DE2953253C1

DE2953253C1 - Verfahren zur Herstellung von Cellulase

Info

Publication number: DE2953253C1
Application number: DE2953253A
Authority: DE
Inventors: Benedict James Natick Mass. Gallo
Original assignee: US Department of Commerce
Current assignee: US Department of Commerce
Priority date: 1978-11-20
Filing date: 1979-11-05
Publication date: 1983-05-19
Also published as: IL58675A; US4275163A; EP0011767A1; JPS55500890A; CA1151089A; ZA796193B; IL58675A0; DE2953253A1; WO1980001080A1; DK221180A; ATE3118T1; EP0011767B1

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Cellulase gemäß dem Oberbegriff des Patentanspruchs 1.

Cellulose sjellt die hauptsächliche Speicherungsform von durch Photosynthese gebildeter Glucose und den Hauptbestandteil der in Biomasse umgewandelten Sonnenenergie dar. In der ganzen Welt erhöht sich der Bedarf an Energie und Nahrungsmitteln. Cellulose ist wegen ihres reichlichen Vorhandenseins ein vorteilhaftes Rohmaterial für die Befriedigung dieser Bedürfnisse. Die Glucose-Untereinheiten der Cellulose können in einer Vielzahl von Verfahren verwendet werden, die einerseits zur Erzeugung von Energie oder andererseits zur Herstellung von Protein dienen. Eine Hauptschwierigkeit, die de. Verbesserung der Technologie der Ausnutzung von Cellulose er'.gegenstand, bestand darin, daß es schwierif war, aus Cellulose mit vertretbaren Kosten in bezug auf 4en Energieaufwand und die Anforderungen an die Ausrüstung in annehmbarer Ausbeute Glucose zu erhalten. Die durch Cellulase katalysierte Hydrolyse der ^-1,4-Glucan-Bindungen von Cellulose unter Bildung des Disaccharids Cellobiose und die anschließende Hydrolyse der Cellobiose unter Bildung von Glucose stellt eine vorteilhafte denkbare bzw. mögliche Lösung für diese Schwierigkeiten dar. Die Herstellung ausreichender Mengen von Cellulase hängt jedoch davon ab, daß man eine geeignete Quelle findet, durch die große Mengen des Enzyms Cellulase in einem in annehmbaren Maße reinen Zustand geliefert werden.

Cellulasen werden im Verdauungsapparat von Schnecken, in bestimmten anaeroben Bakterien und in anderen Mikroorganismen, insbesondere in den Pansenbzw. Vordermagen-Mikroorganismen, die in den Verdauungsorganen vor. Wiederkäuern leben, gefunden. Es ist bekannt daß eine Anzahl von Pilzarten, in die Pilze der Klasse Ascomycetes wie Neurospora und Trichoderma eingeschlossen sind, Cellulase erzeugt. Die Pilzsysteme sind vielleicht die vorteilhaftesten Systeme, weil die Organismen gezüchtet werden können, ohne daß zu besonderen Züchtungsbedingungen wie der Anaerobiose gegriffen werden muß, Und weil zumindest einige zu einem schnellen Wachstum befähigt sind.

Trichoderma reesei, nachstehend als T. reesei bezeichnet, ist eine Ascomycöteh-Pilzärt, die früher der Art Trichoderma viride zugeordnet wurde. Im allgemeinen könnten alle Ascomyceten-Piize, die zum Synthetisieren einer vollständigen Cellulase befähigt sind, verwendet werden, um einen Stamm mit ähnlichen Eigenschaften zu gewinnen. T. reesei wird zur Zeit bevorzugt, weil große Mengen von Cellulasen extrazellulär erzeugt werden, [Simmons, E₁G, Abstracts of Second International Mycology Congress, Tampa, Florida, Serie 61? (1977),] In das Cellulasesystem, das durch diese Art erzeugt wird, sind die Enzyme EndQ-p-glüoanase, Exo-^-glucanase und 0-Glucosidase eingeschlossen, Endo-p-glucanase ist dazu befähigt* /J-glucosidische Bindungen zu hydrolysieren, die sich häuptsächlich an Stellen im Inneren des Cellulosemoleküls befinden. Exo-^-glucanase ist dazu befähigt, die

ι" hydrolytische Entfernung von. bisaccharid-Untereinheiten von den Enden der Cellulosekette zu katalysieren, wodurch als Produkt hauptsächlich Cellobiose geliefert wird. Die jJ-GIucosidäse katalysiert die Hydrolyse von Cellobiose zu Glucose. In den in den Ansprüchen und

