JPWO2013103127A1 - 糖化酵素組成物及びそれを用いる糖化溶液の製造方法 - Google Patents

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Abstract

少ない使用量で、優れた糖化性能を得ることができる糖化酵素組成物及びそれを用いる糖化溶液の製造方法を提供する。糖化酵素組成物は、基質としてのリグノセルロース系バイオマスを糖化処理する。糖化酵素組成物は、セルロース結合ドメインを非含有のエンドグルカナーゼと、セルロース結合ドメインを含有するセロビオハイドラーゼと、セルロース結合ドメインを含有するβ−グルコシダーゼとを含む。

Description

本発明は、糖化酵素組成物及びそれを用いる糖化溶液の製造方法に関する。
近年、自動車用燃料として、ガソリン−エタノール混合燃料を用いることが検討されている。前記エタノールとして、植物性物質の発酵、蒸留により得たバイオエタノールを用いると、土壌管理を厳密に行うことにより所謂カーボンニュートラル効果を得ることができ、二酸化炭素の排出量を低減して地球温暖化の防止に寄与できるものと考えられている。
しかし、前記植物性物質として、例えばサトウキビ、トウモロコシ等の農作物を用いると、該農作物がエタノールの原料として大量に消費されることにより、食料又は飼料としての供給量が減少するという問題がある。そこで、前記植物性物質として、食用または飼料用とならないリグノセルロース系バイオマスを用いてエタノールを製造する技術が検討されている。
前記リグノセルロース系バイオマスは、セルロースを含んでおり、該セルロースを糖化酵素を用いて糖化処理することによりグルコースに分解し、得られたグルコースを発酵させてエタノールを得ることができる。従来、このような糖化酵素として、例えば、アクレモニウム・セルロリティカス由来のセルラーゼが知られている（例えば、特許文献１参照）。
前記糖化酵素は高価であるので、前記エタノールの製造では該糖化酵素の使用量を低減するために基質であるリグノセルロース系バイオマスを低濃度とすることが行われている。ところが、前記基質を低濃度とすると、得られる糖化溶液も低濃度になり、ひいては該糖化溶液を発酵させて得られるエタノールも低濃度となる。この結果、得られたエタノールを濃縮するために蒸留する際に、蒸留に要する時間及び熱エネルギーが増加するという問題がある。
前記問題を解決するために、前記基質を高濃度とすると共に、前記糖化酵素の使用量を増加させ、高濃度のエタノールを得ることにより、エタノールの濃縮及び蒸留等に必要なエネルギーを低減し、全体としてのエネルギー効率を向上させることが考えられる。しかし、この場合、前記糖化酵素は高価であるので、その使用量が増加すると、コスト増となるという問題がある。
そこで、前記問題を解決するために、糖化効率を維持しつつ、糖化酵素の使用量を低減することが望まれる。
特開２０１０−１４８４２７号公報
しかしながら、単に糖化酵素の総量を低減したのでは、糖化酵素の量に比例して、糖化効率も低減するという不都合がある。
本発明の目的は、かかる不都合を解消し、少ない使用量で、優れた糖化性能を得ることができる糖化酵素組成物を提供することにある。
また、本発明の目的は、前記糖化酵素組成物を用いる糖化溶液の製造方法を提供することにもある。
本発明者らの検討によれば、アクレモニウム・セルロリティカスから抽出されたセルラーゼは、種々のセルラーゼからなる混合物であり、リグノセルロース系バイオマスの糖化に優れた効果を示さないものも含まれていることが知見された。
従って、単に前記セルラーゼの混合物の総量を低減したのでは、リグノセルロース系バイオマスの糖化に優れた効果を示すセルラーゼも、示さないセルラーゼも、一律に低減されることとなり、糖化酵素の量に比例して、糖化効率も低下するものと考えられる。
本発明者らは、前記セルラーゼの混合物に含まれる個々のセルラーゼのリグノセルロース系バイオマスに対する糖化性能について、種々検討した。この結果、特定のセルラーゼの組合せからなる糖化酵素組成物が、リグノセルロース系バイオマスの糖化に優れた性能を示すことを見出し、本発明を完成した。
即ち、本発明は、基質としてのリグノセルロース系バイオマスを糖化処理する糖化酵素組成物において、セルロース結合ドメインを非含有のエンドグルカナーゼと、セルロース結合ドメインを含有するセロビオハイドラーゼと、セルロース結合ドメインを含有するβ−グルコシダーゼとを含むことを特徴とする。
ここで、前記エンドグルカナーゼは、セルロースをその内部領域からより短鎖なβ−１，４−グルカンに加水分解する糖化酵素である。また、前記セロビオハイドラーゼは、セルロース又はより短鎖なβ−１，４−グルカンをその末端からセロビオースに加水分解する糖化酵素である。また、β−グルコシダーゼは、セロビオースをグルコースに加水分解する糖化酵素である。なお、セルロース結合ドメインとは、糖化酵素が、セルロースの表面に結合するための構造を意味する。
本発明の糖化酵素組成物によれば、先ず、前記エンドグルカナーゼがリグノセルロース系バイオマスに作用する。前記エンドグルカナーゼは、セルロース結合ドメインを含有していないため、基質としてのリグノセルロース系バイオマスに含まれるセルロースの表面の特定部位に結合することなく、該セルロースの分子鎖の広い範囲で不特定の部位に接触し、より短鎖なβ−１，４−グルカンを生産することができる。
一方、エンドグルカナーゼがセルロース結合ドメインを含有していると、該エンドグルカナーゼは、セルロースをより短鎖なβ−１，４−グルカンに加水分解した後も、該加水分解の反応場に留まってしまう。その結果、エンドグルカナーゼが他のセルロースに接触する機会が低減し、より短鎖なβ−１，４−グルカンを生産する効率が低下してしまう。
前記セロビオハイドラーゼは、セルロース結合ドメインを含有しているので、通常はセルロースに結合し、該セルロースをその末端から加水分解してセロビオースを生産するが、より短鎖なβ−１，４−グルカンが存在するときはより短鎖なβ−１，４−グルカンにも結合し、その末端から加水分解してセロビオースを生産する。従って、前記エンドグルカナーゼにより、より短鎖なβ−１，４−グルカンが生産されると、前記セロビオハイドラーゼの反応開始点が増大することになり、該セロビオハイドラーゼによるセロビオースの生産が促進される。
