CN104093832A - 糖化酶组合物及使用该糖化酶组合物的糖化溶液的配制方法 - Google Patents

糖化酶组合物及使用该糖化酶组合物的糖化溶液的配制方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种以较少的使用量即可获得优异的糖化性能的糖化酶组合物以及使用了该糖化酶组合物的糖化溶液的配制方法。糖化酶组合物对作为基质的木质纤维素类生物质进行糖化处理。糖化酶组合物含有：不含纤维素结合结构域的内切葡聚糖酶、含纤维素结合结构域的纤维二糖水解酶以及含纤维素结合结构域的β-葡萄糖苷酶。

Description

糖化酶组合物及使用该糖化酶组合物的糖化溶液的配制方法
技术领域
本发明涉及糖化酶组合物及使用该糖化酶组合物的糖化溶液的配制方法。
背景技术
近年来，人们正在研究将乙醇汽油(ethanol gasoline)混合燃料用作汽车燃料。人们认为在将通过植物性物质的发酵、蒸馏而得到的生物乙醇作为所述乙醇使用时，能够通过严密地进行土壤管理，获得所谓的碳中和效果，减轻二氧化碳的排出量，从而能够有助于防止地球温暖化。
然而，当例如使用甘蔗(sugarcane)、玉米等农作物作为所述植物性物质时，由于该农作物作为乙醇的原料被大量消耗，因此存在食物或饲料的供应量减少的问题。因此，人们在研究采用不构成食用或饲料用途的木质纤维素类(lignocellulose type)生物质作为所述植物性物质来制造乙醇的技术。
所述木质纤维素类生物质由于含有纤维素(cellulose)，通过使用糖化酶对该纤维素进行糖化处理而分解成葡萄糖，使得到的葡萄糖发酵，能够获得乙醇。以往，作为这种糖化酶，例如已知有来自高纤维素分解酶生产菌(Acremonium cellulolyticus)的纤维素酶(Cellulase)(例如参照专利文献1)。
由于所述糖化酶价格昂贵，在制造所述乙醇中，为了降低该糖化酶的使用量，将作为基质的木质纤维素类生物质调制成低浓度。但是，将所述基质调制成低浓度时，制得的糖化溶液也形成低浓度，进而对该糖化溶液进行发酵而得的乙醇也形成低浓度。其结果是，为了浓缩制得的乙醇而对其进行蒸馏时，存在蒸馏所需时间和热能增加的问题。
为了解决上述问题，可以考虑采用以下方法：通过将所述基质调制成高浓度并同时增加所述糖化酶的使用量，制成高浓度的乙醇，由此降低乙醇浓缩及蒸馏等所需的能量，从而提高整体的能量效率。然而，在这种情况下，由于所述糖化酶价格昂贵，增加其使用量时，存在成本上升的问题。
因此，为了解决上述问题，人们希望在维持糖化效率的同时降低糖化酶的使用量。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本专利公开2010－148427号公报
发明内容
本发明要解决的技术问题
但是，在仅仅是降低糖化酶总量的情况下，存在糖化效率与糖化酶的量成比例下降的缺陷。
本发明的目的在于提供一种能够解决上述缺陷并在较少的使用量下即可获得优异糖化性能的糖化酶组合物。
另外，本发明的目的还在于提供一种使用了所述糖化酶组合物的糖化溶液的调制方法。
解决技术问题的技术手段
本发明的发明者们经研究发现：从高纤维素分解酶生产菌中提取的纤维素酶(cellulase)是一种由各种纤维素酶构成的混合物，在木质纤维素类生物质的糖化中不显示优异效果的纤维素酶也包含其中。
因此，仅仅是降低所述纤维素酶的混合物总量，在木质纤维素类生物质的糖化中显示出优异效果的纤维素酶以及不显示优异效果的纤维素酶一律减少，糖化效率与糖化酶的量成比例下降。
本发明的发明者们对所述纤维素酶的混合物中含有的各纤维素酶针对木质纤维类生物质的糖化性能进行了各种研究。其结果是，发现由特定的纤维素酶的组合构成的糖化酶组合物在木质纤维类生物质的糖化中显示了优异的性能，从而完成了本发明。
即，本发明的特征在于，在对作为基质的木质纤维类生物质进行糖化处理的糖化酶组合物中含有：不含纤维素结合结构域(cellulosebinding domain)的内切葡聚糖酶(endoglucanase)、含纤维素结合结构域的纤维二糖水解酶(cellobiohydrolase)以及含纤维素结合结构域的β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase)。
这里，所述内切葡聚糖酶是将纤维素从该纤维素的内部区域水解成较为短链的β-1,4-葡聚糖的糖化酶。另外，所述纤维二糖水解酶是将纤维素或较为短链的β-1,4-葡聚糖从该纤维素或较为短链的β-1,4-葡聚糖的末端水解成纤维二糖(cellobiose)的糖化酶。另外，所述β-葡萄糖苷酶是将纤维二糖水解成葡萄糖(glucose)的糖化酶。纤维素结合结构域是指用于让糖化酶与纤维素的表面结合的结构。
