DE112012005586B4

DE112012005586B4 - Verzuckernde Enzymzusammensetzung und Verfahren zur Herstellung einer verzuckerten Lösung unter Verwendung der selbigen

Info

Publication number: DE112012005586B4
Application number: DE112012005586.1T
Authority: DE
Inventors: c/o Honda R & D Co. Ltd. Fukuura Maiko; c/o Honda R & D Co. Ltd. Mitsuzawa Shigenobu; c/o Kazusa DNA Research Institut Takeda Migiwa; c/o Kazusa DNA Research Institu Ara Takeshi; c/o Kazusa DNA Research Institu Shibata Daisuke
Original assignee: Honda Motor Co Ltd
Current assignee: Honda Motor Co Ltd
Priority date: 2012-01-06
Filing date: 2012-12-27
Publication date: 2018-07-05
Anticipated expiration: 2032-12-28
Also published as: JPWO2013103127A1; CN104093832B; CN104093832A; US20150044728A1; JP5844823B2; US9580735B2; WO2013103127A1; DE112012005586T5

Abstract

Verzuckernde Enzymzusammensetzung zum Unterwerfen von auf Lignocellulose basierender Biomasse als Substrat einer Verzuckerungsbehandlung, wobei die verzuckernde Enzymzusammensetzung eine Endoglucanase, welche die Aminosäuresequenz nach SEQ ID NO: 1 umfasst, eine Cellobiohydrolase, welche die Aminosäuresequenz nach SEQ ID NO: 2 umfasst, und eine β-Glucosidase, welche die Aminosäuresequenz nach SEQ ID NO: 3 umfasst, umfasst, welche aus einem Acremonium cellulolyticus H1-Stamm erhalten wurden.

Description

Technisches Gebiet
Die vorliegende Erfindung betrifft eine verzuckernde Enzymzusammensetzung und ein Verfahren zur Herstellung einer verzuckerten Lösung unter Verwendung der selbigen.
Stand der Technik
In letzter Zeit wurde ein Benzin-Ethanol-Mischkraftstoff zur Verwendung als Kraftstoff für Automobile untersucht. Es wird angenommen, dass durch Verwendung von Bioethanol, der durch Fermentation und Destillation von Substanzen auf pflanzlicher Basis hergestellt wird, als Ethanol ein so genannter Kohlenstoff-neutraler Effekt erreicht werden kann, um die Menge von Kohlenstoffdioxidemission zu verringern und zur Verhinderung der globalen Erwärmung beizutragen, wenn Bodenbewirtschaftung streng ausgeführt wird.
Es ist jedoch ein Problem, dass, wenn Agrarprodukte wie Zuckerrohr und Mais als die Substanzen auf pflanzlicher Basis verwendet werden, große Mengen solcher Agrarprodukte als Ausgangsmaterial für Ethanol verbraucht werden und die Versorgung mit Nahrungsmitteln oder Futtermitteln beeinträchtigt wird. Folglich ist eine Technologie zum Herstellen von Ethanol unter Verwendung von auf Lignocellulose basierender Biomasse, welche nicht als Nahrungsmittel oder als Futtermittel geeignet ist, als Substanz auf pflanzlicher Basis untersucht worden.
Da die auf Lignocellulose basierende Biomasse Cellulose enthält, kann Ethanol durch Abbauen der Cellulose zu Glucose durch eine Verzuckerungsbehandlung unter Verwendung eines verzuckernden Enzyms und durch Fermentieren der erhaltenen Glucose erzeugt werden. Als ein solches verzuckerndes Enzym ist bisher zum Beispiel eine Cellulase bekannt gewesen, die aus Acremonium cellulolyticus erzeugt wurde (siehe z.B. Patentliteratur 1). Ein Verfahren zur Expression derartiger Cellulasen unter der Kontrolle eines neuen Promotors ist in Patentliteratur 2 beschrieben. Patentliteratur 3 beschreibt die Verwendung einer speziellen cellolytischen Enzymzusammensetzung umfassend spezielle Polypeptide zum Abbau oder zur Umwandlung von cellulosehaltigem Material, und Patentliteratur 4 beschreibt ein neues hydrophobes β-Glucosidase-Protein, welches aus Acremonium cellulolyticus isoliert wurde und die äußerst effiziente Expression dieses Proteins nach Einführung von verschiedenen Modifikationen zum Erhalt einer erhöhten β-Glucosidaseaktivität. Schließlich beschreiben Fujii et al. in Biotechnology for Biofuels 2009, Vol. 2, Bd. 24, Seiten 1 bis 8 einen Vergleich der Effektivität von Cellulasen aus Acremonium cellulolyticus und Trichoderma reesei im Hinblick auf die enzymatische Verzuckerung von Lignocellulose-Biomasse.
Da das verzuckernde Enzym teuer ist, wird während der Ethanolherstellung die Konzentration von auf Lignocellulose basierender Biomasse als Substrat auf einen niedrigen Spiegel eingestellt, um den Verbrauch des verzuckernden Enzyms zu reduzieren. Wenn die Konzentration des Substrats jedoch auf einen niedrigen Spiegel eingestellt wird, wird die Konzentration einer erzeugten verzuckerten Lösung auch gering, und deshalb wird die Konzentration von Ethanol, welches durch Fermentieren der verzuckerten Lösung erzeugt wird, auch gering. Als Ergebnis davon tritt ein Problem dahingehend auf, dass die Zeit und Wärmeenergie, die für die Destillation nötig sind, zunehmen, wenn das erzeugte Ethanol zu Zwecken der Konzentrierung destilliert wird.
Um das Problem zu lösen, ist es vorstellbar, die Konzentration des Substrats sowie den Verbrauch des verzuckernden Enzyms auf ein hohes Niveau zu erhöhen, um so eine hohe Konzentration von Ethanol zu erhalten und die Energie, welche für Konzentrierung, Destillation und dergleichen von Ethanol benötigt wird, zu verringern, so dass die Gesamtenergieeffizienz verbessert wird. Da das verzuckernde Enzym teuer ist, ergibt sich in diesem Fall jedoch das Problem, dass die Kosten infolge der Erhöhung des Verbrauchs zunehmen.
Um das Problem zu lösen, ist es folglich erwünscht, dass die Verzuckerungseffizienz aufrecht erhalten wird und gleichzeitig der Verbrauch eines verzuckernden Enzyms verringert wird.
Liste von Zitaten
Patentliteratur

Patentliteratur 1: Japanische Offenlegungsschrift Nr. 2010-148427 A
Patentliteratur 2: Japanische Offenlegungsschrift Nr. 2001-017180 A
Patentliteratur 3: US-Patentanmeldung US 2010/0143967 A1
Patentliteratur 4: Europäische Patentanmeldung EP 2 468 859 A1