また、前記β−グルコシダーゼもセルロース結合ドメインを含有しているため、前記セロビオハイドラーゼがセロビオースを生産する際の反応場には、該β−グルコシダーゼも存在することになる。従って、前記セロビオハイドラーゼにより生産されたセロビオースを、β−グルコシダーゼにより速やかにグルコースに加水分解することができる。
従って、本発明の糖化酵素組成物によれば、前記エンドグルカナーゼと前記セロビオハイドラーゼと前記β−グルコシダーゼとが協働して、基質であるリグノセルロース系バイオマスに含まれるセルロースを糖化することにより、糖化効率を向上することができ、少ない使用量で優れた糖化性能を得ることができる。
また、本発明の糖化酵素組成物における前記β−グルコシダーゼに含有されているセルロース結合ドメインは、前記セロビオハイドラーゼに含有されているセルロース結合ドメインのアミノ酸配列に対して、７０％以上の相同性を示すアミノ酸配列からなることが好ましい。
セルロース結合ドメインは、アミノ酸配列の相同性が高くなるほど、セルロースやより短鎖なβ−１，４−グルカンの表面に結合する際に、同一部位に結合する確率が大きくなる。そこで、アミノ酸配列が７０％以上の相同性を有するセルロース結合ドメインを含有する前記セロビオハイドラーゼ及び前記β−グルコシダーゼを用いるときには、該β−グルコシダーゼは、該セロビオハイドラーゼがセロビオースを生成する際に同一の反応場に存在する確率が大きくなる。
従って、本発明の糖化酵素組成物によれば、前記エンドグルカナーゼと前記セロビオハイドラーゼと前記β−グルコシダーゼとが協働し、より効率的に糖化することができる。
一方、前記相同性が７０％未満であると、前記セロビオハイドラーゼと前記β−グルコシダーゼとが、十分に同一の反応場に存在することができないことがある。
本発明の糖化酵素組成物において、該糖化酵素組成物の総質量に対する前記エンドグルカナーゼと前記セロビオハイドラーゼと前記β−グルコシダーゼとの合計の含有量は、３０〜８０質量％の範囲であることが好ましい。
前記糖化酵素組成物は、その総質量に対する前記エンドグルカナーゼと前記セロビオハイドラーゼと前記β−グルコシダーゼとの合計の含有量が、８０質量％以上となると糖化効率がかえって低下することから、キシラナーゼ等のヘミセルラーゼを含有することが好ましい。また、前記糖化酵素組成物の総質量に対する前記エンドグルカナーゼと前記セロビオハイドラーゼと前記β−グルコシダーゼとの合計の含有量が３０質量％未満であると、十分な糖化性能を得ることができないことがある。
本発明の糖化酵素組成物における前記エンドグルカナーゼとしては、例えば、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるものを挙げることができる。また、本発明の糖化酵素組成物における前記セロビオハイドラーゼとしては、例えば、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるものを挙げることができる。また、本発明の糖化酵素組成物における前記β−グルコシダーゼとしては、例えば、配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるものを挙げることができる。
また、本発明の糖化酵素組成物は、前記エンドグルカナーゼと前記セロビオハイドラーゼと前記β−グルコシダーゼとを、質量比で０．２〜２．５：１：０．２〜２．５の範囲で含むことが好ましい。
前記セロビオハイドラーゼの質量に対する前記エンドグルカナーゼの質量比が０．２未満であると、前記エンドグルカナーゼによりセルロースからより短鎖なβ−１，４−グルカンが生産される際の生産速度が、前記セロビオハイドラーゼにより、より短鎖なβ−１，４−グルカンからセロビオースが生産される際の生産速度に対して過小となり、十分な糖化効率が得られないことがある。
一方、前記セロビオハイドラーゼに対する前記エンドグルカナーゼの質量比が２．５を超えると、前記エンドグルカナーゼによりセルロースからより短鎖なβ−１，４−グルカンが生産される際の生産速度が、前記セロビオハイドラーゼにより、より短鎖なβ−１，４−グルカンからセロビオースが生産される際の生産速度に対して過大となり、十分な糖化効率が得られないことがある。
また、前記セロビオハイドラーゼに対する前記β−グルコシダーゼの質量比が０．２未満であると、前記β−グルコシダーゼによりセロビオースからグルコースが生産される際の生産速度が、前記セロビオハイドラーゼにより、より短鎖なβ−１，４−グルカンからセロビオースが生産される際の生産速度に対して過小となり、十分な糖化効率が得られないことがある。
一方、前記セロビオハイドラーゼに対する前記β−グルコシダーゼの質量比が２．５を超えると、前記β−グルコシダーゼによりセロビオースからグルコースが生産される際の生産速度が、前記セロビオハイドラーゼにより、より短鎖なβ−１，４−グルカンからセロビオースが生産される際の生産速度に対して過大となり、十分な糖化効率が得られないことがある。
また、本発明の糖化酵素組成物は、さらにキシラナーゼ又はキシロシダーゼを含んでもよい。前記糖化酵素組成物は、キシラナーゼ又はキシロシダーゼを含むことにより、基質としてのリグノセルロース系バイオマスに含まれるヘミセルロースを糖化し、キシロースを得ることができる。従って、基質としてのリグノセルロース系バイオマスの糖化率を上昇させることができる。
また、本発明の糖化溶液の製造方法は、基質としてのリグノセルロース系バイオマスに、糖化酵素を添加して基質・糖化酵素混合物とし、前記基質・糖化酵素混合物を糖化処理して糖化溶液を得る糖化溶液の製造方法において、前記糖化酵素として少なくともセルロース結合ドメインを非含有のエンドグルカナーゼとセルロース結合ドメインを含有するセロビオハイドラーゼとセルロース結合ドメインを含有するβ−グルコシダーゼとを同時に、前記基質に添加することを特徴とする。