根据本发明的糖化酶组合物，首先，所述内切葡聚糖酶对木质纤维素类生物质产生作用。由于所述内切葡聚糖酶不含纤维素结合结构域，因而不与作为基质的木质纤维素类生物质中含有的纤维素的表面特定部位结合，而在所述纤维素的分子链的较大范围内与不特定部位接触，从而能够产生较为短链的β-1,4-葡聚糖。
另一方面，如果内切葡聚糖酶含有纤维素结合结构域，则该内切葡聚糖酶即使将纤维素水解成较为短链的β-1,4-葡聚糖后，也只是停留在该水解的反应部位内。其结果是，内切葡聚糖酶与其他的纤维素接触的机会下降，导致生成较为短链的β-1,4-葡聚糖的效率下降。
由于所述纤维二糖水解酶含有纤维素结合结构域，因而该纤维二糖水解酶通常与纤维素结合，从纤维素的末端对该纤维素进行水解，生成纤维二糖。而当较为短链的β-1,4-葡聚糖存在时，所述纤维二糖水解酶与较为短链的β-1,4-葡聚糖也发生结合，从该β-1,4-葡聚糖的末端进行水解，产生纤维二糖。因此，通过所述内切葡聚糖酶产生较为短链的β-1,4-葡聚糖时，所述纤维二糖水解酶的反应开始点增大，该纤维二糖水解酶促进纤维二糖的生成。
另外，由于所述β-葡萄糖苷酶也含有纤维素结合结构域，在所述纤维二糖水解酶生成纤维二糖时的反应部位中，该β-葡萄糖苷酶也存在。因此，能够通过β-葡萄糖苷酶将通过所述纤维二糖水解酶生成的纤维二糖快速地水解成葡萄糖。
因此，根据本发明的糖化酶组合物，所述内切葡聚糖酶、所述纤维二糖水解酶以及所述β-葡萄糖苷酶共同协作，对作为基质的木质纤维素类生物质中含有的纤维素进行糖化，由此能够提高糖化效率，用较少的使用量即可获得优异的糖化性能。
另外，本发明的糖化酶组合物的所述β-葡萄糖苷酶中含有的纤维素结合结构域，优选是相对所述纤维二糖水解酶中含有的纤维素结合结构域的氨基酸序列显示70％以上的同源性的氨基酸序列构成。
纤维素结合结构域的氨基酸序列的同源性越高，与纤维素或较为短链的β-1,4-葡聚糖的表面结合时在同一部位上结合的几率越大。因此，当采用含有氨基酸序列具有70％以上的同源性的纤维素结合结构域的所述纤维二糖水解酶及所述β-葡萄糖苷酶时，在该纤维二糖水解酶生成纤维二糖时，该β-葡萄糖苷酶存在于相同的反应部位中的几率增大。
因此，根据本发明的糖化酶组合物，所述内切葡聚糖酶、所述纤维二糖水解酶以及所述β-葡萄糖苷酶共同协作，能够更为高效地进行糖化。
另一方面，当所述同源性不足70％时，所述纤维二糖水解酶和所述β-葡萄糖苷酶无法充分地存在于相同的反应部位。
在本发明的糖化酶组合物中，优选是所述内切葡聚糖酶、所述纤维二糖水解酶以及所述β-葡萄糖苷酶相对该糖化酶组合物总质量的总含量是30质量％～80质量％的范围。
当所述内切葡聚糖酶、所述纤维二糖水解酶以及所述β-葡萄糖苷酶相对所述糖化酶组合物的总质量的总含量是80质量％以上时，所述糖化酶组合物的糖化效率反而下降。因此，所述糖化酶组合物优选含有木聚糖酶(xylanase)等半纤维素酶(Hemicellulase)。另外，当所述内切葡聚糖酶、所述纤维二糖水解酶以及所述β-葡萄糖苷酶相对所述糖化酶组合物的总质量的总含量不足30质量％时，该糖化酶组合物无法获得足够的糖化性能。
作为本发明的糖化酶组合物的所述内切葡聚糖酶，例如可以举出通过由序列号1表示的氨基酸序列构成的糖化酶。另外，作为本发明的糖化酶组合物的所述纤维二糖水解酶，例如可以举出通过由序列号2表示的氨基酸序列构成的糖化酶。此外，作为本发明的糖化酶组合物的所述β-葡萄糖苷酶，例如可以举出通过由序列号3表示的氨基酸序列构成的糖化酶。
另外，本发明的糖化酶组合物优选是以质量比0.2～2.5:1:0.2～2.5的范围含有所述内切葡聚糖酶、所述纤维二糖水解酶以及所述β-葡萄糖苷酶。
当所述内切葡聚糖酶相对所述纤维二糖水解酶的质量比不足0.2时，纤维素通过所述内切葡聚糖酶生成较为短链的β-1,4-葡聚糖时的生成速度相对较为短链的β-1,4-葡聚糖通过所述纤维二糖水解酶生成纤维素时的生成速度过小，无法获得足够的糖化效果。
而另一方面，当所述内切葡聚糖酶相对所述纤维二糖水解酶的质量比超过2.5时，纤维素通过所述内切葡聚糖酶生成较为短链的β-1,4-葡聚糖时的生成速度相对较为短链的β-1,4-葡聚糖通过所述纤维二糖水解酶生成纤维素时的生成速度过大，无法获得足够的糖化效果。
另外，当所述β-葡萄糖苷酶相对所述纤维二糖水解酶的质量比不足0.2时，纤维二糖通过所述β-葡萄糖苷酶生成葡萄糖时的生成速度相对较为短链的β-1,4-葡聚糖通过所述纤维二糖水解酶生成纤维二糖时的生成速度过小，无法获得足够的糖化效果。
而另一方面，当所述β-葡萄糖苷酶相对所述纤维二糖水解酶的质量比超过2.5时，纤维二糖通过所述β-葡萄糖苷酶生成葡萄糖时的生成速度相对较为短链的β-1,4-葡聚糖通过所述纤维二糖水解酶生成纤维二糖时的生成速度过大，无法获得足够的糖化效果。