Zusammenfassung der Erfindung
Technische Aufgabe
Wenn die Gesamtmenge der verzuckernden Enzyme einfach verringert wird, tritt jedoch der Nachteil auf, dass auch die Verzuckerungseffizienz in Proportion zu der Menge verzuckernder Enzyme abnimmt.
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, eine verzuckernde Enzymzusammensetzung bereitzustellen, welche einen solchen Nachteil beseitigen kann und eine überlegene Verzuckerungsleistung bei geringem Verbrauch davon erreichen kann.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren zur Herstellung einer verzuckerten Lösung unter Verwendung der verzuckernden Enzymzusammensetzung bereitzustellen.
Lösung der Aufgabe
Die Aufgabe wird durch die in den Patentansprüchen aufgeführten Zusammensetzungen und Verfahren gelöst. Durch Untersuchungen der vorliegenden Erfinder wurde herausgefunden, dass eine aus Acremonium cellulolyticus extrahierte Cellulase eine Mischung verschiedener Cellulasen ist, einschließlich solcher, die nicht sehr effektiv im Verzuckern von auf Lignocellulose basierender Biomasse sind.
Es wird deswegen davon ausgegangen, dass durch einfache Verringerung der Gesamtmenge der Cellulasemischung Cellulasen mit überlegener Effektivität im Verzuckern von auf Lignocellulose basierender Biomasse sowie Cellulasen ohne solche Effektivität in gleichem Maße verringert werden und die Verzuckerungseffizienz im Verhältnis zu der Menge der verzuckernden Enzyme verringert wird.
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung untersuchten verschiedene Aspekte der Verzuckerungsleistungen einzelner Cellulasen, welche in der Cellulasemischung beinhaltet waren, bezüglich auf Lignocellulose basierender Biomasse. Als Ergebnis wurde festgestellt, dass eine verzuckernde Enzymzusammensetzung, die eine spezifische Kombination von Cellulasen umfasst, überlegene Leistung im Verzuckern von auf Lignocellulose basierender Biomasse aufweisen kann, wodurch das Ziel der vorliegenden Erfindung erreicht wurde.
Nämlich ist gemäß vorliegender Erfindung eine verzuckernde Enzymzusammensetzung zum Unterwerfen von auf Lignocellulose basierender Biomasse als Substrat einer Verzuckerungsbehandlung dadurch gekennzeichnet, dassdie verzuckerne Enzymzusammensetzung eine Endoglucanase, welche die Aminosäuresequenz nach SEQ ID NO: 1 umfasst, eine Cellobiohydrolase, welche die Aminosäuresequenz nach SEQ ID NO: 2 umfasst, und eine β-Glucosidase, welche die Aminosäuresequenz nach SEQ ID NO: 3 umfasst, umfasst, welche aus einem Acremonium cellulolyticus H1-Stamm erhalten wurden.
Die Endoglucanase ist dabei ein verzuckerndes Enzym zum Hydrolysieren von Cellulose aus ihrem innenliegenden Bereich zu einem kürzerkettigen β-1,4-Glucan. Weiterhin ist die Cellobiohydrolase ein verzuckerndes Enzym zum Hydrolysieren von Cellulose oder einem kürzerkettigen β-1,4-Glucan von ihrem/seinem Ende her zu Cellobiose. Weiterhin ist die β-Glucosidase ein verzuckerndes Enzym zum Hydrolysieren von Cellobiose zu Glucosen. Eine Cellulose-Bindungs-Domäne steht unterdessen für eine Struktur, welche ein verzuckerndes Enzym an eine Oberfläche von Cellulose bindet.
Mit einer verzuckernden Enzymzusammensetzung der vorliegenden Erfindung wirkt zuerst die Endoglucanase auf auf Lignocellulose basierende Biomasse ein. Da die Endoglucanase keine Cellulose-Bindungs-Domäne enthält, bindet sie nicht an eine spezifische Stelle einer Oberfläche der in der auf Lignocellulose basierenden Biomasse als Substrat enthaltenen Cellulose, und kann mit nicht-spezifischen Stellen über einen breiten Bereich einer molekularen Kette der Cellulose in Kontakt treten und ein kürzerkettiges β-1,4-Glucan ergeben.
Andererseits würde, falls eine Endoglucanase eine Cellulose-Bindungs-Domäne enthalten sollte, die Endoglucanase an einem Hydrolysereaktionsfeld verbleiben, sogar falls sie Cellulose zu einem kürzerkettigen β-1,4-Glucan hydrolysiert hat. Als Ergebnis ist die Wahrscheinlichkeit eines Kontakts zwischen der Endoglucanase und anderer Cellulose verringert und die Produktionseffizienz eines kürzerkettigen β-1,4-Glucans ist erniedrigt.
Da die Cellobiohydrolase eine Cellulose-Bindungs-Domäne enthält, bindet sie normalerweise an Cellulose und hydrolysiert die Cellulose von ihrem Ende her unter Erzeugung von Cellobiose, falls aber ein kürzerkettiges β-1,4-Glucan vorhanden ist, bindet sie auch an das kürzerkettige β-1,4-Glucan und hydrolysiert selbiges von seinem Ende unter Erzeugung von Cellobiose. Deswegen nimmt, falls kürzerkettige β-1,4-Glucane durch die Endoglucanase hergestellt werden, die Anzahl der Reaktionsstartpunkte für die Cellobiohydrolase zu und die Herstellung von Cellobiosen durch die Cellobiohydrolase wird gefördert.
Weiterhin ist die β-Glucosidase, da sie auch eine Cellulose-Bindungs-Domäne enthält, auch in dem Reaktionsfeld vorhanden, wo die Cellobiohydrolase Cellobiose erzeugt. Infolge dessen kann die durch die Cellobiohydrolase erzeugte Cellobiose unmittelbar durch die β-Glucosidase zu Glucosen hydrolysiert werden.
Bei einer verzuckernden Enzymzusammensetzung der vorliegenden Erfindung arbeiten deswegen die Endoglucanase, die Cellobiohydrolase und die β-Glucosidase zusammen, um Cellulose, welche in auf Lignocellulose basierender Biomasse als Substrat enthalten ist, zu verzuckern, so dass die Verzuckerungseffizienz verbessert werden kann und eine überlegene Verzuckerungsleistung mit einem geringeren Verbrauch davon erreicht werden kann.
Die Cellulose-Bindungs-Domäne, die in der β-Glucosidase der verzuckernden Enzymzusammensetzung gemäß der vorliegenden Erfindung enthalten ist, ist aus einer Aminosäuresequenz gebildet, die eine Homologie von nicht weniger als 70 % zu einer Aminosäuresequenz der Cellulose-Bindungs-Domäne, die in der Cellobiohydrolase enthalten ist, aufweist.
Je höher die Homologie der Aminosäuresequenzen von Cellulose-Bindungs-Domänen ist, desto höher wird die Wahrscheinlichkeit der Bindung an die gleiche Stelle, wenn die Domänen an eine Oberfläche von Cellulose oder eines kürzerkettigen β-1,4-Glucans binden. Deswegen nimmt die Wahrscheinlichkeit des Vorhandenseins der β-Glucosidase in demselben Reaktionsfeld zu, wenn die Cellobiohydrolase und die β-Glucosidase verwendet werden, welche Cellulose-Bindungs-Domänen mit Aminosäuresequenzen mit einer Homologie von nicht weniger als 70 % enthalten.
Infolge dessen können bei einer verzuckernden Enzymzusammensetzung der vorliegenden Erfindung die Endoglucanase, die Cellobiohydrolase und die β-Glucosidase zusammenarbeiten, um Verzuckerung effizienter auszuführen.
Indessen können die Cellobiohydrolase und die β-Glucosidase möglicherweise nicht ausreichend in demselben Reaktionsfeld vorhanden sein, falls die Homologie weniger als 70 % beträgt.
In einer verzuckernden Enzymzusammensetzung gemäß der vorliegenden Erfindung liegt der Gesamtgehalt der Endoglucanase, der Cellobiohydrolase und der β-Glucosidase bevorzugt im Bereich von 30 bis 80 Massen-%, bezogen auf die Gesamtmasse der verzuckernden Enzymzusammensetzung.
Falls der Gesamtgehalt der Endoglucanase, der Cellobiohydrolase und der β-Glucosidase 80 Massen-% oder höher, bezogen auf die Gesamtmasse der verzuckernden Enzymzusammensetzung, beträgt, nimmt die Verzuckerungseffizienz vielmehr ab, und deswegen sollte sie besser eine Hemicellulase wie beispielsweise eine Xylanase enthalten. Falls der Gesamtgehalt der Endoglucanase, der Cellobiohydrolase und der β-Glucosidase weniger als 30 Massen-%, bezogen auf die Gesamtmasse der verzuckernden Enzymzusammensetzung, beträgt, kann eine ausreichende Verzuckerungsleistung möglicherweise nicht erreicht werden.
Eine verzuckernde Enzymzusammensetzung gemäß der vorliegenden Erfindung enthält bevorzugt die Endoglucanase, die Cellobiohydrolase und die β-Glucosidase in einem Massenverhältnis im Bereich von 0,2 bis 2,5 : 1: 0,2 bis 2,5.
Falls das Massenverhältnis der Endoglucanase zur Cellobiohydrolase weniger als 0,2 beträgt, ist die Herstellungsrate eines kürzerkettigen β-1,4-Glucans, welches aus Cellulose durch die Endoglucanase hergestellt wird, zu langsam verglichen mit der Herstellungsrate von Cellobiose, die aus einem kürzerkettigen β-1,4-Glucan durch die Cellobiohydrolase hergestellt wird, und ausreichende Verzuckerungseffizienz kann möglicherweise nicht erreicht werden.
Andererseits ist, falls das Massenverhältnis der Endoglucanase zu der Cellobiohydrolase 2,5 überschreitet, die Herstellungsrate eines kürzerkettigen β-1,4-Glucans, welches aus Cellulose durch die Endoglucanase hergestellt wird, zu hoch verglichen mit der Herstellungsrate von Cellobiosen, die aus einem kürzerkettigen β-1,4-Glucan durch die Cellobiohydrolase hergestellt werden, und ausreichende Verzuckerungseffizienz kann möglicherweise nicht erreicht werden.
Indessen ist, falls das Massenverhältnis der β-Glucosidase zu der Cellobiohydrolase weniger als 0,2 beträgt, die Herstellungsrate von Glucose, welche aus Cellobiose durch die β-Glucosidase hergestellt wird, zu langsam verglichen mit der Herstellungsrate von Cellobiose, welche aus einem kürzerkettigen β-1,4-Glucan durch die Cellobiohydrolase hergestellt wird, und ausreichende Verzuckerungseffizienz kann möglicherweise nicht erreicht werden.
Andererseits ist, falls das Massenverhältnis der β-Glucosidase zu der Cellobiohydrolase 2,5 überschreitet, die Herstellungsrate von Glucose, welche aus Cellobiose durch die β-Glucosidase hergestellt wird, zu hoch verglichen mit der Herstellungsrate von Cellobiose aus einem kürzerkettigen β-1,4-Glucan durch die Cellobiohydrolase, und ausreichende Verzuckerungseffizienz kann möglicherweise nicht erreicht werden.
Eine verzuckernde Enzymzusammensetzung gemäß der vorliegenden Erfindung kann weiterhin eine Xylanase oder eine Xylosidase enthalten. Indem sie eine Xylanase oder eine Xylosidase enthält, kann die verzuckernde Enzymzusammensetzung Hemicellulose, welche in auf Lignocellulose basierender Biomasse als Substrat enthalten ist, verzuckern und Xylose erzeugen. Deswegen kann die Zusammensetzung die Verzuckerungsrate der auf Lignocellulose basierenden Biomasse als Substrat erhöhen.
Ein Verfahren zur Herstellung einer verzuckerten Lösung gemäß vorliegender Erfindung ist ein Verfahren zum Herstellen einer verzuckerten Lösung, welches umfasst das Zugeben eines verzuckernden Enzyms zu auf Lignocellulose basierender Biomasse als Substrat, um eine Mischung aus Substrat und verzuckerndem Enzym zu bilden, und dann das Unterwerfen der Mischung aus Substrat und verzuckerndem Enzym einer Verzuckerungsbehandlung, um eine verzuckerte Lösung zu erzeugen, wobei das Verfahren dadurch gekennzeichnet ist, dass als das verzuckernde Enzym mindestens eine Endoglucanase, welche die Aminosäuresequenz nach SEQ ID NO: 1 umfasst, eine Cellobiohydrolase, welche die Aminosäuresequenz nach SEQ ID NO: 2 umfasst, und eine β-Glucosidase, welche die Aminosäuresequenz nach SEO ID NO: 3 umfasst, welche aus einem Acremonium cellulolyticus H1-Stamm erhalten wurden, gleichzeitig zu dem Substrat zugegeben werden.
Falls Enzyme gleichzeitig zugegeben werden (siehe oben), wirkt zuerst die Endoglucanase auf Cellulose, welche in auf Lignocellulose basierender Biomasse enthalten ist. Da die Endoglucanase keine Cellulose-Bindungs-Domäne enthält, wird sie, wenn sie zu dem Substrat zugegeben wird, nicht an eine spezifische Stelle einer Oberfläche der Cellulose gebunden und kann nicht-spezifische Stellen über einen breiten Bereich einer molekularen Kette der Cellulose kontaktieren, um ein kürzerkettiges β-1,4-Glucan zu erzeugen.
Da die Cellobiohydrolase eine Cellulose-Bindungs-Domäne enthält, bindet sie normalerweise an Cellulose und hydrolysiert die Cellulose von ihrem Ende, um Cellobiose zu erzeugen, aber falls ein kürzerkettiges β-1,4-Glucan vorhanden ist, bindet sie auch an das kürzerkettige β-1,4-Glucan und hydrolysiert selbiges von seinem Ende, um Cellobiose zu erzeugen. Deswegen nimmt die Anzahl der Reaktionsstartpunkte für die Cellobiohydrolase zu und die Herstellung von Cellobiosen durch die Cellobiohydrolase wird gefördert, wenn kürzerkettige β-1,4-Glucane durch die Endoglucanase hergestellt werden .
Weiterhin ist die β-Glucosidase, da die β-Glucosidase auch eine Cellulose-Bindungs-Domäne enthält, auch in dem Reaktionsfeld vorhanden, wo die Cellobiohydrolase Cellobiose erzeugt. Infolge dessen wird die Cellobiose, die durch die Cellobiohydrolase erzeugt wird, unmittelbar von der β-Glucosidase zu Glucosen hydrolysiert.
Da die Endoglucanase, die Cellobiohydrolase und die β-Glucosidase in einem Verfahren zum Herstellen einer verzuckerten Lösung gemäß der vorliegenden Erfindung zusammenarbeiten, um Cellulose, welche in auf Lignocellulose basierender Biomasse enthalten ist, zu verzuckern, kann eine verzuckerte Lösung mit einer hohen Zuckerkonzentration effizient erhalten werden.
Ein weiteres Verfahren zur Herstellung einer verzuckerten Lösung gemäß vorliegender Erfindung ist ein Verfahren zum Herstellen einer verzuckerten Lösung, welches umfasst das Zugeben eines verzuckernden Enzyms zu auf Lignocellulose basierender Biomasse als Substrat, um eine Mischung aus Substrat und verzuckerndem Enzym zu bilden, und dann das Unterwerfen der Mischung aus Substrat und verzuckerndem Enzym einer Verzuckerungsbehandlung, um eine verzuckerte Lösung zu erzeugen, wobei das Verfahren dadurch gekennzeichnet ist, dass als das verzuckernde Enzym mindestens eine Endoglucanase, welche die Aminosäuresequenz nach SEQ ID NO: 1 umfasst, zu dem Substrat gegeben wird, und danach mindestens eine Cellobiohydrolase, welche die Aminosäuresequenz nach SEQ ID NO: 2 umfasst, und eine β-Glucosidase, welche die Aminosäuresequenz nach SEO ID NO: 3 umfasst, zugegeben werden, wobei die Endoglucanase, die Cellobiohydralase und die β-Glucosidase aus einem Acremonium cellulolyticus H1-Stamm erhalten wurden.
Falls die Endoglucanase vorher zugegeben wird (siehe oben), sind die Cellobiohydrolase und β-Glucosidase nicht in dem Reaktionsfeld der Endoglucanase vorhanden. Deshalb kann die vorher zugegebene Endoglucanase eine molekulare Kette von Cellulose effizienter kontaktieren, um bevorzugt Cellulose, welche in auf Lignocellulose basierender Biomasse enthalten ist, zu hydrolysieren, um ein kürzerkettiges β-1,4-Glucan herzustellen.
Als Folge davon ist die Menge eines kürzerkettigen β-1,4-Glucans erhöht worden, wenn die Cellobiohydrolase und die β-Glucosidase zugegeben werden, verglichen mit dem Fall gleichzeitiger Zugabe der Endoglucanase, der Cellobiohydrolase und der β-Glucosidase. Deshalb kann die Cellobiohydrolase leicht das kürzerkettige β-1,4-Glucan zu Cellobiose hydrolysieren.
Da die β-Glucosidase aufgrund der Funktion der Cellulose-Bindungs-Domäne im Reaktionsfeld von Hydrolyse durch die Cellobiohydrolase vorhanden ist, kann sie effizient die Cellobiose hydrolysieren, um Glucose herzustellen.
Infolge davon kann durch vorheriges Zugeben der Endoglucanase und dann Zugeben der Cellobiohydrolase und der β-Glucosidase gemäß einem Verfahren zum Herstellen einer verzuckerten Lösung gemäß der vorliegenden Erfindung eine verzuckerte Lösung mit einer hohen Zuckerkonzentration effizienter erzeugt werden.
Figurenliste

