DE60126148T2

DE60126148T2 - Verfahren zur herstellung von heterologen proteinen in fungi

Info

Publication number: DE60126148T2
Application number: DE60126148T
Authority: DE
Inventors: Unilever Res. Vlaard. Antonius M. J. VAN DE LAAR; Unilever Research Colworth Nigel M. Sharnbrook LINDNER; Unilever Research Vlaardingen Peter NIEUWPOORT
Original assignee: Unilever NV
Current assignee: Unilever NV
Priority date: 2000-12-13
Filing date: 2001-11-16
Publication date: 2007-05-31
Anticipated expiration: 2021-11-17
Also published as: AU1604902A; CZ20031659A3; EP1349945B1; WO2002048382A3; US20040077069A1; AU2002216049B2; HUP0302655A3; SK287621B6; US7560249B2; PL362773A1; PL204737B1; SK7402003A3; CA2427665A1; ATE351911T1; HUP0302655A2; ES2278681T3; JP4494716B2; ZA200303353B; HU228689B1; CN1481439A

Description

Bereich der Erfindung
Die Erfindung betrifft ein Verfahren für die Herstellung eines heterologen Proteins oder Peptids in einem Fungus.
Hintergrund der Erfindung
Herstellung von heterologem Protein in einem Wirt wie einem Fungus ist gut bekannt. EP-A-481008 offenbart Herstellung eines heterologen Proteins in einer Hefe, welche auf Glucose gezüchtet wird.
Die industrielle, großtechnische Herstellung eines heterologen Proteins durch einen Wirtsorganismus in einer Fed-Batch-Fermentation zeigt im Allgemeinen drei Phasen.
Die erste Phase ist die Batch-Phase, welche definiert ist als die Phase, in welcher die Zellen zur erforderlichen Konzentration gezüchtet werden. In dieser Phase werden die Zellen exponentiell gezüchtet. Modelle, welche die Batch-Phase beschreiben, setzen voraus, dass Zellen nicht absterben, dass Sauerstoff im Überfluss vorhanden ist und dass alle anderen Bedingungen so sind, dass Wachstum unbegrenzt stattfinden kann. Dies impliziert, dass in der Batch-Phase alle Nährstofferfordernisse in ausreichender Menge befriedigt werden. Zusammenfassend ist die Batch-Phase die Phase, wo Zellen amplifiziert werden, während Herstellung von (heterologem) Protein noch niedrig ist.
Die zweite Phase ist die Feed-Phase, welche definiert ist als die Phase, in welcher Kohlenstoffquelle und andere Erfordernisse in einem relativ konzentrierten Flüssigkeitsstrom bei einer vorher berechneten Rate, der „Feed-Rate", in einen Fermenter eingespeist werden. In dieser Phase liegt der Schwerpunkt auf Proteinherstellung durch die gewachsenen Zellen und Zellwachstum, was zu einer Zunahme von Biomasse führt. Substrat, das in den Fermenter eingespeist wird, wird bei diesem Stadium im Allgemeinen für Zellwachstum und Produktsynthese verwendet. Das Zellwachstum wird durch die Feed-Rate kontrolliert, um ein Optimum beim Zellwachstum und der Herstellung von heterologem Protein zu erhalten.
Schließlich wird die dritte Phase erreicht, welche als die Rückgangsphase definiert ist, in welcher begrenzende Bedingungen auftreten. In dieser Phase ist zum Beispiel die Sauerstoffkonzentration in dem Fermenter niedrig bis Null, was in einigen Fällen zur Bildung von Ethanol führt. In diesem Stadium werden sich die meisten Zellen auf Erhaltung fokussieren und üblicherweise wird die Produktsynthese verringert. Obwohl in dieser Phase Zellwachstum noch beobachtet werden kann, ist Wachstum im Allgemeinen sehr begrenzt bis Null. Allmählich können Zellen in dieser Phase Lebensfähigkeit verlieren.
Die Herstellung von heterologem Protein auf einem Medium, welches eine gewöhnliche Kohlenstoffquelle wie Glucose oder andere auf Zucker basierte Kohlenstoffquelle umfasst, ist zufriedenstellend, bis begrenzende Bedingungen am Ende der Feed-Phase vorhanden zu sein beginnen. Beispiele für begrenzende Bedingungen schließen verringerte Sauerstoffkonzentration, verringerte Nährstoffe wie Vitamine, Kohlenstoff, Stickstoff und Akkumulation von toxischen Verbindungen im Wachstumsmedium ein.
Falls ein Fungus, insbesondere eine Hefe, auf einem Medium gezüchtet wird, welches Glucose als Kohlenstoffquelle umfasst, wird, sobald begrenzende Bedingungen auftreten, Herstellung von heterologem Protein beträchtlich verringert.
Für Hefen, welche auf gewöhnlichem Medium einschließlich einem Zucker als Kohlenstoffquelle gezüchtet werden, sind die oben beschriebenen Phasen in einer Fed-Batch-Fermentation vorhanden. Sobald die Rückgangsphase begonnen hat, wird daher spezifische Herstellung, welche definiert ist als Menge an heterologem Protein oder Peptid, hergestellt pro Gramm Biomasse, beibehalten oder verringert. Obwohl die Zelldichte hoch ist, ist Produktsynthese daher in der Rückgangsphase niedrig. Ein weiterer Nachteil von gewöhnlichen Medien, welche häufig Glucose als Kohlenstoffquelle umfassen, ist die hohe Menge an Substrat, die zu Biomasse umgewandelt wird, statt Umwandlung zu Produkt, welches in dem Kontext dieser Erfindung üblicherweise ein heterologes Protein ist. Daher begleitet in solchen Systemen eine relativ hohe Menge an Biomasse unvermeidbar die Herstellung von hohen Graden an heterologem Protein.
Diese hohe Biomasse für zu einem viskosen Fermentationsmedium, in welchem zum Beispiel leicht Sauerstoffbegrenzung entsteht.
