KR810000047B1

KR810000047B1 - 페드뱃취 배양법을 이용한 구연산의 제조방법

Info

Publication number: KR810000047B1
Application number: KR7901763A
Authority: KR
Inventors: 배종찬; 현형환
Original assignee: 경주현; 제일제당 주식회사
Priority date: 1979-05-30
Filing date: 1979-05-30
Publication date: 1981-02-04

Abstract

내용 없음.

Description

페드뱃취 배양법을 이용한 구연산의 제조방법

제1도는 회분배양에서의 미생물의 생장과 구연산 생산경로를 표시하는 그래프.

제2도는 연속배양에서 미생물의 비생장율(μ)에 대한 구연산의 비생산율(QP : -·-) 및 이산화탄소의 비방출율(QCO2 : -·-)의 관계를 나타내는 그래프.

본 발명은 질소원을 생장제한기질(growth-limiting substrate)로 사용하는 페드뱃취 배양법을 이용하여 노르말 파라핀(n-paraffin)을 탄소원으로 이용하는 미생물에 의한 구연산의 제조방법에 관한 것으로 발효 배양중에 질소원을 연속적으로 첨가시켜 미생물의 생장속도를 통제함을 그 특징으로 하고 있다.

지금까지의 발효공업에서는 회분배양법(batch culture)이 주로 이용되어 왔으나 발효공정 기술의 개발에 의한 생산수율의 향상이 발효공업분야에서 중요한 과제로 등장하고 있어 구연산 제조공업에 이러한 페드뱃취 배양법을 이용하게 되면 회분 배양법에 비해 고농도의 구연산을 포함한 발효액을 얻을 수 있음은 물론 탄소원(노르말 파라핀)에 대한 구연산의 생산수율 역시 매우 향상되어 생산원가의 절감을 가져올 수 있다.

구연산 발효에서는 배지성분으로 사용되는 탄소원이 생산 원가에 지대한 영향을 미치는 요소이기 때문에 탄소원에 대한 생산수율의 향상은 생산원가면에서 상당한 잇점이 있는 것이며, 또한 탄소원으로서 노르말 파라핀은 당에 비해 단위중량당 더 많은 탄소수를 포함하고 있기 때문에 노르말 파라판을 이용한 구연산 생산이 당을 이용하는 것보다 더 높은 수율을 얻을 수 있을 뿐만 아니라 가격면에서도 느로말 파라핀이 저렴하다는 잇점이 있어 노르말 파라핀을 이용한 구연산 발효가 활발히 연구되어 왔던 것이다.

한편, 구연산 제조의 회분재양법은 질소원이 발효초기에 첨가되기 때문에 다량의 이산화탄소를 방출하게 되어 구연산의 생선수율이 저하되는 결점이 있으나 질소원의 통제에 의한 페드뱃취 배양법은 이산화탄소의 방출을 억제함으로서 구연산의 생성수율 및 농도의 현저한 증가를 유도하는 잇점이 있는 것이다.

일반적으로 페드뱃취 배양법은 발효배지중의 어떤 기질이 미생물의 생장을 저해하는 경우 또는 기질이 발효산물의 생산에 기질 저해(catabolite repression of product formation)를 일으키는 경우에 주로 이용되어 왔는데 이러한 경우 회분 배양법에 의한 발효는 그러한 기질의 발효액중의 초기농도에 의해 미생물의 생장이 저해를 받거나 발효산물의 생산이 저해를 받게 된다.

그러므로 그러한 특정기질을 발효기간중에 미생물의 생장속도에 맞추어 연속적으로 첨가하는 패드뱃취 배양법을 이용하면 발효기간중 발효액 중의 그 기질의 농도가 거의 제로(zero)상태에서 유지되기 때문에 미생물 생장의 저해나 발효산물의 생산에 대한 기질저해는 방지될 수 있을 것이다.

그러나, 노르말 파라핀을 이용한 구연산 제조에 있어서는 제1도에 나타난 바와같이, 질소원을 발효초기에 고농도로 첨가되는 회분 배양법의 경우 질소원이 발효액중에 고농도로 존재하는 미생물의 생장기(growth phase)에는 구연산이 전혀 생산되지 않으며 질소원이 완전히 고갈될 즈음에서 부터 구연산이 발효액중에 축적되기 시작하는 것이다.