[1] 1 ist ein Flussdiagramm, welches eine Ausführungsform eines Verfahrens zum Herstellen einer verzuckerten Lösung gemäß der vorliegenden Erfindung zeigt.
[2] 2A und 2B sind Graphen, die den Durchmesser einer Kolonie eines Stamms, aus welchem eine verzuckernde Enzymzusammensetzung gemäß der vorliegenden Erfindung extrahiert werden kann, und den Durchmesser einer AZCL-Halo zeigen.
[3] 3 ist ein Graph, der CMC-Abbauaktivität eines Stamms zeigt, aus welchem eine verzuckernde Enzymzusammensetzung gemäß der vorliegenden Erfindung extrahiert werden kann.
[4] 4 ist ein Graph, der Verzuckerungsleistung eines verzuckernden Enzyms gemäß der vorliegenden Erfindung zeigt.
[5] 5 ist ein Graph, der die Ergebnisse von Untersuchungen über den Einfluss des Gehalts einer verzuckernden Enzymzusammensetzung gemäß der vorliegenden Erfindung, bezogen auf die Gesamtmasse, auf die Herstellung von Glucose zeigt.
[6] 6 ist ein Graph, der die Ergebnisse von Untersuchungen über den Einfluss des Massenverhältnisses einer Endoglucanase, einer Cellobiohydrolase, einer β-Glucosidase, einer Xylanase und einer β-Xylosidase in einer verzuckernden Enzymzusammensetzung gemäß der vorliegenden Erfindung auf die Herstellung eines Saccharids zeigt.