^Ji der Beschreibung angewendeten Begriff Cellulase sind alle derartigen Enzyme, darunter isozymische Formen, eingeschlossen. Die durch T. reesei erzeugte Cellulase wird in dem Nährmedium gefunden. Die Synthese von Cellulase durch den Wildtyp von T. reesei erfolgt unter strenger metabolischer und genetischer Kontrolle, wobei sowohl eine Induktion als auch eine Repression beobachtet werden. Unter dem Begriff induktion ist zu verstehen, daß die Gegenwart des Substrats, auf das ein Enzym einwirkt, oder die Gegenwart eines analogen Substrats notwendig ist, da"mit das Enzym durch den Mikroorganismus synthetisiert werden kann. Repression ist ein Ausdruck, der angewendet wird, um das Phänomen zu beschreiben, daß die Gegenwart einer Substanz in dem Nährmedium ausreicht, um die Synthese eines Enzyms zu verhindern. Die Gegenwart eines Repressors für ein bestimmtes Enzym verhindert, daß die Genkodierung für dieses Enzym zum Ausdruck gebracht wird, und die Gegenwart eines Induktors wird zusätzlich benötigt, um das Gen zum Ausdruck zu bringen. Bei Kulturen des Wildtyps von T. reesei wirkt Cellulose als Induktor für die Synthese von Cellulase, weshalb die Gegenwart von Cellulose in dem Medium notwendig ist, um ein merkliches Ausmaß der Synthese von Cellulase zu erzielen. Eine Anzahl von Substanzen, insbesondere Glucose und Glycerin, wirken als Repressoren. Die für eine Synthese von Cellulase notwendigen Bedingungen sind demnach die Gegenwart von Cellulose und die fast vollständige Abwesenheit von Glucose. Wenn Cellulase synthetisiert und Cellulose in dem Medium abgebaut wird, wird jedoch Glucose erzeugt, was zu einer Repression der Cellulasesynthese führen kann. Die Menge bzw. Konzentration der durch den Wildtyp-Stamm erzeugten Cellulase ist deshalb nie sehr hoch. Außerdem ist die Synthese von Cellulase

μ durch eine Verzögerungsperiode nach der Repression gekennzeichnet. Sobald die Glucose in dem Nährmedium aufgebraucht ist, dauert es selbst in Gegenwart eines Induktors mehrere Stunden, bis die Synthese von Cellulase beginnt. Für eine maximale Cellulaseproduk tion ist es daher notwendig, den Wüdtyp-Stamm durch Mutation zu verändern, um die strengen Kontrollbedingungen zu modifizieren, die normalerweise die Geschwindigkeit begrenzen, mit der die Cellulasegene zum Ausdruck gebracht werden.

Gegenstand der Erfindung ist das im Patentanspruch 1 gekennzeichnete Verfahren zur Herstellung Von Cellulaie. Die Patentansprüche 2 und 3 nennen Ausgestaltungen dieses Verfahrens. Trichoderma reesei MCG 77 (NRRL 11,236), ein

es Mikroorganismus, der vorteilhafte Eigenschaften für die Herstellung von Cellulase-Enzymen hat, ist ein Stamm von T. reesei, bei dem es sich um das Endergebnis einer Vielzahl von Mutations- und Selektionsschritten han-

3 4

dejt, die in Fig, 1 in Vam eirjes QberWipKs, grsphiseh (nw?h?ledend »Is QlMeose-Stpß. bez,efplinet), Während bei

dargestellt werden, In Fig, 1 wird, such, der Μμμυηβη- der anderen FermentjerHng Kein Q|u.pp$e*Stoß durph-

St^fnmN014gezeigt,vondemMontenecQ|fri,B,S,uni| gefährt wurde, Kprve 1 stellt den Glucpie-Stqß dar,

Eyelejgh, P, E, in App|, and Enyirpn, MierqMQJ. 3<f, 777 Während &9ΓΥε % den G,|ucqse*Verbnw»ph, flarsteflti

(1077) berichtet haben. ' 5 Kijrve 3 bezeichnet βίηεη PMC-Versuch, mit GIucQse-

T, reesei MCG 77 (NRRL 11,236), nachstehend kurz Stoß und Kurv= 4 einen CMC-Versych qfine Glucpse-

mit »NRRL 11,236« bezeichnet, hat die folgenden Stoß, Kprve 5 stellt einen FP-Ver$uch mjt Glucose-Stoß

wichtigen Eigenschaften: ^J dar, w!hren.cj Ki?FV^e 6 einen FP-Versuch ohne

NRRL 11,236 erzeugt extracellular mit einer hohen Gjijcose-Stpß bezeichnet (CMC = Carbpxyrnethylcel-

Geschwindigkeit Cellulase, pie Erzeugung ypn Cejluja- IQ lujose; FP — Filterpapier).

se wird durch Glucose reprimiert, jedoch tritt im F i g. 5 zeigt die Ergebnisse von Fermentien<i;gen und

Anschluß an den völligen Verbrauch der Glucose oder der Erzeugung von Cellulase durch NRRL 11,236 und

an cjie Öberfüh rung in ein glucosefrejes Medium bei der QM 9414 in Gegenwart von 1% Cellulose oder