Daher gibt es einen Wunsch für ein Verfahren zur Herstellung von heterologem Protein in einem Wirt wie einem Fungus, welches zu hoher Ausbeute an heterologem Protein selbst unter begrenzenden Bedingungen führt, wo normalerweise Rückgang und ver ringerte spezifische Herstellung vorhanden wären, während zur gleichen Zeit die spezifische Herstellung des Wachstumssystems im Vergleich zu den bekannten Wachstumssystemen beibehalten oder erhöht wird.
Das Verfahren der vorliegenden Erfindung überwindet mindestens eines der angezeigten Probleme.
Zusammenfassung der Erfindung
Es ist überraschend gefunden worden, dass Fungi, gezüchtet auf einem Medium, welches Ethanol als Hauptkohlenstoffquelle und einen Induzierer wie Galactose umfasst, um die Herstellung eines heterologen Proteins zu kontrollieren, hohe spezifische Herstellung von heterologem Protein zeigen, während spezifische Herstellung des heterologen Proteins selbst unter begrenzenden Bedingungen überraschend hoch ist.
Überraschenderweise zeigen gemäß diesem Verfahren gezüchtete Fungi nicht die gut bekannten Kennzeichen von Rückgang, welche für Fungi angetroffen werden, welche auf den traditionellen Glucose-basierten Medien gezüchtet werden. Unter Fortsetzung der Speisung mit Medium, welches diese spezifische Kohlenstoffquelle umfasst, erhalten oder erhöhen die Fungi sogar den absoluten und spezifischen Herstellungsgrad von heterologem Protein.
Daher betrifft die Erfindung ein Verfahren für die Herstellung eines heterologen Proteins durch einen Fungus, umfassend Wachstum von besagtem Fungus auf einem Medium, umfassend eine Kohlenstoffquelle, worin 50–100 Gew.-% von besagter Kohlenstoffquelle Ethanol ist und worin das Medium zusätzlich einen Induzierer umfasst.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Im Kontext der Erfindung umfasst der Begriff Fungus Hefen und Schimmel.
Für den Zweck der Erfindung ist der Begriff heterologes Protein so gemeint, dass er sowohl Proteine, als auch Peptide einschließt.
Ein heterologes Protein ist ein Protein, welches durch den Fungus nicht natürlich hergestellt wird, sondern nur nachdem der Fungus dermaßen modifiziert worden ist.
Wo Gewicht-Prozentsätze angezeigt werden, sind dieses Gewicht-Prozentsätze auf Gesamtprodukt oder Gesamtmediumsgewicht, sofern nicht anders angezeigt.
Wo der Begriff Sauerstoffkonzentration verwendet wird, wird auf gelöste Sauerstoffkonzentration verwiesen, welche durch das in den Beispielen veranschaulichte Verfahren gemessen wird.
Das Ende der Batch-Phase wird definiert als der Moment, wenn das gesamte den Zellen zur Verfügung gestellte Kohlenstoffsubstrat verbraucht worden ist.
Induktionsphase wird definiert als die Phase, welche nach der Batch-Phase von dem Moment an beginnt, wenn Induktion von heterologem Protein begonnen wird, bis zu dem Moment, wenn maximale Induktion für die verwendete spezifische Induziererkonzentration erhalten wird.
Kohlenstoffquelle wird definiert als das Substrat, welches die Zufuhr von Kohlenstoff und Energie zur Zelle zur Verfügung stellt. Fungi erhalten ihren Zellenkohlenstoff überwiegend aus organischen Verbindungen. Diese dienen gewöhnlich sowohl als Kohlenstoffquelle, als auch als Energiequelle: sie werden teilweise in das Zellmaterial assimiliert und teilweise oxidiert, um Energie vorzusehen. In diesem Kontext wird auf H. Schlegel in General microbiology, Cambridge University Press, 1992, 7. Auflage, Seite 194 verwiesen.
Die Erfindung betrifft ein Verfahren für die Herstellung eines heterologen Proteins durch einen Fungus. Um dieses Protein herzustellen, wird der Fungus so genetisch modifiziert, dass kontrollierte Herstellung dieses heterologen Proteins oder Peptids möglich ist.
Jedes geeignete Konstrukt oder Transformationsverfahren kann für diese genetische Modifikation verwendet werden. Beispiele für geeignete Konstrukte und Transformationsverfahren werden in EP-A-481008 gegeben, welches hiermit durch Verweis eingeschlossen wird.
Im Allgemeinen wird der modifizierte Fungus nach Modifikation einen (integrierten) Vektor umfassen, welcher das Gen umfasst, welches für das heterologe Protein kodiert, unter der Kontrolle eines Promotors. Die Wirksamkeit des Promotors wird durch den sogenannten Induzierer reguliert. Beispiele für Promotor schließen die Galactose-Promotor wie GAL4, GAL7 ein, welche durch Galactose induziert werden; Methanol-induzierte Promotor, induziert durch Methanol; Ethanol-Promotor, induziert durch Ethanol; Temperatur-regulierte Promotor, induziert durch eine Temperaturveränderung; Phosphat-regulierte Promotor, induziert durch die Gegenwart von Phosphat; und Glucose-reprimierbare Promotor, induziert durch die Abwesenheit von Glucose.
Der Fungus wird auf einem Medium gezüchtet, welches eine Kohlenstoffquelle umfasst, von welcher 50 bis 100 Gew.-% Ethanol ist, in Kombination mit der Gegenwart eines Induzierers in dem Medium.