このように酵素を同時に添加するときには、先ず、前記エンドグルカナーゼがリグノセルロース系バイオマスに含まれるセルロースに作用する。前記エンドグルカナーゼは、セルロース結合ドメインを含有していないため、前記基質に添加された際に、前記セルロースの表面の特定部位に結合されることなく、該セルロースの分子鎖の広い範囲で不特定の部位に接触し、より短鎖なβ−１，４−グルカンを生産する。
前記セロビオハイドラーゼは、セルロース結合ドメインを含有しているので、通常はセルロースに結合し、該セルロースをその末端から加水分解してセロビオースを生産するが、より短鎖なβ−１，４−グルカンが存在するときはより短鎖なβ−１，４−グルカンにも結合し、その末端から加水分解してセロビオースを生産する。従って、前記エンドグルカナーゼにより、より短鎖なβ−１，４−グルカンが生産されると、前記セロビオハイドラーゼの反応開始点が増大することになり、該セロビオハイドラーゼによるセロビオースの生産が促進される。
また、前記β−グルコシダーゼもセルロース結合ドメインを含有しているため、前記セロビオハイドラーゼがセロビオースを生産する際の反応場には、該β−グルコシダーゼも存在することになる。従って、前記セロビオハイドラーゼにより生産されたセロビオースが、β−グルコシダーゼにより速やかにグルコースに加水分解される。
本発明の糖化溶液の製造方法によれば、前記エンドグルカナーゼと前記セロビオハイドラーゼと前記β−グルコシダーゼとが協働して、リグノセルロース系バイオマスに含まれるセルロースを糖化するので、糖濃度の高い糖化溶液を効率よく得ることができる。
また、本発明の糖化溶液の製造方法は、基質としてのリグノセルロース系バイオマスに、糖化酵素を添加して基質・糖化酵素混合物とし、前記基質・糖化酵素混合物を糖化処理して糖化溶液を得る糖化溶液の製造方法において、前記糖化酵素として少なくともセルロース結合ドメインを非含有のエンドグルカナーゼを前記基質に添加した後、少なくともセルロース結合ドメインを含有するセロビオハイドラーゼとセルロース結合ドメインを含有するβ−グルコシダーゼとを添加することを特徴とする。
このように、先に前記エンドグルカナーゼを添加するときには、前記セロビオハイドラーゼ及びβ−グルコシダーゼは、該エンドグルカナーゼの反応場に存在しない。従って、先に添加された前記エンドグルカナーゼは、セルロースの分子鎖に対し、より効率的に接触することができるため、優先的にリグノセルロース系バイオマスに含まれるセルロースを加水分解し、より短鎖なβ−１，４−グルカンを生産する。
すると、前記セロビオハイドラーゼと前記β−グルコシダーゼとを添加するときには、前記エンドグルカナーゼと前記セロビオハイドラーゼと前記β−グルコシダーゼとを同時に添加するときに比較して、より短鎖なβ−１，４−グルカンの量が増加している。そのため、前記セロビオハイドラーゼは、前記より短鎖なβ−１，４−グルカンをセロビオースに容易に加水分解することができる。
また、前記β−グルコシダーゼは、セルロース結合ドメインの働きによって、前記セロビオハイドラーゼによる加水分解の反応場に存在しているため、前記セロビオースを、効率よく加水分解して、グルコースを生産することができる。
従って、本発明の糖化溶液の製造方法によれば、先ず前記エンドグルカナーゼを添加し、次いで前記セロビオハイドラーゼと前記β−グルコシダーゼとを添加することにより、糖濃度の高い糖化溶液をさらに効率よく得ることができる。
本発明の糖化溶液の製造方法の一実施形態を示すフローチャート。 本発明の糖化酵素組成物を抽出することができる菌株のコロニーの直径とＡＺＣＬハロの直径とを示すグラフ。 本発明の糖化酵素組成物を抽出することができる菌株のＣＭＣ分解活性を示すグラフ。 本発明の糖化酵素の糖化性能を示すグラフ。 本発明の糖化酵素組成物の総質量に対する含有量のグルコース産生に与える影響の検討結果を示すグラフ。 本発明の糖化酵素組成物中のエンドグルカナーゼ、セルビオハイドラーゼ、β-グルコシダーゼ、キシラナーゼ、及びβ-キシロシダーゼの質量比の糖産生に与える影響の検討結果を示すグラフ。
次に、添付の図面を参照しながら本発明の実施の形態についてさらに詳しく説明する。
図１に、基質としてリグノセルロース系バイオマスを用いてエタノールを製造する際の糖化処理の工程を示す。
前記糖化処理では、先ず、基質としてリグノセルロース系バイオマスの１つである稲藁を粗粉砕したものにアンモニア水を混合して、稲藁及びアンモニアを含む基質混合物を得る。ここで、前記アンモニア水は、２０〜３０質量／体積％の範囲の濃度であり、前記基質混合物は、前記アンモニア水に対し、好ましくは２０〜７０質量％の範囲の稲藁を含むようにする。
次に、得られた前記基質混合物を、２５〜１００℃の範囲の温度で、２〜２００時間の範囲の時間保持し、糖化前処理を行う。この結果、前記基質である稲藁からリグニンが解離され、又は稲藁が膨潤されたアンモニア含有糖化前処理物が得られる。
尚、本実施形態において、解離とは、セルロース等に結合しているリグニンの結合部位のうち、少なくとも一部の結合を切断することをいう。また、膨潤とは、液体の浸入により結晶性セルロースを構成するセルロース等に空隙が生じ、又は、セルロース繊維の内部に空隙が生じて膨張することをいう。
次に、前記アンモニア含有糖化前処理物からアンモニアを放散させてアンモニアを分離し、アンモニア分離糖化前処理物を得る。続いて、アンモニア分離糖化前処理物のｐＨを、糖化酵素が作用し得る範囲、例えば、ｐＨ３〜７の範囲に調整する。
次に、前記ｐＨ調整された前記アンモニア分離糖化前処理物に糖化酵素を添加して、基質・糖化酵素混合物を調製し、該基質・糖化酵素混合物を、３０〜６０℃の範囲の温度に、５０〜１５０時間保持して、糖化処理を行う。前記糖化処理により、前記基質・糖化酵素混合物に含まれるセルロースが、前記糖化酵素の作用により加水分解される。この結果、グルコース等の糖が含まれる糖化溶液を得ることができる。
ここで、本実施形態の糖化溶液の製造方法では、前記糖化酵素として、セルロース結合ドメインを含有しないエンドグルカナーゼと、セルロース結合ドメインを含有するセロビオハイドラーゼと、セルロース結合ドメインを含有するβ−グルコシダーゼとを含む糖化酵素組成物を用いる。