Ceflulaseproduktion keine auf dje Repression folgende Cellulose-Glycenn-Miscliungen, Pie Cellulaseaktivität

Verzögerungsperiode auf. Die Cellulasesyntheseist in 15 wurde unter Verwendung von Filterpapier (FP), Salicin

bezug auf eine Repression durch Glycerin nicht (S) oder Carboxymethylcellulose (CMC) bestimmt

empfindlich. Außer Cellulose kann als Induktor der F i g. 6 zeigt die Mengen an Gesamt-Cellulase, die bei

Cellulasesynthese beispielsweise eine lösliche Substanz einer sechstägigen Inkubation in Gegenwart von

wie Lactose eingesetzt werden. Xylose verstärkt die Lactose und Xylose als Induktoren für NRRL !1,236 und

durch Lactose induzierte Cellulasesynthese. Der Orga- 20 QM 9414 erzeugt wurden.

Die vorstehend beschriebenen Merkmale fübren zu Die Stämme QM 9414 und NG 14 wurden auf

einer Vielzahl von bedeutenden Betriebsvorteilen bei Kartoffel-Dextrose-Agar-Schrägkulturen gehalten,

der Herstellung von Cellulase durch Kulturen von 25 NRRL 11,236 wurde auf Agar-Schrägkulturen gehalten,

NRRL 11,236. Die schnelle Erholung nach der die Vogels Salze enthielten, die mit 0,00005%

Repression ermöglicht es, große Mengen von Cellulase (Gewicht/ Volumen) Biotin und 1,25 bis 2,25% (Gewicht/

mit einer hohen Geschwindigkeit zu synthetisieren, Volumen) Cellulose ergänzt waren. [Difco Manual,

nachdem zwecks Erzielung einer gewünschten Biomas- 9. Auflage, Difco Laboratories Ine, Detroit, (1953).]

se eine Züchtung auf Glucose durchgeführt wurde. Das 30 Einige Experimente wurden mit 10-Liter-Submerskultu-

Fehlen der Repression durch Glycerin ermöglicht es, ren unter Anwendung eines handelsüblichen Fermen-

Cellulase in kontinuierlichen Kulturen in Gegenwart ters durchgeführt. Das Nährmedium war ein basisches

eines Induktors zu synthetisieren. Glycerin ist eine Salzmedium, wie es von M. Mandels in Symposium On

relativ billige Kohlenstoffquelle für die Züchtung von Cellulose AS A Chemical and Energy Source,

NRRL 11,236, da Glycerin ein Nebenprodukt der 35 Biotechnol. Bioeng. Symp. No. 5, R. Wilke.Ed, Wiley-In-

Äthanolgärung ist Weil es möglich ist, mit einem terscience, New York, Seite 681 (1975) beschrieben

löslichen Zucker oder einer Kombination von Zuckern wird, jedoch wurde Harnstoff weggelassen und wurden

zu induzieren, wird das gesamte Gärverfahren verein- 0,1% (Gewicht/Volumen) Proteose-Pepton und 0,1%

facht, wodurch es ermöglicht wird, eine einfachere (Gewicht/Volumen) Polyoxyäthylensorbitanmonocleat

Ausrüstung anzuwenden und den Gesamt-Energiever- 40 hinzugegeben. Impfkulturen wurden mit Konidien aus

brauch zu vermindern. Da sich NRRL 11,236 unter den Schrägkulturen eingeleitet die drei Tage lang in dem

üblichen Kulturbedingungen als haploider Mikroorga- angegebenen Medium, das mit 0,75% (Gewicht/Volu-

nismus fortpflanzt, ist er im allgemeinen von einer men) Cellulose und 0,75% (Gewicht/Volumen) Glucose

Generation zur nächsten ohne genetische Veränderung ergänzt war, gezüchtet worden waren. Die Fermenter

exakt reproduzierbar. 45 wurden beimpft mit entweder einem lOprozcntigen

Der Stamm NRRL 11,236 wurde am 20. Dezember oder einem 20prozentigem (Volumen/Volumen) Inocu-

1977 in der Kultursammlung des Northern Regional Ium. Die Temperatur, der aufgelöste Sauerstoff und der

Research Centers des US-Landwirtschaftsministeriums, pH-Wert wurden während der Experimente kontrolliert

1815 North University Street, Peoria, Illinois, 61 604, und kontinuierlich aufgezeichnet. Der pH-Wert wurde

hinterlegt so anfänglich von 5,0 auf 3,0 sinken gelassen und durch

F i g. 1 gibt einen groben Überblick über das Zugabe von 2 η NH*OH, falls notwendig, auf 3,0

Verfahren zur Herstellung der Mutante NRRL 11,236 einreguliert Die Temperatur wurde auf 27°C bis 28°C

aus dem Elter T. reesei QM 6% Auch das Verfahren zur gehalten. Die Belüftung wurde auf eine Strömungsge-

Herstellung der nach dem Stand der Technik bekannten schwindigkeit von 2 l/min bei einem Manometerdruck

Mutante T. reesei NG 14 wird gezeigt. ss von 9,4i> bar eingestellt wobei das Rühren zwischen

F i g. 2 zeigt die Herstellung von Cellulase durch die 300 U/min und 500 U/min variiert wurde.