Nach Stand der Technik wird von der Verwendung von Ethanol als Kohlenstoffquelle im Allgemeinen abgeraten, wie durch die unten zitierte Offenbarung beispielhaft angeführt. Zusammenfassend wird von der Verwendung von Ethanol anstelle von Glucose als Kohlenstoffquelle berichtet, dass es die Biomasse-Ausbeute verringert, höheren Sauerstoffverbrauch erfordert und somit kein oder begrenztes Wachstum unter Sauerstoff-begrenzenden Bedingungen vorsieht. Ferner kann die Ethanol-Toxizität von Stämmen zu Verlust bei Lebensfähigkeit und Zelltod führen. Dies wird zum Beispiel in Tabelle 1 von The yeasts, Band 3, 2. Ausgabe, Kapitel 6 offenbart. Es wird speziell auf den Anhang 1 dieser Offenbarung verwiesen, welche offenbart, dass für Hefe die Wachstumsrate auf Ethanol 0,1 h^–1 gegenüber 0,35 h^–1 auf Glucose ist. Dieser Anhang offenbart ferner, dass auf einem Medium mit Ethanol als Kohlenstoffsubstrat, Hefen einen höheren Sauerstoffverbrauch zeigen, als auf einem Medium, welches Glucose als Kohlenstoffsubstrat umfasst.
Wachstum von Zellen auf Ethanol als Kohlenstoffquelle wird ferner durch Shiba et al. (J. of bioscience and bioengineering, Vol. 89, Seite 426–430, 2000) beschrieben. Shiba offenbaren Expression von Carboxypeptidase Y (CPY) unter Verwendung von GAL10 Promotor in einem Saccharomyces cerevisiae gal80 Mutanten. Das Wachstumsmedium umfasst Ethanol als die einzige Kohlenstoffquelle. Beim Beginn von Ethanol-Einspeisung wird sowohl von der Wachstumsrate, als auch der CPY-Herstellung berichtet, dass sie abnehmen. Dieses System ist nicht unter der Kontrolle eines Induzierers.
Die vorliegende Erfindung sieht ein Verfahren vor, worin Proteinherstellung in Gegenwart eines Mediums beibehalten oder sogar erhöht wird, welches eine Kohlenstoffquelle umfasst, von welcher 50 bis 100 Gew.-% Ethanol ist, insbesondere wenn begrenzende Wachstumsbedingungen entstehen. Ferner ist das Verfahren gemäß der Erfindung auf jede Art Fungus anwendbar und erfordert keine spezifischen gal80 Mutanten zum Wachstum. Das Verfahren der Erfindung ist auch durch Induktion kontrollierbar.
Saliola, M. et al., (Applied and environmental microbiology, Jan. 1999, p. 53–60) offenbart Verwendung des Ethanol-induzierbaren KlADH4-Promotors für heterologe Genexpression in Kluyveromyces lectis. Dieses Dokument lehrt, dass Expression optimal ist, wenn Ethanol als Promotor und gleichzeitig als einzige Kohlenstoffquelle in einem Fed-Batch-System verwendet wird. Dieses Herstellungssystem ermöglicht keine Kontrolle von Genexpression in der Feed-Phase.
Jin, S. et al., (Journal of Biotechnology, Vol. 54, Seiten 161–174, 1997) offenbarten rekombinantes S. cerevisiae Wachstum auf Gemischen aus Galactose und Ethanol.
Ein weiterer Nutzen des Verfahrens gemäß der Erfindung ist Kontrolle von Wärmeerzeugung, welche für die Herstellung von wärmelabilen Proteinen wichtig ist.
Es wird bevorzugt, dass das Medium eine Kohlenstoffquelle umfasst, von welcher 50 bis 100 Gew.-% Ethanol ist, in Kombination mit der Gegenwart eines Induzierers in dem Medium durch alle Phasen hindurch, aber es wurde gefunden, dass es möglich ist, ein Medium zu verwenden, welches diese Erfordernisse in der Batch-Phase nicht erfüllt, solange die Erfordernisse durch das Medium der Feed-Phase erfüllt werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform betrifft die Erfindung ein Verfahren für die Herstellung eines heterologen Proteins durch einen Fungus, welches Verfahren eine Batch-Phase und eine Feed-Phase umfasst, und worin das Medium der Feed-Phase eine Kohlenstoffquelle umfasst, von welcher 50 bis 100 Gew.-% Ethanol ist und worin das Medium der Feed-Phase zusätzlich einen Induzierer umfasst.
Verglichen mit den bekannten Wachstumssystemen, welche üblicherweise Glucose oder anderen Zucker als Hauptkohlenstoffquelle enthalten, ermöglicht das Medium gemäß der Erfindung hohe spezifische Herstellungsgrade selbst unter begrenzenden Bedingungen; also es gibt vorzugsweise keine Rückgangsphase.
Von der spezifischen Herstellung wurde sogar gefunden, dass sie am höchsten in der Feed-Phase unter begrenzenden Sauerstoffbedingungen ist, während für Glucose-basierte Wachstumssysteme die höchste spezifische Herstellung üblicherweise in der Feed-Phase gefunden wird, wo Menge an Biomasse noch relativ niedrig ist.
Ohne durch irgend welche Theorien gebunden sein zu wollen nehmen die Anmelder an, dass die Rückgangsphase wegen der Verwendung eines Mediums, welches eine Kohlenstoffquelle umfasst, von welcher 50 bis 100 Gew.-% Ethanol ist, in dem Verfahren der Erfindung verlängert oder sogar abwesend ist.
In dem Verfahren des Herstellens eines heterologen Proteins sind die Einspeisbedingungen vorzugsweise optimiert, so dass Zellwachstumsrate und Herstellung von heterologem Protein optimal sind. Wie oben angezeigt, wird ein Fed-Batch-System unter Verwendung eines Fermenters hochgradig bevorzugt, falls der Fungus in industriellem Maßstab gezüchtet wird.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform betrifft die Erfindung ein Verfahren für die Herstellung eines heterologen Proteins durch einen Fungus, welches Verfahren eine Batch-Phase, eine Induktionsphase und eine Feed-Phase umfasst, worin in besagter Feed-Phase