본 발명자들은 이같은 점에 착안하여 질소원에 대한 실험을 다각적으로 실시하여 오던중 질소원의 연속적인 첨가에 의해 발효액중의 질소원의 농도를 거의 제로(zero)상태로 제한 통제함으로서 발효초기부터 구연산이 생산되도록 하여 탄소원에 대한 생산수율을 향상시키는데 성공하였다.

이러한 생산수율의 이론적 배경을 고찰해 보면 표 1에 나타난 바와같이 미생물 대사에 의한 이산화탄소(CO₂)의 방출을 억제하여 탄소원의 소모를 감소시킴으로서 구연산의 생산을 증가시킨다는 것을 알 수 있다.

본 발명에서는 질소원의 첨가방법에 따라 다음과 같이 세가지 방법의 페드뱃취 배양법을 연구하였다.

1. 지수적 페드뱃취 배양(exponential fed-batch culture) : 질소원의 지수적 첨가(exponential feeding)에 의해 배양액중에서의 미생물의 비생장율(specific growth rate)을 일정하게 유지시키는 배양방법.

2. 선형적 페드뱃취 배양(linear fed-batch culture) : 배양중에 질소원의 첨가속도(Feed rate)를 시간에 따라 변하지 않고 일정하게 유지시키는 배양법.

3. 지수적 선형적 페드뱃취 배양 : 질소원의 첨가방법에 있어서 배양초기에는 지수적 첨가, 그 다음 선형적으로 첨가함으로서 위의 두가지 방법을 혼합해서 사용하는 방법.

질소원으로는 황산암모니움, 암모니아수, 암모니아, 요소, 염안등이 페드뱃취 배양법에서 사용될 수 있으며 구연산 발효를 위한 미생물로는 캔디다 리폴리티카 IFO 1437 치아민 요구주(candida lipolitica IFO 437 thiamine auxotroph)가 사용되었다.

이하 본 발명을 좀더 상세히 설명하면,

먼저 캔디다 리폴리티카 IFO 1437 치아민 요구주를 실시예 1에 기재된 내용과 같은 조성의 배지 5ℓ를 포함한 10ℓ발효조(일본 마푸비시 회사 제품)에 식균하여 실시예 1 기재된 내용과 동일한 실험조건하에서 뱃취 및 페드뱃취 배양에 대해 구연산의 생성수율 농도 및 탄소평형(carbon balance)등을 검토하였던바, 표 1에 나타난 바와같이 페드뱃취 배양에서의 구연산의 생성수율 및 농도 뱃취 배양에 비해 현저히 향상되었다. 페드뱃취 배양에서는 이러한 구연산 수율의 향상에 대한 기작을 밝히기 위해 표 1에 나타난 탄소평형을 관찰해 보면 뱃취 배양법에 비해 페드뱃취 배양에서는 탄소원으로부터 CO₂방출로의 탄소전환은 현저히 감소되고 구연산으로의 탄소전환은 현저히 증가되었음을 알 수 있다.

즉, 페드뱃취 배양에서는 배양액중의 질소원의 농도을 통제함으로서 CO₂의 방출을 억제하여 탄소원의 소모가 감소되어 보다 많은 탄소가 구연산 생산으로 유도되기 때문에 구연산 생성수율이 증가되는 것으로 사료된다.

[표 1. 페드뱃취 배양의 효과]

구연산 수율 및 구연산 농도는 질소원(질소베이스 : 0.42g-N/1)으로 황산 암모니움 암모니아수, 요소를 사용하였을때 거의 동일한 결과를 나타내었으며 그 평균치를 취한 것이다.

구연산의 수율은 다음식

에 의해 계산되었으며 건조균체의 탄소함량은 탄소분석기(carbon analyzer)로 분석한 결과 건조균체량(Dry cell mass)의 50%였다.

지수적 페드뱃취 배양에서 질소원의 첨가속도(F ; 1/hr)는 식

에 의해 계산될 수 있으며, SO, YX/S, μ, t, XO는 각각 미생물의 비생장율(1/hr^-1) 배양시간(hr), 미생물의 초기 총건조 균체량(g) 저장조내의 질소원의 농도(N base : g/ℓ)질소원에 대한 미생물의 수율계수(g-dry cell/g 질소원 : N base)이다.

본 실험에서는 YX/S는 17.0이었다.