另外，本发明的糖化酶组合物可以进一步含有木聚糖酶或木糖苷酶(xylosidase)。通过含有木聚糖酶或木糖苷酶，所述糖化酶组合物能够将作为基质的木质纤维素类生物质中含有的半纤维素糖化，从而获得木糖(xylose)。因此，能够提升作为基质的木质纤维素类生物质的糖化率。
另外，本发明的糖化溶液的配制方法是在作为基质的木质纤维素类生物质中添加糖化酶，制成基质和糖化酶混合物，对所述基质和糖化酶混合物进行糖化处理，从而制得糖化溶液，该糖化溶液的配制方法的特征在于：在所述基质中，至少同时添加作为所述糖化酶的不含纤维素结合结构域的内切葡聚糖酶、含纤维素结合结构域的纤维二糖水解酶以及含纤维素结合结构域的β-葡萄糖苷酶。
像这样同时添加糖化酶时，首先所述内切葡聚糖酶与木质纤维素类生物质中含有的纤维素发生作用。由于所述内切葡聚糖酶不含纤维素结合结构域，在被添加到所述基质中时，不与所述纤维素的表面的特定部位结合，而在该纤维素的分子链的较大范围内与不特定部位接触，生成较为短链的β-1,4-葡聚糖。
由于所述纤维二糖水解酶含纤维素结合结构域，因而该纤维二糖水解酶通常与纤维素结合，对该纤维素从该纤维素的末端进行水解，从而生成纤维二糖。而当较为短链的β-1,4-葡聚糖存在时，所述纤维二糖水解酶与较为短链的β-1,4-葡聚糖也发生结合，从该β-1,4-葡聚糖的末端进行水解，生成纤维二糖。因此，通过所述内切葡聚糖酶产生较为短链的β-1,4-葡聚糖时，所述纤维二糖水解酶的反应开始点增大，该纤维二糖水解酶促进纤维二糖的生成。
另外，由于β-葡萄糖苷酶也含纤维素结合结构域，在所述纤维二糖水解酶生成纤维二糖时的反应部位中，该β-葡萄糖苷酶也同时存在。所以，能够通过β-葡萄糖苷酶将通过所述纤维二糖水解酶生成的纤维二糖快速地水解成葡萄糖。
根据本发明的糖化溶液的配制方法，由于所述内切葡聚糖酶、所述纤维二糖水解酶和所述β-葡萄糖苷酶共同协作，对木质纤维素类生物质中含有的纤维素进行糖化，因此能够高效地制得糖浓度较高的糖化溶液。
另外，本发明的糖化溶液的配制方法是在作为基质的木质纤维素类生物质中添加糖化酶，制成基质和糖化酶混合物，对所述基质和糖化酶混合物进行糖化处理，从而制得糖化溶液，该糖化溶液的配制方法的特征在于：在所述基质中至少添加作为所述糖化酶的不含纤维素结合结构域的内切葡聚糖酶后，至少添加含纤维素结合结构域的纤维二糖水解酶以及含纤维素结合结构域的β-葡萄糖苷酶。
像这样在先添加所述内切葡聚糖酶时，所述纤维二糖水解酶以及所述β-葡萄糖苷酶不存在于所述内切葡聚糖酶的反应部位中。因此，由于先被添加的所述内切葡聚糖酶相对纤维素的分子链能够高效地进行接触，能够优先对木质纤维素类生物质中含有的纤维素进行水解，从而生成较为短链的β-1,4-葡聚糖。
这样，与同时添加所述内切葡聚糖酶、所述纤维二糖水解酶以及所述β-葡萄糖苷酶的情形相比，在添加所述纤维二糖水解酶和所述β-葡萄糖苷酶时，较为短链的β-1,4-葡聚糖的数量增加。因此，所述内切葡聚糖酶能够简单地将所述较为短链的β-1,4-葡聚糖水解成纤维二糖。
另外，所述β-葡萄糖苷酶因纤维素结合结构域的作用而存在于基于所述纤维二糖水解酶的水解的反应部位中，因此能够高效地对所述纤维二糖进行水解，从而生成葡萄糖。
因此，根据本发明的糖化溶液，通过先添加所述内切葡聚糖酶，然后添加所述纤维二糖水解酶和所述β-葡萄糖苷酶，能够进一步高效地制成糖浓度高的糖化溶液。
附图说明
图1是表示本发明的糖化溶液的配制方法的一个实施方式的流程图。
图2是表示能够提取本发明的糖化酶组合物的菌株的菌落直径和AZCL晕直径的图表。
图3是表示能够提取本发明的糖化酶组合物的菌株的CMC分解活性的图表。
图4是表示本发明的糖化酶的糖化性能的图表。
图5是表示相对本发明的糖化酶组合物总质量的含量对葡萄糖生成产生的影响的研究结果的图表。
图6是表示本发明的糖化酶组合物中的内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶、β-葡萄糖苷酶、木聚糖酶以及β-木糖苷酶(β-xylosidase)的质量比对糖生成产生的影响的研究结果的图表。
具体实施方式
接着，参照附图就本发明的实施方式进行进一步详细说明。
图1中表示使用作为基质的木质纤维素类生物质制造乙醇时的糖化处理步骤。
在上述糖化处理中，首先，对作为基质的木质纤维素类生物质中的一种的稻秆进行粗粉碎，将氨水混合到被粗粉碎的稻秆中，制成含稻秆和氨的基质混合物。这里，所述氨水的浓度范围是20质量/体积％～30质量/体积％。所述基质混合物优选是相对所述氨水含有20质量％～70质量％范围的稻秆。
接着，在25℃～100℃范围的温度下，将制成的所述基质混合物保持2小时～200小时范围，实施糖化前处理。其结果是，木质素(lignin)从作为所述基质的稻秆中解离或者稻秆湿润膨胀，从而获得含氨糖化前处理物。