本実施形態で用いられる前記エンドグルカナーゼと前記セロビオハイドラーゼと前記β−グルコシダーゼとは、例えば、以下の方法により得ることができる。
先ず、変異前培養工程として、アクレモニウム・セルロリティカスＴＮ株（独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター、受託番号：ＦＥＲＭ−ＢＰ−６８５、以下、「ＴＮ株」と略記する）を、表１に示す組成を備える培養液に植菌し、３０℃で一晩培養する。次に、変異処理工程として、前記培養したＴＮ株を、表２に示す組成を備える固体培地の表面に塗布し、紫外線を照射することにより、変異処理菌株を得る。その後、変異後培養工程として、前記変異処理菌株を、３０℃で７日間培養する。
ここで、前記固体培地に含まれている発色基質であるＡＺＣＬ−ＨＥ−ＣＥＬＬＵＬＯＳＥ（商品名、メガザイム社製）は、糖化酵素により分解されると、青色に発色する物質である。従って、前記培養により前記変異処理菌株が糖化酵素を産生すると、該糖化酵素によりＡＺＣＬ−ＨＥ−ＣＥＬＬＵＬＯＳＥが分解され、該変異処理菌株のコロニーの周囲には、該産生される糖化酵素の量に応じた大きさの青色円（以下、「ＡＺＣＬハロ」という）が形成される。
そこで、前記ＡＺＣＬハロの大きさが最大となるコロニーを種菌とし、前記変異前培養工程、変異処理工程及び変異後培養工程を再度繰り返した後、得られるコロニーを、その大きさ及びその周囲に形成されるＡＺＣＬハロの大きさから、複数選択する。
次に、前記選択したコロニーの菌株及びＴＮ株を、新たな前記固体培地に植菌し、３０℃で７日間培養し、コロニーの直径及びＡＺＣＬハロの直径を測定すると共に、ＡＺＣＬハロの直径／コロニーの直径の値を算出した。
また、前記選択したコロニーの菌株及びＴＮ株を、新たな前記培養液に植菌し、３０℃で培養し、ｐＨ５．５、３０℃の条件下、培養開始後、７，１０，１１，１２，１３，１４，１７日目のカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）分解活性を測定した。前記ＣＭＣ分解活性は、次のようにして測定した。
先ず、糖化酵素を含む水溶液の試料１０μｌに、２００ｍＭの酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）１９０μｌと、１質量／体積％のＣＭＣ（メルク社製、型番：１．０２３３１．０５００）水溶液２００μｌとを加え、３０℃で１５分間反応させる。
その後、前記反応させた溶液に、３０質量／体積％のロッシェル塩、１質量／体積％のジニトロサリチル酸、１．６質量／体積％の水酸化ナトリウムを含む水溶液４００μｌを加え、１００℃で５分間処理する。次に、得られた溶液の波長５４０ｎｍの光線に対する吸光度を測定し、グルコースを標準物質として、溶出した還元糖濃度を算出する。ここで、１分間に1μｍｏｌの還元糖を遊離する酵素量を１Ｕとする。
そして、前記選択したコロニーから、前記算出したＡＺＣＬハロの直径／コロニーの直径の値、及びＣＭＣ分解活性の値の最も高いものを選択し、アクレモニウム・セルロリティカスＨ１株（独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター、受託番号：ＦＥＲＭ−Ｐ−２２１６４、以下、「Ｈ１株」と略記する）とし、本実施形態の糖化酵素組成物の抽出に用いる菌株とする。
Ｈ１株及びＴＮ株のコロニーの直径、ＡＺＣＬハロの直径及びＡＺＣＬハロの直径／コロニーの直径の値を、図２に示す。また、Ｈ１株及びＴＮ株のＣＭＣ分解活性値の経時変化を、図３に示す。
図２（ａ）から明らかなように、Ｈ１株のコロニーは、ＴＮ株のコロニーに比較して、ＡＺＣＬハロの直径が大きくなっている。従って、Ｈ１株は、ＴＮ株より多くの糖化酵素を産生していることが明らかである。
また、図２（ｂ）から明らかなように、Ｈ１株のコロニーは、ＴＮ株のコロニーに比較して、ＡＺＣＬハロの直径／コロニーの直径の値が約２倍になっている。従って、Ｈ１株は、ＴＮ株に対し、菌体あたりの糖化酵素活性が高いことが明らかである。
また、図３から、Ｈ１株は、ＴＮ株に比較して、培養期間のいずれにおいても、ＣＭＣ分解活性が有意に高いことが明らかである。ＣＭＣ分解活性は、セルロース分解活性を表す指標として用いられるため、Ｈ１株は、ＴＮ株に対し、優れた糖化酵素を産生することが明らかである。
次に、Ｈ１株から、本実施形態において用いられる糖化酵素であるエンドグルカナーゼとセロビオハイドラーゼとβ?グルコシダーゼとを抽出する方法について説明する。
先ず、Ｈ１株を、表３に示す組成を備える培養液に植菌し、３０℃で１４日間培養する。そして、前記培養を行った培養液を、孔径が０．２μｍのフィルターを用いてろ過する。
次に、得られたろ液を、陰イオン交換担体（商品名：ＴＯＹＯＰＥＡRＬ ＱＡＥ−５５０Ｃ、東ソー株式会社製）を充填した第１の分離カラム（商品名：Ｂｉｏ−Ｒａｄエコノカラム、バイオラッドラボラトリーズ株式会社製、直径５．０ｃｍ×長さ５０．０ｃｍ）により分離して、溶出時間に応じて画分Ｑ１〜Ｑ１２を得る。
次に、得られた前記画分Ｑ１を、５０℃で２４時間加熱処理した後、遠心分離（９４６０×ｇ、２０分間）を行い、得られた上清を孔径が０．２μｍのフィルターを用いてろ過する。得られたろ液を、第２の分離カラム（商品名：Ｍｏｎｏ Ｓ ５．５０Ｌカラム、ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社製）により分離して、溶出時間に応じて画分Ｓ１〜Ｓ９を得る。そして、前記画分Ｓ３から、セルロース結合ドメインを含有しないエンドグルカナーゼを得る。前記エンドグルカナーゼは、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる糖化酵素である。
次に、前記画分Ｑ３を、疎水性担体（商品名：ＴＯＹＯＰＥＡRＬ Ｂｕｔｙｌ−６５０Ｍ、東ソー株式会社製）を充填した第３の分離カラム（商品名：ＸＫ２６／２０カラム、ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社製、直径２．６ｃｍ×長さ２０ｃｍ）により分離して、溶出時間に応じて画分Ｂ１〜Ｂ８を得る。
