KR970007922B1

KR970007922B1 - 연속발효에 의한 l-라이신의 제조방법

Info

Publication number: KR970007922B1
Application number: KR1019890017776A
Authority: KR
Inventors: 이진희; 이재홍; 강경래
Original assignee: 제일제당 주식회사; 안시환
Priority date: 1989-12-01
Filing date: 1989-12-01
Publication date: 1997-05-17
Also published as: KR910012254A

Abstract

없음

Description

연속발효에 의한 L-라이신의 제조방법

본 발명은 연속발효에 의한 L-라이신의 제조방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 연속발효과정에서 산화환원전위를 최적 조건으로 조절하여 기존의 회분식 발효에 비해 L-라이신의 생산성을 획기적으로 향상시키는 방법에 관한 것이다.

L-라이신은 사료첨가물 또는 의약용으로 널리 사용되는 아미노산의 일종으로 공업적으로 미생물을 이용한 직접 발효법으로 제조하여 왔다.

공업적 생산에 있어서는 대부분 회분식 또는 유가식 배양공정을 사용하고 있으며, 연속발효로서는 브레비박테리움(Folia Microbiol., 27, 315(1982)), (Kvasni Prum, 28(12), 278(1982)), 코리네박테리움(Eur. Congr. Biotechnol. 3rd 2, 527(1984)), (Dokl. Bolg. Nauk., 38(11), 1525(1985)), (일본공개특허공보 소 62-289192(1987))에 의한 L-라이신 생산 연구예가 있다.

본 발명자등은 산화환원전위를 조절하여 L-라이신 연속발효를 행함으로서 종래에 비해 L-라이신의 생산성을 획기적으로 향상시켰으며, 산화환원 전위를 조절함에 있어서 용존산소의 양 이외에 유가액의 탄소원의 농도와 루이신의 농도를 조절함을 특징으로 한다.

L-라이신 발효는 호기적 발효로서 배양액중의 용존산소의 양이 발효에 매우 큰 영향을 미친다.

보통 배양액중의 용존산소의 양을 측정하기 위해서 D.O(Dissolved Oxygen) 전극을 사용하지만, 이것은 0.01mg O₂/liter 이하는 측정하기 어려운점이 있다.

따라서 이와 같이 대단히 낮은 용존산소의 양을 D.O 전극 대신에 산화환원전위전극을 이용하여 측정함으로서, D.O 전극이 감지할 수 없는 범위의 용존산소의 양을 산화환원전위로서 정량적으로 알아낼 수 있다.

통상 L-라이신의 공업적 생산으로서는 회분식 또는 유가배양식 공정을 선호하고 있는데, 이러한 회분식 또는 유가식 배양의 경우 산화환원전위는 발효시간이 경과함에 따라 일정하지 않고 수시로 변하므로, 최적 용존산소농도를 유지시킬 수 없는 단점이 있다.

따라서 본 발명자등은 정상상태를 유지할 수 있는 연속발효법을 이용하여 L-라이신 발효에 있어서 최적 용존산소, 즉 최적 산화환원 전위의 범위가 존재함을 발견하고 또한 이 최적조건하에서 L-라이신의 생산성면에 있어서도 회분식 발효에 매우 높게 유지됨을 발견하며 본 발명을 완성하였다.

본 발명에서 사용한 균주는 코리네박테리움 글루타이컴(Corynebacterium glutamicum) KFCC 10672이었으며, 배지중의 탄소원으로서는 당밀을 사용하였다.

발효 초기에는 회분식 발효법으로 시작하며 미생물이 대수증식기의 적정시점에 이르면 연속발효법으로 전환하였다.

초기배지는 당 8%, 황산암모늄 11g/ℓ, 염화나트륨 2.7g/ℓ, KH₂PO₄1.0g/ℓ, MgSO₄ㆍ7H₂O 1.0g/ℓ, FeSO₄ㆍ7H₂O 13mg/ℓ, MnSO₄·H₂O 13mg/ℓ, 스레오닌 400mg/ℓ, 메치오닌 200mg/ℓ, 티아민 540㎍/ℓ, 비오틴 325㎍/ℓ, 니아신 아마이드 1625㎍/ℓ, 칼슘판토세네이트 1625㎍/ℓ, 루이신 920mg/ℓ를 함유한 것이며, 연속발효로 전환시 유가액의 조성은 황산암모늄 23.6g/ℓ, 염화나트륨 1.5g/ℓ, KH₂PO₄0.6g/ℓ, MgSO₄ㆍ7H₂O 0.55g/ℓ, MnSO₄ㆍH₂O 6.6mg/ℓ, FeSO₄ㆍ7H₂O 6.6mg/ℓ, 스레오닌 350mg/ℓ, 메치오닌 160mg/ℓ, 티아민 300㎍/ℓ, 비오틴 180g/ℓ, 니아신아마이드 910g/ℓ, 칼슘판토세네이트 910g/ℓ를 포함하며 당농도는 7.5-20%, 루이신의 농도는 370-1400mg/ℓ 범위에서 조절하였다.