另外，在本实施方式中，解离是指与纤维素等结合的木质素的结合部位中，至少一部分结合被切断的现象。另外，湿润膨胀是指构成结晶性纤维素的纤维素等因液体侵入而产生空隙、或者在纤维素纤维内部产生空隙而膨胀的现象。
然后，从所述含氨糖化前处理物中释放出氨，将氨分离，从而制得氨分离糖化前处理物。接着，将氨分离糖化前处理物的pH调整到糖化酶能够起作用的范围，例如pH3～pH7的范围。
接着，向所述被调整了pH的所述氨分离糖化前处理物中添加糖化酶，调制基质和糖化酶混合物，并将该基质和糖化酶混合物在30℃～60℃温度范围内保持50小时～150小时，进行糖化处理。通过所述糖化处理，所述基质和糖化酶混合物中含有的纤维素因所述糖化酶的作用被水解。其结果是，能够得到含葡萄糖等糖的糖化溶液。
这里，在本实施方式的糖化溶液的配制方法中，采用下述糖化酶组合物作为所述糖化酶。该糖化酶组合物含有不含纤维素结合结构域的内切葡聚糖酶、含纤维素结合结构域的纤维二糖水解酶以及含纤维素结合结构域的β-葡萄糖苷酶。
本实施方式中使用的所述内切葡聚糖酶、所述纤维二糖水解酶以及所述β-葡萄糖苷酶例如可以通过下述方法制得。
首先，作为变异前培养步骤，将高纤维素分解酶生产菌(acremonium cellulolyticus)TN菌株(独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心，保藏号：FERM-BP-685，以下简记作“TN菌株”)植菌到具有表1中所示组成的培养液中，在30℃下培养一晚。接着，作为变异处理步骤，将上述培养后的TN菌株涂敷到具有表2中所示组成的固体培养基的表面上，通过照射紫外线，获得变异处理菌株。然后，作为变异后培养步骤，在30℃温度下培养所述变异处理菌株7天。
(表1)
组成 浓度(质量/体积％)
稻秆 5.0
KH2PO4 0.2
(NH4)2SO4 0.14
尿素 0.4
聚氧乙烯山梨醇酐单油酸酯 0.1
MgSO4·7H2O 0.03
ZnSO4·7H2O 0.007
MnSO4·6H2O 0.001
CuSO4·7H2O 0.005
(表2)
组成 浓度(质量/体积％)
稻秆 1.0
AZCL-He-纤维素 0.02
醋酸缓冲溶液(pH4) 20(mM)
琼脂 2.0
这里，作为所述固体培养基含有的生色底物的AZCL-HE-CELLULOSE(商品名称：Megazyme公司制造)是被糖化酶分解时生色成蓝色的物质。因此，所述变异处理菌株通过所述培养产生糖化酶时，AZCL-HE-CELLULOSE被该糖化酶分解，在该变异处理菌株的菌落(colony)周围形成蓝色圆(以下称“AZCL晕(AZCLhalo)”)，该蓝色圆的大小对应该生成的糖化酶的量。
因此，将所述AZCL晕的大小最大的菌落作为菌种，在再次重复所述变异前培养步骤、变异处理步骤及变异后培养步骤后，根据获得的菌落的大小及其周围形成的AZCL晕的大小选择多个所述菌落。
接着，将前述选择的菌落的菌株及TN菌株植菌到新的所述固体培养基中，在30℃下培养7天。测定菌落直径及AZCL晕直径，同时计算出AZCL晕直径/菌落直径的数值。
另外，将所述选择的菌落的菌株及TN菌株植菌到新的所述培养液中，在30℃下进行培养，在pH5.5及30℃的条件下开始培养，然后分别测定在第7天、第10天、第11天、第12天、第13天、第14天及第17天的羧甲基纤维素(CMC)的分解活性。所述CMC分解活性通过以下方式测定。
首先，在10μl的含糖化酶的水溶液试料中，加入190μl的200mM的醋酸缓冲溶液(pH5.5)和200μl的1质量/体积％的CMC(Merck公司制造，型号：1.02331.0500)水溶液，在30℃的温度下让其反应15分钟。
然后，在所述反应后的溶液中加入400μl的含有30质量/体积％的酒石酸钠钾(rochelle salt)、1质量/体积％的二硝基水杨酸(Dinitrosalicylic acid)以及1.6质量/体积％的氢氧化钠的水溶液,在100℃下处理5分钟。接着，测定制得的溶液相对波长540nm的光线的吸光度，将葡萄糖作为标准物质，计算出洗脱后的还原糖的浓度。这里，将1分钟释放出1μmol的还原糖的酶量设定为1U。
并且，从所述挑选的菌落中选出所述计算出的AZCL晕直径/菌落直径的数值最大以及CMC分解活性的数值最大的菌落，作为高纤维素分解酶生产菌H1菌株(独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心，保藏号：FERM-P-22164，以下简记作“H1菌株”)，并作为本实施方式中用于提取糖化酶组合物的菌株。
H1菌株及TN菌株的菌落的直径、AZCL晕直径以及AZCL晕直径/菌落直径的数值示于图2中。另外，将H1菌株和TN菌株的CMC分解活性值的历时变化示于图3中。
从图2(a)中明显可知：H1菌株的菌落与TN菌株的菌落相比，AZCL晕直径增大。因此，显然H1菌株与TN菌株相比生成较多糖化酶。