そして、前記画分Ｂ７から、セルロース結合ドメインを含有するセロビオハイドラーゼを得る。前記セロビオハイドラーゼは、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる糖化酵素である。また、前記画分Ｂ８から、セルロース結合ドメインを含有するβ−グルコシダーゼを得る。前記β−グルコシダーゼは、配列番号３で表されるアミノ酸配列からなる糖化酵素である。
前記のようにして得られる前記エンドグルカナーゼ、前記セロビオハイドラーゼ及び前記β−グルコシダーゼのアミノ酸配列は、モチーフライブラリとしてＰｆａｍデータベースを用いてセルロース結合ドメインに対する相同検索を行った。
その結果、前記セロビオハイドラーゼは、配列番号２で表されるアミノ酸配列のうち、４９７番目から５２９番目のアミノ酸配列がセルロース結合ドメインであることが判明した。また、前記β−グルコシダーゼは、配列番号３で表されるアミノ酸配列のうち、７８０番目から８１２番目のアミノ酸配列がセルロース結合ドメインであることが判明した。前記エンドグルカナーゼは、セルロース結合ドメインを含有しないことが判明した。
次に、前記セロビオハイドラーゼ及び前記β−グルコシダーゼのセルロース結合ドメインのアミノ酸配列の相同性評価を、例えば、ＮＣＢＩ（National Center for Biotechnology Information）サイトのＢｌａｓｔ検索を用いて行ったところ、２４／３３、即ち７２．７％の相同性を有していた。
セルロース結合ドメインは、アミノ酸配列の相同性が高くなるほど、セルロースやより短鎖なβ−１，４−グルカンの表面に結合する際に、同一部位に結合する確率が大きくなる。そこで、アミノ酸配列が７２．７％の相同性を有するセルロース結合ドメインを含有する前記セロビオハイドラーゼ及び前記β−グルコシダーゼを用いることにより、該β−グルコシダーゼは、該セロビオハイドラーゼがセロビオースを生成する際に同一の反応場に存在する確率が大きくなる。
従って、本実施形態の糖化酵素組成物によれば、前記エンドグルカナーゼと前記セロビオハイドラーゼと前記β−グルコシダーゼとが協働し、より効率的に糖化することができる。
本実施形態の糖化酵素組成物は、前記糖化酵素組成物の総質量に対し、前記のようにして得られる前記エンドグルカナーゼと前記セロビオハイドラーゼと前記β−グルコシダーゼとの合計の含有量が、３０〜８０質量％の範囲とされる。また、本実施形態の糖化酵素組成物は、前記のようにして得られる前記エンドグルカナーゼと前記セロビオハイドラーゼと前記β−グルコシダーゼとを、質量比で０．２〜２．５：１：０．２〜２．５の範囲の質量比としたものが用いられる。
本実施形態の糖化溶液の製造方法では、前記糖化酵素組成物を構成する前記エンドグルカナーゼと前記セロビオハイドラーゼと前記β−グルコシダーゼとを同時に、ｐＨ調整された前記アンモニア分離糖化前処理物に添加する。
このようにすることにより、前記エンドグルカナーゼと前記セロビオハイドラーゼと前記β−グルコシダーゼとが協働して、リグノセルロース系バイオマスに含まれるセルロースを糖化するので、グルコース等の糖濃度の高い糖化溶液を効率よく得ることができる。
本実施形態では、前記糖化酵素組成物を構成する前記エンドグルカナーゼと前記セロビオハイドラーゼと前記β−グルコシダーゼとを同時に、ｐＨ調整された前記アンモニア分離糖化前処理物に添加するようにしているが、先に前記エンドグルカナーゼのみをｐＨ調整された前記アンモニア分離糖化前処理物に添加し、所定時間酵素糖化処理を行った後に、前記セロビオハイドラーゼと前記β−グルコシダーゼとを添加してもよい。
本発明の糖化溶液の製造方法によれば、先ず前記エンドグルカナーゼを添加し、次いで前記セロビオハイドラーゼと前記β−グルコシダーゼとを添加することにより、糖濃度の高い糖化溶液をさらに効率よく得ることができる。
また、本実施形態では、セルロース結合ドメインを非含有のエンドグルカナーゼと、セルロース結合ドメインを含有するセロビオハイドラーゼと、セルロース結合ドメインを含有するβ−グルコシダーゼとのみからなる糖化酵素組成物を用いているが、当該糖化酵素組成物は、さらにキシラナーゼ又はキシロシダーゼを含んでもよい。
キシラナーゼ又はキシロシダーゼを含むことにより、リグノセルロース系バイオマスに含まれるヘミセルロースをキシロースに酵素糖化することができるため、リグノセルロース系バイオマスの糖化率を向上させることができる。
次に、本発明の実施例及び比較例を示す。
［実施例１］
本実施例では、先ず、基質としてリグノセルロース系バイオマスである稲藁を微粉砕したものに、２５質量％のアンモニア水を、質量比が１：２．５となるように混合して、稲藁及びアンモニアを含む基質混合物を得た。次に、前記基質混合物を、８０℃の温度で８時間保持し、糖化前処理を行った後、アンモニアを分離し、ｐＨを４．０に調整した。そして、稲藁の含有量が２０体積％となるように調整して本実施例の糖化前処理物を得た。
次に、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるエンドグルカナーゼと、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるセロビオハイドラーゼと、配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるβ−グルコシダーゼと、キシラナーゼ（Thermoascus aurantiacus由来endo-1,4-beta-xylanase A、GenBank ACCESSION No. AAF24127）及びβ-キシロシダーゼ（Thermotoga maritima由来β-xylosidase、株式会社耐熱性酵素研究所製）を０．３：１：０．３：１．０：０．７の質量比で混合し、糖化酵素組成物を調製した。それを稲藁１ｇあたりの終濃度が２ｍｇとなるように、前記前処理物に加え、５０℃で７２時間糖化処理を行って、糖化処理物を得た。ここでは、特定の菌由来のキシラナーゼ及びβ-キシロシダーゼを用いているが、エンドキシラナーゼ活性およびβ-キシロシダーゼ活性を有する酵素であれば、どのような酵素を用いても良い。次に、前記糖化溶液を、９５℃で５分熱処理後、１５，７６０×ｇ、４℃で５分間遠心分離を行い、上清を新しい１．５ ｍＬエッペンチューブに移した。孔径が０．２μｍのフィルターを用いてろ過した後、ＨＰＬＣにより糖濃度を測定した。
