasst: Behandeln eines vorbehandelten Lignocellulose-haltigen Substrats mit einer Enzymmischung, die CBHI-Kern und eine oder mehrere von CBHI1, CBHII, EG I, EG II und β-Glucosidase umfasst, wobei der CBHI-Kern in der Enzymmischung in einer Menge von 15 bis 100% relativ zum ganzen Enzym vom CBHI-Typ vorliegt. Bevorzugt beträgt die Menge an CBHI-Kern in der Enzymmischung 50 bis 100%. Bevorzugter beträgt die Menge an CBHI-Kern in der Enzymmischung 80 bis 100%.
  • Weiter kann das Verfahren der vorliegenden Erfindung in einem Aspekt ein Verfahren zur Umwandlung von Cellulose in Glucose umfassen, welches das Behandeln eines vorbehandelten Lignocellulose-haltigen Substrats mit einer Enzymmischung umfasst, die CBHI-Kern plus -Linker und eine oder mehrere von CBHI1, CBHII, EG I, EG II und β-Glucosidase umfasst, wobei der CBHI-Kern plus -Linker in der Enzymmischung in einer Menge von 50% bis 100% relativ zu allen Enzymen vom CBHI-Typ vorliegt. Vorzugsweise beträgt die Menge an CBHI-Kern plus -Linker in der Enzymmischung 70% bis 100%. Bevorzugter beträgt die Menge an CBHI-Kern plus -Linker in der Enzymmischung 80% bis 100%.
  • Es wird auch eine Cellulase-Zusammensetzung beschrieben, die modifizierte CBHI und eine oder mehrere von CBHI, CBHII, EG I, EG II und β-Glucosidase umfasst, wobei die modifizierte CBHI in der Cellulase-Zusammensetzung in einer Menge von 55 bis 100 Gew.-% relativ zu dem ganzen Enzym vom CBHI-Typ vorliegt. Die modifizierte CBHI kann 70 bis 100 Gew.-% betragen oder kann 80 bis 100 Gew.-% betragen. Die modifizierte CBHI dieser Cellulase-Zusammensetzung kann eine modifizierte Trichoderma-CBHI sein.
  • Ebenfalls beschrieben wird eine Cellulase-Zusammensetzung, die ein Enzym vom CBHI-Typ und eine oder mehrere von CBHII, EG I, EG II und β-Glucosidase umfasst, wobei CBHI-Kern in der Cellulase-Zusammensetzung in einer Menge von 15 bis 100 Gew.-% realtiv zu dem ganzen Enzym vom CBHI-Typ vorliegt. Der CBHI-Kern kann 50 bis 100 Gew.-% oder 80 bis 100 Gew.-% betragen. Der CBHI-Kern dieser Cellulase-Zusammensetzung kann aus Trichoderma-CBHI erhalten sein.
  • Ebenfalls beschrieben wird eine Cellulase-Zusammensetzung, die modifizierte CBHI und eine oder mehrere von CBHII, EG I, EG II und β-Glucosidase umfasst, wobei die modifizierte CBHI in der Cellulase-Zusammensetzung zu 50 bis 90 Gew.-% relativ zu anderen Cellulase-Enzymen vorliegt. Die modifizierte CBHI kann eine modifizierte Trichoderma-CBHI sein.
  • Diese Zusammenfassung beschreibt nicht notwendigerweise alle erforderlichen Merkmale der Erfindung, sondern die Erfindung kann auf einer Unterkombination der beschriebenen Merkmale beruhen.
  • KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
  • Diese und andere Merkmale der Erfindung werden aus der folgenden Beschreibung ersichtlicher, in der auf die beigefügten Zeichnungen Bezug genommen wird, in denen:
  • 1 eine graphische Darstellung der prozentualen Umwandlung von Cellulose in Glucose unter Verwendung verschiedener vorbehandelter Lignocellulose-haltiger Substrate und variierender Mengen an CBHI und CBHI-Kernprotein zeigt. 1A zeigt die Hydrolyse von vorbehandeltem gewaschenem Maisstroh unter Verwendung zunehmender Mengen an entweder CBHI oder CBHI-Kern. 1B zeigt die Umwandlung vorbehandelter Haferschalen nach dreistündiger Inkubation unter Verwendung verschiedener Mischungen von CBHI und CBHI-Kernprotein. 1C zeigt eine graphische Darstellung der prozentualen Umwandlung von Cellulose aus vorbehandelter Pappel in Glucose nach dreistündiger Inkubation unter Verwendung verschiedener Kombinationen von CBHI und CBHI-Kernprotein.
  • 2 zeigt eine graphische Darstellung der Auswirkung der Abwandlung der Konzentration des Cellulose-haltigen Substrats innerhalb einer Reaktionsmischung. 2A zeigt die Hydrolyse von Cellulose zu Glucose unter Verwendung variierender Konzentrationen von SIGMACELLTM. 2B zeigt die Hydrolyse von Cellulose zu Glucose unter Verwendung variierender Konzentrationen an vorbehandelter Pappel. 2C zeigt eine Zusammenfassung der aus den 2A und 2B erhaltenen Daten, welche den EI bei variierten Substrat-Konzentrationen vergleicht.
  • 3 zeigt eine graphische Darstellung der Beziehung zwischen der relativen Hydrolysegeschwindigkeit von CBHI-Kern und CBHI und der Menge an aus der Reaktionsmischung zurückgewonnenem CBHI-Kern. Das hohe Maß der Rückgewinnung von CBHI-Kern ist ein direktes Ergebnis der Menge an CBHI-Kern in Lösung und der Reaktionsmischung.
  • 4 zeigt eine graphische Darstellung der Beziehung der Aktivität von CBHI und CBHI-Kern in Cellulase-Enzymmischungen, die CBHII, EG I (Endoglucanase I) und BG (β-Glucosidase) umfassen.
  • BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORM
  • Die vorliegende Erfindung betrifft die enzymatische Umwandlung von Cellulose in Glucose. Spezieller stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Umwandlung von vorbehandelten Lignocellulose-haltigen Substraten unter Verwendung von modifiziertem CBHI-Protein und die Rückgewinnung und Wiederverwendung des modifizierten CBHI-Proteins bereit.
  • Die folgende Beschreibung ist eine bevorzugte Ausführungsform lediglich mittels Beispiels und ohne Beschränkung der Kombination von Merkmalen, die für die wirkungsvolle Durchführung der Erfindung erforderlich sind.
  • Es ist in der Technik wohlbekannt, dass Cellulose in vielen Lignocellulose-haltigen Materialien nicht leicht durch Enzyme hydrolysierbar sein kann. Demgemäß wird es bevorzugt, dass das Cellulose-haltige Substrat für eine enzymatische Hydrolyse, wie hierin beschrieben, vor der Behandlung mit Enzymen vorbehandelt wird.
  • Es gibt eine Anzahl von in der Technik bekannten Vorbehandlungsverfahren, die thermische, mechanische, chemische oder Kombinationen dieser Verfahren verwenden, um die Faserstruktur von Cellulose-haltigen Substraten zu zerstören, und die die anschließende enzymatische Hydrolyse des Cellulose-haltigen Substrats verbessern. Jedes Vorbehandlungsverfahren, das die enzymatische Hydrolyse verbessern kann, kann in Kombination mit dem Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Zum Beispiel, ohne dass man jedoch beschränkt zu sein wünscht, kann das Vorbehandlungsverfahren, das in der U.S. 4,461,648 oder U.S. 4,237,226 (die beide hierin durch Bezugnahme aufgenommen werden) verwendet wird, oder irgendeines der in der Technik bekannten Aufschlussverfahren (z.B. Rydholm S. A. 1985, Pulping Processes, Kreiger Pub. Co., das hierin durch Bezugnahme aufgenommen wird), einschließlich Kraft-, Sulfit-, mechanischen, thermischen und chemisch-thermisch-mechanischen Aufschlusses, verwendet werden. Alternativ können Vorbehandlungsverfahren auch die Zugabe von organischen Lösungsmitteln beinhalten, um die Fraktionierung von Lignin, Cellulose und Hemicellulose aus Lignocellulose-haltigen Ausgangsmaterialien zu unterstützen. Diese Vorbehandlungsverfahren können, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, jene einschließen, die in der U.S. 3,932,307 , welche die Imprägnierung von Lignocellulose-haltigem Ausgangsmaterial mit einer Lösung von mit Lignin löslichmachendem Reaktanten in einem organischen Lösungsmittel und das anschließende Eintauchen des imprägnierten Materials in ein Lösungsmittel lehrt, welches mit der Reaktanten-haltigen Lösung, mit der das Lignocellulose-haltige Material imprägniert worden ist, weder löslich noch mischbar ist; in der U.S. 4,826,566 , die Lösungsmittelmischungen, wie Triethylenglycol mit Arylsulfon- oder anderen Säuren, verwendet; in der U.S. 5,859,236 , welche die Imprägnierung von Lignocellulose-haltigem Material mit einer Extraktionsflüssigkeit lehrt, die ein Glycol und Lewis-Säure enthält; und in der U.S. 5,730,838 offenbart sind, welche die Behandlung von Lignocellulose-haltigem Material mit einer Kombination von Alkohol, Wasser und mit Wasser nicht mischbarem organischem Lösungsmittel, zum Beispiel einem Keton, lehrt.
  • Ein bevorzugtes Vorbehandlungsverfahren ist ein Säure-Wasserdampfkochen, wie in der U.S. 4,461,648 offenbart, in dem eine Säure, zum Beispiel Schwefelsäure, zu etwa 0 bis etwa 5% zu einem Lignocellulose-haltigen Substrat gegeben wird und die angesäuerte Mischung etwa 5 Sekunden bis etwa 2 Minuten bei einer Temperatur von etwa 180 bis etwa 250°C gekocht wird.