a) Pilzzellen zu einer Zelldichte von mindestens 5 g/l auf einem Medium gezüchtet werden, welches jede Kohlenstoffquelle umfasst, ohne spezifische Präferenz, und die Pilzzellen nachfolgend zu einer Zelldichte von mehr als 5 g/l, vorzugsweise 10 bis 90 g/l, bevorzugter 40 bis 60 g/l unter Verwendung eines Mediums gezüchtet werden, welches einen Induzierer und eine Kohlenstoffquelle umfasst, worin 50–100 Gew.-% von besagter Kohlenstoffquelle Ethanol ist
b) nachdem die Zelldichte von Schritt (a) erhalten worden ist, begrenzende Wachstumsbedingungen erzeugt werden,
c) nachdem diese begrenzenden Bedingungen eingesetzt haben, die Zellen weiter auf einem Medium gezüchtet werden, welches eine Kohlenstoffquelle umfasst, worin 50–100 Gew.-% von besagter Kohlenstoffquelle Ethanol ist.

In diesem bevorzugten Verfahren werden in einem ersten Schritt Zellen in einer Batch-Phase gezüchtet, bis Kohlenstoffsubstrat verbraucht worden ist, und in einem zweiten Schritt werden die Zellen zu einer ausreichenden Zelldichte gezüchtet, um Herstellung von heterologem Protein in hohen Mengen zu ermöglichen. In den ersten Stadien dieser zweiten Phase wird Herstellung von heterologem Protein durch Zugabe eines Induzierers zu dem Feed-Medium induziert. Die Zeit, die es braucht, um von Null Induktion, und somit sehr niedrigem Herstellungsgrad von heterologem Protein, bis zu maximaler Induktion zu kommen, wird die Induktionsphase genannt. Diese Induktionsphase bildet das erste Stadium der Feed-Phase.
Begrenzende Bedingungen in einem Fermenter können auf mehreren Wegen erhalten werden. Begrenzende Bedingungen werden als jene Bedingungen definiert, in welchen exponentielles Zellwachstum nicht länger möglich ist und Zellwachstum zurückgeht.
Vorzugsweise werden in dem Verfahren der Erfindung begrenzende Bedingungen in einem Medium durch ein Verfahren erzeugt, welches ausgewählt wird aus der Gruppe umfassend

a) Verringerung der Sauerstoffkonzentration in dem Fermentermedium, vorzugsweise auf unter 30%, bevorzugter unter 15%,
b) Überdosieren des Mediums mit Ethanol, bis der Ethanolgrad in dem Medium bei oder über der Wachstum begrenzenden Konzentration für die Zellen des Stamms ist, der in dem Medium gezüchtet wird,
c) Verringern des Grads an anderen wesentlichen Inhaltsstoffen für Wachstum der Zellen, wobei besagte Inhaltsstoffe vorzugsweise ausgewählt werden aus Stickstoff, Phosphor, Schwefel und Vitaminen.