另外，从图2(b)中明显可知：H1菌株的菌落与TN菌株的菌落相比，AZCL晕直径/菌落直径的数值大约是两倍。因此，显然H1菌株相对TN菌株而言，每个菌株的糖化酶活性较高。
另外，从图3中明显可知：H1菌株与TN菌株相比，在培养期间的任一期间中，CMC分解活性明显增高。由于CMC分解活性是作为表示纤维素分解活性的指标使用的，因此H1菌株相对TN菌株而言，显然更能够生成优异的糖化酶。
接着，对从H1菌株中提取在本实施方式中使用的作为糖化酶的内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶以及β-葡萄糖苷酶的方法进行说明。
首先，在具有表3中所示组成的培养液中植菌H1菌株，在30℃下培养14天。并且，用孔径0.2μm的过滤器对实施了所述培养的培养液进行过滤。
(表3)
组成 浓度(质量/体积％)
氨分离糖化前处理物 5.0
(NH4)2SO4 0.5
尿素 0.4
KH2PO4 2.4
MgSO4·7H2O 0.12
ZnSO4·7H2O 0.001
MnSO4·6H2O 0.001
CuSO4·7H2O 0.001
聚氧乙烯山梨醇酐单油酸酯 0.1
接着，通过填充了阴离子交换载体(商品名称：TOYOPEARLQAE-550C，东曹公司(Tosoh Corporation)制造)的第一分离柱(separation column)(商品名称：Bio-Rad层析柱(econo-column)，Bio-rad Laboratories株式会社制造，直径5.0cm×长度50.0cm)将获得的过滤液分离，对应洗脱时间获得馏分(fraction)Q1～Q12。
然后，在50℃下对获得的所述馏分Q1加热处理24小时后，进行离心分离(9460×g，20分钟)，用孔径0.2μm的过滤器对获得的上清液过滤。用第二分离柱(商品名称：Mono S5.50L柱，GE HealthcareJapan株式会社制造)对获得的过滤液进行分离，对应洗脱时间获得馏分S1～S9。然后，从所述馏分S3中获得不含纤维素结合结构域的内切葡聚糖酶。所述内切葡聚糖酶是通过由序列号1表述的氨基酸序列构成的糖化酶。
接着，用填充了疏水性载体(商品名称：TOYOPEARLButyl-650M，东曹公司制造)的第三分离柱(商品名称：XK26/20柱，GE Healthcare Japan株式会社制造，直径2.6cm×长度20cm)对所述馏分Q3进行分离，对应洗脱时间获得馏分B1～B8。
然后，从所述馏分B7中获得含纤维素结合结构域的纤维二糖水解酶。所述纤维二糖水解酶是通过由序列号2表述的氨基酸序列构成的糖化酶。另外，从所述馏分B8中获得含纤维素结合结构域的β-葡萄糖苷酶。所述β-葡萄糖苷酶是通过由序列号3表述的氨基酸序列构成的糖化酶。
通过上述方式得到的所述内切葡聚糖酶、所述纤维二糖水解酶以及所述β-葡萄糖苷酶的氨基酸序列，使用Pfam数据库作为Motif文库(motif library)对纤维素结合结构域进行同源性检索。
其结果，判明了所述纤维二糖水解酶的序列号2表述的氨基酸序列中第497号至第529号的氨基酸序列是纤维素结合结构域。并判明了所述β-葡萄糖苷酶的序列号3表述的氨基酸序列中第780号至第812号的氨基酸序列是纤维素结合结构域。判明所述内切葡聚糖酶不含纤维素结合结构域。
接着，例如采用NCBI(National Center for BiotechnologyInformation)站点的Blast检索对所述纤维二糖水解酶和所述β-葡萄糖苷酶的纤维素结合结构域的氨基酸序列进行同源性评价时，发现具有24/33、即72.7％的同源性。
氨基酸序列的同源性越高，纤维素结合结构域与纤维素或较为短链的β-1,4-葡聚糖的表面结合时，在同一部位上结合的几率增大。因此，通过使用含有氨基酸序列具有72.7％的同源性的纤维素结合结构域的所述纤维二糖水解酶和所述β-葡萄糖苷酶，在该纤维二糖水解酶生成纤维二糖时，该β-葡萄糖苷酶在相同的反应部位存在的几率增大。
所以，根据本实施方式的糖化酶组合物，所述内切葡聚糖酶、所述纤维二糖水解酶以及所述β-葡萄糖苷酶能够共同协作，从而更为高效地进行糖化。
本实施方式的糖化酶组合物被设定成通过所述方式制得的所述内切葡聚糖酶、所述纤维二糖水解酶以及所述β-葡萄糖苷酶相对所述糖化酶组合物总质量的总含量是30质量％～80质量％的范围。另外，本实施方式的糖化酶组合物采用通过所述方式制得的所述内切葡聚糖酶、所述纤维二糖水解酶以及所述β-葡萄糖苷酶以质量比0.2～2.5:1:0.2～2.5的范围的组合。
在本实施方式的糖化溶液的配制方法中，与构成所述糖化酶组合物的所述内切葡聚糖酶、所述纤维二糖水解酶以及所述β-葡萄糖苷酶同时添加被调整了pH的所述氨分离糖化前处理物。