  • Ohne an eine Theorie gebunden sei zu wollen, nimmt man an, dass das Vorbehandlungsverfahren die anschließende enzymatische Hydrolyse von Cellulose durch Erhöhung der Delignifizierung verbessert, welche Mikroporen in der Cellulose schafft, die kristalline Form der Cellulose verändert, die Polymerisation der Cellulose verringert, die Oberfläche der Cellulose erhöht oder Kombinationen davon bewirkt. Da ein großer Teil der Cellulose innerhalb vieler Arten von Cellulose-haltigem Substrat normalerweise für eine enzymatische Umwandlung in Glucose ohne Vorbehandlung nicht zugänglich ist, kann die Wirksamkeit der Vorbehandlungsphase die Effizienz und kommerzielle Anwendung der enzymatischen Umwandlung von Cellulose in Glucose beeinflussen.
  • Mit dem Ausdruck "Cellulose-haltiges Substrat" ist jedes Material gemeint, das Cellulose umfasst, die durch enzymatische Hydrolyse im Glucose umgewandelt werden kann. Das Cellulose-haltige Substrat ist bevorzugt ein vorbehandeltes Lignocellulose-haltiges Substrat, das mindestens etwa 10% Lignin umfasst. Zum Beispiel kann, ohne dass man beschränkt sein will, das Cellulose-haltige Substrat, das für die Vorbehandlung geeignet ist, umfassen:
    • • landwirtschaftliche Rückstände (Lignin-Gehalt etwa 15%), wie, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, Maisstroh, Weizenstroh, Gerstenstroh und Sojabohnenstroh;
    • • Rückstände nach Stärke- oder Zuckerentfernung, zum Beispiel, ohne darauf beschränkt zu sein, Haferschalen, Reisschalen, Zuckerrohr-Bagasse, Zuckerrohr-Zellstoff;
    • • für Ethanol bestimmte Feldfrüchte, wie, ohne darauf beschränkt zu sein, Hirse, Chinaschilf, Spartgras und Roggengras;
    • • Forstwirtschaftsprodukte, zum Beispiel, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, Hartholz (z.B. Pappel; Lignin-Kerngehalt etwa 25%), Weichholz (Lignin-Gehalt etwa 35%), Eukalyptus und Forstwirtschaftsrückstände, Sägemehl; und
    • • andere vorbehandelte Lignocellulose-haltige Substrate, einschließlich Zellstoff- und Papierprodukten, zum Beispiel, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, Solka-Floc,
    oder deren Kombinationen. Vorbehandeltes Hartholz oder landwirtschaftliche Rückstände, einschließlich Cellulose-haltiger Maisstroh-, Haferschalen-, Gerstenstroh- oder Weizenstroh-Substrate, die durch das in der U.S. 4,461,648 beschriebene Verfahren erzeugt werden, sind bevorzugte Lignocellulose-haltige Substrate.
  • Die enzymatische Hydrolyse von Cellulose kann der Vorbehandlung direkt folgen, oder alternativ kann eine Anzahl von Schritten der Vorbehandlung folgen und der enzymatischen Hydrolyse der Cellulose vorangehen. Zum Beispiel kann, ohne dass man jedoch beschränkt zu sein wünscht, vorbehandeltes Cellulose-haltiges Substrat mit Wasser gewaschen werden, um Chemikalien, Verunreinigungen oder deren Kombinationen zu entfernen, welche die enzymatische Umwandlung von Cellulose in Glucose behindern könnten.
  • Mit "CBHI" ist ein Protein gemeint, das eine Cellulose-bindende Domäne, eine Linkerregion und eine CBHI-Kernregion oder Derivate davon umfasst und ein Cellulose-Polymer vom reduzierenden Ende aus verdaut und Cellobiose freisetzt.
  • Ein nicht beschränkendes Beispiel für ein Derivat von CBHI ist phosphorylierte CBHI. Bis heute sind CBHI-Enzyme in Familie 7 und Familie 48 eingeteilt worden und umfassen einen Bereich von Molekulargewichten. Bevorzugt wird die CBHI aus Trichoderma erhalten. Das Trichoderma reesei-CBHI-Protein liegt zu etwa 65 kDa vor, umfasst eine C-terminale Cellulose-bindende Domäne, eine Linkerregion und eine CBHI-Kernregion und verdaut Cellulose vom reduzierenden Ende aus unter Freisetzung von Cellobiose (Shoemaker, 1983). Jedoch versteht es sich, dass CBHI-Protein auch aus anderen Quellen erhalten werden kann (Barr et al., 1996, Biochemistry 35: 586–592; Birch 1998, Current Genetics 33: 70–76; Henrissat 1998, Biochemical society transactions 21(2): 153–156; Henrissat und Bairoch 1996, Biochem. J. 316: 695–696; Liman et al. 1995, Enzyme and Microbial Technology 17: 340–346; Parsiegla et al. 2000, Biochemistry 39: 11238–11246; Schulein 1997, Journal of Biotechnology 57: 71–81; Shen et al., 1995, Biochem. J. 311: 67–74; Teeri et al., 1997, Biochemical society transactions 26(2): 173–178; die alle hierin durch Bezugnahme aufgenommen werden).
  • Mit "CBHI-Kern" ist der Teil von CBHI gemeint, der die katalytische Domäne von CBHI umfasst und der in der Lage ist, ein Cellulose-haltiges Substrat, wie hierin definiert, zu hydrolysieren. Zum Beispiel ist, was nicht auf irgendeine Weise als beschränkend angesehen werden sollte, der Trichoderma-CBHI-Kern etwa 56 kDa groß. Der CBHI-Kern kann durch proteolytische Spaltung des CBHI-Proteins unter Verwendung einer geeigneten Protease, zum Beispiel, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, von Papain (unter Verwendung des Verfahrens von van Tillbeurgh et al. 1986; Offord et al. 1991; die beide hierin durch Bezugnahme aufgenommen werden), erzeugt werden. Auf diese Weise kann auch eine Protease, zum Beispiel, aber nicht darauf beschränkt, Papain, zu einer rohen Enzymmischung gegeben werden, um CBHI-Kern innerhalb der Mischung zu erzeugen. In dieser Ausführungsform können, abhängig von der zugesetzten Protease, andere Kern-Enzyme ebenfalls erzeugt werden. Der CBHI-Kern kann auch unter Verwendung von rekombinanter Technik, zum Beispiel unter Verwendung des in der U.S. 5,874,276 offenbarten Verfahrens, erzeugt werden. Auf diese Weise können CBHI und CBHI-Kern in demselben Wirtsorganismus coexprimiert werden, oder der Wirt kann so genetisch modifiziert werden, dass die native CBHI-Expression verringert oder ausgeschaltet wird und durch die rekombinante CBHI-Kern-Expression ergänzt bzw. ersetzt wird. Es versteht sich, dass der CBHI-Kern auch Fragmente oder Derivate des CBHI-Kerns einschließt, einschließlich Substitutionen, Deletionen, Insertionen innerhalb der CBHI-Kernsequenz, wie es dem Fachmann bekannt wäre, vorausgesetzt, dass diese Fragmente und Derivate CBHI-Kern-Aktivität zeigen, indem sie in der Lage sind, Cellulose zu hydrolysieren. Ein nicht beschränkendes Beispiel für ein CBHI-Kern-Derivat ist ein phosphorylierter CBHI-Kern. Es versteht sich auch, dass der CBHI-Kern aus einem Organismus isoliert werden kann, in dem das CBHI-Protein keine Cellulose-bindende Domäne oder Linkerregion umfasst.
  • Mit dem Ausdruck "CBHI-Kern plus -Linker" ist ein Fragment eines CBHI-Proteins gemeint, das CBHI-Kernprotein und die Linker-Aminosäuresequenz oder ein Fragment davon umfasst, welche das CBHI-Kernprotein mit der CBD des CBHI-Proteins verbindet. Der Linkerabschnitt des CBHI-Kerns plus -Linkers kann jede Länge der Aminosäuresequenz umfassen. Weiter versteht es sich, dass CBHI-Kern plus -Linker auch Fragmente oder Derivate von CBHI-Kern plus -Linker einschließt, welche Substitutionen, Deletionen, Insertionen innerhalb der CBHI-Kern plus -Linkersequenz einschließen, wie es dem Fachmann bekannt wäre, vorausgesetzt, dass diese Fragmente und Derivate von CBHI-Kern plus -Linker CBHI-Kern-Aktivität zeigen. Ein nicht beschränkendes Beispiel für ein CBHI-Kern- plus -Linker-Derivat ist ein phosphorylierter CBHI-Kern plus -Linker. Es versteht sich auch, dass CBHI-Kern plus -Linker aus einem Organismus isoliert sein können, in dem das CBHI-Protein keine Cellulose-bindende Domäne umfasst.
