KR20020033750A

KR20020033750A - Ｌ-리신 생산용 돌연변이 박테리아 균주

Info

Publication number: KR20020033750A
Application number: KR1020027001299A
Authority: KR
Inventors: 라이워헝밍제이; 에딩톤존엠; 양유에킨; 덴시리챠드; 스위셔스타시아; 마오웨잉
Original assignee: 추후제출; 아처 다니엘 미드랜드 캄파니
Priority date: 1999-08-02
Filing date: 2000-08-01
Publication date: 2002-05-07
Also published as: ATE549405T1; AU6506400A; JP2003506037A; NZ516895A; EP1198564A2; WO2001009306A2; MXPA02001173A; EP1198564B1; CA2380320A1; KR100793215B1; CA2380320C; CN1367827A; AU775818B2; WO2001009306A3; JP2011147459A; BR0012966A; WO2001009306A9; JP5236850B2

Abstract

본 발명은 신규 미생물, 이의 제조 방법 및 아미노산을 생산하는 신규 방법을 제공한다. 어버이 박테리아 균주의 돌연변이유발 및 개선된 라피네이트 내성 표현형의 선별로 다량의 아미노산을 생산하는 성장 특성이 향상된 균주를 분리할 수 있다. 본 발명의 미생물은 코리네박테리아 또는 브레비박테리아와 같은 아미노산 생산 어버이 균주로부터 제조하며, L-리신을 생산하는 어버이 균주가 특히 바람직하다.

Description

Ｌ-리신 생산용 돌연변이 박테리아 균주{MUTANT BACTERIAL STRAINS L-LYSINE PRODUCTION}

코리네박테리아(Corynebacteria)가 아미노산의 발효 생산에 유용한 것으로 인식된 이후(S.Kinoshita 등,Proceedings of the International Symposium on Enzyme Chemistry2:464-468(1957)), L-리신의 공업적 생산은 경제적으로 중요한 공업적 공정이 되었다. 이 필수 아미노산의 상업적 제조는 원칙적으로 그람 양성 코리네박테리아 글루타미컴(Corynebacterium glutamicum), 브레비박테리아 플라붐(Brevibacterium flavum) 및 브레비박테리아 락토퍼멘툼(Brevibacterium lactofermentum)을 이용하여 실시된다(Kleemann, A 등, "Amino Acids," ULLMANN'S ENCYCLOPEDIA OF INDUSTRIAL CHEMISTRY, vol. A2, pp57-97, Weinham: VCH-Verlagsgesellschaft(1985)). 현재 이들 유기체가 매년 제조되는 L-리신의 약 250,000 톤을 담당한다.

L-리신의 상업적 제조 효율은 L-리신을 더욱 다량으로 생산하는 돌연변이 박테리아 균주를 분리하여 증가시킬 수 있다. 아미노산 제조를 위한 미생물 공정에 사용되는 미생물은 4가지 부류, 즉 야생형 균주, 영양 요구 돌연변이, 조절 돌연변이 및 영양 요구성 조절 돌연변이로 분류된다(K.Nakayama 등,Nutritional Improvement of Food and Feed Proteins, M.Friedman, ed., (1978), pp. 649-661). 코리네박테리아 및 관련 유기체의 돌연변이는 값싼 탄소원, 예컨대 당밀, 아세트산 및 에탄올로부터 직접 발효시켜 아미노산을 저렴하게 생산할 수 있다. 또한, 발효로 제조된 아미노산은 입체특이성(L-이성체)이 있으므로 이 발효 공정은 합성 공정과 비교하여 유리하다.