Vorzugsweise erhöht sich nach der Batch-Phase das Feed-Profil exponentiell mit Biomasse-Herstellung. Wenn Sauerstoffbegrenzung entsteht und in die Rückgangsphase eingetreten wird, wird die Feed-Rate vorzugsweise auf eine Rate eingestellt, eine Ethanolkonzentration von unter 10 Vol.-% in dem Fermentermedium beizubehalten. Dies kann zum Beispiel durch eine lineare Feed-Rate oder eine pulsierte Feed-Rate oder eine schrittweise Feed-Rate erreicht werden.
In einer sogar bevorzugteren Ausführungsform wird das Verfahren der Erfindung als wiederholtes Fed-Batch-Verfahren durchgeführt.
Vorzugsweise ist der Induzierer geeignet, den Promotor einzuschalten, welcher operabel mit dem heterologen Gen in dem Genkonstrukt verbunden ist, welches für Transformation des Wirt-Fungus verwendet wird. Bevorzugte Induzierer sind Galactose, Methanol, Temperatur und Phosphate.
Der am meisten bevorzugte Induzierer ist Galactose.
Die gegenwärtige Erfindung bezieht sich nicht auf Expressionsverfahren, worin Ethanol sowohl als Induzierer, als auch als (Teil der) Kohlenstoffquelle verwendet wird.
Wenn Galactose der Induzierer ist, sollte die Menge an Galactose in dem Medium vorzugsweise so sein, dass der Promotor zum gewünschten Grad eingeschaltet wird, während die Menge so gering ist, dass Galactose nicht metabolisiert wird. Um dies zu verhindern ist es möglich, einen Stamm zu verwenden, welcher nicht in der Lage ist, den Induzierer zu metabolisieren.
Vorzugsweise ist die Zusammensetzung des Feed-Mediums so, dass das Medium in dem Fermenter von 0,1 bis 10 Gew.-% Galactose, bevorzugter von 0,05 bis 1 Gew.-%, sogar noch bevorzugter von 0,05 bis 0,2 Gew.-% Galactose umfasst.
Die Kohlenstoffquelle in dem Medium gemäß der Erfindung umfasst mindestens 50 Gew.-% und bis zu 100 Gew.-% Ethanol. Vorzugsweise umfasst die Kohlenstoffquelle von 80 bis 100 Gew.-% Ethanol. Der Rest der Kohlenstoffquelle kann zum Beispiel ein Zucker wie Glucose, Galactose, Lactose, Sucrose, Fructose oder eine andere Verbindung wie Glycerol, Acetat oder komplexe Kohlenstoffsubstrate wie Molke und Melassen sein.
Der Fungus kann eine Hefe oder ein Schimmel sein. Beispiele für geeignete Hefegattungen schließen Saccharomyces, Kluyveromyces, Pichia, Hansenula ein. Beispiele für geeignete Schimmel schließen Aspergillus, Rhizopus, Trichoderma ein. Der besonders bevorzugte Organismus ist Saccharomyces cerevisiae.
Das heterologe Protein kann jedes Protein oder Peptid sein, von welchem Herstellung gewünscht wird. Vom Verfahren gemäß der Erfindung wurde gefunden, dass es für die Herstellung von Frostschutz-Peptiden, Antikörpern oder Fragmenten davon, oder Enzymen wie Cutinase und Galactosidase besonders geeignet ist. Frostschutz-Peptide sind Proteine, die die Fähigkeit haben, das Wachstum von Eis zu modifizieren, und werden zum Beispiel in Biotechnology advances, Vol. 13, Nr. 3, pp 375–402, 1995 durch Griffith et al. beschrieben, welches hiermit durch Verweis eingeschlossen wird.
Das Medium für die verschiedenen Phasen im Wachstum des Fungus umfasst im Allgemeinen eine Kohlenstoffquelle, gegebenenfalls einen Induzierer, dessen Anwesenheit nach der Batch-Phase erforderlich ist, und gegebenenfalls weitere Inhaltsstoffe wie Vitamine, Hefeextrakt, Spurenmetallionen, Säuerungsmittel, um den pH bei einem gewünschten Grad zu halten, Phosphatsalze, Sulfatsalze, Wasser und Schaumverhütungsmittel.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Herstellen eines heterologen Proteins oder Peptids, worin das Batch-Medium von 1–40 Gew.-% Glucose, Wasser, Spurenmetalle, gegebenenfalls ein Schaumverhütungsmittel, Hefeextrakt, Vitamine, Phosphatsalze und Sulfatsalze umfasst und worin das Feed-Medium von 5 bis 35 Vol.-% Ethanol, 0,1–10 Gew.-% Galactose, Wasser, Spurenmetalle und gegebenenfalls Schaumverhütungsmittel, Hefeextrakt, Vitamine, Phosphatsalze und Sulfatsalze umfasst und worin die „Feed-Rate" „φ" von 0,25 bis 4 g/Min. bei einem 10 Liter Maßstab oder einem entsprechenden Wert für eine Fermentation in größerem Maßstab ist.
Die Erfindung betrifft ferner ein heterologes Proteinisolat, insbesondere Frostschutz-Peptidisolat, erhalten durch das Verfahren gemäß der Erfindung.
Die Erfindung wird nun durch die folgenden nichtbegrenzenden Beispiele veranschaulicht werden.
Beispiele
Medien und Kultivierung
Alle Medien- und Kultivierungsdaten basieren auf 10 Liter Maßstab Ethanolfermentation.
Für 10 m' Maßstab ist es grob das Gleiche, angepasst an Maßstabsfaktor 1000.
Medien: Vorkulturmedien:
Batch- und Feed-Medien werden in Tabelle 1 für einen 10 Liter Maßstab aufgelistet. Tabelle 1