  • Mit dem Ausdruck "CBHI mit inaktiver Cellulose-bindender Domäne" ist ein Protein gemeint, das CBHI-Kern oder CBHI-Kern plus -Linker und eine Cellulose-bindende Domäne (CBD) umfasst, die inaktiviert worden ist. Die Inaktivierung einer CBD kann durch in der Technik bekannte Verfahren durchgeführt werden, zum Beispiel, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, gemäß Linder et al. (Linder et al., 1995, Protein Science, 4: 1056–1064; und Linder et al., 1999, FEBS Letters 447, 13–16, die hierin durch Bezugnahme aufgenommen werden). Eine inaktivierte CBD hat eine verringerte Fähigkeit der CBD zur Folge, Cellulose zu binden, im Vergleich zu der Bindungsaktivität, die mit einer entsprechenden Wildtyp-CBHI verbunden ist und unter identischen Bedingungen bestimmt wird (zum Beispiel, wie in Bindungsstudien von Linder et al., 1999, FEBS Letters 447, 13–16 beschrieben). Weiter versteht es sich, dass CBHI mit inaktiver Cellulose-bindender Domäne auch Fragmente oder Derivate von CBHI einschließt, welche Substitutionen, Deletionen, Insertionen innerhalb der CBHI-, Linker-, CBD-Sequenz oder einer Kombination davon einschließen, wie es dem Fachmann bekannt wäre, vorausgesetzt, dass diese Fragmente und Derivate CBHI-Kern-Aktivität zeigen und eine verringerte Fähigkeit zeigen, Cellulose zu binden. Ein nicht beschränkendes Beispiel für ein CBHI-Derivat mit inaktiver Cellulose-bindender Domäne ist eine phosphorylierte CBHI mit inaktiver Cellulose-bindender Domäne. Es versteht sich auch, dass eine CBHI mit inaktiver Cellulose-bindender Domäne aus einem Organismus isoliert werden kann, in dem das CBHI-Protein eine Cellulose-bindende Domäne umfasst, die CBD jedoch eine schlechte Cellulose-bindende Aktivität zeigt. Eine CBHI, die eine schlechte Cellulose-bindende Aktivität zeigt, zeigt unter Verwendung des gleichen Substrats weniger als etwa 70% der Cellulose-bindenden Aktivität einer CBHI, die aus Trichoderma reesei erhalten wurde. Bevorzugt zeigt CBHI, die eine schlechte Cellulose-bindende Aktivität zeigt, weniger als etwa 50% der Cellulose-bindenden Aktivität von Trichoderma reesei-CBHI. Ein Bereich von CBHI-Enzymen ist in der Technik bekannt und umfasst, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, jene, die in Barr et al. (1996, Biochemistry 35: 586–592), Birch (1998, Current Genetics 33: 70–76), Henrissat (1998, Biochemical society transactions 21(2): 153–156), Henrissat und Bairoch (1996, Biochem. J. 316: 695–696), Liman et al. (1995, Enzyme and Microbial Technology 17: 340–346), Parsiegla et al. (2000, Biochemistry 39: 11238–11246), Schulein (1997, Journal of Biotechnology 57: 71–81), Shen et al., (1995, Biochem. J. 311: 67–74) und Teeri et al. (1997, Biochemical society transactions 26(2): 173–178; die alle hierin durch Bezugnahme aufgenommen werden) offenbart sind.
  • Mit "modifizierter CBHI" ist ein Protein gemeint, das entweder CBHI-Kern, CBHI-Kern plus -Linker, CBHI mit inaktiver Cellulose-bindender Domäne oder eine Kombination derselben umfasst. Ein modifiziertes CBHI-Protein ist dadurch gekennzeichnet, dass es CBHI-Kern-Aktivität zusammen mit einer verringerten oder keiner Cellulose-bindenden Aktivität aufweist.
  • Wie nachstehend in mehr Einzelheiten beschrieben, wurde beobachtet, dass bei mehreren vorbehandelten Lignocellulose-haltigen Substraten die Hydrolysegeschwindigkeit unter Verwendung eines modifizierten CBHI-Proteins, zum Beispiel, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, von CBHI-Kern, gleich der Hydrolysegeschwindigkeit ist, welche unter Verwendung von CBHI beobachtet wird, oder diese in einigen Fällen überschreitet. Dies steht im Gegensatz zu früheren Berichten, in denen CBHI bei reiner Cellulose als viel schneller als CBHI-Kern offenbart ist. Ohne durch eine Theorie gebunden sein zu wollen, ist es möglich, dass die äquivalenten Aktivitäten zwischen CBHI und CBHI-Kern und anderen modifizierten CBHI-Proteinen bei vorbehandelter Lignocellulose auf der Tatsache beruhen können, dass Lignocellulose-haltige Substrate, die vorbehandelt worden sind, eine große Oberfläche aufweisen und dies den Zugang für das modifizierte CBHI-Protein, wie das CBHI-Kernprotein, vergrößert, um das Substrat zu verdauen. Der Fachmann erkennt ohne weiteres, dass die Ergebnisse, die bei CBHI-Kern beobachtet wurden, auch unter Verwendung von modifizierter CBHI, wie hierin definiert, die entweder CBHI-Kern plus -Linker, CBHI mit inaktivierter Cellulose-bindender Domäne oder eine Kombination derselben umfasst, erhalten werden können.
  • Weiter wurde auch beobachtet, dass durch Erhöhen der Konzentration des Cellulose-Substrats modifizierte CBHI, zum Beispiel, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, CBHI-Kern, Cellulose schneller umwandelt (siehe 2A und B). Ohne durch eine Theorie gebunden sein zu wollen, kann eine erhöhte Substrat-Konzentration die Wanderungszeiten des modifizierten CBHI-Proteins innerhalb der Reaktionsmischung verringern, wodurch die Hydrolysegeschwindigkeit des Substrats erhöht wird.
  • Die Vorteile, die mit der Verwendung von modifizierter CBHI, zum Beispiel, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, von CBHI-Kern oder von Mischungen von Enzymen, wie das CBHI-Kernprotein umfassen, gegenüber jener von nur CBHI verbunden sind, umfassen die erhöhte Möglichkeit, die modifizierte CBHI aus der Reaktionsmischung (insbesondere im Vergleich zu CBHI) nach dem Verdau zurückzugewinnen (siehe z.B. Tabelle 3, Beispiel 1 und 3). Weiter gibt es bei einigen Substraten eine höhere oder raschere Umwandlung des Lignocellulose-haltigen Substrats in Glucose, wenn modifizierte CBHI, zum Beispiel, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, CBHI-Kern, verwendet wird, im Vergleich zu CBHI, wodurch Kosten verringert werden, die mit der Wiedereinführung von neuem Enzym in die Hydrolysemischung verbunden sind, und der Enzymverbrauch verringert wird.
  • Abhängig von dem zu hydrolysierenden Cellulose-haltigen Substrat kann es in einigen Fällen wünschenswert sein, Mischungen von modifizierter CBHI-CBHI zu verwenden, zum Beispiel, was nicht auf irgendeine Weise als beschränkend angesehen werden sollte, CBHI-Kern-CBHI-Mischungen, um die Hydrolyse des Substrats zu optimieren (1B und C). Unter diesen Umständen können ebenfalls Kosteneinsparungen aufgrund der Zurückgewinnung des modifizierten CBHI-Proteins und der erhöhten Reaktionsgeschwindigkeiten erzielt werden, da nur ein partieller Verlust an zugesetztem Enzym auftritt und eine erhöhte Aktivität die Verwendung von weniger Enzym oder verringerten Reaktionszeiten ermöglicht.
  • Um die Erfindung durchzuführen, wird die enzymatische Hydrolyse von Cellulose unter Verwendung einer Cellulase-Enzymmischung durchgeführt. Der Fachmann ist sich darüber im Klaren, dass eine effiziente Cellulase-Mischung Enzyme vom CBHI-Typ, CBHII-Typ, EG, β-Glucosidase und andere Enzyme enthält, wie es erforderlich ist, um den vollen Bereich der notwendigen Hydrolysereaktionen zu bewirken. Dem Fachmann ist es auch klar, dass der Ausdruck "vom CBHI-Typ" das Holoenzym umfasst. Die Trichoderma-CBHI weist ein Molekulargewicht von etwa 65 kD auf, was die CBHI-Kern-, -Linker- und Cellulose-bindende Domäne-Regionen umfasst. "Vom CBHI-Typ" schließt auch ein:
    • • CBHI-Kernprotein, zum Beispiel im Fall von Trichoderma mit einem Molekulargewicht von etwa 56 kD,
    • • CBHI-Kernprotein mit angebrachtem Linker ("CBHI-Kern plus -Linker") mit einem Molekulargewicht im Fall von Trichoderma von etwa 60 kD,
    • • phosphorylierte CBHI mit, beispielsweise in Trichoderma, einem Molekulargewicht von etwa 65 kD,
    • • isolierte CBHI-CBD (Cellulose-bindende Domäne),
    sowie verschiedene Formen mit verschiedenen Glycosylierungsgraden und anderen Strukturmerkmalen, die in geringen Mengen vorkommen. Es versteht sich auch, dass Enzym vom CBHI-Typ auch modifizierte CBHI, wie hierin beschrieben, einschließen kann, einschließlich CBHI mit inaktivierter Cellulose-bindender Domäne.
  • Im Kontext mit der vorliegenden Erfindung sind die Enzyme vom CBHI-Typ bevorzugt mindestens 55% modifizierte CBHI, zum Beispiel, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, CBHI-Kernprotein. Der Anteil an modifiziertem CBHI-Protein kann bis zu 100% des gesamten anwesenden Enzyms vom CBHI-Typ ausmachen.
  • Die Bestimmung des Prozentsatzes an modifizierter CBHI, zum Beispiel, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, CBHI-Kern, innerhalb der Enzyme vom CBHI-Typ wird unter Verwendung einer isoelektrischen fokussierenden Kapillar(CIEF)-Elektrophorese durchgeführt. Das Verfahren der CIEF-Elektrophorese ist in Beispiel 4 beschrieben.
  • Die Erfindung wird in einem Hydrolysesystem durchgeführt, in dem der Effizienzindex EI größer als 0,5 ist. Der Effizienzindex EI, der unter Verwendung der Verfahren von Beispiel 1 gemessen wird, ist das Verhältnis der Hydrolysegeschwindigkeit der modifizierten CBHI, zum Beispiel, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, des CBHI-Kerns, zu jener von intakter CBHI, wobei: EI = [Aktivität der modifizierten CBHI]/[Aktivität der CBHI].