Beschreibung von Ausführungsformen
Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung werden im Folgenden unter Bezugnahme auf die angefügten Zeichnungen detaillierter beschrieben werden.
1 zeigt ein Verfahren von Verzuckerungsbehandlungen beim Herstellen von Ethanol unter Verwendung von auf Lignocellulose basierender Biomasse als Substrat.
In den Verzuckerungsbehandlungen wird zuerst Ammoniakwasser mit grob zerkleinertem Reisstroh als eine auf Lignocellulose basierende Biomasse als Substrat gemischt, um eine Substratmischung herzustellen, welche Reisstroh und Ammoniak enthält. In diesem Fall liegt die Konzentration des Ammoniakwassers im Bereich von 20 bis 30% Masse/Volumen und die Substratmischung wird bevorzugt so eingestellt, dass sie Reisstroh im Bereich von 20 bis 70 Massen-%, bezogen auf das Ammoniakwasser, enthält.
Dann wird die hergestellte Substratmischung bei einer Temperatur im Bereich von 25 bis 100 °C für eine Zeitdauer im Bereich von 2 bis 200 Stunden gehalten, um eine Behandlung vor der Verzuckerung (Vor-Verzuckerung-Behandlung) durchzuführen. Als Ergebnis wird ein Ammoniak enthaltendes, vor Verzuckerung behandeltes Produkt erhalten, in welchem Lignin von dem Reisstroh als Substrat dissoziiert oder das Reisstroh aufgequollen wird.
In dieser Hinsicht bedeutet der Begriff „dissoziieren“ in der vorliegenden Ausführungsform, dass zumindest ein Teil von Bindungen in Bindungsstellen von an Cellulose gebundenem Lignin, etc., aufgebrochen wird. Der Begriff „aufquellen“ bedeutet, dass aufgrund von Infiltrierung einer Flüssigkeit Lücken in Cellulose, etc., welche kristalline Cellulose darstellt, erzeugt werden, oder dass Lücken innerhalb einer zu expandierenden Cellulosefaser erzeugt werden.
Als nächstes wird Ammoniak abgetrennt durch Verdampfen von Ammoniak aus dem Ammoniak enthaltenden, vor Verzuckerung behandelten Produkt, um ein von Ammoniak abgetrenntes, vor Verzuckerung behandeltes Produkt zu ergeben. Dann wird der ph-Wert des von Ammoniak abgetrennten, vor Verzuckerung behandelten Produkts auf einen Bereich eingestellt, in welchem verzuckernde Enzyme arbeiten können, zum Beispiel im pH-Wert-Bereich von 3 bis 7.
Dann werden verzuckernde Enzyme zu dem pH-eingestellten, von Ammoniak abgetrennten, vor Verzuckerung behandelten Produkt zugegeben, um eine Mischung aus Substrat und verzuckerndem Enzym herzustellen, und dann wird durch Halten der Mischung aus Substrat und verzuckerndem Enzym im Temperaturbereich von 30 bis 60 °C für 50 bis 150 Stunden eine Verzuckerungsbehandlung durchgeführt. Durch die Verzuckerungsbehandlung wird Cellulose, welche in der Mischung aus Substrat und verzuckerndem Enzym enthalten ist, durch die Wirkung der verzuckernden Enzyme hydrolysiert. Als Ergebnis davon kann eine verzuckerte Lösung, welche ein Saccharid wie beispielsweise Glucose enthält, erhalten werden.
In einem Verfahren zum Herstellen einer verzuckerten Lösung gemäß der vorliegenden Ausführungsform wird als das verzuckernde Enzym eine verzuckernde Enzymzusammensetzung verwendet, welche eine Endoglucanase, welche keine Cellulose-Bindungs-Domäne enthält, eine Cellobiohydrolase, welche eine Cellulose-Bindungs-Domäne enthält, und eine β-Glucosidase, welche eine Cellulose-Bindungs-Domäne enthält, enthält.
Die in der vorliegenden Ausführungsform zu verwendende Endoglucanase, Cellobiohydrolase und β-Glucosidase können zum Beispiel durch das folgende Verfahren erhalten werden.

Zuerst, als ein Vor-Mutation-Kulturschritt, wird ein Acremonium cellulolyticus TN-Stamm (internationale Patent-Mikroorganismen-Hinterlegungsstelle, The National Institute of Advanced Industrial Science and Technology; Zugangsnummer: FERM-BP-685; im Folgenden abgekürzt als „TN-Stamm“) in eine Kulturflüssigkeit inokuliert, welche die in Tabelle 1 gezeigte Zusammensetzung aufweist, und über Nacht bei 30 °C kultiviert. Dann, als ein mutagener Behandlungsschritt, wird der kultivierte TN-Stamm auf die Oberfläche eines festen Kulturmediums ausgestrichen, welches die in Tabelle 2 gezeigte Zusammensetzung aufweist, und mit ultraviolettem Licht bestrahlt, um einen mutagen behandelten Stamm zu erhalten. Anschließend wird der mutagen behandelte Stamm bei 30 °C für 7 Tage als ein Nach-Mutation-Kulturschritt kultiviert. [Tabelle 1]

Zusammensetzung	Konzentration (% Masse/Volumen)
Reisstroh	5,0
KH₂PO₄	0,2
(NH₄)₂SO₄	0,14
Harnstoff	0,4
Polyoxyethylensorbitanmonooleat	0,1
MgSO₄ · 7 H₂O	0,03
ZnSO₄ · 7 H₂O	0,007
MgSO₄ · 6 H₂O	0,001
CuSO₄ · 7 H₂O	0,005

[Tabelle 2]

Zusammensetzung	Konzentration (% Masse/Volumen)
Reisstroh	1,0
AZCL-He-Cellulose	0,02
Acetatpufferlösung (pH4)	20 (mM)
Agar	2,0