前記ＨＰＬＣは、セパレータ（商品名：Ｗａｔｅｒｓ ２６９５、日本ウォーターズ株式会社製）と、ＲＩ検出器（商品名：Ｗａｔｅｒｓ ２４１４、日本ウォーターズ株式会社製）と、分離カラム（商品名：ＨＰＸ−８７Ｐカラム、バイオラッドラボラトリーズ株式会社製）とにより、カラム温度８５℃、検出器温度４０℃の条件下、超純水を溶離液として、０．６ｍｌ／ｍｉｎの流量で、糖濃度の測定を行った。結果を、図４に示す。図４はグルコースとキシロースの合計を糖濃度として表示している。
［比較例１］
本比較例では、市販の糖化酵素（商品名：アクレモニウムセルラーゼ、Ｍｅｉｊｉ Ｓｅｉｋａファルマ株式会社製）を用いたことを除き、実施例１と全く同一にして糖化溶液を製造し、該糖化溶液のグルコース濃度を測定した。結果を、図４に示す。
図４に示すように、前記エンドグルカナーゼと前記セロビオハイドラーゼと前記β−グルコシダーゼとからなる糖化酵素組成物を用いて得た実施例の糖化溶液の糖濃度は３．８質量／体積％であり、前記アクレモニウムセルラーゼ（商品名）を用いて得た比較例の糖化溶液の糖濃度は２．３質量／体積％であった。
従って、実施例の糖化酵素組成物によれば、比較例の糖化酵素に比較して、所定時間の酵素糖化処理により得られる糖化溶液中の糖濃度を、約１．７倍に増加させることができることが明らかである。これを換言すれば、実施例の糖化酵素組成物は、比較例の糖化酵素の容量の１．７倍減で、同等の糖濃度の糖化溶液を得ることができることになり、少ない使用量で優れた糖化性能を得られることが明らかである。
［実施例２］
次に、本発明の酵素の合計の含有量について検討を行った。
［実施例２−１］
本実施例では、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるエンドグルカナーゼと、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるセロビオハイドラーゼと、配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるβ−グルコシダーゼとを、０．３：１：０．３の質量比で混合し、全酵素質量の３５．１％になるように糖化酵素組成物を調製した以外は、実施例１と全く同一にして糖化処理を行い、糖化処理物を得て、グルコース濃度の測定を行った。結果を図５に示す。
［実施例２−２］
本実施例では、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるエンドグルカナーゼと、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるセロビオハイドラーゼと、配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるβ−グルコシダーゼとを、全酵素質量の５６．７％になるように糖化酵素組成物を調製した以外は、実施例２−１と全く同一にして糖化処理を行い、糖化処理物を得て、グルコース濃度の測定を行った。結果を図５に示す。
［実施例２−３］
本実施例では、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるエンドグルカナーゼと、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるセロビオハイドラーゼと、配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるβ−グルコシダーゼとを、全酵素質量の７８．４％になるように糖化酵素組成物を調製した以外は、実施例２−１と全く同一にして糖化処理を行い、糖化処理物を得て、グルコース濃度の測定を行った。結果を図５に示す。
［比較例２−１］
本比較例では、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるエンドグルカナーゼと、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるセロビオハイドラーゼと、配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるβ−グルコシダーゼとを、全酵素質量の１３．５％になるように糖化酵素組成物を調製した以外は、実施例２−１と全く同一にして糖化処理を行い、糖化処理物を得て、グルコース濃度の測定を行った。結果を図５に示す。
［比較例２−２］
本比較例では、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるエンドグルカナーゼと、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるセロビオハイドラーゼと、配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるβ−グルコシダーゼとを、全酵素質量の１００％になるように糖化酵素組成物を調製した以外は、実施例２−１と全く同一にして糖化処理を行い、糖化処理物を得て、グルコース濃度の測定を行った。結果を図５に示す。
図５、比較例２−１で示すように、本発明のエンドグルカナーゼと、セロビオハイドラーゼと、β−グルコシダーゼとを入れる割合が、全酵素質量の１３．５％と少ない場合には、糖化処理物中のグルコース濃度は２．０％と少ない値を示す。酵素濃度が低いために、糖化効率が悪いものと考えられる。
また、本発明のエンドグルカナーゼと、セロビオハイドラーゼと、β−グルコシダーゼとの合計の含有量は、多いほどよいわけではなく、比較例２−２で示すように、全酵素質量の１００％になるように糖化酵素組成物を調整すると、糖化処理物中のグルコース濃度は１．５％とかえって低下している。