  • Die Bestimmung des EI wird bei konstanter Substratkonzentration vorgenommen und wird unter Verwendung einer vergleichbaren Basis an Enzym, zum Beispiel auf einer pro mg Protein-Basis, vorgenommen. Für die Bestimmung des EI, wie hierin offenbart, wurde eine Substratkonzentration von 2% Cellulose und 10 mg Protein verwendet. Die vorliegende Erfindung zieht die Verwendung Lignocellulose-haltiger Substraten in Betracht, die dadurch gekennzeichnet sind, dass sie einen EI von etwa 0,5 bis etwa 4,0 aufweisen. Ein bevorzugter EI beträgt etwa 0,7 bis etwa 2,0, bevorzugter beträgt der EI etwa 0,8 bis etwa 1,5.
  • Wie hierin beschrieben, weist bei vorbehandelten Lignocellulose-haltigen Substraten EI einen Wert in der Nähe von oder sogar über 1 auf. Dies legt nahe, dass modifizierte CBHI, zum Beispiel, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, CBHI-Kern, diese Materialien so rasch wie oder rascher als CBHI hydrolysieren kann. Dieser Befund steht in direktem Gegensatz zu Lehren in der Literatur, in denen die Geschwindigkeit von CBHI viel größer ist als jene von CBHI-Kern (z.B. Kim, 1997; Van Tilbeurgh et al., 1986, Nidetsky et al., 1994).
  • In einem Aspekt einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird modifizierte CBHI, zum Beispiel, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, CBHI-Kernprotein, nach der Hydrolyse zurückgewonnen und wiederverwendet. Die Methoden, die man für die Zurückgewinnung und Wiederverwendung löslicher Proteine verwenden kann, sind in der Technik wohlbekannt und können auf jede modifizierte CBHI, zum Beispiel CBHI-Kern, angewandt werden. Diese Methoden beinhalten die Abtrennung der unlöslichen festen Rückstände von der Hydrolyse-Flüssigkeit und das Zurückschicken der Hydrolyse-Flüssigkeit zu frischem (nicht hydrolysiertem) Substrat. Alternativ kann das Enzym zum Beispiel, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, durch pH-, Salz-, Temperatur-Fällung, Extraktion, zum Beispiel, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, Lösungsmittel-Extraktion, oder Filtration, zum Beispiel, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, Ultrafiltration, aus der Hydrolyse-Flüssigkeit entfernt und zurück zu der Hydrolyse gegeben werden. Im Fall der Enzymentfernung unter Verwendung von Ultrafiltration weist eine bevorzugte Membran ein MG-Rückhaltevermögen von etwa 1000 bis etwa 20000 auf. Bevorzugter beträgt das Rückhaltevermögen etwa 5000 bis etwa 10000.
  • Deshalb stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Umwandlung von Cellulose in Glucose bereit, welches die Behandlung eines vorbehandelten Lignocellulose-haltigen Substrats mit einer Enzymmischung umfasst, die Cellulase-Enzym und eine modifizierte CBHI umfasst, wobei die modifizierte CBHI in der Enzymmischung in einer Menge von 55 bis 100 Gew.-% relativ zum ganzen Enzym vom CBHI-Typ vorliegt. Bevorzugt beträgt die Menge an modifizierter CBHI in der Enzymmischung 70 bis 100 Gew.-%. Bevorzugter beträgt die Menge an modifizierter CBHI in der Enzymmischung 80 bis 100 Gew.-%.
  • Auch eine Cellulase-Zusammensetzung, die modifizierte CBHI und eine oder mehrere von CBHI, CBHII, EG I, EG II und β-Glucosidase umfasst, wird beschrieben, wobei die modifizierte CBHI in der Cellulase-Zusammensetzung in einer Menge von 55 bis 100 Gew.-% vorliegt relativ zum ganzen Enzym vom CBHI-Typ. Die modifizierte CBHI kann zu 70 bis 100 Gew.-% vorliegen und kann zu 80 bis 100 Gew.-% vorliegen. Es wird auch bevorzugt, dass die modifizierte CBHI eine modifizierte Trichoderma-CBHI ist.
  • Ebenfalls beschrieben wird ein Verfahren zur Umwandlung von Cellulose in Glucose, umfassend die Behandlung eines Lignocellulose-haltigen Substrats mit einer Enzymmischung, welche CBHI umfasst, oder einer Mischung, die Cellulase und modifizierte CBHI, zum Beispiel, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, CBHI-Kernprotein, umfasst. Wenn eine Mischung von CBHI und CBHI-Kern verwendet wird, beträgt die Menge an CBHI oder CBHI-Kern in der Enzym-Reaktionsmischung 10 bis 100 Gew.-% der CBHI und des CBHI-Kernproteins (wobei CBHI + CBHI-Kern bis zu 100 Gew.-% der Enzyme vom CBHI-Typ umfassen; siehe die 1B und 1C). Die Menge an CBHI oder CBHI-Kern kann 20 bis 80 Gew.-% der CBHI und des CBHI-Kernproteins innerhalb der Reaktionsmischung betragen. Zum Beispiel kann, was auf keine Weise als beschränkend angesehen werden sollte, eine geeignete Reaktionsmischung zwischen etwa 20 Gew.-% CBHI und 80 Gew.-% CBHI (der CBHI und des CBHI-Kernsproteins) umfassen.
  • Ebenfalls beschrieben wird ein Verfahren zur Umwandlung von Cellulose in Glucose, welches umfasst, dass man ein Cellulose-haltiges Substrat mit einer Enzymmischung behandelt, die CBHI und modifizierte CBHI, zum Beispiel CBHI-Kern, als einzige Enzyme vom CBHI-Typ und ein oder mehrere andere Cellulase-Enzyme, einschließlich CBHII, EG I, EG II und β-Glucosidase, umfasst, wobei das Gewichtsverhältnis von CBHI oder CBHI-Kern als Beispiel für eine modifizierte CBHI in der Enzymmischung im Bereich von etwa 10 bis etwa 100 Gew.-% des CBHI-Typs liegt. Die Menge von CBHI oder CBHI-Kern kann 20 bis 80 Gew.-% des CBHI-Typs betragen. In diesem Verfahren kann der CBHI-Kern zu einer Cellulase-Mischung (die eine oder mehrere von CBHI, CBHII, EG I, EG II und β-Glucosidase umfasst) gegeben werden, welche zum Beispiel, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, von einem filamentösen Pilz produziert wird. Bevorzugt ist der filamentöse Pilz Trichoderma. Ähnlich kann CBHI-Kern durch einen Wirt exprimiert werden, der eine Cellulase-Enzymmischung (die CBHI, CBHII, EG I, EG II und β-Glucosidase umfasst) exprimieren kann.
  • Ebenfalls beschrieben wird eine Cellulase-Zusammensetzung, die ein Enzym vom CBHI-Typ, das zum Beispiel aus Trichoderma erhalten wurde, und eine oder mehrere von CBHII, EG I, EG II und β-Glucosidase umfasst, wobei CBHI-Kern in der Cellulase-Zusammensetzung in einer Menge relativ zum ganzen Enzym vom CBHI-Typ zu 15 bis 100 Gew.-% vorliegt. Der CBHI-Kern kann 50 bis 100 Gew.-% ausmachen und kann 80 bis 100 Gew.-% ausmachen.
  • Ebenfalls hierin beschrieben wird eine Cellulase-Zusammensetzung, die modifizierte CBHI und ein oder mehrere Nicht-CBHI-Enzyme, zum Beispiel, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, CBHII, EG I, EG II und β-Glucosidase, umfasst, wobei die modifizierte CBHI in der Cellulase-Zusammensetzung zu 50 bis 90 Gew.-%, relativ zu anderen Cellulase-Enzymen, wie sie dem Fachmann bekannt wären, vorliegt. Andere Cellulase-Enzyme können native Enzyme zusätzlich zu den oben angeführten Enzymen, zum Beispiel, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, EG III, oder Derivate von nativen Cellulase-Enzymen einschließen, die eine Cellulase-Aktivität zeigen, einschließlich, aber nicht beschränkt auf CBHII, EG I, EG II, EG III oder β-Glucosidase. Die modifizierte CBHI kann modifizierte Trichoderma-CBHI sein.
  • Gemäß einem in Betracht gezogenen Aspekt einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Umwandlung von Cellulose in Glucose unter Verwendung einer Enzymmischung bereitgestellt, welche CBHI und eine modifizierte CBHI, zum Beispiel CBHI-Kern plus -Linker, und ein oder mehrere andere Cellulase-Enzyme, einschließlich CBHII, EG I, EG II und β-Glucosidase umfasst, wobei das Gewichtsverhältnis von CBHI-Kern plus -Linker in der Enzymmischung 50 bis 100 Gew.-% der Enzyme vom CBHI-Typ beträgt. Bevorzugt beträgt die Menge an CBHI-Kern plus -Linker 70 bis 100 Gew.-% der Enzyme vom CBHI-Typ. Bevorzugter beträgt die Menge an CBHI-Kern plus -Linker 80 bis 100 Gew.-% des Gewichts an Enzymen vom CBHI-Typ.
  • Wenn die modifizierte CBHI CBHI mit inaktivierter Cellulose-bindender Domäne einschließt, umfassen die Enzymmischungen, die CBHI mit inaktivierter Cellulose-bindender Domäne und eine oder mehrere andere Cellulase-Enzyme, einschließlich CBHII, EG I, EG II und β-Glucosidase, umfassen, ein Gewichtsverhältnis von CBHI mit inaktiver Cellulose-bindender Domäne von 70% bis 100% der Enzyme vom CBHI-Typ in der Enzymmischung. Bevorzugt beträgt die Menge an CBHI mit inaktiver Bindungsdomäne 80% bis 100% der Enzyme vom CBHI-Typ.