AZCL-HE-CELLULOSE (Markenname, von Megazyme International Irland), welche in dem festen Kulturmedium als ein Farbentwicklungssubstrat enthalten ist, ist eine Substanz, welche eine blaue Farbe entwickelt, wenn sie durch ein verzuckerndes Enzym abgebaut wird. Wenn der mutagen behandelte Stamm durch die Kultivierung ein verzuckerndes Enzym herstellt, wird deshalb die AZCL-HE-CELLULOSE durch das verzuckernde Enzym abgebaut und ein blauer Kreis (im Folgenden bezeichnet als „AZCL-Halo“) wird um eine Kolonie des mutagen behandelten Stammes herum gebildet, wobei die Größe des Kreises der Menge des produzierten verzuckernden Enzyms entspricht.
Dann wird eine Kolonie mit der maximalen Größe der AZCL-Halo als ein Inokulum ausgewählt und der Vor-Mutation-Kulturschritt, der mutagene Behandlungs-Schritt und der Nach-Mutation-Kulturschritt werden nochmals wiederholt. Aus den resultierenden Kolonien werden mehrere Kolonien gemäß ihren Größen und den Größen der um sie herum gebildeten AZCL-Halos ausgewählt.
Jeder Stamm der ausgewählten Kolonien und der TN-Stamm wurden auf ein neues Medium des festen Kulturmediums inokuliert und bei 30 °C für 7 Tage kultiviert. Die Durchmesser der Kolonien und die Durchmesser der AZCL-Halos wurden gemessen und (Durchmesser der AZCL-Halo)/(Durchmesser der Kolonie) wurde berechnet.
Weiterhin wurden jeder Stamm der ausgewählten Kolonien und der TN-Stamm in ein neues Medium der Kulturflüssigkeit inokuliert und bei 30 °C kultiviert, dann wurde eine Kultur unter Bedingungen von pH-Wert 5,5 und 30 °C gestartet. An Tagen 7, 10, 11, 12, 13, 14 und 17 wurde die Carboxymethylcellulose (CMC)-Abbauaktivität gemessen. Die CMC-Abbauaktivität wurde wie folgt gemessen.
Zuerst werden zu 10 µl einer wässrigen Probenlösung, welche ein verzuckerndes Enzym enthält, 190 µl einer 200 mM Acetatpufferlösung (pH-Wert 5,5) und 200 µl einer wässrigen CMC-Lösung (1 % Masse/Volumen; Güteklasse Nr. 1.02331.0500, von Merck & Co., Inc.) zugegeben und bei 30 °C für 15 min reagieren gelassen.
Dann werden zu der zur Reaktion gebrachten Lösung 400 µl einer wässrigen Lösung, welche 30 % Masse/Volumen Rochelle-Salz, 1 % Masse/Volumen Dinitrosalicylsäure und 1,6 % Masse/Volumen Natriumhydroxid enthält, zugegeben und bei 100 °C für 5 min behandelt. Als nächstes wird die Absorption von Licht einer Wellenlänge von 540 nm für die erhaltene Lösung gemessen und die Konzentration eines eluierten reduzierenden Zuckers wird auf Basis einer Standardsubstanz von Glucose berechnet. In dieser Beziehung wird die Enzymmenge, welche 1 µmol reduzierenden Zucker pro min freisetzt, als 1 U definiert.
Von den ausgewählten Kolonien wird die, welche den höchsten Wert von (Durchmesser der AZCL-Halo)/(Durchmesser der Kolonie) und CMC-Abbauaktivität aufweist (wie oben berechnet), ausgewählt als der Acremonium cellulolyticus H1-Stamm (im Folgenden abgekürzt als „H1-Stamm“; Internationale Patent-Mikroorganismen-Hinterlegungsstelle, The National Institute of Advanced Industrial Science and Technology; Zugangsnummer: FERM-P-22164; nachträglich übertragen an das International Patent Organism Depository des National Institute of Technology and Education, Japan; Zugangsnummer FERM-BP-11508) und als ein Stamm für Extraktion einer verzuckernden Enzymzusammensetzung der vorliegenden Ausführungsform verwendet.
In 2A und 2B sind die Koloniedurchmesser, die AZCL-Halo-Durchmesser und die Werte von (Durchmesser der AZCL-Halo)/(Durchmesser der Kolonie) für den H1-Stamm und den TN-Stamm gezeigt. Die CMC-Abbauaktivität-Werte des H1-Stamms und des T1-Stamms sind in 3 gezeigt.
Wie aus 2A erkenntlich, ist der AZCL-Halo-Durchmesser für die Kolonie des H1-Stamms größer im Vergleich zu der Kolonie des TN-Stamms. Deshalb ist es klar, dass der H1-Stamm mehr verzuckerndes Enzym produziert als der TN-Stamm.
Weiterhin ist, wie aus 2B ersichtlich, der Wert von (Durchmesser der AZCL-Halo)/(Durchmesser der Kolonie) für die Kolonie des H1-Stamms ungefähr zweimal so groß wie für die Kolonie des TN-Stamms. Deshalb ist es klar, dass der H1-Stamm höhere verzuckernde Enzym-Aktivität pro Pilzkörper aufweist im Vergleich zu dem TN-Stamm.
Aus 3 ist ersichtlich, dass der H1-Stamm signifikant höhere CMC-Abbauaktivität aufweist im Vergleich zu dem TN-Stamm. Da die CMC-Abbauaktivität verwendet wird als ein Indikator, der die Cellulose-Abbauaktivität darstellt, ist es klar, dass der H1-Stamm ein verzuckerndes Enzym produziert, das dem des TN-Stamms überlegen ist.
Als nächstes wird ein Verfahren beschrieben werden zum Extrahieren verzuckernder Enzyme aus dem H1-Stamm, welche in der vorliegenden Ausführungsform verwendet werden, nämlich, einer Endoglucanase, einer Cellobiohydrolase und einer β-Glucosidase.

Zuerst wird der H1-Stamm in eine Kulturflüssigkeit inokuliert, welche die in Tabelle 3 gezeigte Zusammensetzung aufweist, und bei 30 °C für 14 Tage kultiviert. Die Kulturflüssigkeit, in welcher der Stamm kultiviert worden ist, wird mit einem Filter mit einer Porengröße von 0,2 µm filtriert. [Tabelle 3]

Zusammensetzung	Konzentration (% Masse/Volumen)
Von Ammoniak abgetrenntes, vor Verzuckerung behandeltes Produkt	5,0
(NH₄)₂SO₄	0,5
Harnstoff	0,4
KH₂PO₄	2,4
MgSO₄ · 7 H₂O	0,12
ZnSO₄ · 7 H₂O	0,001
MnSO₄ · 6 H₂O	0,001
CuSO₄ · 7 H₂O	0,001
Polyoxyethylensorbitanmonooleat	0,1