지수적 페드뱃취 배양에서 미생물의 비생장율은 상기식에 의해 계산된 질소원의 첨가속도에 의해 일정하게 유지될 수 있으며 표 1에서는 0.032hr^-1에서 유지되었다. 첨가방법에 있어서는 질소원 용액(4.24g-N/ℓ) 500㎖이 multigraph-controller(Uoinon Giken Co type 17F)를 사용하여 배지 45ℓ가 들어 있는 발효조에 첨가된다.

상기식에 의해 계산되어 나온 황산암모니움의 첨가속도(F)는 multi-graph-controller에 기억될 수 있어 지수적으로 첨가된다.

뱃취 배양과 페드뱃취 배양에서 사용된 질소원의 농도는 다같이 0.4g-N/ℓ이지만 뱃취배양(액량5ℓ)에서는 초기에 첨가된다. 또한 선형적 페드뱃취 배양에서는 질소원용액(4.2g-N/ℓ)500㎖이 4.5ℓ의 배지를 포함한 발효조에 페리스탈틱 펌프(peristaltic pump)를 사용하여 140시간 동안 일정한 속도로 첨가된다.

지수적 선형적 페드뱃취 배양에서는 처음에 질소원 용액(4.24g-N/ℓ)250㎖을 미생물의 비생장율이 0.1hr-1이 되도록 지수적으로 첨가하고 난다음 나머지 용액(4.24g N/ℓ)250㎖은 선형적으로 110시간동안 첨가되었다. 미생물의 비생장율의 값을 선택하는 기준을 찾기 위한 연속배양을 한 결과 제2도에서 나타나는 바와같이 희석속도(dilution rate : D)즉 비생장율이 0.04hr-1 근처에서 구연산의 비생산율(specific production rate. mg citrate/g-cell. hr)이 최고치를 보여줬기 때문에 지수적 페드뱃취 배양에서는 미생물의 비생장율을 0.04hr^-1근처에서 통제하였다.

본 발명은 회분배양법에 비해 고농도의 구연산을 포함한 발효액을 얻을 수 있음은 물론 탄소원에 대한 구연산의 생산 수율 역시 매우 향상되어 생산원가의 절감을 가져올 수 있는 특징이 있다.

본 발명을 실시예에 따라 상세히 설명하면 다음과 같다.

[실시예 1]

노르말 파라핀 39gℓ(sg=0.778, C₁₃=0.3, C₁₄=8.6, C₁₅=578, C₁₆=21.8, C₁₇=8.1, C₁₈=2.5 C19=0.6, C20=0.3w/w%의 조정), 황산암모니움 3g/ℓ, 제일인산카리 0.5g/ℓ, 황산마그네슘(7H20) 0.5g/ℓ염화나트륨 0.1g/ℓ, 효모엑키스 0.5g/ℓ, 치아민 염산(Thiamine, HCl) 50㎍/ℓ, 황산철(FeSO4, 7H20) 1mg/ℓ, 황산망간(MnSO4, 4H20) 2mg/ℓ, 황산아연(ZnSO4, 7H20) 2mg/ℓ, 황산구리(CuSO4, 5H20) 50㎍/ℓf등으로 된 배지 100㎖을 포함한 1ℓ-플라스크에 캔디다 리폴리티카 IFO 1437 치아민 요구주를 접종시켜 4일간 진탕배양후 10ℓ-발효조의 본 배양을 위한 전 배양액으로 사용된다. 전 배양에서는 산도를 조정하기 위해 2일 배양에서 건열살균한 탄산칼슘을 10g/ℓ의 농도가 되도록 첨가한다. 뱃취 및 페드뱃취의 본 배양에서는 노르말 파라핀 70g/ℓ, 황산암모니움 2g/ℓ(질소 베이스 : 0.42-N/ℓ)로 한 것 이외에는 전 배양의 배지 조성과 동일하며 10ℓ발효조에서 액량 5ℓ, 온도 30℃, 통기속도 1.0vvm, 교반속도 900rpm, 내압 0.5㎏/㎠으로 하여 수행되었다.

발효도중 배양액의 pH는 10N 가성소다 용액으로 자동적으로 6.0에서 조절되었으며 소포제는 타이머가 부착된 페리스탈릭 펌프에 의해 첨가되었다. 발효중 가성소다 용액의 첨가가 거의 중단되던 발효는 종결되며 페드뱃취배양에서의 질소원의 첨가방법은 전술한 바와같다.