  • Gemäß einem weiteren in Betracht gezogenen Aspekt einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Umwandlung von Cellulose in Glucose unter Verwendung einer Enzymmischung bereitgestellt, die CBHI mit einer inaktiven Cellulose-bindenden Domäne umfasst. Die Inaktivierung der CBHI-CBD kann unter Verwendung jedes geeigneten Verfahrens bewerkstelligt werden, das in der Technik bekannt ist, zum Beispiel, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, des Verfahrens von Linder et al., (1995, oben zitiert; das hierin durch Bezugnahme aufgenommen wird) oder Linder et al. (1999, oben zitiert; das hierin durch Bezugnahme aufgenommen wird). Diese Literaturstellen beschreiben Änderungen bei einzelnen Aminosäuren innerhalb der CBD von CBHI, die einen partiellen oder vollständigen Verlust der Fähigkeit der CBD, Cellulose zu binden, zur Folge haben. Andere Verfahren zur Inaktivierung der CBD können die Deletion eines Teils der CBD oder die Insertion einer Peptidsequenz in das CBD einschließen, um die CBD-Bindungsaktivität zu zerstören.
  • Der Fachmann ist sich darüber im Klaren, dass die Cellulose-Hydrolyse unter einer Vielfalt von Bedingungen stattfinden kann. Bevorzugt wird die Cellulose-Hydrolyse durch Cellulase-Enzyme in einer Aufschlämmung von Wasser und Cellulase durchgeführt, welche etwa 0,5% bis etwa 15% Cellulose bei einem pH von etwa 4 bis etwa 5 und bei einer Temperatur von etwa 50°C umfasst. Diese Bedingungen sind für die meisten Cellulase-Enzyme geeignet. Jedoch zieht die vorliegende Erfindung die Hydrolyse von Cellulose auch unter anderen Bedingungen in Betracht, die für eine spezielle Cellulase/CBHI-Kern-, CBHI-CBHI-Kern- oder andere Mischungen geeignet sind, die modifizierte CBHI, wie hierin definiert, umfassen. Derartige Bedingungen können vom Fachmann leicht festgelegt werden.
  • Jede Quelle von Cellulase-Enzym-System kann gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Bevorzugt stammen die Cellulase-Enzyme von Trichoderma longibrachiatum und Trichoderma reesei oder einer Kombination derselben ab. Weiter werden die CBHI und das modifizierte CBHI-, zum Beispiel, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, CBHI-Kern-, Protein ebenfalls bevorzugt aus T. longibrachiatum und T. reesei oder einer Kombination derselben erhalten.
  • Die rohen Trichoderma-Cellulase-Enzyme, die als Basis im Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet werden, können direkt durch Kultur des geeigneten Mikroorganismus erhalten werden, oder die Enzyme können im Handel erworben werden (z.B. von Iogen Corporation). CBHI-Kern kann durch Exprimieren der geeigneten genetischen Sequenz in einer geeigneten Wirtszelle erhalten werden, wie es üblicherweise in der Technik bevorzugt wird und in der US 5,874,276 (die hierin durch Bezugnahme aufgenommen wird) beschrieben ist, oder CBHI-Kern kann durch enzymatische Spaltung von CBHI hergestellt werden, wie oben beschrieben. Ähnlich kann CBHI-Kern plus -Linker durch Exprimieren einer Nucleotidsequenz, welche die CBHI-Kern und -Linkerregion umfasst, oder über proteolytische Spaltung des Holoenzyms erhalten werden. CBHI mit inaktiver Cellulose-bindender Domäne kann, wie oben beschrieben, durch Exprimieren der geeigneten Gensequenz, die eine inaktive CBD entweder durch Substitution, Deletion oder Insertion kodiert, oder wie es dem Fachmann bekannt wäre, erhalten werden.
  • Der erfahrene Fachmann erkennt, dass die Menge an Cellulase-Enzym, die bei der Hydrolyse von Cellulose zu Glucose zu verwenden ist, durch die Natur des Cellulose-haltigen Substrats, das Vorbehandlungsverfahren, die Kosten des Enzyms, die gewünschte Hydrolysezeit und die gewünschte Glucose-Ausbeute aus dem Cellulose-haltigen Substrat bestimmt wird. Ein typischer Enzym-Dosisbereich beträgt etwa 1 bis etwa 50 Filterpapier-Einheiten (FPE) Cellulase pro Gramm Cellulose über eine Zeitspanne von etwa 3 bis etwa 200 Stunden. In einer bevorzugten Ausführungsform beträgt die Cellulase-Enzymdosis etwa 1 bis etwa 10 FPE pro Gramm Cellulose.
  • Der erfahrene Fachmann ist sich darüber im Klaren, dass die Cellulosekonzentration so gewählt wird, dass die Fähigkeit der Pumpen berücksichtigt wird, die Feststoffe zu handhaben und zu mischen. Abhängig vom Material wird eine Cellulosekonzentration von etwa 1% bis etwa 25% verwendet. Jedoch wurde, wie hierin beschrieben, beobachtet, dass höhere Cellulosekonzentrationen die Hydrolyse unter Verwendung von modifizierter CBHI, zum Beispiel, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, CBHI-Kern, begünstigen (siehe Beispiele 3). Eine bevorzugte Cellulosekonzentration innerhalb der Reaktionsmischung beträgt etwa 10% bis etwa 16%. Eine bevorzugtere Cellulosekonzentration beträgt etwa 12% bis etwa 16%.
  • 1 zeigt die prozentuale Umwandlung von Cellulose in Glucose bei einem vorbehandelten Lignocellulose-haltigen Substrat, in diesem Fall vorbehandeltem gewaschenem Maisstroh, unter Verwendung verschiedener Mengen an CBHI- oder CBHI-Kernprotein. Die prozentuale Umwandlung des vorbehandelten Lignocellulose-haltigen Substrats nach jeweils dreistündiger Reaktion mit CBHI- Kernprotein ist bei Enzymkonzentrationen zwischen etwa 1 und etwa 10 mg Enzym pro Gramm Cellulose größer als mit dem CBHI-Enzym. Ähnliche Ergebnisse sind auch bei anderen vorbehandelten Lignocellulose-haltigen Substraten beobachtet worden, einschließlich, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, Haferschalen, Maisstroh und Weizenstroh (die Ergebnisse sind in 3 zusammengefasst).
  • Die Auswirkung der Erhöhung der Konzentration des Cellulose-haltigen Substrats in der Reaktionsmischung wurde ebenfalls überprüft, und eine Stichprobe der Ergebnisse unter Verwendung von SIGMACELLTM oder vorbehandeltem Hartholz ist in den 2A, B und C dargestellt. Allgemein wurde eine erhöhte Umwandlung von Cellulose in Glucose durch CBHI-Kern mit zunehmender Konzentration des Cellulose-haltigen Substrats beobachtet. Wie in 2C gezeigt, übertrifft die Aktivität von CBHI typisch jene von CBHI-Kern (Verhältnis CBHI-Kern:CBHI < 1) bei niedrigen Substratkonzentrationen, jedoch übertrifft bei höheren Substratkonzentrationen die CBHI-Kern-Aktivität jene von CBHI. Diese Daten legen auch nahe, dass eine erhöhte CBHI-Kern-Aktivität (relativ zur CBHI-Aktivität) bei verschiedenen Substratkonzentrationen abhängig vom verwendeten Substrat beobachtet wird. Jedoch hatte bei allen getesteten Substraten eine Erhöhung der Substratkonzentration eine Erhöhung der Substratumwandlung unter Verwendung von CBHI-Kern zur Folge. Im Fall von SIGMACELLTM übertrifft die CBHI-Kern-Aktivität die Holoenzym-Aktivität bei etwa 6 bis etwa 7 Gew.-% Substratkonzentration, während bei vorbehandeltem Hartholz dieser Schwellenwert bei etwa 3 Gew.-% Cellulose erreicht wird. Jedoch versteht es sich, dass, obwohl die Kern-Aktivität die Holoenzym-Aktivität bei einer gewissen Substratkonzentration abhängig vom Substrat übertrifft, das Kern-Protein immer noch in verdünnteren Cellulose-Lösungen bei einem vorbehandelten Lignocellulose-haltigen Substrat aktiv ist. Deshalb kann CBHI-Kern immer noch wirksam bei niedrigeren Substratkonzentrationen verwendet werden, falls gewünscht. Die Überlegung hinsichtlich der zu verwendenden Menge an CBHI-Kern und Substrat hängt von mehreren Variablen der Reaktionsmischung ab, einschließlich der Reaktionszeit, Reaktionstemperatur, des zu hydrolysierenden Cellulose-haltigen Substrats usw., wie es dem Fachmann bekannt wäre.
  • Die Analyse der Adsorption von entweder CBHI oder CBHI-Kern an verschiedenen Cellulose-haltigen Substraten (siehe Tabelle 3, Beispiel 1) zeigt an, dass bei den meisten Substraten CBHI-Kern wirksam zurückgewonnen werden kann, während CBHI leichter durch das Substrat zurückgehalten wird. Die Menge an CBHI-Kern, die aus einer Reaktionsmischung zurückgewinnbar ist, kann als "Rückgewinnungsindex" oder "RI" ausgedrückt werden, worin RI ein Maß des Proteins, in diesem Fall CBHI + CBHI-Kern, in Lösung als Funktion des Gesamt-Proteins, d.h. CBHI + CBHI-Kern, das ursprünglich zugesetzt wurde, ist: RI = [Menge an Protein in Lösung]/[anfänglich zugesetztes Gesamt-Protein] × 100
  • Die Bestimmung von RI wird bei einer konstanten Substratkonzentration, zum Beispiel, wie hierin beschrieben, bei 2% Cellulose, vorgenommen. Unter Verwendung von vorbehandeltem Hartholz (z.B. Pappel) als Lignocellulose-haltigem Substrat wird bei einer 2%-igen Cellulosekonzentration ein RI von 96 in Reaktionsmischungen beobachtet, die 100% CBHI-Kern umfassen. Dies zeigt an, dass etwa 96% des zugesetzten Enzyms aus der Reaktionsmischung zurückgewinnbar sind. In Mischungen, die 50% CBHI-Kern und 50% CBHI umfassen, beträgt der RI etwa 60, während in Mischungen, die 100% CBHI umfassen, der RI etwa 24 beträgt. Diese Daten stehen im Einklang mit früheren Berichten, dass CBHI Cellulose vorzugsweise bindet und nicht leicht vom Substrat entfernt wird.