リグノセルロース系バイオマスはセルロースとセルロース表面を覆う形で存在するヘミセルロースで構成されている。ヘミセルラーゼが存在することにより、ヘミセルロース分解が進行し、より効率的に糖化が進み、短時間で糖化処理物中の糖濃度が増加するものと考えられる。そのため、エンドグルカナーゼ、セロビオハイドラーゼと、β−グルコシダーゼだけではなく、キシラナーゼ等のヘミセルラーゼが存在することにより、より効率的に糖化処理を行うことができる。
従って、本発明のエンドグルカナーゼと、セロビオハイドラーゼと、β−グルコシダーゼとの合計の含有量は、３０〜８０質量％の範囲であることが好ましい。前記酵素の合計含有量がこの範囲であれば、糖化処理物中のグルコース濃度が約２．４％以上と効率が良い。
[実施例３]
次に、糖化酵素組成物の各酵素の質量比に関して検討を行った。
[実施例３−１]
配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるエンドグルカナーゼと、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるセロビオハイドラーゼと、配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるβ−グルコシダーゼとキシラナーゼとβ−キシロシダーゼを０．２：１：０．２：０．２：０．２の質量比で混合して糖化酵素組成物を調製した。それを終濃度が稲藁１ｇあたり２ｍｇとなるように、前記前処理物に加え、５０℃で７２時間糖化処理を行って、糖化処理物を得た。糖化溶液の調整、糖濃度の測定は実施例１と同様に行った。各酵素の混合比を表４に、結果を図６に示す。
[実施例３−２]
配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるエンドグルカナーゼと、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるセロビオハイドラーゼと、配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるβ−グルコシダーゼとキシラナーゼとβ−キシロシダーゼを０．３：１：０．３：１．０：０．７の質量比で混合した以外は、実施例１と同様にして糖濃度の測定を行った。各酵素の混合比を表４に、結果を図６に示す。
[実施例３−３]
配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるエンドグルカナーゼと、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるセロビオハイドラーゼと、配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるβ−グルコシダーゼとキシラナーゼとβ−キシロシダーゼを０．３：１：１．０：０．７：０．３の質量比で混合した以外は、実施例１と同様にして糖濃度の測定を行った。各酵素の混合比を表４に、結果を図６に示す。
[実施例３−４]
配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるエンドグルカナーゼと、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるセロビオハイドラーゼと、配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるβ−グルコシダーゼとキシラナーゼとβ−キシロシダーゼを０．５：１：２．５：０．５：０．５の質量比で混合した以外は、実施例１と同様にして糖濃度の測定を行った。各酵素の混合比を表４に、結果を図６に示す。
[実施例３−５]
配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるエンドグルカナーゼと、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるセロビオハイドラーゼと、配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるβ−グルコシダーゼとキシラナーゼとβ−キシロシダーゼを１．０：１：０．３：０．７：０．３の質量比で混合した以外は、実施例１と同様にして糖濃度の測定を行った。各酵素の混合比を表４に、結果を図６に示す。
[実施例３−６]
配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるエンドグルカナーゼと、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるセロビオハイドラーゼと、配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるβ−グルコシダーゼとキシラナーゼとβ−キシロシダーゼを２．５：１：０．５：０．５：０．５の質量比で混合した以外は、実施例１と同様にして糖濃度の測定を行った。各酵素の混合比を表４に、結果を図６に示す。
[実施例３−７]
配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるエンドグルカナーゼと、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるセロビオハイドラーゼと、配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるβ−グルコシダーゼとキシラナーゼとβ−キシロシダーゼを０．３：１：０．３：１．３：０．３の質量比で混合した以外は、実施例１と同様にして糖濃度の測定を行った。各酵素の混合比を表４に、結果を図６に示す。
[実施例３−８]
配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるエンドグルカナーゼと、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるセロビオハイドラーゼと、配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるβ−グルコシダーゼとキシラナーゼとβ−キシロシダーゼを０．３：１：０．３：０．３：１．３の質量比で混合した以外は、実施例１と同様にして糖濃度の測定を行った。各酵素の混合比を表４に、結果を図６に示す。