* Ethanol rein, 96,2% Vol./Vol. Gehalt, nicht denaturiert

Alle Medien wurden für 25 Minuten bei 121°C/1,2 bar (Linden Autoklav) sterilisiert, Zucker getrennt. Die Leitungs wassermengen werden unten beschrieben und die Gesamtmenge ist so, dass das Gesamtgewicht wie in der untersten Reihe von Tabelle 1 angezeigt ist. Zusammensetzung von Egli-Vitaminen und Spurenmetallen Tabelle 2
Vitamine waren 0,22 μm Filter-sterilisiert
Stamm
Der verwendete Stamm war Saccharomyces cerevisiae CEN.PK102-3A. Der Basis CEN.PK2 S. cerevisiae Stamm ist kommerziell erhältlich von EUROSCARF, Institute for Microbiology, Johann Wolfgang Goethe-Universität Frankfurt, Marie-Curie-Straße 9; Gebäude N250, D-60439 Frankfurt, Deutschland.
Dieser S. cerevisiae Stamm ist nicht in der Lage, Galactose zu metabolisieren, da das GAL1-Gen durch Insertion von Sequenzen, abgeleitet vom S. cerevisiae URA3 Gen zerrissen worden ist. Der Wirtsstamm wurde mit einem Expressionsplasmid transformiert, welches die folgenden Elemente umfasst:
Promotor: GAL7-Promotor, Leiter GAPDH. GAL7-Promotor: Zwei stromaufwärts aktivierende Sequenzen sind immer vorhanden. Sie sind 2 natürliche Elemente, die Teil der Sequenz sind, wie angefügt.
Selektionsmarker: Leu2d
Signalsequenz: Invertase (SUC2)
Integrationsziel: Fragment von rDNA Wiederholung mit einzigartiger Restriktionsstelle für auf eine spezifische Region zielende Integration im Hefe-Chromosom XII
Heterologes Gen:
Beispiel 1: Ein Frostschutz-Protein-Gen, welches für das Ocean-Pout HPLC12-Frostschutz-Protein kodiert (WO-A-9702343).
Beispiel 2: K609B, ein Antikörper gegen virulente Faktoren in Ferkeln.
Beispiel 3: Protein VHH G, welches HGL11 ist, welches ein Immunglobulin mit schwerer Kette ist; der Lipase-Inhibitor gegen menschliche Magenlipase, offenbart in EP-A-1134231.
Beispiel 4: Protein VHH P, welches HPL18 ist, welches ein Immunglobulin mit schwerer Kette ist; der Lipase-Inhibitor gegen menschliche Pankreas-Lipase, offenbart in EP-A-1134231.
Die Proteine von Beispiel 2–4 sind Antikörper, erhalten durch Immunisierung eines Lamas gemäß dem in EP-A-1134231 offenbarten Verfahren.
Kultivierung
Stammlagerung:
Die Stämme wurden bei –80°C in Einzel-Batch von YNB-gewachsenen Kulturen, 1:1 verdünnt mit einem Gemisch aus Magermilch und 20% Glycerol gelagert.
Inokulation:
50 ml YNB wurden mit 1 ml gelagertem Stamm inokuliert und für 48 Stunden ± 2 Stunden bei 30°C bei 150 U/Min. inkubiert.
Nachfolgend wurde das Inokulum auf 500 ml von 2% YPD übertragen, gefolgt von Inkubation für 24 Stunden ± 2 Stunden bei 30°C bei 150 U/Min.
Fermenter:
Die Fermentationen wurden in Standard-Fermentern mit einem Arbeitsvolumen von zehn Litern durchgeführt. Zur Temperaturkontrolle war der Fermenter mit einer Kühlschlange und einem Heizfinger ausgestattet. Baffles hatten Standardmaße. Ein Impeller von Typ Rushton mit sechs Flügeln wurde zum Rühren verwendet. Gelöster Sauerstoff (DO₂) wurde mit einer Ingold DO₂-Elektrode (Mettler-Toledo) gemessen und der pH wurde mit einer Ingold Impro 3000 Gel-Elektrode (Mettler-Toledo) gemessen. Ein Massenspektrofotometer Prima 600 (VG Gas-Analysesystem) wurde zum Messen des Abgases verwendet. Das ganze Fermentationsverfahren war automatisiert und Software-gesteuert, aber könnte auch manuell auf der Basis der unten vorgesehenen Leitung durchgeführt werden.
Ein Feed-Profil wurde auferlegt, um die Fermentation zu kontrollieren. Der pH wurde unter Verwendung von 3M Phosphorsäure (Baker) und 12,5% Vol./Vol. Ammoniak (Merck) kontrolliert.
DO₂ wurde bei 30% durch automatische Anpassung der Impeller-Geschwindigkeit kontrolliert, bis maximale Rührergeschwindigkeit eintrat (1000 U/Min.).
Während der Fermentation wurden 5 ml Proben für Trockengewichtsbestimmung und Produktkonzentrationsanalyse mit einem Autosampler entnommen und bei 4°C gekühlt.
Batch-Phase:
Um die Batch-Phase zu beginnen, wurden 500 ml YPD-Inokulum zu 5,5 l Batch-Medium zugegeben. Die Fermentationsparatmeter waren wie gemäß Tabelle 3.1 Wenn der Ethanolgehalt im Abgas auf 300 ppm sinkt, wurde die exponentielle Einspeisung (Feed) gestartet.
Feed-Phase:
Das Feed-Medium wurde in zwei Feed-Flaschen, angeschlossen an die gleiche Pumpe, getrennt.
Eine Feed-Flasche enthielt das Ethanol und Leitungswasser bis 2 Liter und wurde durch die Bodenplatte in den Fermenter eingespeist. Die zweite Feed-Flasche enthielt alle anderen Feed-Bestandteile und Wasser bis 2 Liter und wurde durch die Oberplatte eingespeist.