발효 공정에 의한 L-리신 생산의 경제적 중요성으로 인해, 생산된 L-리신의 총량을 증가시키고 제조 단가를 낮추고자 하는 분명한 목적으로, 리신 합성용 생화학 경로가 집중적으로 연구되었다(최근 Sahm 등의 문헌[Ann.N.Y.Acad.Sci.782:25-39 (1996)]에 검토되어 있음). 리신 경로로의 도입은 L-아스파르테이트에서 시작하는데(도 1 참조), L-아스파르테이트 자체는 옥살로아세테이트의 트랜스아민화 반응으로 제조된다. C.글루타미컴의 특별한 특징은 리신 중간체 피페리딘 2,6-디카르복실레이트를 2가지 상이한 경로에 의해 디아미노피멜레이트로 전환시키는 능력이다. 2가지 다른 경로란, 숙시닐화된 중간체를 포함하는 반응들에 의한 경로와 디아미노피멜레이트 탈수소효소의 단일 반응에 의한 경로이다. 전반적으로, 경로로 유입되는 탄소 유동율(carbon flux)은 2지점에서 조절된다. 그 첫번째는 L-트레오닌과 L-리신의 수준에 의한 아스파르테이트 키나제의 피드백 억제를 통한 조절이며, 두번째는 디히드로디피콜리네이트 신타제의 수준 제어를 통한 조절이다. 따라서, 이들2가지 효소의 활성을 통제하지 않고 증가시키면 코리네박테리아에서 L-리신 생산을 증가시킬 수 있다.

L-리신 합성에 이르는 생화학적 경로 외에, 세포로부터 배지로의 L-리신 이송이 C.글루타미컴의 리신 과잉생산 균주의 개발시 고려해야 하는 또 다른 인자임을 제시하는 최근 증거가 있다. Kramer와 그 연구진들의 연구는, 누설되기 쉬운 막의 결과로서 리신의 세포 밖으로의 수동적인 이송이 리신 유출을 설명하는 유일한 원인은 아니라는 것을 시사하고 있다. 이들의 데이타는 다음 (1) 내지 (3)의 특성을 보유한 특정 캐리어를 제안하고 있다. (1) 이송자는 리신에 대한 Km 값(20 mM)이 다소 높고; (2) 이송자는 OH^-심포트 시스템(흡수 시스템은 H⁺안티포트 시스템)이며; (3) 이송자는 양하전되어 있고, 막 전위가 분비를 자극한다(S.Broer 및 R.Kramer,Eur.J.Biochem.202: 137-143(1991)).

L-리신을 제조하는데 영양 요구성 또는 내성에 대해 분리된 각종 균주들을 이용하는 일부 발효 공정이 당업계에 공지되어 있다. 미국 특허 제2,979,439호는 호모세린(또는 메티오닌과 트레오닌)을 요구하는 돌연변이체를 개시하고 있고, 미국 특허 제3,700,557호는 트레오닌, 메티오닌, 아르기닌, 히스티딘, 로이신, 이소로이신, 페닐알라닌, 시스틴 또는 시스테인에 대한 영양 요구성을 보유한 돌연변이체를 개시하고 있으며, 미국 특허 제3,707,441호는 리신 유사체에 내성이 있는 돌연변이체를 개시하고 있고, 미국 특허 제3,687,810호는 L-리신을 생산하는 능력과 박시트라신, 페니실린 G 또는 폴리믹신에 대한 내성을 갖는 돌연변이체를 기재하고있다. 또한, 미국 특허 제3,708,395호는 호모세린, 트레오닌, 트레오닌과 메티오닌, 로이신, 이소로이신 또는 이들의 혼합물에 대한 영양 요구성과 리신, 트레오닌, 이소로이신 또는 이의 유사체에 대한 내성을 보유한 돌연변이체를 개시하고 있고, 미국 특허 제3,825,472호는 리신 유사체에 대한 내성을 보유한 돌연변이체를 개시하고 있으며, 미국 특허 제4,169,763호는 L-리신을 생산하고 아스파르트산 유사체 및 설파 약물 중 하나 이상에 내성이 있는 코리네박테리아의 돌연변이 균주를 개시하고 있다. 미국 특허 제5,846,790호는 임의의 비오틴 작용 억제제의 부재하에 L-글루탐산 및 L-리신을 생산할 수 있는 돌연변이 균주를 개시하고 있고, 미국 특허 제5,650,304호는 4-N-(D-알라닐)-2,4-디아미노-2,4-디데옥시-L-아라비노스 2,4-디데옥시-L-아라비노스 또는 이의 유도체에 내성이 있는 L-리신 제조용 코리네박테리아 또는 브레비박테리아 속에 속하는 균주를 개시하고 있다.