  • Die in den 1 bis 4 dargestellten Ergebnisse demonstrieren, dass eine Vielfalt von vorbehandelten Cellulose-haltigen Substraten, bevorzugt Lignocellulose-haltigen Substraten, für eine Hydrolyse unter Verwendung von CBHI-Kernprotein gut geeignet sind. In mehreren Fällen und unter gewissen Bedingungen ist die absolute Hydrolysegeschwindigkeit unter Verwendung von CBHI-Kern im Vergleich zu CBHI größer, obwohl die Menge an CBHI-Kern, die zu einem gegebenen Zeitpunkt an das Substrat gebunden ist, gering ist, häufig weniger als etwa 10% (siehe 3, worin RI > 90).
  • Deshalb ist diese Erfindung auf die Hydrolyse von Cellulose-haltigen Substraten unter Verwendung einer modifizierten CBHI, zum Beispiel, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, eines CBHI-Kernproteins, gerichtet, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass es eine geringe Tendenz aufweist, an Cellulose-haltige Substrate zu binden, aber immer noch eine hohe Aktivität zeigt.
  • Auch beschrieben wird ein Verfahren zur Hydrolyse eines Cellulose-haltigen Substrats, welches die Zugabe einer ausreichenden Menge an modifizierter CBHI, zum Beispiel, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, an CBHI-Kern, zu einer Cellulase-Enzymmischung und das Stattfindenlassen der Reaktion über eine ausreichende Zeitspanne, um Cellulose zu Glucose zu hydrolysieren, umfasst.
  • Auch beschrieben wird ein Verfahren zur Hydrolyse eines Cellulose-haltigen Substrats unter Verwendung von Mischungen von CBHI und CBHI-Kernproteinen über einen Bereich von Mischungen von etwa 20 Gew.-% CBHI-Kern und etwa 80 Gew.-% CBHI bis zu etwa 100 Gew.-% CBHI-Kern.
  • Mit Bezug auf 1A ist die prozentuale Umwandlung von Cellulose aus gewaschenem Maisstroh in Glucose nach dreistündiger Inkubation mit CBHI oder CBHI-Kernprotein gezeigt. Es gibt eine Zunahme der Umwandlung von Cellulose in Glucose mit einer zunehmenden CBHI- und CBHI-Kern-Dosis. Bei allen Dosen erreicht CBHI-Kern eine höhere Umwandlung als CBHI.
  • Mit Bezug auf die 1B und C ist die prozentuale Umwandlung von Cellulose aus vorbehandelten Haferschalen bzw. Hartholz in Glucose nach dreistündiger Inkubation in Anwesenheit von verschiedenen Kombinationen von CBHI-CBHI-Kernprotein gezeigt. Die größte Umwandlung von Cellulose in Glucose wird bei einer Mischung von CBHI und CBHI-Kernprotein beobachtet, welche etwa 20 Gew.-% CBHI und etwa 80 Gew.-% CBHI-Kernprotein bis etwa 80 Gew.-% CBHI und etwa 20 Gew.-% CBHI-Kern umfasst.
  • Die Ergebnisse der Hydrolyse von Cellulose unter Verwendung von modifizierter CBHI, zum Beispiel, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, CBHI-Kern oder oben beschriebene CBHI- und CBHI-Kernprotein-Mischungen, wurden, falls nicht anders angegeben, in Assays bestimmt, die 2% Cellulose als Substrat enthielten.
  • Die Ergebnisse, welche die Wirksamkeit der Verwendung von CBHI-Kern demonstrieren, sind auch unter Verwendung von Cellulosekonzentrationen von bis zu 8 Gew.-% bei Landwirtschafts-Rückständen oder von bis zu 12% bei vorbehandeltem Hartholz erhalten worden (siehe die 2A, B und C). So zieht die vorliegende Erfindung die Verwendung von modifizierter CBHI allein, zum Beispiel, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, von CBHI-Kern, oder von Mischungen von CBHI und modifiziertem CBHI-Protein, zum Beispiel, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, CBHI-Kern, in Betracht, um Cellulose in Glucose in Mischungen zu überführen, in denen die anfängliche Cellulose-Mischung etwa 0,5 Gew.-% bis etwa 15 Gew.-% Cellulose umfassen kann. Bevorzugt beträgt die Cellulose-Konzentration etwa 1 Gew.-% bis etwa 12 Gew.-%. Bevorzugter liegt das entsprechende Lignocellulose-haltige Substrat, das etwa 50% Cellulose enthält, in der Enzymmischung bei einer Konzentration von etwa 2 Gew.-% bis etwa 25 Gew.-% vor.
  • Mit Bezug auf 3 ist eine Zusammenfassung der Aktivitäten von CBHI und modifizierter CBHI, in diesem Beispiel CBHI-Kern, bei verschiedenen Lignocellulose-haltigen Substraten und die Zurückgewinnbarkeit dieser Proteine aus diesen Substraten gezeigt. 3 vergleicht RI- und EI-Werte für einen Bereich von verschiedenen Substraten. Drei Klassen von Substraten können aus den in 3 wiedergegebenen Daten identifiziert werden:
    • 1) eine Substrat-Klasse, die dadurch gekennzeichnet ist, dass sie einen niedrigen RI und einen niedrigen EI aufweist (angeordnet im linken unteren Teil der Graphik; "Substrat-Klasse eins"). Ein Beispiel für ein derartiges Substrat ist SigmacellTM mit einem RI von etwa 36 und einem EI von etwa 0,1, was demonstriert, dass die Geschwindigkeit von CBHI viel größer ist als jene von CBHI-Kern und dass die Zurückgewinnbarkeit von CBHI-Kern gering ist;
    • 2) eine Substrat-Klasse, die dadurch gekennzeichnet ist, dass sie einen mittleren RI von etwa 45 bis 75 und einen EI von mehr als 0,75 aufweist (Klasse, die im mittleren Bereich der Graphik angeordnet ist; "Substratklasse zwei"). Beispiele für diese Substrate umfassen Weizenstroh mit einem RI von etwa 64 und einen EI von etwa 1,1, was demonstriert, dass die Geschwindigkeit von CBHI-Kern etwa äquivalent zu jener von CBHI ist und dass die Zurückgewinnbarkeit von CBHI-Kern größer als etwa 50% ist; und
    • 3) eine dritte Substrat-Klasse, die dadurch gekennzeichnet ist, dass sie einen RI von mehr als 75 und einen EI von mehr als 1 aufweist ("Substratklasse drei"). Beispiele für diese Substratklasse umfassen Haferschalen (ein RI von etwa 98 und ein EI von etwa 0,75), Maisstroh (ein RI von etwa 98 und ein EI von etwa 1,1), H60 (ein RI von etwa 96 und ein EI von 1,1) und Solka-Floc (ein RI von etwa 97 und ein EI von etwa 3,3).
  • Mit Bezugnahme auf 4 sind Ergebnisse gezeigt, die aus der Hydrolyse von vorbehandelten Haferschalen durch Cellulase-Mischungen erhalten wurden, welche CBHI oder modifizierte CBHI, zum Beispiel, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, CBHI-Kern, umfassten. Die Cellulase-Mischung, die modifizierte CBHI umfasst, zeigt ähnliche Ergebnisse wie Mischungen, die CBHI umfassen, was nahelegt, dass modifizierte CBHI bei der Hydrolyse von Cellulase-Mischungen wirksam ist. Weiter kann modifizierte CBHI, zum Beispiel, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, CBHI-Kern, leichter als CBHI zurückgewonnen werden, und diese Eigenschaft kann bei der Cellulose-Hydrolyse vorteilhaft sein.
  • Deshalb wird auch ein Verfahren zur Hydrolyse eines Lignocellulose-haltigen Substrats unter Verwendung von modifizierter CBHI, zum Beispiel, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, CBHI-Kern oder Mischungen von modifizierter CBHI-CBHI beschrieben, worin das Substrat dadurch gekennzeichnet ist, dass es ein Klasse-Zwei- oder -Drei-Substrat ist. Weiter ist dieses Verfahren auf ein Verfahren zur Lignocellulose-Hydrolyse gerichtet, bei dem das Substrat dadurch gekennzeichnet ist, dass es einen EI von mindestens etwa 0,75 und einen RI von etwa 45 bis etwa 100 aufweist. Das Substrat kann dadurch gekennzeichnet sein, dass es einen EI von mehr als etwa 1,0 und einen RI von mehr als etwa 60 aufweist. Alternativ kann der EI etwa 1,0 bis 4,0 betragen und kann der RI etwa 60 bis etwa 100 betragen.
  • Es wird auch ein Verfahren zur Hydrolyse eines Lignocellulose-haltigen Substrats beschrieben, in dem das Substrat dadurch gekennzeichnet ist, dass es einen RI von etwa 45 bis etwa 98 aufweist. Der RI kann etwa 60 bis etwa 98 betragen. Alternativ kann der RI etwa 80 bis etwa 98 betragen.
  • Die vorliegende Erfindung umfasst auch ein Verfahren zur Hydrolyse eines Lignocellulose-haltigen Substrats, in dem das Substrat dadurch gekennzeichnet ist, dass es einen EI von etwa 0,75 bis etwa 4,0 aufweist. Bevorzugt beträgt der EI etwa 0,9 bis etwa 4,0. Bevorzugter beträgt der EI etwa 1 bis etwa 3,6.
  • Die obigen Beschreibung soll die beanspruchte Erfindung auf keinerlei Weise beschränken. Weiter könnte die erörterte Kombination von Merkmalen für die erfindungsgemäße Lösung nicht absolut erforderlich sein.