연속발효의 정상상태에서의, 균체 농도를 조절하기 위해서는 유가액의 탄소원의 농도를 제한하거나, 루이신의 농도를 제한하였고, 또한 배양액중의 용존산소의 농도를 제한하는 방법도 이용하였다.

또 배양액의 산화환원전위는 발효조의 통기량과 교반속도 또는 균체농도에 의해서 조절하였다.

L-라이신 발효에 있어서의 최적 산화환원전위값을 유지시키기 위해서는 알맞은 균체농도를 유지해야하며, 이는 유가액의 탄소원의 농도 혹은 루이신의 농도에 의해 임의로 조절될 수 있으며, 최적의 산화환원전위값을 유지시키며 동시에 최대의 생산성을 보이기 위해서는 유가액의 당농도는 12-15%, 루이신의 농도는 900-950mg/ℓ이었으며, 본 발명에서는 pH 6.9, 온도 32℃로 발효조건을 일정하게 유지시켰다.

이와 같이 연소발효의 정상상태에서의 산화환원를 조절함으로서 본 발명자등은 발효액의 산화환원전위가 L-라이신 발효의 대당수율과 중요한 관계가 있음을 밝혀내었고 L-라이신 비생산속도와 기질소모 속도에도 영향을 끼침을 밝혀 본 발명을 완성하였다.

본 발명에서 최적화된 산화환원전위의 범위는 -110~-55mV이며 이때의 대당수율은 40-43%에 이르렀고, 이보다 훨씬 낮은 산화 환원전위값을 갖는 용존산소가 매우 제한된 조건에서는 대당수율 및 비생산속도, 기질소모속도가 급격히 감소하고, 또한 이 보다 훨씬 높은 산화환원전위값을 갖는 조건에서도 오히려 대당수율과 비생산 속도, 기질소모속도가 감소함을 발견하였다.

따라서 L-라이신 발효에 있어서 용존산소의 양이 매우 중요하며 본 발명에서는 발효에 적합한 용존산소의 양을 산화환원전위로서 최적화 하였으며, 용존산소의 양이 극히 제한되거나 아니면 지나치게 충분할 경우 대당수율, 비생산속도, 기질소모속도가 감소함을 밝혔다.

한편 이때 L-라이신 이외의 발효부산물이 양에서도 차이를 보이는데, 산화환원전위값이 낮을수록 부산물인 알라닌, 글라이신, 발린의 생성량이 상대적으로 많았고, 산화환원전위값이 높을수록 알지닌, 글루타민산의 양이 상대적으로 많았으며, 아스파틱산과 스레오닌의 경우 크게 변화되지 않음도 알 수 있었다.

또 본 발명에서는 탄소원만이 제한된 연속발효의 경우와 루이신만이 제한된 연속발효에 있어서 소모된 당에 대한 대당수율과 비생산속도, 기질소모속도의 차이가 거의 없다는 사실도 밝혀내었다.

이 외에도 본 발명등은 희석율의 변화가 연속발효에 미치는 영향도 밝혀 내었는데, 희석율이 커질수록 정상상태에서의 잔당의 양이 중가하고 산화환원전위값은 감소하며, 균체의 농도는 일정하다가 희석율이 매우 높을때 급격히 감사하였다.

그리고 생성된 L-라이신의 농도는 희석률이 낮을수록 높았으며, 반면 L-라이신의 생산성면에 있어서는 희석율이 0.08-0.1hr^-1일때 최대치를 보였으며 그 이외의 범위에서는 감소하는 추세를 보였다.

결국 본 발명에서 밝혀낸 바에 의하면 L-라이신의 연속발효는 최적산화환원전위, 즉 최적용존산소조건하에서 최대로 6.5g/ℓㆍhhr의 생산성을 보였다.

다음의 실시예는 본 발명을 좀더 구체적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위는 이에 의하여 제한받는 것은 아니다.