Mutanten NRRL 11,236, TKO 41 undQM9414₍ Die Celhiloseaktivitat wurde mit Carboxymethylcellu-

Fig.3 zeigt die Ergebnisse eines Züchtungsexperi- lose (CMC) oder mit Filterpapier (FP) als Substrat

tr.ents, bei dem zusätzlich zu der Erzeugung von gemessen, wie es von Andreotti, R. E„ u. a. in

Cellulase Filterpapier-Celiulaseeinheiten/m! (FP, Kur- 60 Proceedings Biocpnversion Symp., I.I.T., Delhi, Seite 249

ven 2), Mycel-Protein (MPr, Kurven 4), lösliches Protein (1977) beschrieben wird. Eine Einheit der Aktivität ist

(SPr, Kuryen 3) und Glucose (Kurven 1) in dem Medium die Menge des Enzyms, durch die die Freisetzung von

als Funktion der Zeit gemessen wurden. Es werden einem Mikromol Glucose pro Minute katalysiert wird.

Werte gezeigt, die mit NRRL 11,236 (Kreise) und mit Die Cellutaseaktivität mit Baumwolle als Substrat wird

QM 9414 (Quadrate) erhalten wurden. 65 in Milligramm redozierenden Zuckers (Glucose) ausge-

Fig.4 zeigt Ergebnisse von zwei parallel durchge- drückt, der erzeugt wird, wenn 1 ml des Kulturfiltrats

führten Fermentierungen. Bei der einen Fermentierung 24 h lang bei pH 4,8 und 50⁰C in einem nicht

wurde nach 74 h stoßweise 1 % Glucose hinzugegeben geschüttelten Reagenzglas auf 50 mg Baumwolle

einwirkt. 0-Glucosidase wurde in internationalen Einheiten (Mikromol Glucose, die pro Minute freigesetzt werden) unter Verwendung von Salcin gemessen, wie es von Mandels, M. u. a. in Biotechnol. Bioeng. Symp. No. 6, Wiley-Interscience, New York, Seite 21 (1976) beschrieben wird. Als Substrate für die Messung der Aktivität des gesamten Cellulasesystems wurden Filterpapier (FP) und Baumwolle verwendet. Zur Messung der Aktivität von Endo-/?-glucanase wurde Carboxymethylcellulose (CMC) als Substrat eingesetzt Der Stamm NRRL 11,236 wurde aus dem Wildtyp von T. reesei in einer Reihe von Schritten gewonnen, die mit einer Mutagenese und einer sich daran anschließenden Selektion verbunden waren, wie es in F i g. 1 in groben Umrissen erläutert wird. Der Stamm QM 9123 ist früher beschrieben worden. [Mandels, M. u. a. in Applied Microbiology 21. 152 (1971).] Der Stamm TKO 41 wurde durch Mutagenese mittels Ultraviolettlicht erzeugt und entsprechend der Fähigkeit zum Überleben der KhUiiiuiii-Behandlung scickitcii. Dei Stamm NRRL 11,236 wurde erzeugt, indem man den Stamm TKO 41 einer UV-Mutagenese unterzog, und auf der Basis seiner Befähigung zur Aufhellung bzw. Klärung von Cellulose auf einer 8% (GewicM/Volumen) Glycerin enthaltenden Agarplatte selektiert, und er wurde weiter selektiert hinsichtlich der Freiheit von einer Repression durch Glycerin in einer Submerskultur. Der Stamm NG 14 und sein Vorläufer sind früher beschrieben worden [Montenecourt, B. D. und Eveleigh. D.E. in Appl. and Environ. Microbiol. 34. 77 (1977).] Unter den beschriebenen Züchtungsbedingungen tritt die Erzeugung von Cellulase durch Trichoderma-Stämme typischerweise im Anschluß an die Periode des aktivsten Wachstums ein. Während der erster, ju Stunden wird der pH-Wert schnell sinken gelassen und erreicht die Biomasse ein Maximum, jedoch werden nur kleine Mengen an Cellulase erzeugt. Die größte Erzeugung von Ceilulase erfolgt während der zweiten Periode von 50 Stunden, während restliche Cellulose verbraucht wird, und die Biomasse bleibt in einen stationären Zustand oder vermindert sich langsam. Versuche zur Verlängerung der Phase der Enzymproduk'ion durch Zugabe von mehr Cellulose zu einem späteren Zeitpunkt der Fermentierung waren nur von n-ißigem Erfolg begleitet. Durch die Verwendung einer hochkristallinen Cellulose wie faserförmiger Baumwolle ·>. ird die Produktionsphase verlängert, weil das Substrat· langsamer verbraucht wird.