通过采用这种方式，由于所述内切葡聚糖酶、所述纤维二糖水解酶及所述β-葡萄糖苷酶能够共同协作，对木质纤维素类生物质中含有的纤维素进行糖化，从而能够效率良好地制得葡萄糖等糖浓度高的糖化溶液。
在本实施方式中，与构成所述糖化酶组合物的所述内切葡聚糖酶、所述纤维二糖水解酶及所述β-葡萄糖苷酶同时添加被调整了pH的所述氨分离糖化前处理物。但是，也可以先只将所述内切葡聚糖酶添加到被调整了pH的所述氨分离糖化前处理物中，在进行规定时间的酶糖化处理之后，再添加所述纤维二糖水解酶和所述β-葡萄糖苷酶。
根据本发明的糖化溶液的配制方法，通过先添加所述内切葡聚糖酶，再添加所述纤维二糖水解酶和所述β-葡萄糖苷酶，能够进一步高效地制得糖浓度高的糖溶液。
另外，本实施方式中，采用了仅由不含纤维素结合结构域的内切葡聚糖酶、含纤维素结合结构域的纤维二糖水解酶以及含纤维素结合结构域的β-葡萄糖苷酶构成的糖化酶组合物。但是，该糖化酶组合物还可以进一步含有木聚糖酶或木糖苷酶。
通过含有木聚糖酶或木糖苷酶，由于能够将木质纤维素类生物质中含有的半纤维素酶糖化成木糖，能够提高木质纤维素类生物质的糖化率。
接着，示出本发明的实施例及比较例。
实施例
(实施例1)
在本实施例中，首先在对作为基质的木质纤维素类生物质、即稻秆进行了细碎后的材料中，以质量比成为1:2.5的形式混合25％质量的氨水，制得含有稻秆及氨的基质混合物。接着，在80℃温度下保持所述基质混合物8小时，进行糖化处理。然后，分离氨，并将pH调整成4.0。并且调整稻秆含量成为20体积％，从而制成本实施例的糖化前处理物。
接着，以0.3:1:0.3:1.0:0.7的质量比，混合由序列号1表述的氨基酸序列构成的内切葡聚糖酶、由序列号2表述的氨基酸序列构成的纤维二糖水解酶、由序列号3表述的氨基酸序列构成的β-葡萄糖苷酶、木聚糖酶(湿热子囊菌(Thermoascus aurantiacus)来源的内切1,4-β-木聚糖酶(endo-1,4-beta-xylanase A),GenBank ACCESSIONNo.AAF24127)以及β-木糖苷酶(海栖热袍杆菌(Thermotoga maritima)来源的β-木糖苷酶(β-xylosidase),株式会社耐热性酶研究所制造)，调制成糖化酶组合物。将该糖化酶组合物加入到所述前处理物中，使得该糖化酶组合物的最终浓度成为2mg/1g稻秆。并在50℃温度下，糖化处理72小时，制成糖化处理物。这里，使用特定的菌来源的木聚糖酶以及β-木糖苷酶。但是，只要是具有内切木聚糖酶活性和β木糖苷酶活性的糖化酶，可以使用任意一种糖化酶。接着，在95℃温度下对所述糖化溶液热处理5分钟后，在15,760×g以及4℃温度下，离心分离5分钟后，将上清液移入新的1.5mL的微量离心管(eppendorftube)中。在用孔径0.2μm的过滤器进行过滤后，通过HPLC测定糖浓度。
所述高效液相色谱(HPLC)采用隔离器(separator)(商品名称：Waters2695，日本ウォーターズ(waters)株式会社制造)、RI检测器(商品名称：Waters2414，日本waters株式会社制造)以及分离柱(商品名称：HPX-87P column，Bio-rad Laboratories株式会社制造)，在柱温度85℃，检测器温度40℃的条件下，以超纯水为洗脱液(eluent)，并以0.6ml/min的流量测定糖浓度。结果示于图4。图4中将葡萄糖和木糖的总糖浓度作为糖浓度进行表示。
(比较例1)
在本比较例中，除了使用市售的糖化酶(商品名称：高纤维素分解酶生产菌(acremonium cellulolyticus)，Meiji Seika Pharma株式会社制造)以外，其余的以与实施例1完全相同的方式配制糖化溶液，测定该糖化溶液的葡萄糖浓度。结果示于图4中。
如图4所示，使用由所述内切葡聚糖酶、所述纤维二糖水解酶以及所述β-葡萄糖苷酶构成的糖化酶组合物，制成的实施例中的糖化溶液的糖浓度是3.8质量/体积％，使用所述高纤维素分解酶生产菌(商品名称)制成的比较例的糖化溶液的糖浓度是2.3质量/体积％。
所以，明显可知实施例的糖化酶组合物与比较例的糖化酶组合物相比，通过规定时间的酶糖化处理，制成的糖化溶液中的糖浓度能够增加到大约1.7倍。换言之，由于实施例中的糖化酶组合物相对比较例中的糖化酶的容量少1.7倍，能够制成同等糖浓度的糖化溶液，明显可知在较少的糖化酶使用量下，就能够获得优异的糖化性能。
(实施例2)
接着，对本发明的酶的总含量进行了研究。
(实施例2-1)
在本实施例中，以0.3:1:0.3的质量比，混合由序列号1表述的氨基酸序列构成的内切葡聚糖酶、由序列号2表述的氨基酸序列构成的纤维二糖水解酶以及由序列号3表述的氨基酸序列构成的β-葡萄糖苷酶，调制糖化酶组合物使得其相对整体酶质量是35.1％，除此以外，通过与实施例1完全相同的方式进行糖化处理，制成糖化处理物，测定了葡萄糖浓度。结果示于图5中。