  • Die vorliegende Erfindung wird weiter in den folgenden Beispielen erläutert. Jedoch versteht es sich, dass diese Beispiele lediglich erläuternden Zwecken dienen und nicht verwendet werden sollten, um den Bereich der vorliegenden Erfindung auf irgendeine Weise zu beschränken.
  • Beispiel 1. Hydrolyse von Cellulose-haltigen Materialien durch CBHI und CBHI-Kern und Bestimmung von EI
  • Die verwendeten Substrate sind in Tabelle 1 aufgeführt, und Enzyme wurden wie folgt hergestellt. Tabelle 1: Cellulose-Substrate
    Figure 00320001
    • * wie gemäß US 4,461,648 ; das Vorbehandlungsverfahren beinhaltete die Zugabe von Schwefelsäure zu etwa 0 bis etwa 5% zu einem Lignocellulose-haltigen Substrat, und die angesäuerte Mischung wurde etwa 5 Sekunden bis etwa 2 Minuten bei einer Temperatur von etwa 180 bis etwa 250°C gekocht.
  • Gereinigte CBHI wurde aus einer rohen Trichoderma-Cellulase-Brühe erhalten, indem man zuerst die Brühe durch Glasmikrofaser-Filterpapier filtrierte. Die Cellulase-Flüssigkeit wurde dann unter Verwendung einer 10000 MG-Rückhalte-Membran dialysiert, um ihre Leitfähigkeit auf 12000 μS zu erniedrigen. Die CBHI wurde angereichert, indem man 190 mg Protein/ml Harz auf DEAE-Sepharose-Ionenaustauscherharz bei pH 6 lud. Die anderen Komponenten wurden vor CBHI aus dem Harz desorbiert, indem man 50 mM Phosphat-, 25 mM NaCl-Puffer mit einer Leitfähigkeit von 9000 μS durch die Säule laufen ließ. Das CBHI wurde desorbiert, indem man 50 mM Phosphat-, 300 mM NaCl-Puffer mit einer Leitfähigkeit von 30000 μS durch die Säule laufen ließ. Die CBHI wurde dann durch Ultrafiltration konzentriert, und ihre Reinheit wurde durch eine LKB Bromma-Isoelektrofokussierungs-Elektrophoreseeinheit beurteilt.
  • CBHI-Kernprotein wurde durch einen 2-tägigen Quest-Papain-Verdau der reinen Komponente bei einer Dosis von 0,05 g Papain/g Protein aus CBHI erhalten. Der Verdauungs-pH und die Temperatur waren 4,5 bzw. 37°C. Der Verdau wurde dann durch Glasmikrofaser-Filterpapier filtriert. Die Reinheit der CBHI wird dann durch eine LKB Bromma-Isoelektrofokussierungs-Elektrophoreseeinheit bestimmt.
  • Die Hydrolysemischungen wogen insgesamt 10 Gramm. Die Menge an zugesetztem Substrat war derart, dass 0,2 Gramm Cellulose vorlagen. Zusätzlich wurde Neodox 23-6-Tensid (4 mg/Gramm Cellulose) zusammen mit 80 IE Novozyme 188 beta-Glucosidase zugesetzt, welche eine Vorratslösungsaktivität von 1444 Einheiten pro Milliliter aufwies. Das Tensid und die beta-Glucosidase steuern das Schäumen bzw. die Cellobiose-Bildung. Die Mischung wurde mit 50 mM Natriumcitrat-Puffer, pH 4,8, auf insgesamt 10 Gramm (ausschließlich CBHI oder CBHI-Kern) gebracht. Die CBHI- oder CBHI-Kern-Dosis betrug 10 mg Protein pro Gramm Cellulose.
  • Die Mischungen wurden unter Schütteln bei 250 U/min drei Stunden bei 50°C inkubiert. Zu diesem Zeitpunkt wurde eine Probe der Mischung entnommen und durch Glasmikrofaser-Filterpapier filtriert. Die Glucosekonzentration in der Probe wurde mittels eines YSI Glucose Analyzer von Yellow Springs Instruments, Yellow Springs, Ohio, gemessen. Die Glucosekonzentration wird als prozentuale Umwandlung der Cellulose in dem Substrat ausgedrückt. Die Ergebnisse der Inkubation der Substrate von Tabelle 1 mit den oben erhaltenen Enzymen sind in Tabelle 2 aufgeführt. Tabelle 2: Umwandlung von Cellulose-Substraten unter Verwendung von CBHI oder CBHI-Kernprotein.
    Figure 00330001
    • * abgeschätzt aus mitgeteilten Aktivitätsraten von CBHI und CBHI-Kern.
  • Der Wirksamkeitsindex EI ist das Verhältnis der Umwandlung durch CBHI-Kern zu CBHI unter den in diesem Beispiel verwendeten Bedingungen. Bei EI = 0 ist der CBHI-Kern vollständig unfähig, das Substrat zu hydrolysieren. Bei einem EI zwischen null und eins ist die Geschwindigkeit von CBHI-Kern niedriger als die Geschwindigkeit von CBHI. Bei EI = 1 ist die Geschwindigkeit von CBHI-Kern die gleiche wie die von CBHI. Bei EI > 1 ist CBHI-Kern schneller als CBHI.
  • Bei SigmaCell beträgt der EI 0,42 (siehe 3). Dies steht im Einklang mit den Ergebnissen von Van Tilbeurgh et al. (1986), Kim et al., (1997) und Nidetsky et al. (1994), die alle viel langsamere Hydrolysegeschwindigkeiten durch CBHI-Kern als durch CBHI mitteilten, welche den niedrigen Verhältnissen von CBHI-Kern-Aktivität:CBHI-Aktivität entsprechen. Dies ist einer niedrigen EI ähnlich, obwohl die Verfahren nicht die gleichen sind wie jene, die für die EI-Bestimmung verwendet werden.
  • Überraschend liegt bei den anderen Substraten der EI zwischen 0,8 und 1,09, außer bei Solka-Floc, das mit einem EI von mehr als 3 hydrolysiert wurde (3).
  • Die Proteinmenge in Lösung wurde bei mehreren der Substrate nach dreistündiger Hydrolyse gemessen. Diese Messung wurde mittels eines Biorad-Proteinassays unter Verwendung von Iogen-Cellulase (90 g/l) als Standard vorgenommen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 gezeigt.
  • Tabelle 3: Zurückgewinnung von Protein aus Lösung nach Hydrolyse
    Figure 00340001
  • Die Menge an CBHI-Kern in Lösung ist sehr hoch, gut über 90% des Gesamt-Proteins. Die Menge an CBHI in Lösung ist viel geringer. Deshalb bietet CBHI-Kern die Möglichkeit, bei einer Hydrolysegeschwindigkeit, die praktisch so groß wie die von CBHI ist, zurückgewonnen und wiederverwendet zu werden.
  • Beispiel 2: Hydrolyse von vorbehandelter Pappel mittels Mischungen von CBHI und CBHI-Kern
  • Die Verfahren von Beispiel 1 wurden wiederholt, außer dass CBHI- und CBHI-Kern in Mischungen verwendet wurden. Die Mischungen von CBHI/CBHI-Kern waren 0/100, 20/80, 40/60, 60/40, 80/20 und 100/0 als Prozent vom Gesamt-Protein. Das Gesamt-Protein betrug 10 mg pro Gramm Cellulose.
  • Die Ergebnisse für vorbehandelte Haferschalen als Substrat sind in 1B und die für vorbehandeltes Hartholz (Pappel) sind in 1C dargestellt. Überraschend ist die Leistung der Mischungen von CBHI/CBHI-Kern von 20/80, 40/60, 60/40 und 80/20 besser als die von CBHI allein (100/0). Dies legt nahe, dass eine Synergie zwischen CBHI und CBHI-Kern vorliegt. Die optimale Mischung, etwa 50/50, ist 20% wirksamer als CBHI selbst.
  • Beispiel 3: Hydrolyse bei verschiedenen Cellulosekonzentrationen
  • Die Verfahren von Beispiel 1 wurden wiederholt, außer dass die Cellulosekonzentration 0,5%, 2,0%, 5,0% und 10,0% betrug.
  • Die Ergebnisse sind in 2 gezeigt. Wenn die Cellulosekonzentration erhöht wird, erhöhen sich die EI-Werte bei SigmaCell (2A) und Pappel (2B). Eine hohe Cellulosekonzentration begünstigt CBHI-Kern bei der Hydrolyse (2C).
  • Beispiel 4: Verfahren zur Bestimmung von modifizierten CBHI-Proteinen als Prozentsatz des gesamten Enzyms vom CBHI-Typ
  • Ein Beckman MDQ-PAGE-Kapillarelektrophoreseinstrument im isoelektrischen Kapillarfokussierungsmodus (CIEF) wurde verwendet, um die Menge an CBHI-Kern, CBHI-Kern plus -Linker, phosphorylierter CBHI und Holoenzym in einer Probe von CBHI zu bestimmen, die aus Trichoderma erhalten wurde. CIEF ist ein Zweischritt-Verfahren, welches 1) die Fokussierung und 2) die Mobilisierung beinhaltet. Eine 10 μl-Probe mit 10% Protein wird mit 200 μl neutralem Ampholyt gemischt und in eine Kapillare injiziert. Unter dem Einfluss eines elektrischen Felds wird durch die Ampholyten ein pH-Gradient (von pH 3–10) geschaffen. Die Proteine wandern in die Richtung, die entgegengesetzt zu ihrer Ladung ist, bis sie einen neutralen Zustand erreichen, wo sie fokussiert werden. Dem folgt eine Niederdruck-Mobilisierung (bei 0,8 psi) der Proteine, wo sie mittels eines UV-Detektors bei 280 nm gescannt werden. Ein Elektropherogramm wird erzeugt, das Peaks zeigt, welche den Extinktionsablesungen bei speziellen Migrationszeiten entsprechen. Unter Verwendung von Protein-Standards können verschiedene Peaks gemäß bekannten pI-Werten identifiziert werden.