건조 균체 중량은 발효액을 혼합 유기용매(노르말 부타놀 : 에타놀 : 클로로포름=10 : 10 : 1v/v)로 희석하여 0D660을 측정한 다음 표준곡선에 의해 확산 된다.

각종 생성물의 화학적인 분석을 위한 발효액은 원심분리(12,000g, 4℃, 10분)한 다음 여과지(TOTY filter paper No.2)로 여과하여 사용하며 구연산은 펜티브로모 아세톤방법(pentabromoacetone method)에 의해 측정되고 노르말파라핀은 개스 크로마토그라피(Gas chromatography Model 063, Hitachi Ltd)로 측정한다.

또한 방출되는 CO₂의 양은 CO₂분석기를 사용하여 측정되었다.

위와같이 행한 실험결과 뱃취 배양에서는 구연산의 수율이 137%, 구연산의 농도 95.9g/ℓ였으나 미생물의 비생장율을 0.02hr^-1로 조절한 지수적 페드뱃취 배양법에서는 구연산 생성수율 155%, 구연산 농도 109.9g/ℓ였다. 건조균체의 농도는 질소원의 농도를 2g/ℓ로 고정하였기 때문에 뱃취 및 페드뱃취에서 다같이 7.2g/ℓ였다.

[실시예 2]

실시예 1과 동일한 실험조건하에서 질소원(황산 암모니움)의 첨가속도만 달리한 즉, 미생물의 비생장율을 0.05hr^-1에서 조절한 지수적 페드 뱃취 배양에서는 구연산 수율은 149%, 구연산 농도는 108.5g/ℓ였다.

[실시예 3]

실시예 1과 동일한 실험조건에서 질소원인 황산암모니움의 농도를 6g/ℓ(질소베이스 : 1.27g-N/ℓ)가 되도록 첨가하였을때 그 첨가속도가 미생물의 비생장율이 0.042hr^-1가 되도록 조절한 지수적 페드뱃취 배양에서는 구연산의 수율이 109%, 구연산의 농도는 73gℓ였다.

[실시예 4]

실시예 1과 동일한 실험조건하에서 질소원인 황산암모니움의 농도를 1g/ℓ(질소 베이스 : 0.21g/ℓ)가 되도록 첨가하고 미생물의 생장율이 0.042hr^-1에서 조절되도록 질소원의 첨가속도를 조절한 지수적 페드뱃취 배양에서는 구연산의 수율 및 농도는 각각 128%, 89.6g/ℓ였으며 뱃취 배양에서는 구연산의 수율 및 농도는 각각 120% 84gℓ였다.

[실시예 5]

실시예 1과 동일한 실험조건하에서 질소원으로서 암모니아수를 1.06g/ℓ(질소 베이스 : 0.424g/ℓ)가 되도록 첨가하여 미생물의 비생장율을 0.032hr^-1로 조절한 지수적 페드뱃취 배양에서는 구연산의 수율 및 농도는 166%, 116.2g/ℓ였다.

[실시예 6]

실시예 1과 동일한 실험조건하에서 질소원으로서 요소를 0.91g/ℓ(질소베이스 : 0.424g/ℓ)가 되도록 첨가하여 미생물의 비생장율을 0.032hr^-1로 조절한 지수적 페드뱃취 배양에서는 구연산의 수율 및 농도는 167%, 117g/ℓ였다.

[실시예 7]

실시예 1과 동일한 실험조건하에서 질소원으로서 암모니아수를 2.12g/ℓ(질소베이스 : 0.848g/ℓ)가 되도록 선형전인 첨가방법(140시간첨가)에 의한 페드뱃취 배양에서는 구연산의 수율 및 농도는 140%, 98g/ℓ였다.

Claims

노르말 파라핀을 탄소원으로 이용하는 치아민 요구주 미생물 캔디다 리폴리티카 IFO 1437(Candida lipolitica, IFO 1437)을 사용하여 페드뱃취 배양법을 이용한 구연산의 제조방법에 있어, 배지중의 질소원농도가 0.2-1.3g/ℓ가 유지되도록 질소원을 지수적, 선형적, 또는 지수적선형적 방법으로 첨가하는 것을 특징으로하는 구연산의 제조방법.