(实施例2-2)
在本实施例中，将由序列号1表述的氨基酸序列构成的内切葡聚糖酶、由序列号2表述的氨基酸序列构成的纤维二糖水解酶以及由序列号3表述的氨基酸序列构成的β-葡萄糖苷酶，调制糖化酶组合物使得其相对整体酶质量是56.7％，除此以外，通过与实施例2-1完全相同的方式进行糖化处理，制成糖化处理物，测定了葡萄糖浓度。结果示于图5中。
(实施例2-3)
在本实施例中，将由序列号1表述的氨基酸序列构成的内切葡聚糖酶、由序列号2表述的氨基酸序列构成的纤维二糖水解酶以及由序列号3表述的氨基酸序列构成的β-葡萄糖苷酶，调制糖化酶组合物使得其相对整体酶质量是78.4％，除此以外，通过与实施例2-1完全相同的方式进行糖化处理，制成糖化处理物，测定了葡萄糖浓度。结果示于图5中。
(比较例2-1)
在本比较例中，将由序列号1表述的氨基酸序列构成的内切葡聚糖酶、由序列号2表述的氨基酸序列构成的纤维二糖水解酶以及由序列号3表述的氨基酸序列构成的β-葡萄糖苷酶，调制糖化酶组合物使得其相对整体酶质量是13.5％，除此以外，通过与实施例2-1完全相同的方式进行糖化处理，制成糖化处理物，测定了葡萄糖浓度。结果示于图5中。
(比较例2-2)
在本比较例中，将由序列号1表述的氨基酸序列构成的内切葡聚糖酶、由序列号2表述的氨基酸序列构成的纤维二糖水解酶以及由序列号3表述的氨基酸序列构成的β-葡萄糖苷酶，调制糖化酶组合物使得其相对整体酶质量是100％，除此以外，通过与实施例2-1完全相同的方式进行糖化处理，制成糖化处理物，测定了葡萄糖浓度。结果示于图5中。
如图5和比较例2-1中所示，加入的本发明的内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶及β-葡萄糖苷酶的比率少至整体酶质量的13.5％时，糖化处理物中的葡萄糖浓度示出的是数值较低的2.0％。由于酶浓度低，认为糖化效率较差。
另外，本发明的内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶及β-葡萄糖苷酶的合计含量并不是越高越好。如比较例2-2中所示，调制糖化酶组合物使其成为相对整体酶质量的100％时，糖化处理物中的葡萄糖浓度反而降低到1.5％。
木质纤维素类生物质由纤维素和以覆盖纤维素表面的形式存在的半纤维素构成。可以认为因半纤维素的存在，半纤维素的分解得到促进，高效地进行糖化，能够在短时间内增加糖化处理物中的糖浓度。因此，由于不仅内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶及β-葡萄糖苷酶存在，木聚糖酶等半纤维素酶也存在，从而能够高效地实施糖化处理。
因此，本发明的内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶及β-葡萄糖苷酶的总含量优选是30质量％～80质量％的范围。所述酶的总含量只要处于该范围内，糖化处理物中的葡萄糖浓度在大约2.4％以上，效率良好。
(实施例3)
以下，对糖化酶组合物的各酶的质量比进行了研究。
(实施例3-1)
以0.2:1:0.2:0.2:0.2的质量比，混合由序列号1表述的氨基酸序列构成的内切葡聚糖酶、由序列号2表述的氨基酸序列构成的纤维二糖水解酶、由序列号3表述的氨基酸序列构成的β-葡萄糖苷酶、木聚糖酶以及β-木糖苷酶，调制糖化酶组合物。将该糖化酶组合物添加到所述前处理物中，使得该糖化酶组合物的最终浓度是2mg/1g稻秆，并且在50℃下糖化处理72小时，制成糖化处理物。糖化溶液的调制、糖浓度的测定与实施例1中同样地进行。各酶的混合比示于表4中，结果示于图6中。
(实施例3-2)
除了以0.3:1:0.3:1.0:0.7的质量比，混合由序列号1表述的氨基酸序列构成的内切葡聚糖酶、由序列号2表述的氨基酸序列构成的纤维二糖水解酶、由序列号3表述的氨基酸序列构成的β-葡萄糖苷酶、木聚糖酶以及β-木糖苷酶以外，其余的以与实施例1相同方式测定糖浓度。各酶的混合比示于表4中，结果示于图6中。
(实施例3-3)
除了以0.3:1:1.0:0.7:0.3的质量比，混合由序列号1表述的氨基酸序列构成的内切葡聚糖酶、由序列号2表述的氨基酸序列构成的纤维二糖水解酶、由序列号3表述的氨基酸序列构成的β-葡萄糖苷酶、木聚糖酶以及β-木糖苷酶以外，其余的以与实施例1相同方式测定糖浓度。各酶的混合比示于表4中，结果示于图6中。
(实施例3-4)
除了以0.5:1:2.5:0.5:0.5的质量比，混合由序列号1表述的氨基酸序列构成的内切葡聚糖酶、由序列号2表述的氨基酸序列构成的纤维二糖水解酶、由序列号3表述的氨基酸序列构成的β-葡萄糖苷酶、木聚糖酶以及β-木糖苷酶以外，其余的以与实施例1相同方式测定糖浓度。各酶的混合比示于表4中，结果示于图6中。