  • Unter diesen Bedingungen zeigt Trichoderma-CBHI eine typische Wanderungszeit von etwa 22,1 Minuten, Trichoderma-CBHI-Kern plus -Linker eine Wanderungszeit von etwa 22,5 Minuten, Trichoderma-CBHI-Kern eine Wanderungszeit von etwa 24,7 Minuten und phosphorylierte Trichoderma-CBHI von etwa 23 Minuten. Diese Wanderungszeiten können um etwa ±2 Minuten variieren und werden routinemäßig unter Verwendung von Standards überprüft. Die Konzentration der Proteine wird aus der Fläche der Peaks bestimmt, welche den Proteinen entsprechen, zum Beispiel wie in Tabelle 4 angezeigt.
  • Tabelle 4 – Zusammensetzung von Trichoderma CBHI-Komponenten in Cellulase-Enzymen des Standes der Technik
    Figure 00370001
  • Beispiel 5: Hydrolyse von vorbehandelten Haferschalen durch Cellulase-Mischungen, die CBHI-Kern umfassen
  • Proben von 0,226 Gramm mit Wasserdampf vorbehandelten Haferschalen (Trocken-Basis) werden in 50 mM Natriumcitrat-Puffer plus 0,5% Natriumbenzoat, pH 5,0, zu einem Gesamtgewicht von 2,5 Gramm in 15 ml-Zentrifugenröhrchen suspendiert. Die Suspension machte 5% Cellulose aus. Zu einem Satz Röhrchen wird eine Mischung von CBHI-Kern zusammen mit CBHII, EG I und β-Glucosidase gegeben. Die relativen Mengen von CBHI/CBHII/EG I sind 60%/20%/20%. Zusätzlich wird Novozym 188 β-Glucosidase mit einer Konzentration von 125 BG-Einheiten pro Gramm Cellulose zugesetzt. In einem zweiten Satz Röhrchen wird CBHI-Kern durch CBHI ersetzt, wobei der Rest der Mischung unverändert bleibt. Die Gesamt-Enzymdosis beträgt zwischen 12 und 95 mg pro Gramm Cellulose, ausschließlich der β-Glucosidase. Die Kolben werden bei 50°C inkubiert und 24 Stunden geschüttelt. Zu diesem Zeitpunkt werden Proben entnommen und bezüglich der verbleibenden Cellulosekonzentration analysiert. Die Cellulosekonzentration wird durch Zentrifugieren der Aufschlämmung, Waschen mit Wasser und Suspendieren in 82%-iger Schwefelsäure zum Erhalt einer Netto-Schwefelsäure-Konzentration von 70% bestimmt. Die Aufschlämmung wird 30 Minuten bei 40°C inkubiert, gefolgt vom Verdünnen in deionisiertem Wasser auf 2% Schwefelsäure. Zu diesem Zeitpunkt werden die Proben 1 Stunde bei 121°C Wasserdampf-autoklaviert, um die Oligomere in monomere Glucose zu überführen. Die Glucosekonzentration wird gemessen und mit der anfänglichen Cellulosekonzentration verglichen, um die prozentuale Celluloseumwandlung zu bestimmen.
  • Ergebnisse, die aus der Hydrolyse von vorbehandelten Haferschalen durch CBHI-Kern umfassende Cellulase-Mischungen erhalten werden, sind in 4 gezeigt. Die CBHI-Kern umfassende Cellulase-Mischung zeigt die gleichen Ergebnisse wie Mischungen, die CBHI umfassen, was demonstriert, dass CBHI-Kern bei der Hydrolyse von Cellulose unter Verwendung von Cellulase-Mischungen wirksam ist. Weiter kann, da CBHI-Kern oder jedes andere modifizierte CBHI-Enzym nach der Cellulose-Hydrolyse zurückgewonnen werden kann, modifizierte CBHI zurückgeführt und wiederverwendet werden, was die Kosten verringert, die mit der Glucoseproduktion verbunden sind.
  • Die vorliegende Erfindung ist mit Bezug auf bevorzugte Ausführungsformen beschrieben worden. Jedoch ist es für den Fachmann offensichtlich, dass eine Anzahl von Abwandlungen und Modifikationen vorgenommen werden kann, ohne vom Bereich der Erfindung, wie hierin beschrieben, abzuweichen.
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Claims (19)

  1. Verfahren zur Überführung von Cellulose in Glucose, umfassend das Behandeln eines vorbehandelten Lignocellulose enthaltenden Substrats mit einer Enzymmischung, welche umfasst: eine modifizierte CBHI, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus CBHI-Kern, CBHI-Kern plus -Linker, CBHI mit inaktivierter Cellulose-bindender Domäne und deren Kombinationen; und Cellulase-Enzyme, die ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Endoglucanasen (EG), Exocellobiohydrolasen (CBH), β-Glucosidasen und deren Kombinationen, wobei die modifizierte CBHI in der Enzymmischung zu 55 bis 100 Gew.-%, bezogen auf alle Enzyme vom CBHI-Typ, vorliegt, wobei das vorbehandelte Lignocellulose enthaltende Substrat mindestens 10% Lignin umfasst.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, in dem die Cellulose in dem vorbehandelten Lignocellulose enthaltenden Substrat in dem Behandlungsschritt bei einer Konzentration von 1 Gew.-% bis 25 Gew.-% vorliegt.
  3. Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, in dem die Cellulose in dem vorbehandelten Lignocellulose enthaltenden Substrat in dem Behandlungsschritt bei einer Konzentration von 10 Gew.-% bis 16 Gew.-% vorliegt.
  4. Verfahren nach irgendeinem vorhergehenden Anspruch, in dem die modifizierte CBHI eine modifizierte Trichoderma-CBHI ist.
  5. Verfahren nach irgendeinem vorangehenden Anspruch, in dem die modifizierte CBHI nach dem Behandlungsschritt zurückgewonnen wird.
  6. Verfahren nach irgendeinem vorangehenden Anspruch, in dem die modifizierte CBHI nach dem Schritt der Rückgewinnung wieder verwendet wird.
  7. Verfahren nach Anspruch 6, in dem der Schritt der Rückgewinnung eine Ultrafiltrationsmembran umfasst.
  8. Verfahren nach irgendeinem vorangehenden Anspruch, in dem das vorbehandelte Lignocellulose enthaltende Substrat ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus landwirtschaftlichen Rückständen, Rückständen nach Stärke- oder Zuckerentfernung, für Ethanol bestimmten Feldfrüchten, Forstwirtschaftsprodukten und Zellstoff- und Papierprodukten oder deren Kombinationen.
  9. Verfahren nach Anspruch 8, in dem: die landwirtschaftlichen Rückstände ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Maisstroh, Weizenstroh, Gerstenstroh und Sojabohnenstroh; die Rückstände nach der Stärke- oder Zuckerentfernung ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Haferschalen, Reisschalen, Zuckerrohr-Bagasse und Maisfaser; die für Ethanol bestimmten Feldfrüchte ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Hirse, Chinaschilf, Spartgras und Roggengras; die Forstwirtschaftsprodukte ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Hartholz, Weichholz, Eukalyptus und Sägemehl; und die Zellstoff- und Papierprodukte Solka-Floc sind.
  10. Verfahren nach Anspruch 1, in dem die Enzymmischung modifizierte CBHI und Cellulase-Enzyme umfasst, die ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus CBHI, CBHII, EG I, EG II, β-Glucosidase und deren Kombinationen.
  11. Verfahren nach Anspruch 10, in dem die modifizierte CBHI eine modifizierte Trichoderma-CBHI ist.
  12. Verfahren nach Anspruch 10 oder Anspruch 11, in dem die modifizierte CBHI nach dem Behandlungsschritt zurückgewonnen wird.
  13. Verfahren nach Anspruch 12, in dem die modifizierte CBHI nach dem Rückgewinnungsschritt wieder verwendet wird.
  14. Verfahren nach Anspruch 10, in dem die modifizierte CBHI CBHI mit einer inaktiven Celluose-bindenden Domäne ist.
  15. Verfahren nach Anspruch 10, in dem die modifizierte CBHI CBHI-Kern ist.
  16. Verfahren nach Anspruch 15, in dem der CBHI-Kern aus Trichoderma-CBHI erhalten ist.
  17. Verfahren nach Anspruch 10, in dem die modifizierte CBHI CBHI-Kern plus -Linker ist.
  18. Verfahren nach Anspruch 17, in dem der CBHI-Kern plus -Linker aus Trichoderma-CBHI erhalten ist.
  19. Verfahren zur Überführung von Cellulose in Glucose, umfassend das Behandeln eines vorbehandelten Lignocellulose enthaltenden Substrats mit einer Enzymmischung, welche umfasst: eine modifizierte CBHI, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus CBHI-Kern, CBHI-Kern plus -Linker, CBHI mit inaktivierter Cellulose-bindender Domäne und deren Kombinationen; und Cellulase-Enzyme, die ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Endoglucanasen (EG) Exocellobiohydrolasen (CBH), β-Glucosidasen und deren Kombinationen, wobei die modifizierte CBHI in der Enzymmischung zu 55 bis 100 Gew.-%, bezogen auf alle Enzyme vom CBHI-Typ, vorliegt, wobei das vorbehandelte Lignocellulose enthaltende Substrat ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Maisstroh, Weizenstroh, Gerstenstroh und Sojabohnenstroh, Haferschalen, Reisschalen, Zuckerrohr-Bagasse und Maisfaser, Hirsekorn, Chinaschilf, Spartgras und Roggengras, Hartholz, Eukalyptus und Sägemehl.
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