Das erhaltene Filtrat wird durch die erste Auftrennungssäule (Markenname: Bio-Rad Econo-Säule, Durchmesser 5,0 cm x Länge 50,0 cm; von Bio-Rad Laboratories, Inc.), gefüllt mit einem Anionen-Austauscher-Medium (Markenname: TOYOPEARL QAE-550C; von Tosoh Corporation), aufgetrennt, um Fraktionen Q1 bis Q12 gemäß der Elutionszeit zu erhalten.
Als nächstes wird die erhaltene Fraktion Q1 bei 50 °C für 24 Stunden wärmebehandelt, dann zentrifugiert (9460 x g, 20 min), und der erhaltene Überstand wird mit einem Filter mit einer Porengröße von 0,2 µm filtriert. Das erhaltene Filtrat wird durch die zweite Auftrennungssäule (Markenname: Mono S 5.50L-Säule; von GE Healthcare Japan) aufgetrennt, um Fraktionen S1 bis S9 gemäß der Elutionszeit zu erhalten. Eine Endoglucanase, welche keine Cellulose-Bindungs-Domäne enthält, wird aus der Fraktion S3 erhalten. Die Endoglucanase ist ein verzuckerndes Enzym, gebildet aus der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1.
Als nächstes wird die Fraktion Q3 durch die dritte Auftrennungssäule (Markenname: XK26/20-Säule; Durchmesser 2,6 cm x Länge 20 cm; von GE Healthcare Japan), gefüllt mit einem hydrophoben Medium (Markenname: TOYOPEARL Butyl-650M; von Tosoh Corporation), aufgetrennt, um Fraktionen B1 bis B8 gemäß der Elutionszeit zu erhalten.
Dann wird eine Cellobiohydrolase, welche eine Cellulose-Bindungs-Domäne enthält, aus der Fraktion B7 erhalten. Die Cellobiohydrolase ist ein verzuckerndes Enzym, welche aus der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2 gebildet ist. Weiterhin wird eine β-Glucosidase, welche eine Cellulose-Bindungs-Domäne enthält, aus der Fraktion B8 erhalten. Die β-Glucosidase ist ein verzuckerndes Enzym, welches aus der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 3 gebildet ist.
Es wurde eine Homologiesuche der Aminosäuresequenzen der Endoglucanase, der Cellobiohydrolase und der β-Glucosidase, welche so erhalten wurden, bezüglich Cellulose-Bindungs-Domänen unter Verwendung der Pfam-Datenbank als eine Motiv-Bibliothek durchgeführt.
Als das Ergebnis wurde für die Cellobiohydrolase herausgefunden, dass die Aminosäuresequenz 497 bis 529 in der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2 eine Cellulose-Bindungs-Domäne darstellt. Ähnlich wurde für die β-Glucosidase herausgefunden, dass die Aminosäuresequenz 780 bis 812 in der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 3 eine Cellulose-Bindungs-Domäne darstellt. Es wurde herausgefunden, dass die Endoglucanase keine Cellulose-Bindungs-Domäne enthält.
Als nächstes wurde eine Homologieuntersuchung der Aminosäuresequenzen der Cellulose-Bindungs-Domänen der Cellobiohydrolase und der β-Glucosidase durchgeführt, zum Beispiel unter Verwendung von BLAST-Suchen auf der Seite von NCBI (National Center for Biotechnology Information), wobei eine Homologie von 24/33, nämlich 72,7 %, gefunden wurde.
Wenn sie an eine Oberfläche von Cellulose oder eines kürzerkettigen β-1,4-Glucans binden, binden Cellulose-Bindungs-Domänen mit Aminosäuresequenzen, welche größere Homologie aufweisen, an dieselbe Stelle mit höherer Wahrscheinlichkeit. Deshalb wird, unter Verwendung der Cellobiohydrolase und der β-Glucosidase, welche Cellulose-Bindungs-Domänen mit Aminosäuresequenzen mit einer Homologie von 72,7 % enthalten, die Wahrscheinlichkeit der Anwesenheit der β-Glucosidase in demselben Reaktionsfeld groß, wenn die Cellobiohydrolase Cellobiose erzeugt.
Infolge dessen können mit einer verzuckernden Enzymzusammensetzung der vorliegenden Ausführungsform die Endoglucanase, die Cellobiohydrolase und die β-Glucosidase für effizientere Verzuckerung zusammenarbeiten.
Für eine verzuckernde Enzymzusammensetzung der vorliegenden Ausführungsform wird der Gesamtgehalt der Endoglucanase, der Cellobiohydrolase und der β-Glucosidase (zu erhalten wie oben) im Bereich von 30 bis 80 Massen-%, bezogen auf die Gesamtmasse der verzuckernden Enzymzusammensetzung, ausgewählt. Weiterhin wird eine verzuckernde Enzymzusammensetzung, welche die Endoglucanase, die Cellobiohydrolase und die β-Glucosidase (zu erhalten wie oben) in einem Massenverhältnis im Bereich von 0,2 bis 2,5 : 1 : 0,2 bis 2,5 enthält, in der vorliegenden Ausführungsform verwendet.
Durch ein Verfahren zum Herstellen einer verzuckerten Lösung gemäß der vorliegenden Ausführungsform werden die Endoglucanase, die Cellobiohydrolase und die β-Glucosidase, welche die verzuckernde Enzymzusammensetzung darstellen, gleichzeitig zu dem pH-eingestellten, von Ammoniak abgetrennten, vor Verzuckerung behandelten Produkt zugegeben.
Dadurch arbeiten die Endoglucanase, die Cellobiohydrolase und die β-Glucosidase zusammen, um Cellulose, welche in auf Lignocellulose basierender Biomasse enthalten ist, zu verzuckern und können infolge dessen effizient eine verzuckerte Lösung mit einer hohen Konzentration eines Saccharids, wie zum Beispiel Glucose, erzeugen.
Obwohl in der vorliegenden Ausführungsform die Endoglucanase, die Cellobiohydrolase und die β-Glucosidase, welche die verzuckernde Enzymzusammensetzung darstellen, gleichzeitig zu dem pH-eingestellten, von Ammoniak abgetrennten, vor Verzuckerung behandelten Produkt zugegeben werden, kann die Endoglucanase vorher alleine zu dem pH-eingestellten, von Ammoniak abgetrennten, vor Verzuckerung behandelten Produkt zugeben werden, um eine enzymatische Verzuckerungsbehandlung für eine vorbestimmte Zeitdauer durchzuführen, und danach die Cellobiohydrolase und die β-Glucosidase zugegeben werden.
Gemäß einem Verfahren zum Herstellen einer verzuckerten Lösung gemäß der vorliegenden Erfindung kann eine verzuckerte Lösung mit einer hohen Zuckerkonzentration effizienter erzeugt werden, indem zuerst die Endoglucanase und dann die Cellobiohydrolase und die β-Glucosidase zugegeben werden.
Obwohl in der vorliegenden Ausführungsform die verzuckernde Enzymzusammensetzung verwendet wird, welche nur die Endoglucanase, welche keine Cellulose-Bindungs-Domäne enthält, die Cellobiohydrolase, welche die Cellulose-Bindungs-Domäne enthält und die β-Glucosidase, welche die Cellulose-Bindungs-Domäne enthält, enthält, kann die verzuckernde Enzymzusammensetzung weiterhin eine Xylanase oder eine Xylosidase enthalten.
Durch Enthalten einer Xylanase oder Xylosidase kann Hemicellulose, welche in der auf Lignocellulose basierenden Biomasse enthalten ist, enzymatisch zu Xylose verzuckert werden, und deswegen kann die Verzuckerungsrate der auf Lignocellulose basierenden Biomasse verbessert werden.
Als nächstes werden Beispiele und Vergleichsbeispiele der vorliegenden Erfindung beschrieben werden.
Beispiel
[Beispiel 1]
In diesem Beispiel wurde zuerst Reisstroh als auf Lignocellulose basierende Biomasse als Substrat fein gemahlen, zu welchem 25 Massen-% Ammoniakwasser zugegeben wurden auf ein Massenverhältnis von 1 : 2,5, um eine Substratmischung zu erhalten, welche Reisstroh und Ammoniak enthält. Als nächstes wurde die Substratmischung bei einer Temperatur von 80 °C für 8 Stunden gehalten, um eine Behandlung vor der Verzuckerung durchzuführen, dann wurde Ammoniak abgetrennt und der pH-Wert wurde auf 4,0 eingestellt. Der Gehalt an Reisstroh wurde auf 20 Vol.-% eingestellt, um ein vor Verzuckerung behandeltes Produkt dieses Beispiels zu erhalten.
Eine verzuckernde Enzymzusammensetzung wurde hergestellt durch Mischen einer Endoglucanase, welche aus der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1 gebildet ist, einer Cellobiohydrolase, welche aus der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2 gebildet ist, einer β-Glucosidase, welche aus der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 3 gebildet ist, einer Xylanase (Endo-1,4-beta-Xylanase A, stammend aus Thermoascus aurantiacus; GenBank Zugangsnummer AAF24127) und einer β-Xylosidase (β-Xylosidase, stammend aus Thermotoga maritima; von Thermostable Enzyme Laboratory Co., Ltd.) in einem Massenverhältnis von 0,3 : 1: 0,3 : 1,0 : 0,7. Die Zusammensetzung wurde zu dem vorbehandelten Produkt auf eine Endkonzentration von 2 mg pro g Reisstroh zugegeben, und die Mischung wurde einer Verzuckerungsbehandlung bei 50 °C für 72 Stunden unterworfen, um ein verzuckerungsbehandeltes Produkt zu erhalten. Obwohl in diesem Fall eine Xylanase und eine β-Xylosidase, stammend aus spezifischen Pilzen, verwendet wurden, können jegliche Enzyme, welche Endoxylanase-Aktivität und β-Xylosidase-Aktivität aufweisen, verwendet werden. Dann wurde die verzuckerte Lösung bei 95 °C für 5 min wärmebehandelt, bei 15.760 x g zentrifugiert, 4 °C für 5 min, und der Überstand wurde in ein neues 1,5 ml Eppendorf Reaktionsgefäß übertragen. Nach Filtration mit einem Filter, welcher eine Porengröße von 0,2 µm aufweist, wurde die Zuckerkonzentration mittels HPLC gemessen.
Die Zuckerkonzentration wurde durch die HPLC mit einem Separator (Markenname: Waters 2695; von Nihon Waters K. K.), einem RI-Detektor (Markenname: Waters 2414; von Nihon Waters K. K.) und einer Auftrennungssäule (Markenname: HPX-87P-Säule; von Bio-Rad Laboratories, Inc.) unter Bedingungen der Säulentemperatur bei 85 °C und der Detektortemperatur bei 40 °C unter Verwendung von ultrareinem Wasser als Elutionsmittel bei einer Flussrate von 0,6 ml/min gemessen. Die Ergebnisse sind in 4 gezeigt. In 4 ist die Gesamtglucose und -xylose als die Zuckerkonzentration gezeigt.
[Vergleichsbeispiel 1]
In diesem Vergleichsbeispiel wurde eine verzuckerte Lösung hergestellt, genau wie im Beispiel 1, außer dass ein kommerziell erhältliches verzuckerndes Enzym verwendet wurde (Markenname: Acremonium Cellulase; von Meiji Seika Pharma Co., Ltd.); und die Glucosekonzentration der verzuckerten Lösung wurde gemessen. Die Ergebnisse sind in 4 gezeigt.
Wie in 4 gezeigt, betrug die Zuckerkonzentration der verzuckerten Lösung des Beispiels, hergestellt unter Verwendung einer verzuckernden Enzymzusammensetzung, zusammengesetzt aus der Endoglucanase, der Cellobiohydrolase und der β-Glucosidase, 3,8 % Masse/Volumen, und die Zuckerkonzentration der verzuckerten Lösung des Vergleichsbeispiels, hergestellt unter Verwendung der Acremonium-Cellulase (Markenname), betrug 2,3 % Masse/Volumen.