[실시예 1]

[탄소원이 제한된 연속발효]

종균배양 : 아래와 같은 조성을 가지는 배지 50m를 250m 용적의 배플(Baffle)이 있는 진탕배양용 플라스크에 넣고 살균한 후 코리넥박테리움 글루타미컴(Corynebacterium glutamicum) KFCC 10672을 1백금이 접종한 후, 32℃에서 진탕회전배양기(220rpm)를 이용하여 15시간 배양하여 종균으로 사용하였다.

[종균 배지]

포도당 40g/ℓ

펩톤10g/ℓ

K₂HPO₄1.5g/ℓ

KH₂PO₄0.5g/ℓ

효모추출물10g/ℓ

비오틴100㎍/ℓ

티아민200㎍/ℓ

요소3g/ℓ

MnSO₄ㆍ7H₂O0.5g/ℓ

염화나트륨2.5g/ℓ

pH 7.2(KOH)

살균 121℃ 20분

본배양 : 상술한 종균배양에서 얻은 배양액 50ml를 다음과 같은 조성을 가지는 살균된 주발효조(2ℓ용 발효조) 950ml에 식균하였다.

[주발효 배지]

당(당밀)8%

황산암모늄11g/ℓ

염화나트륨2.7g/ℓ

KH₂PO₄1.0g/ℓ

MgSO₄ㆍ7H₂O1.0g/ℓ

FeSO₄ㆍ7H₂O13mg/ℓ

MnSO₄ㆍH₂O13mg/ℓ

스레오닌400mg/ℓ

메치오닌200mg/ℓ

티아민540㎍/ℓ

비오틴325㎍/ℓ

니아신 아마이드 1625㎍/ℓ

칼슘 판토세네이트 1625㎍/ℓ

루이신920mg/ℓ

소포제(5%)3ml/ℓ

pH 6.9(KOH)

살균 121℃ 20분

식균 후 회분식 발효를 시작하여 미생물이 대수증식기의 적정시점에 이르면 염속발효로 전환하였으며 이때 유가액의 조성은 다음과 같다.

[유가액의 조성]

당(당밀)7.5%-15%

황산암모늄23.6g/ℓ

염화나트륨1.5g/ℓ

KH₂PO₄0.6g/ℓ

MgSO₄ㆍ7H₂O0.55g/ℓ

MnSO₄ㆍH₂O6.6mg/ℓ

FeSO₄ㆍ7H₂O6.6mg/ℓ

스레오닌350mg/ℓ

메치오닌160mg/ℓ

티아민300㎍/ℓ

비오틴180㎍/ℓ

니아신아마이드910㎍/ℓ

칼슘 판토세네이트 910㎍/ℓ

루이신930mg/ℓ

소포제(5%)3ml/ℓ

살균 121℃ 20분

연속발효시 배양온도는 32℃, PH 6.9(NH₄OH 조절), 통기량은 0.5vvm, 배양부피 1로 일정하게 유지하였고, 발효조의 소포제 전극을 이용하여 자동적으로 소포제를 투입하였다. 정상상태에서의 결과를 표 1에 기재하였다.

[표 1]

[실시예 2]

[루이신이 제한된 연속발효]

연속발효시 유가액의 루이신 농도와 당농도를 제외하고는 실시예 1의 방법과 동일하게 행하였으며 정상상태에서의 결과는 표 2에 기재하였다.

[표 2]

이 경우 유가액의 탄소원의 농도는 충분한 반면, 루이신의 농도가 제한되어 있으므로 발효성당을 포함한 잔당의 양이 높아서 저하되었으나, 실제로 발효에 소모된 당을 기준으로 계산한 대당수율 면에 있어서는 탄소원이 제한된 연속발효의 경우와 거의 비슷하였다.

[실시예 3]

희석율과 유가액의 당농도, 루이신 농도를 제외하고는 실시예 1의 방법과 동일하게 행하였으며 정상상태에서의 결과는 표 3에 기재하였다.

[표 3]

[실시예 4]

[희석율이 L-라이신 연속발효에 미치는 영향.]

실시예 1의 방법과 동일하게 행하였으며 희석율과 유가액의 당농도만 임의로 조절하였다. 정상상태에서의 결과를 표 4에 기재하였다.

[표 4]

Claims

미생물에 의한 L-라이신 발효시, 배지중 용존산소의 양을 산화환원전위값으로 조절하되, 그 값이 -110~-55mV가 되도록 하고, 특히 연속발효시 유가액의 당농도를 12-15%로 유지함을 특징으로 하는 L-라이신의 제조방법.