Aus zwei Flaschen, angeschlossen an eine Pumpe, wurde die gleiche exponentielle Feed-Rate gemäß Gleichung 1 angewendet. Für zwei Flaschen ist die sich ergebende Feed-Rate das Doppelte der Pumprate.

(Gleichung 1)

Φ_v,t = Feed-Rate	g/Min.
μ = Wachstumsrate	h^–1
X₀ Biomasse bei Feed-Beginn	g (Mw = 24,6 g/mol)
t = Zeit seit Feed-Beginn	Min.
P_feed = Feed-Dichte	g Ethanol/g Feed
Y_X,S = gesch. Ausbeute von Biomasse	g X/g Substrat
60 = Zeitfaktor	Min./h

Feed-Parameter waren gemäß Tabelle 3.

Tabelle 3: Fermentation Feed-Parameter für 10 Liter Ethanolfermentation
Wenn die Sauerstoffkonzentration 0% war, wurden die begrenzenden Bedingungen eingesetzt und die Pumprate wurde auf lineare Feed-Rate eingestellt. Diese Einspeisung wurde fortgesetzt, bis das gesamte Feed erschöpft war. Ergebnisse: Beispiel 1

* Spezifische Herstellung: mg AFP/g Trockensubstanz

Auf der Basis dieser Ergebnisse wird geschlossen, dass Herstellung von AFP, wenn in der Feed-Phase nachdem begrenzende Bedingungen auftreten, das Speisen mit Medium, welches eine Kohlenstoffquelle enthält, welche 100 Gew.-% Ethanol ist, fortgesetzt wird, zu überraschend hoher spezifischer Herstellung von AFP führt.
Es wurde beobachtet, dass die Herstellung von Biomasse konstant ohne Verlust von absoluter AFP-Produktivität war.
Vergleichsbeispiel
Wachstumsmedium in der Feed-Phase enthielt kein Ethanol, sondern 100 Gew.-% Glucose als Kohlenstoffquelle. Das Medium für diesen Versuch wird oben beschrieben. Auch werden die Fermenter-Feed-Bedingungen oben spezifiziert, mit den folgenden Ausnahmen:
Das Feed-Medium wurde auf den Fermenter aus einer Feed-Flasche angewendet, welche alle Bestandteile enthielt, und wurde durch die Bodenplatte in den Fermenter eingespeist. Eine exponentielle Feed-Rate wurde gemäß Gl. 1 angewendet.
Feed-Parameter waren gemäß Tabelle 3 mit Ausnahme des X0-Werts, welcher auf 2,11 mol eingestellt wurde, um die gleiche Feed-Rate mit einer Feed-Flasche wie bei der Ethanolfermentation mit zwei Feed-Flaschen an einer Pumpe zu ergeben.
Die Ergebnisse waren wie folgt:
Es wird geschlossen, dass wenn das Wachstumsmedium nur Glucose als Kohlenstoffsubstrat enthält, AFP-Herstellung von dem Moment an sinkt, wenn begrenzende Bedingungen einsetzen. AFP-Herstellung steigt nicht länger und die Herstellung geht zurück. Ergebnisse – Beispiel 2