Dc Erzeugung von Celluiase wird bei den meisten AsconvvC""en-P;'zen. wobei Neurospora und Trichoderma eir.gesoK-T-sen sind, und bei allen Stämmen von T. p.-esei. ν.on·.. SRRL ' !.236 eingeschlossen ist. durch Glucke rvr.ru-.>ert Bei allen bekannten Stämmen von T. reesei mit Ausnahme von NRRL 11,236 tritt im Anschluß an den vollständigen Verbrauch der Glucose eine Postrepressions-Verzögerungsperiode mit einer beträchtlichen- Länge ein, während der die Erzeugung von Cellulase auf einem niedrigen Niveau fortgesetzt wird Tatsächlich ist im Falle von QM 9414 dieErhoIung von der Repression durch Glucose nicht vollständig, ·.veshalb dieser Stamm weniger Celluiase erzeugt wenn er auf Glucose gezüchtet wird als wenn er- auf Cellulose gezüchtet wird Die Fähigkeit von NRRL 11,236, sich schnell und vollständig von der Repression durch Glucose zu erholen, hai einen bedeutenden praktischen Vorteil, der darin besteht, daß diese Fähigkeit einen schnellen Aufbau von Biomasse durch Züchtung auf Glucose erlaubt woran sich nach der Übertragung auf ein von Glucose freies Cellulosemediurn eine schnelle Erzeugung von Cellulase anschließt. Durch diese Züchtungs-»Diät« wird in wesentlich verkürzten Zeiten eine maximale Erzeugung von Cellulase erzielt. Wie vorher festgestellt wurde, wurde der Stamm NRRL 11,236 so ausgewählt, daß er frei von Repression durch Glycerin ist. Diese Eigenschaft ist vom industriellen Standpunkt aus vorteilhaft, weil sie ermöglicht, daß Kulturen von NRRL 11,236 unter Bedingungen, die in jo bezug auf die Stoffwechselenergie nicht beschränkend sind, Cellulase erzeugen. Durch die Fähigkeit zur fortgesetzten Herstellung von Cellulase in Gegenwart von Glycerin mit ' ellulose als Induktor wird nahegelegt, daß die Mutation in NRRL 11,236 nicht bloß darin

ι i besteht, daß dieser Mikroorganismus gegenüber Glucose nicht reagierend gemacht wird, sondern eher darin besteht, daß die Qualität seiner Reaktion bzw. seines Ansprechens verändert wird.

Ein anderes auffälliges Merkmal von NRRL 11.236

-·' UCMCIIl U(II I! I, UdU HIMM. t l,J.;uuuiti

werden kann. Normale Induktoren der Cellulasesynthese beim Wildtyp von T. reesei sind Cellulose selbst und Cellobiose. Cellobiose ist im Vergleich mit Cellulose teuer und weist gemeinsam mit Cellulose den Nachteil auf, daß induzierte Cellulase unter Erzeugung von Glucose, eines Repressors, auf die Induktorsubstanz einwirkt. Durch die Fähigkeit zur Erkennung von induktoranalogen Substanzen wie Lactose wird eine Anzahl ion spezifischen methodologischen Vorteilen

Jf zur Verfügung gestellt. Durch die Fähigkeit, bei der Fermentierung mit löslichen Materialien zu arbeiten, werden die bei einer Fermenticrung mit unlöslichen Substanzen verbundenen technischen Probleme vermindert. Es tritt kein Verlust von Cellulase infolge Adsorption an die Oberfläche der restlichen Cellulose ein. Das Volumen des Fermenters wird mit einem höheren Wirkungsgrad ausgenutzt, da der NRRL 11,236-Biomasse ein größerer Anteil zur Verfügung gestellt werden kann und zum Rühren und zur Belüftung des Fermenters weniger Energie benötigt wird. Außerdem kann die Menge des Induktors erhöht werden, weil im Unterschied zu Cellulose keine Beschränkung durch die Masse bzw. das Volumen auferlegt wird. Eine noch !größere Bedeutung hat der Umstand, daß Lactose ein Hauptbestandteil der Molke.

eines Abfall- und Nebenprodukts der käseproduzieren-

; .den Industrie, ist. Demnach steht für eine Herstellung : ■ von Cellulase mit niedrigem Kostenaufwand ein großer Vorrat eines billigen Nebenprodukts zur Verfugung. In