図６に示すように、本発明のエンドグルカナーゼとセロビオハイドラーゼとβ−グルコシダーゼとを、質量比で０．２〜２．５：１：０．２〜２．５の範囲で混合すれば、いずれも最終糖濃度３．０％以上と非常に効率良く糖化反応を行うことができる。
また、添加するキシラナーゼ又はキシロシダーゼの量としては、セロビオハイドラーゼ質量比１に対して、０．２〜１．３が好ましい。
本発明は、基質への結合を考慮した酵素を複数用い、その質量比を詳細に検討をすることで、少ない酵素量でありながら、非常に効率よく糖化を行うことができる酵素組成物を提供することが可能となった。
【００１３】
ロの直径／コロニーの直径の値を、図２に示す。また、Ｈ１株及びＴＮ株のＣＭＣ分解活性値の経時変化を、図３に示す。
［００６６］
図２（ａ）から明らかなように、Ｈ１株のコロニーは、ＴＮ株のコロニーに比較して、ＡＺＣＬハロの直径が大きくなっている。従って、Ｈ１株は、ＴＮ株より多くの糖化酵素を産生していることが明らかである。
［００６７］
また、図２（ｂ）から明らかなように、Ｈ１株のコロニーは、ＴＮ株のコロニーに比較して、ＡＺＣＬハロの直径／コロニーの直径の値が約２倍になっている。従って、Ｈ１株は、ＴＮ株に対し、菌体あたりの糖化酵素活性が高いことが明らかである。
［００６８］
また、図３から、Ｈ１株は、ＴＮ株に比較して、培養期間のいずれにおいても、ＣＭＣ分解活性が有意に高いことが明らかである。ＣＭＣ分解活性は、セルロース分解活性を表す指標として用いられるため、Ｈ１株は、ＴＮ株に対し、優れた糖化酵素を産生することが明らかである。
［００６９］
次に、Ｈ１株から、本実施形態において用いられる糖化酵素であるエンドグルカナーゼとセロビオハイドラーゼとβ−グルコシダーゼとを抽出する方法について説明する。
［００７０］
先ず、Ｈ１株を、表３に示す組成を備える培養液に植菌し、３０℃で１４日間培養する。そして、前記培養を行った培養液を、孔径が０．２μｍのフィルターを用いてろ過する。
［００７１］

Claims (11)

  1. 基質としてのリグノセルロース系バイオマスを糖化処理する糖化酵素組成物において、
    セルロース結合ドメインを非含有のエンドグルカナーゼと、セルロース結合ドメインを含有するセロビオハイドラーゼと、セルロース結合ドメインを含有するβ−グルコシダーゼとを含むことを特徴とする糖化酵素組成物。
  2. 請求項１に記載の糖化酵素組成物において、
    前記β−グルコシダーゼに含有されているセルロース結合ドメインは、前記セロビオハイドラーゼに含有されているセルロース結合ドメインのアミノ酸配列に対して、７０％以上の相同性を示すアミノ酸配列からなることを特徴とする糖化酵素組成物。
  3. 請求項２に記載の糖化酵素組成物において、
    さらにキシラナーゼ又はキシロシダーゼを含むことを特徴とする糖化酵素組成物。
  4. 請求項２又は３に記載の糖化酵素組成物において、
    前記エンドグルカナーゼは、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる糖化酵素であることを特徴とする糖化酵素組成物。
  5. 請求項２又は３に記載の糖化酵素組成物において、
    前記セロビオハイドラーゼは、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる糖化酵素であることを特徴とする糖化酵素組成物。
  6. 請求項２又は３に記載の糖化酵素組成物において、
    前記β−グルコシダーゼは、配列番号３で表されるアミノ酸配列からなる糖化酵素であることを特徴とする糖化酵素組成物。
  7. 請求項２又は３に記載の糖化酵素組成物において、
    前記エンドグルカナーゼは、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる糖化酵素であり、前記セロビオハイドラーゼは、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる糖化酵素であり、前記β−グルコシダーゼは、配列番号３で表されるアミノ酸配列からなる糖化酵素であることを特徴とする糖化酵素組成物。
  8. 請求項７に記載の糖化酵素組成物において、
    前記糖化酵素組成物の総質量に対する前記エンドグルカナーゼと前記セロビオハイドラーゼと前記β−グルコシダーゼとの合計の含有量が、３０〜８０質量％の範囲であることを特徴とする糖化酵素組成物。
  9. 請求項８に記載の糖化酵素組成物において、
    前記糖化酵素組成物は、前記エンドグルカナーゼと前記セロビオハイドラーゼと前記β−グルコシダーゼとを、質量比で０．２〜２．５：１：０．２〜２．５の範囲で含むことを特徴とする糖化酵素組成物。
  10. 基質としてのリグノセルロース系バイオマスに、糖化酵素を添加して基質・糖化酵素混合物とし、前記基質・糖化酵素混合物を糖化処理して糖化溶液を得る糖化溶液の製造方法において、
    前記糖化酵素として少なくともセルロース結合ドメインを非含有のエンドグルカナーゼとセルロース結合ドメインを含有するセロビオハイドラーゼとセルロース結合ドメインを含有するβ−グルコシダーゼとを同時に、前記基質に添加することを特徴とする糖化溶液の製造方法。
  11. 基質としてのリグノセルロース系バイオマスに、糖化酵素を添加して基質・糖化酵素混合物とし、前記基質・糖化酵素混合物を糖化処理して糖化溶液を得る糖化溶液の製造方法において、
    前記糖化酵素として少なくともセルロース結合ドメインを非含有のエンドグルカナーゼを前記基質に添加した後、少なくともセルロース結合ドメインを含有するセロビオハイドラーゼとセルロース結合ドメインを含有するβ−グルコシダーゼとを添加することを特徴とする糖化溶液の製造方法。
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