* Spezifische Herstellung: mg heterologes Protein/g Trockensubstanz

Es wird geschlossen, dass die spezifische Herstellung von heterologem Protein unter Verwendung von Ethanol als Kohlenstoffquelle viel höher ist, als bei Glucose als Kohlenstoffquelle. Ergebnisse – Beispiel 3

* Spezifische Herstellung: mg heterologes Protein/g Trockensubstanz

Es wird geschlossen, dass die spezifische Herstellung von heterologem Protein unter Verwendung von Ethanol als Kohlenstoffquelle viel höher ist, als auf Glucose als Kohlenstoffquelle. Ergebnisse – Beispiel 4

* Spezifische Herstellung: mg Protein/g Trockensubstanz

Es wird geschlossen, dass die spezifische Herstellung von heterologem Protein unter Verwendung von Ethanol als Kohlenstoffquelle viel höher ist, als auf Glucose als Kohlenstoffquelle.

Claims

Verfahren für die Herstellung eines heterologen Proteins durch einen Fungus, umfassend Wachstum von besagtem Fungus auf einem Medium, umfassend eine Kohlenstoffquelle, worin 50–100 Gew.-% von besagter Kohlenstoffquelle Ethanol ist, und worin das Medium zusätzlich einen Induzierer umfasst.
Verfahren gemäß Anspruch 1, welches eine Batch-Phase und eine Feed-Phase umfasst, worin das Medium der Feed-Phase eine Kohlenstoffquelle umfasst, von welcher 50 bis 100 Gew.-% Ethanol ist und worin das Medium der Feed-Phase zusätzlich einen Induzierer umfasst.
Verfahren gemäß Anspruch 2, worin das Medium der Feed-Phase eine Kohlenstoffquelle umfasst, von welcher 50 bis 100 Gew.-% Ethanol ist, und zusätzlich Galactose als ein Induzierer.
Verfahren gemäß Anspruch 2 oder 3, worin das Verfahren in einem Fermenter durchgeführt wird, welcher mit Medium bei einer Feed-Rate gespeist wird, welche so ist, dass die Ethanolkonzentration in dem Fermenter unter 10 Vol.-% gehalten wird.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1–4, welches Verfahren eine Batch-Phase, eine Induktionsphase und eine Feed-Phase umfasst, worin in besagter Feed-Phase a) Pilzzellen zu einer Zelldichte von mindestens 5 g/l auf einem Medium gezüchtet werden, welches jede Kohlenstoffquelle umfasst, ohne spezifische Präferenz, und die Pilzzellen nachfolgend zu einer Zelldichte von mehr als 5 g/l, vorzugsweise 10 bis 90 g/l, bevorzugter 40 bis 60 g/l unter Verwendung eines Mediums gezüchtet werden, welches einen Induzierer und eine Kohlenstoffquelle umfasst, worin 50–100 Gew.-% von besagter Kohlenstoffquelle Ethanol ist b) nachdem die Zelldichte von Schritt (a) erhalten worden ist, begrenzende Wachstumsbedingungen erzeugt werden, c) nachdem diese begrenzenden Bedingungen eingesetzt haben, die Zellen weiter auf einem Medium gezüchtet werden, welches eine Kohlenstoffquelle umfasst, worin 50–100 Gew.-% von besagter Kohlenstoffquelle Ethanol ist.
Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, worin das Verfahren als ein wiederholtes Fed-Batch-Verfahren durchgeführt wird.
Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, worin der Induzierer ausgewählt wird aus der Gruppe umfassend Galactose, Methanol, Temperatur und Phosphate.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 2–7, worin das Feed-Medium von 0,1 bis 10 Gew.-% Galactose umfasst.
Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, worin die Kohlenstoffquelle 80–100 Gew.-% Ethanol umfasst.
Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, worin der Fungus eine Hefe, vorzugsweise Saccharomyces cerevisiae ist.
Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, worin das heterologe Protein ausgewählt wird aus Frostschutz-Peptiden, Antikörpern oder Fragmenten davon und Enzymen.
Verfahren gemäß Anspruch 5, worin das Batch-Medium von 1–40 Gew.-% Glucose, Wasser, Spurenmetalle, gegebenenfalls ein Schaumverhütungsmittel, Hefeextrakt, Vitamine, Phosphatsalze und Sulfatsalze umfasst und worin das Feed-Medium von 5 bis 35 Vol.-% Ethanol, 0,1–10 Gew.-% Galactose, Wasser, Spurenmetalle und gegebenenfalls Schaumverhütungsmittel, Hefeextrakt, Vitamine, Phosphatsalze und Sulfatsalze umfasst und worin die „Feed-Rate" „φ" von 0,25 bis 4 g/Min. am 10 Liter Maßstab ist.