5n dieser Hinsicht gewinnt die Tatsache an Bedeutung, daß Xylose, die selbst kein Induktor ist, die induzierende Wirkung der Lactose verstärkt Xylose wird bei der Vorbehandlung von pflanzlichen Cellulosen wie Stroh und Maisstengeln und -blättern in großen Mengen hergestellt Gegenwärtig wird bei solchen Verfahren soviel Xylose hergestellt daß der Preis sehr niedrig ist Die kombinierte Verwendung von Lactose und Xylose führt fast zur Verdoppelung der Cellulaseproduktion, die mit celluloseinduziertem NRRL 11,236 in Schüttel kolben-Kulturen erzielt wird, und bietet außerdem alle vorstehend beschriebenen Vorteile der löslichen Induk-

. toren. Außerdem wird durch die Fähigkeit zum Synthetisieren von Cellulase in Abwesenheit von Cellulose eine der bedeutenderen Schwierigkeiten, die der Erzielung hoher Ausbeuten entgegenstehen, nämlich die Tatsache, daß die Frodukte der Ceüulosehydrolyse. Cellobiose und Glucose, die Cellulasesynthese reprimieren, beseitigt Daher erlaubt die Erzeugung von

Cellulase mit NRRL 11,236 eine maximale Cellulasesynthese in einem cellulosefreien Medium. Nähere Einzelheiten zu den Wachstums- und Regulierungseigenschaften von NRRL 11,236 werden in den Beispielen angegeben.

Der Stamm NRRL 11,236 zeichnet sich weiter dadurch aus, daß er auf Kartoffeldextrose-Agar-Medium schlecht wächst und darauf anscheinend keine Koni',»-*2n bildet. Außerdem erzeugt der Stamm nach 6-bis 8tägiger Züchtung in einer Submerskultur auf dem Medium 4577 MP eine einzigartige blaßrosafarbene Kulturflüssigkeit. Dieses Medium hat die folgende Zusammensetzung (in Gewichtsprozent/Volumen):
KH₂PO₄, 1,5%; MgSO₄ · 7 H₂O, 0,03%; (NH₄J₂HPO₄, 0,28%; CaCI₂ · 2 H₂0,0,03%; Harnstoff, 0,06%; Proteo- 1 i sepepton, 0,1%; Biotin, 0,00005%; Mandels Spurenelemente. 1 ml (siehe die vorstehend erwähnte Literaturstelle von Mandels, M.) und eine Kohlenstoffquelle, im allgemeinen 1% Cellulose. Der Stamm NRRL 11,236 »*CIg» I" ^iCgCri'A'Sri VCri ivaufCmit'r ^w iTig/ΓΓ11/ ficiCn UCI

Mycel-Übertragung auf ein Kabicidin enthaltendes Medium nur ein geringes Wachstum, falls er überhaupt wächst.

Der Stamm NRRL 11,236 kann im allgemeinen auf jedem Medium gezüchtet werden, das für die Züchtung von T. reesei-Stämmen geeignet ist. Der pH des Mediums sollte auf dem Wert 3 oder einem höheren Wert gehalten werden.

Beispie Il ⁱⁿ

Er eugung von Cellulase in T. reesei-Stämmen: Jeder Stamm wurde in einem Fernbach-Behälter (Schüttelkolben) gezüchtet, der 1 Liter des vorstehend beschriebenen Mediums 4577 MP enthielt, das mit 1% (Gewicht/ Volumen) Cellulose ergänzt und mit 1,5% (Gewicht/Volumen) KH₂PO₄ gepuffert war. Die Kulturen wurden bei 28°C auf einer Rotations-Schüttelvorrichtung inkubiert. Zu den angegebenen Zeiten wurden aliquote Anteile von 5 ml aus der Kultur entnommen und in bezug auf λο den pH-Wert und die Cellulaseaktivität in der überstehenden Flüssigkeit geprüft. Die Ergebnisse für die Stämme QM 9414, TKO 41 und NRRL 11,236 werden in F i g. 2 gezeigt. Bei allen Stämmen verzögerte sich der Beginn der Erzeugung von Cellulase um etwa 2 Tage. Während dieser Zeit vergrößerte sich die Biomasse. (Diese Meßwerte werden nicht gezeigt.) Sobald die Cellulasesynthese begonnen hatte, wurde Cellulase durch den Stamm NRRL 11,236 mit einer höheren Geschwindigkeit und in einem größeren Ausmaß synthetisiert als durch die anderen Stämme.