코리네박테리아에서의 L-리신 발효 생산 분야의 더욱 최근의 개발은 리신 생산을 증대시키기 위한 분자 생물학 기법의 사용과 관련이 있다. 다음 예들은 그 분야의 예로서 제시된 것이다. 미국 특허 출원 제4,560,654호 및 제5,236,831호는 S-(2-아미노에틸)-시스테인에 민감성인 숙주 코리네박테리아 또는 브레비박테리아 미생물을 재조합 DNA 분자로 형질전환시켜 얻은 L-리신을 생산하는 돌연변이 균주를 개시하고 있는데, 여기서 S-(2-아미노에틸)-시스테인에 대한 내성 및 리신 생산 능력을 부여하는 DNA 단편은 벡터 DNA로 삽입된다. 미국 특허 출원 제5,766,925호는 코리네폼(Coryneform) 박테리아에서 기원하고 L-리신 및 L-트레오닌에 의해 탈감작되는 피드백 억제를 보유한 아스파르토키나제를 암호화하는 유전자를 누출형 호모세린 탈수소효소를 보유한 코리네폼 박테리아 또는 호모세린 탈수소효소 유전자가 결여된 코리네폼 박테리아의 염색체 DNA에 통합시켜 제조된 돌연변이 균주를 개시하고 있다.

박테리아 돌연변이 균주를 이용하여 고안된 다수의 공정들은 박테리아 성장을 약화시키고, 따라서 다른 영양소의 보충을 통해 아미노산 생산 수율을 향상시키도록 설계되어 있다. 일반적으로, 글루코스와 같은 기질로부터의 아미노산 수율(%)을 향상시키도록 고안된 돌연변이는 야생형 균주와 같은 활발한 성장 능력은 상실할 것이다. 아미노산 수율의 총 감소를 초래하는 것 외에도, 이들 돌연변이는 성장을 지탱하는데 더 많은 영양소를 필요로 한다는 점에서, 제조 단가를 상당히 증가시킬 수 있다.

따라서, 저렴한 제조 단가로 특정 아미노산의 수율을 최대화하는 신규 아미노산 생산 박테리아 균주의 개발에 대한 요구가 계속되고 있다. 이들 문제를 감안하여, 대안 방법은 생산성을 증가시키고 원료 단가를 줄이는 데 사용되는 특정 돌연변이 및 배지를 포함한다.

본 발명은 미생물학 및 미생물 유전학 분야에 관한 것이다. 더욱 구체적으로, 본 발명은 신규 박테리아 균주, 아미노산의 발효 생산에 유용한 방법 및 공정에 관한 것이다.

도 1. A) 코리네박테리아에서 L-리신 생산을 유도하는 생화학 경로의 개략적 제시도; B) 코리네박테리아에서 L-이소로이신 생산을 유도하는 생화학 경로의 개략적 제시도.

바람직한 양태들의 상세한 설명

1. 정의

용어가 제공하는 범위를 비롯하여 명세서 및 청구범위의 명확하고 일관된 이해를 제공하기 위해서, 다음과 같이 정의한다.

고수율 유도체:본 명세서에 사용된 바와 같이, 미생물이 유도된 어버이 균주와 비교하여 덱스트로스로부터 특정 아미노산을 고수율로 생산하는 미생물 균주를 의미한다.

돌연변이:본 명세서에서 사용된 바와 같이, 해당 뉴클레오티드 서열의 단일 염기쌍 변화, 삽입 또는 결실을 말한다.

오페론:본 명세서에서 사용된 바와 같이, DNA의 구조 유전자 및 조절 성분을 비롯하여 박테리아 유전자 발현 및 조절 단위를 말한다.

어버이 균주:본 명세서에서 사용된 바와 같이, 본 발명의 미생물을 산출하기 위해서 일부 형태의 돌연변이 유발법이 적용된 미생물 균주를 말한다.

표현형:본 명세서에서 사용된 바와 같이, 미생물의 유전자 구성에 따른 관찰가능한 물리적 특성을 의미한다.

라피네이트:본 명세서에서 사용된 바와 같이, 리신 회수를 위한 이온 교환 조작으로부터 유래한 폐류(wastestream) 생성물을 의미한다. 라피네이트는 다량의 황산암모니아, L-리신, 기타 아미노산, 염 및 이소말토스 등의 탄수화물을 함유한다. 열처리를 이용하여 라피네이트 함유 배지를 살균하면 배양물 성장의 저해를 유발하는 아미노산 유도체와 기타 대사 길항물질이 생산된다.