Somit kann durch die verzuckernde Enzymzusammensetzung des Beispiels die Zuckerkonzentration einer verzuckerten Lösung, welche durch eine enzymatische Verzuckerungsbehandlung für eine vorbestimmte Zeitdauer erhalten wird, ungefähr 1,7-fach erhöht werden, im Vergleich zu dem verzuckernden Enzym des Vergleichsbeispiels. Mit anderen Worten, die verzuckernde Enzymzusammensetzung des Beispiels kann in einer 1,7-fach geringeren Menge als die Menge des verzuckernden Enzyms des Vergleichsbeispiels eine verzuckerte Lösung mit der äquivalenten Zuckerkonzentration erzeugen, was eindeutig gute Verzuckerungsleistung bei einem geringen Verbrauch davon zeigt.
[Beispiel 2]
Als nächstes wurde der Gesamtgehalt von Enzymen gemäß der vorliegenden Erfindung untersucht.
[Beispiel 2-1]
In diesem Beispiel wurde eine Verzuckerungsbehandlung genau wie in Beispiel 1 durchgeführt, außer dass eine verzuckernde Enzymzusammensetzung hergestellt wurde durch Mischen einer Endoglucanase, gebildet aus der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1, einer Cellobiohydrolase, gebildet aus der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2, und einer β-Glucosidase, gebildet aus der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 3, in einem Massenverhältnis von 0,3 : 1 : 0,3, um 35,1 % der Gesamtenzymmasse darzustellen, um ein Verzuckerungsbehandlungsprodukt zu ergeben, dessen Glucosekonzentration gemessen wurde. Die Ergebnisse sind in 5 gezeigt.
[Beispiel 2-2]
In diesem Beispiel wurde eine Verzuckerungsbehandlung genau wie in Beispiel 2-1 durchgeführt, außer dass eine verzuckernde Enzymzusammensetzung so hergestellt wurde, dass eine Endoglucanase, gebildet aus der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1, eine Cellobiohydrolase, gebildet aus der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2, und eine β-Glucosidase, gebildet aus der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 3, 56,7 % der Gesamtenzymmasse darstellten, um ein Verzuckerungsbehandlungsprodukt zu ergeben, dessen Glucosekonzentration gemessen wurde. Die Ergebnisse sind in 5 gezeigt.
[Beispiel 2-3]
In diesem Beispiel wurde eine Verzuckerungsbehandlung genau wie in Beispiel 2-1 durchgeführt, außer dass eine verzuckernde Enzymzusammensetzung so hergestellt wurde, dass eine Endoglucanase, gebildet aus der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1, eine Cellobiohydrolase, gebildet aus der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2, und eine β-Glucosidase, gebildet aus der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 3, 78,4 % der Gesamtenzymmasse darstellten, um ein Verzuckerungsbehandlungsprodukt zu ergeben, dessen Glucosekonzentration gemessen wurde. Die Ergebnisse sind in 5 gezeigt.
[Vergleichsbeispiel 2-1]
In diesem Vergleichsbeispiel wurde eine Verzuckerungsbehandlung genau wie in Beispiel 2-1 durchgeführt, außer dass eine verzuckernde Enzymzusammensetzung so hergestellt wurde, dass eine Endoglucanase, gebildet aus der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1, eine Cellobiohydrolase, gebildet aus der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2, und eine β-Glucosidase, gebildet aus der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 3, 13,5 % der Gesamtenzymmasse darstellten, um ein Verzuckerungsbehandlungsprodukt zu ergeben, dessen Glucosekonzentration gemessen wurde. Die Ergebnisse sind in 5 gezeigt.
[Vergleichsbeispiel 2-2]
In diesem Vergleichsbeispiel wurde eine Verzuckerungsbehandlung genau wie in Beispiel 2-1 durchgeführt, außer dass eine verzuckernde Enzymzusammensetzung so hergestellt wurde, dass eine Endoglucanase, gebildet aus der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1, eine Cellobiohydrolase, gebildet aus der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2, und eine β-Glucosidase, gebildet aus der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 3, 100 % der Gesamtenzymmasse darstellten, um ein Verzuckerungsbehandlungsprodukt zu ergeben, dessen Glucosekonzentration gemessen wurde. Die Ergebnisse sind in 5 gezeigt.
Wie in Vergleichsbeispiel 2-1 in 5 gezeigt, wird die Glucosekonzentration eines Verzuckerungsbehandlungsprodukts auch so gering wie 2,0 %, falls der prozentuale Anteil einer Endoglucanase, einer Cellobiohydrolase und einer β-Glucosidase der vorliegenden Erfindung so gering ist wie 13,5 %, bezogen auf die Gesamtenzymmasse. Dies ist schlüssig, da die Verzuckerungseffizienz wegen einer niedrigen Enzymkonzentration gering ist.
Dies bedeutet nicht, dass es umso besser ist, je höher der Gesamtgehalt einer Endoglucanase, einer Cellobiohydrolase und einer β-Glucosidase der vorliegenden Erfindung ist. Wie aus Vergleichsbeispiel 2-2 zu sehen, nimmt die Glucosekonzentration eines Verzuckerungsbehandlungsprodukts vielmehr auf 1,5 % ab, falls die verzuckernde Enzymzusammensetzung auf 100 % der Gesamtenzymmasse eingestellt wird.
Auf Lignocellulose basierende Biomasse besteht aus Cellulose und Hemicellulose, welche Celluloseoberflächen bedeckend vorkommt. Es wird angenommen, dass Hemicelluloseabbau fortschreitet, falls eine Hemicellulase vorhanden ist, und Verzuckerung effizienter abläuft und die Zuckerkonzentration eines Verzuckerungsbehandlungsprodukts in einer kurzen Zeitdauer zunimmt. Infolge dessen kann eine Verzuckerungsbehandlung effizienter durchgeführt werden in der Gegenwart einer Hemicellulase, wie beispielsweise Xylanase, zusätzlich zu einer Endoglucanase, einer Cellobiohydrolase und einer β-Glucosidase.
Deswegen liegt der Gesamtgehalt an einer Endoglucanase, einer Cellobiohydrolase und einer β-Glucosidase der vorliegenden Erfindung bevorzugt im Bereich von 30 bis 80 Massen-%. Falls der Gesamtgehalt der Enzyme innerhalb dieses Bereichs liegt, ist die Effizienz hoch und die Glucosekonzentration eines Verzuckerungsbehandlungsprodukts beträgt nicht weniger als ungefähr 2,4 %.
[Beispiel 3]
Als nächstes wurde das Massenverhältnis zwischen Enzymen in einer verzuckernden Enzymzusammensetzung untersucht.
[Beispiel 3-1]
Eine verzuckernde Enzymzusammensetzung wurde durch Mischen einer Endoglucanase, gebildet aus der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1, einer Cellobiohydrolase, gebildet aus der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2, einer β-Glucosidase, gebildet aus der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 3, einer Xylanase und einer β-Xylosidase in einem Massenverhältnis von 0,2 : 1: 0,2 : 0,2 : 0,2 hergestellt. Die Zusammensetzung wurde zu dem vorbehandelten Produkt auf eine Endkonzentration von 2 mg pro g Reisstroh zugegeben und die Mischung wurde einer Verzuckerungsbehandlung bei 50 °C für 72 Stunden unterworfen, um ein verzuckerungsbehandeltes Produkt zu erhalten. Einstellung einer verzuckerten Lösung und Messung einer Zuckerkonzentration wurden wie in Beispiel 1 durchgeführt. Das Mischungsverhältnis zwischen den entsprechenden Enzymen ist in Tabelle 4 gezeigt und die Ergebnisse sind in 6 gezeigt.
[Beispiel 3-2]
Messung einer Zuckerkonzentration wurde wie in Beispiel 1 durchgeführt, außer dass eine Endoglucanase, gebildet aus der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1, eine Cellobiohydrolase, gebildet aus der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2, eine β-Glucosidase, gebildet aus der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 3, eine Xylanase und eine β-Xylosidase in einem Massenverhältnis von 0,3 : 1 : 0,3 : 1,0 : 0,7 gemischt wurden. Das Mischungsverhältnis zwischen den entsprechenden Enzymen ist in Tabelle 4 gezeigt und die Ergebnisse sind in 6 gezeigt.
[Beispiel 3-3]
Messung einer Zuckerkonzentration wurde wie in Beispiel 1 durchgeführt, außer dass eine Endoglucanase, gebildet aus der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1, eine Cellobiohydrolase, gebildet aus der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2, eine β-Glucosidase, gebildet aus der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 3, eine Xylanase und eine β-Xylosidase in einem Massenverhältnis von 0,3 : 1 : 1,0 : 0,7 : 0,3 gemischt wurden. Das Mischungsverhältnis zwischen den entsprechenden Enzymen ist in Tabelle 4 gezeigt und die Ergebnisse sind in 6 gezeigt.
[Beispiel 3-4]
Messung einer Zuckerkonzentration wurde wie in Beispiel 1 durchgeführt, außer dass eine Endoglucanase, gebildet aus der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1, eine Cellobiohydrolase, gebildet aus der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2, eine β-Glucosidase, gebildet aus der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 3, eine Xylanase und eine β-Xylosidase in einem Massenverhältnis von 0,5 : 1 : 2,5 : 0,5 : 0,5 gemischt wurden. Das Mischungsverhältnis zwischen den entsprechenden Enzymen ist in Tabelle 4 gezeigt und die Ergebnisse sind in 6 gezeigt.
[Beispiel 3-5]
Messung einer Zuckerkonzentration wurde wie in Beispiel 1 durchgeführt, außer dass eine Endoglucanase, gebildet aus der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1, eine Cellobiohydrolase, gebildet aus der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2, eine β-Glucosidase, gebildet aus der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 3, eine Xylanase und eine β-Xylosidase in einem Massenverhältnis von 1,0 : 1 : 0,3 : 0,7 : 0,3 gemischt wurden. Das Mischungsverhältnis zwischen den entsprechenden Enzymen ist in Tabelle 4 gezeigt und die Ergebnisse sind in 6 gezeigt.
[Beispiel 3-6]
Messung einer Zuckerkonzentration wurde wie in Beispiel 1 durchgeführt, außer dass eine Endoglucanase, gebildet aus der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1, eine Cellobiohydrolase, gebildet aus der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2, eine β-Glucosidase, gebildet aus der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 3, eine Xylanase und eine β-Xylosidase in einem Massenverhältnis von 2,5 : 1 : 0,5 : 0,5 : 0,5 gemischt wurden. Das Mischungsverhältnis zwischen den entsprechenden Enzymen ist in Tabelle 4 gezeigt und die Ergebnisse sind in 6 gezeigt.
[Beispiel 3-7]
Messung einer Zuckerkonzentration wurde wie in Beispiel 1 durchgeführt, außer dass eine Endoglucanase, gebildet aus der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1, eine Cellobiohydrolase, gebildet aus der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2, eine β-Glucosidase, gebildet aus der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 3, eine Xylanase und eine β-Xylosidase in einem Massenverhältnis von 0,3 : 1 : 0,3 : 1,3 : 0,3 gemischt wurden. Das Mischungsverhältnis zwischen den entsprechenden Enzymen ist in Tabelle 4 gezeigt und die Ergebnisse sind in 6 gezeigt.
[Beispiel 3-8]