(实施例3-5)
除了以1.0:1:0.3:0.7:0.3的质量比，混合由序列号1表述的氨基酸序列构成的内切葡聚糖酶、由序列号2表述的氨基酸序列构成的纤维二糖水解酶、由序列号3表述的氨基酸序列构成的β-葡萄糖苷酶、木聚糖酶以及β-木糖苷酶以外，其余的以与实施例1相同方式测定糖浓度。各酶的混合比示于表4中，结果示于图6中。
(实施例3-6)
除了以2.5:1:0.5:0.5:0.5的质量比，混合由序列号1表述的氨基酸序列构成的内切葡聚糖酶、由序列号2表述的氨基酸序列构成的纤维二糖水解酶、由序列号3表述的氨基酸序列构成的β-葡萄糖苷酶、木聚糖酶以及β-木糖苷酶以外，其余的以与实施例1相同方式测定糖浓度。各酶的混合比示于表4中，结果示于图6中。
(实施例3-7)
除了以0.3:1:0.3:1.3:0.3的质量比，混合由序列号1表述的氨基酸序列构成的内切葡聚糖酶、由序列号2表述的氨基酸序列构成的纤维二糖水解酶、由序列号3表述的氨基酸序列构成的β-葡萄糖苷酶、木聚糖酶以及β-木糖苷酶以外，其余的以与实施例1相同方式测定糖浓度。各酶的混合比示于表4中，结果示于图6中。
(实施例3-8)
除了以0.3:1:0.3:0.3:1.3的质量比，混合由序列号1表述的氨基酸序列构成的内切葡聚糖酶、由序列号2表述的氨基酸序列构成的纤维二糖水解酶、由序列号3表述的氨基酸序列构成的β-葡萄糖苷酶、木聚糖酶以及β-木糖苷酶以外，其余的以与实施例1相同方式测定糖浓度。各酶的混合比示于表4中，结果示于图6中。
(表4)
如图6所示，只要以质量比范围0.2～2.5:1:0.2～2.5混合本发明的内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶及β-葡萄糖苷酶，均能够进行最终糖浓度是3.0％以上的极为高效的糖化反应。
另外，作为要添加的木聚糖酶或木糖苷酶的量，优选是相对纤维二糖水解酶质量比1为0.2～1.3。
本发明通过使用多种考虑到与基质相结合的酶，并对所述多种酶的质量比进行详细研究，提供一种在使用较少量的酶的情况下，能够非常高效低进行糖化的酶组合物。
PCT/RO/134表

Claims (11)

1.一种糖化酶组合物，其对作为基质的木质纤维类生物质进行糖化处理，该糖化酶组合物的特征在于，含有：不含纤维素结合结构域的内切葡聚糖酶、含纤维素结合结构域的纤维二糖水解酶以及含纤维素结合结构域的β-葡萄糖苷酶。
2.根据权利要求1所述的糖化酶组合物，其特征在于，所述β-葡萄糖苷酶中含有的纤维素结合结构域由相对所述纤维二糖水解酶中含有的纤维素结合结构域的氨基酸序列、显示了70％以上的同源性的氨基酸序列构成。
3.根据权利要求2所述的糖化酶组合物，其特征在于，该糖化酶组合物进一步含有木聚糖酶或木糖苷酶。
4.根据权利要求2或3所述的糖化酶组合物，其特征在于，所述内切葡聚糖酶是由序列号1表示的氨基酸序列构成的糖化酶。
5.根据权利要求2或3所述的糖化酶组合物，其特征在于，所述纤维二糖水解酶是由序列号2表示的氨基酸序列构成的糖化酶。
6.根据权利要求2或3所述的糖化酶组合物，其特征在于，所述β-葡萄糖苷酶是由序列号3表示的氨基酸序列构成的糖化酶。
7.根据权利要求2或3所述的糖化酶组合物，其特征在于，所述内切葡聚糖酶是由序列号1表示的氨基酸序列构成的糖化酶，所述纤维二糖水解酶是由序列号2表示的氨基酸序列构成的糖化酶，所述β-葡萄糖苷酶是由序列号3表示的氨基酸序列构成的糖化酶。
8.根据权利要求7所述的糖化酶组合物，其特征在于，所述内切葡聚糖酶、所述纤维二糖水解酶以及所述β-葡萄糖苷酶的总含量相对所述糖化酶组合物的总质量为30质量％～80质量％的范围。
9.根据权利要求8所述的糖化酶组合物，其特征在于，所述糖化酶组合物以0.2～2.5:1:0.2～2.5的质量比范围含有所述内切葡聚糖酶、所述纤维二糖水解酶以及所述β-葡萄糖苷酶。
10.一种糖化溶液的配制方法，在作为基质的木质纤维素类生物质中添加糖化酶，制成基质和糖化酶混合物，对所述基质和糖化酶混合物进行糖化处理，从而制得糖化溶液，
所述糖化溶液的配制方法的特征在于：在所述基质中，至少同时添加作为所述糖化酶的不含纤维素结合结构域的内切葡聚糖酶、含纤维素结合结构域的纤维二糖水解酶以及含纤维素结合结构域的β-葡萄糖苷酶。
11.一种糖化溶液的配制方法，在作为基质的木质纤维素类生物质中添加糖化酶，制成基质和糖化酶混合物，对所述基质和糖化酶混合物进行糖化处理，从而制得糖化溶液，
所述糖化溶液的配制方法的特征在于：在所述基质中，至少添加作为所述糖化酶的不含纤维素结合结构域的内切葡聚糖酶后，至少添加含纤维素结合结构域的纤维二糖水解酶以及含纤维素结合结构域的β-葡萄糖苷酶。
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