Beispiel 2

Züchtung, Erzeugung von Cellulase und Reaktion auf den vollständigen Verbrauch von Glucose: F i g. 3 zeigt die Ergebnisse eines ähnlichen Züchtungsexperiments, bei dem zusätzlich zur Erzeugung von Cellulase Filterpapier-CelluIaseemheiten/ml (FP), Mycel-Protein (MPr), lösliches Protein (SPr) und Glucose in dem Medium (G) als Funktion der Zeit gemessen wurden. Der Stamm NRRL 1136 wurde mit QM 9414 verglichen. Die Kulturen wurden im wesentlichen wie in Beispiel 1 beschrieben gezüchtet, jedoch enthielt das Medium am Anfang 1% Glucose in 2% Fichtenholzschliff, der in einer Kugelmühle bis zur Erzielung einer Teilchengröße entsprechend einer lichten Maschenweite von 74 um gemahlen worden war. Mycel-Protein und lösliches Protein wurden durch das Verfahren von Lowry, O. H., u. a., Biochem. 193,265 (1951) gemessen. Ir, Fig. 3sind die Werte,die mit dem Stamm NRRL 11,236 erhalten wurden, durch Kreise dargestellt, während die Werte für QM 9414 durch Quadrate dargestellt werden. Die Kurven 1 geben den Glucoseverbrauch wieder. Die Kurven 2 stellen den FP-Versuch dar. Die Kurven 3 geben das lösliche Protein wieder, während die Kurven 4 das Mycel-Protein darstellen. Man kann sehen, daß der Beginn der Cellulasesynthese bei beiden Stämmen zeitlich im allgemeinen mit dem vollständigen Verbrauch der Glucose aus dem Medium übereinstimmte, jedoch begann die Cellulasesynthese bei NRRL 11,236 sofort und mit hoher Geschwindigkeit. Bei QM 9414 trat die Cellulasesynthese aufgrund einer Postrepressions-Verzögerung verspätet ein, und die Geschwindigkeit der Synthese war bedeutend niedriger als bei NRRL 11,236. Bei NRRL 11,236 wurden innerhalb von IO Stunden nach dem vollständigen Verbrauch der Glucose beträchtliche Mengen von Ceiiuiase synthetisiert. Bei beiden Stämmen war die Geschwindigkeit der Synthese von löslichem Protein in dem Medium und von Cellulase im wesentlichen parallel.

Beispiel 3

Experiment mit Glucose-Stoß: Zur weiteren Darlegung der Repression durch Glucose und des Fehlens einer Postrepressions-Verzögerung bei NRRL 11,236 wurde eine Kultur in der Wachstumsphase, bei der Cellulase synthetisiert wird, ein Glucose-Stoß verabreicht. Zur Einleitung der Züchtung in einem Fermenter wurde ein lOprozentiges (Volumen/Volumen) Inoculum von Mycel verwendet, das auf 1% (Gewicht/Volumen) Glucose gezüchtet worden war. Der Fermenter enthielt als Kohlenstoffquelle Cellulose in Form von 1,5% (Gewicht/Volumen) Fichtenholzschliff (lichte Maschenweite: 420 μηι), der weiter bearbeitet worden war, indem man ihn zweimal eine Minute lang durch eine Walzenmühle mit einer Spaltweite von 508 μπι hindurchlaufen ließ, und von 0,5% (Gewicht/Volumen) Baumwolle, die auch zweimal mit einer Walzenmühle mit einer Spaltweite von 254 μηι bearbeitet worden war. [Tassinari, T. und Macy, C, Biotechnol. Bioeng. 19, 1321 (1970).] Die Ergebnisse von zwei parallel durchgeführten Fermentierungen werden in F i g. 4 gezeigt. Bei der einen Fermentierung wurde nach 74 Stunden ein lprozentiger Glucose-Stoß hinzugefügt, während bei der anderen kein Glucose-Stoß erfolgte. Die mit 1 bezeichnete Kurve stellt den Glucose-Stoß dar, während Kurve 2 den Glucoseverbrauch darstellt. Kurve 3 bezeichnet den CMC-Versuch "v* Glucose-Stoß und Kurve 4 den CMC-Versuch ohne Glucose-Stoß-Kurve 5 bezeichnet den FP-Versuch mit Glucose-StoS, während Kurve 6 den FP-Versuch ohne Glucose-Stoß bezeichnet Cellulase wurde unter Verwendung von Filterpapier (FP) als Substrat und von Carboxymethylcellulose (CMC) als Substrat geprüft Man kann sehen, daß, selbst nachdem die Cellulasesynthese begonnen hatte, eine weitere Synthese durch Glucose reprimiert wurde. Die Cellulasesynthese begann jedoch wieder ohne eine bedeutende Postrepressions-Verzögerung, sobald die Glucose in dem Medium vollständig verbraucht war. Innerhalb von 10 Stunden nach dem vollständigen Verbrauch der Glucose wurden beträchtliche Mengen von Cellulase synthetisiert Die Ceüulasemenge, die am Ende in dem Fermenter mit Glucose-Stoß erzeugt worden war, war so hoch wie bei dem KontroUversuch oder höher.