Messung einer Zuckerkonzentration wurde wie in Beispiel 1 durchgeführt, außer dass eine Endoglucanase, gebildet aus der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1, eine Cellobiohydrolase, gebildet aus der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2, eine β-Glucosidase, gebildet aus der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 3, eine Xylanase und eine β-Xylosidase in einem Massenverhältnis von 0,3 : 1 : 0,3 : 0,3 : 1,3 gemischt wurden. Das Mischungsverhältnis zwischen den entsprechenden Enzymen ist in Tabelle 4 gezeigt und die Ergebnisse sind in 6 gezeigt. [Tabelle 4]

	Endoglucanase	Cellobiohydrolase	β-Glucosidase	Xylanase	β-Xylosidase
Beispiel 3-1	0,2	1,0	0,2	0,2	0,2
Beispiel 3-2	0,3	1,0	0,3	1,0	0,7
Beispiel 3-3	0,3	1,0	1,0	0,7	0,3
Beispiel 3-4	0,5	1,0	2,5	0,5	0,5
Beispiel 3-5	1,0	1,0	0,3	0,7	0,3
Beispiel 3-6	2,5	1,0	0,5	0,5	0,5
Beispiel 3-7	0,3	1,0	0,3	1,3	0,3
Beispiel 3-8	0,3	1,0	0,3	0,3	1,3

Wie in 6 gezeigt, kann eine Verzuckerungsreaktion sehr effizient durchgeführt werden und immer zu einer Zuckerendkonzentration von 3,0 % oder höher führen, falls eine Endoglucanase, eine Cellobiohydrolase und eine β-Glucosidase der vorliegenden Erfindung in einem Massenverhältnis im Bereich von 0,2 bis 2,5 : 1 : 0,2 bis 2,5 gemischt werden.
Die Zugabemenge einer Xylanase oder einer Xylosidase beträgt bevorzugt 0,2 bis 1,3, bezogen auf das Masseverhältnis 1 einer Cellobiohydrolase.
Eine Enzymzusammensetzung, die ein Substrat trotz einer geringen Menge von Enzymen sehr effizient verzuckern kann, kann nun gemäß der vorliegenden Erfindung bereitgestellt werden durch Verwendung mehrerer Enzyme unter Berücksichtigung ihrer Bindung an ein Substrat und durch detailliertes Untersuchen des Massenverhältnisses zwischen ihnen.

Claims

Verzuckernde Enzymzusammensetzung zum Unterwerfen von auf Lignocellulose basierender Biomasse als Substrat einer Verzuckerungsbehandlung, wobei die verzuckernde Enzymzusammensetzung eine Endoglucanase, welche die Aminosäuresequenz nach SEQ ID NO: 1 umfasst, eine Cellobiohydrolase, welche die Aminosäuresequenz nach SEQ ID NO: 2 umfasst, und eine β-Glucosidase, welche die Aminosäuresequenz nach SEQ ID NO: 3 umfasst, umfasst, welche aus einem Acremonium cellulolyticus H1-Stamm erhalten wurden.
Verzuckernde Enzymzusammensetzung nach Anspruch 1, weiterhin umfassend eine Xylanase oder eine Xylosidase.
Verzuckernde Enzymzusammensetzung nach Anspruch 2, wobei der Gesamtgehalt der Endoglucanase, der Cellobiohydrolase und der β-Glucosidase im Bereich von 30 bis 80 Massen-% liegt, bezogen auf die Gesamtmasse der verzuckernden Enzymzusammensetzung.
Verzuckernde Enzymzusammensetzung nach Anspruch 3, wobei die verzuckernde Enzymzusammensetzung die Endoglucanase, die Cellobiohydrolase und die β-Glucosidase in einem Massenverhältnis im Bereich von 0,2 bis 2,5 : 1 : 0,2 bis 2,5 umfasst.
Verfahren zum Herstellen einer verzuckerten Lösung, umfassend Zugeben eines verzuckernden Enzyms zu auf Lignocellulose basierender Biomasse als Substrat, um eine Mischung aus Substrat und verzuckerndem Enzym zu bilden, und dann Unterwerfen der Mischung aus Substrat und verzuckerndem Enzym einer Verzuckerungsbehandlung, um eine verzuckerte Lösung zu erzeugen; wobei als das verzuckernde Enzym mindestens eine Endoglucanase, welche die Aminosäuresequenz nach SEQ ID NO: 1 umfasst, eine Cellobiohydrolase, welche die Aminosäuresequenz nach SEQ ID NO: 2 umfasst, und eine β-Glucosidase, welche die Aminosäuresequenz nach SEQ ID NO: 3 umfasst, welche aus einem Acremonium cellulolyticus H1-Stamm erhalten wurden, gleichzeitig zu dem Substrat zugegeben werden.
Verfahren zum Herstellen einer verzuckerten Lösung, umfassend Zugeben eines verzuckernden Enzyms zu auf Lignocellulose basierender Biomasse als Substrat, um eine Mischung aus Substrat und verzuckerndem Enzym zu bilden, und dann Unterwerfen der Mischung aus Substrat und verzuckerndem Enzym einer Verzuckerungsbehandlung, um eine verzuckerte Lösung zu erzeugen; wobei als das verzuckernde Enzym mindestens eine Endoglucanase, welche die Aminosäuresequenz nach SEQ ID NO: 1 umfasst, zu dem Substrat gegeben wird, und danach mindestens eine Cellobiohydrolase, welche die Aminosäuresequenz nach SEQ ID NO: 2 umfasst, und eine β-Glucosidase, welche die Aminosäuresequenz nach SEQ ID NO: 3 umfasst, zugegeben werden, wobei die Endoglucanase, die Cellobiohydrolase und die β-Glucosidase aus einem Acremonium cellulolyticus H1-Stamm erhalten wurden.
Stamm, welcher ein Acremonium cellulolyticus H1- Stamm der Zugangsnummer FERM-BP-11508 ist.