Beispiel 4

Wirkungen von Glycerin auf die Synthese von Cellulase durch NRRL 11,236 und QM 9414: Die zwei Stämme wurden in SchUttelkolben gezüchtet, die 30 ml s des vorstehend beschriebenen Mediums enthielten, worin entweder 1% (Gewicht/Volumen) Cellulose oder Cellulose-Glycerin-Mischungen, wie sie in Fig.5 gezeigt werden, enthalten waren. Bei diesen Experimenten waren die Vfedien mit 1,5% (Gewicht/Volumen) KH₂PO₄ gepuffert, um den pH auf einem größeren Wert als 3,0 zu halten. Zweifache Kulturen des Stammes QM 9414 und dreifache Kulturen des Stammes NRRL 11,236 wurden 162 Stunden lang bei 28°C auf einer sich hin- und herbewegenden Schüttelvorrichtung gezüchtet, is Die Cellulaseaktivität in der überstehenden Flüssigkeit wurde dann unter Verwendung von Filterpapier (FP), Salicin (S) oder Carboxymethylcellulose (CMC) als Substrat bestimmt. Die Durchschnittswerte f·"?r jeden Test wurden graphisch dargestellt. Die Erzeugung von Cellulase wurde bei QM 9414 durch die Gegenwart von 2,5% Glycerin im wesentlichen vollkommen reprimiert. Andererseits wurde durch NRRL 11,236 Cellulase synthetisiert, und zwar in wesentlich größeren Mengen als durch QM 9414 in Abwesenheit von Glycerin. Die Zugabe von Glycerin führte nur zu einer mäßigen Verminderung der Menge der synthetisierten Cellulase. Selbst in Gegenwart von 7,5% (Gewicht/Volumen) Glycerin wurde durch NRRL 11,236 beträchtlich mehr Cellulase synthetisiert als durch nicht reprimiertes QM 9414. Der Stamm NRRL 11,236 kann Glycerin im Stoffwechsel umwandeln und ist dazu befähigt, Cellulase zu synthetisieren, während gleichzeitig Glycerin verbraucht wird. (Diese Meßwerte werden nicht gezeigt.) Die Reaktion von NRRL 11,236 auf Glycerin ist vom praktischen Gesichtspunkt aus von großer Bedeutung. Die Hydrolyse der Cellulose kann für eine im großen Maßstab erfolgende Erzeugung von Ethanol mit der Ethanqlgärung verbunden werden. Glycerin, das während der Herstejfung von Ethanol als Nebenprodukt gebildet wird, könnte für die Züchtung und für die Produktion von Biomasse des Pilzes NRRL 11,236, die für die Erzeugung von mehr Cellulase eingesetzt wird, in den Kreislauf zurückgeführt werden.

Beispiel 5

Wirkungen von Lactose und Xylose auf die Induktion der Celluiasesynthese. Fig.6 zeigt die Mengen der gesamten Cellulase, die bei einer 6tägigen Inkubation in Gegenwart der angegebenen Substanzen als Induktoren erzeugt we Jen, wobei der Stamm NRRL 11,236 mit QM 9414 verglichen wird.

Bei dem Züchtungsmedium handelte es sich um das Medium 4577 MP, das so modifiziert war, daß es 0,08% Harnstoff, 1,25% KH₂PO₄ und 0,53% (NH₄J₂H PO« enthielt. Wie vorher beobachtet wurde, war die durch Cellulose allein induzierte Erzeugung von Cellulase bei NRRL 11,236 wesentlich größer "als bei QM 9414. Überraschenderweise war die Synthese von Cellulase durch NRRL 11,236 durch Lactose induzierbar, die sogar effektiver zu sein schien als Cellulose. Xylose wirkte bei keinem der beiden Stämme als Induktor. Xylose verstärkte jedoch bei NRRL 11,236 in hohem Maße sowohl die Induktion durch Cellulose als auch die Induktion durch Lactose. Eine maximale Cellulaseproduktion, die beträchtlich größer war als die bei einer Induktion durch Cellulose erhaltene Cellulaseproduktion, wurde beobachtet, als Xylose in Verbindung mit Cellulose oder Lactose als Induktor vorhanden war. Die Eigenschaft des Stammes NRRL 11,236, daß er für eine maximale Celluiasesynthese durch die Kombination von zwei löslichen Zuckern, Lactose und Xylose, induziert werden kann, scheint eine allein diesem Stamm zukommende Eigenschaft zu sein.

Hierzu 4 Blatt Zeichnungen

Claims

Patentanspreche; 53^13

1. Verfahren zur Herstellung von Cellulase durch Züchten von TricRoderma reesei und Gewinnen der ejctrazelluJär erzeugten CeJlülase, dadurch gekenn ζ e ϊ c h η e t, daß man als Trichoderma reesei Trichoderinä reesei MCG 77 (NRRL 11,236) züchtet,

2. Verfahren nach Anspruch 1* dadurch gekennzeichnet, daß man als Induktor der Cetlulasesynthese Lactose einsetzt

3. Verfahren nach Anspruch I, dadurch gekennzeichnet, daß das Nährmediüm Glucose oder Glycerin enthält.