가열 살균된 라피네이트 함유 배지를 사용하여, 배양물 성장을 저해하는 내부에 포함된 아미노산 유도체에 대한 내성이 있고, 배양물 성장을 저해하는 내부에 포함된 대사 저해제에 내성이 있으며/또는 배양물 성장을 저해하는 내부에 포함된 리신 및/또는 리신 전구체의 분해 생성물에 내성이 있는 미생물, 예컨대 브레비박테리아 또는 코리네박테리아를 선별할 수 있다.

상대적 성장:본 명세서에서 사용된 바와 같이, 소정 기간에 걸쳐 정해진 배지에서 어버이 균주의 성장과 자손 균주의 성장을 직접 비교하여 성장을 평가하는 척도를 말한다.

돌연변이유발:본 명세서에서 사용된 바와 같이, 돌연변이가 DNA에 형성되는과정을 의미한다. "무작위" 돌연변이유발은, 돌연변이의 정확한 위치를 예측할 수 없고, 미생물의 염색체 어느 곳에서든지 발생할 수 있으며, 방사선 또는 화학 처리 등의 제제에 의해 유발되는 물리적 손상의 결과로서 돌연변이가 발생한다.

2. 어버이 박테리아 균주의 돌연변이유발

본 발명은 다량의 아미노산을 생산하고 라피네이트에 대한 내성이 향상된 미생물의 제조 방법을 제공한다. 연구를 통하여, 성장 및 아미노산 생합성에 필요한 황산암모니아를 리신 회수의 이온 교환 조작 유래의 폐류 생성물인 라피네이트로 대체할 수 있다는 것이 밝혀졌다. 라피네이트는 다량의 황산암모니아, L-리신, 기타 아미노산, 염 및 이소말토스와 같은 탄수화물을 함유한다. 그러나, 가열 처리하여 배지를 살균하는 과정에서, 라피네이트 배지는 배양물 성장의 저해를 유발하는 아미노산 유도체와 기타 대사 길항물질을 생산한다. 이러한 문제를 해결하기 위해서, 배지 중의 고농도의 라피네이트를 견딜 수 있고 그 아미노산 생산을 증가시키는 균주를 선별하는 방법을 고안하였다.

본 발명의 박테리아 균주는 어버이 박테리아 균주의 돌연변이유발 후, 개선된 라피네이트 내성 표현형을 선별하여 만드는 것이 바람직하다. 아미노산의 발효 생산에 유용한 것으로 당업계에 공지된 임의의 유기체로부터 어버이 미생물을 선택할 수 있다. 바람직한 어버이 미생물은 아미노산을 생산하는 코리네박테리아 및 브레비박테리아이며, 특히 가장 바람직한 유기체는 L-리신을 생산하는 코리네박테리아 및 브레비박테리아이다.

제1 구체예에서, 본 발명은

(a) 어버이 박테리아 균주 A를 돌연변이유발시키는 단계;

(b) 상기 돌연변이된 어버이 균주 A를 황산암모니아 함량을 기준으로 약 1% 이상의 라피네이트를 함유하는 배지와 접촉시키는 단계;

(c) 라피네이트 내성 박테리아 균주 B를 선별하는 단계;

(d) 상기 라피네이트 내성 박테리아 균주 B의 L-리신 생산을 측정하는 단계

를 포함하여 라피네이트 내성이 개선된 아미노산 생산 박테리아 균주의 제조 방법을 제공한다.

비제한적인 예로서 방사선 및 화학 절차를 비롯하여, 당업계에 공지된 임의의 무작위 돌연변이유발법을 사용하여 어버이 균주를 돌연변이시킬 수 있다. 무작위 화학 돌연변이유발이 특히 바람직하고, N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘(NTG) 등의 적절한 제제를 사용한 돌연변이 유발이 가장 바람직하다.

신규 박테리아 균주의 돌연변이유발 및 선별에 대한 일반적인 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 예컨대 문헌[J.H.Miller,Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York(1972); J.H. Miller,A Short Course in Bacterial Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York(1992); M.Singer and P.Berg,Genes & Genomes,University Science Books, Mill Valley, California(1991); J.Sambrook, E.F. Fritsch and T.Maniatis,Molecular Cloning: A Laboratroy Manual,2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold SpringHarbor, New York(1989); P.B.Kaufman et al.,Handbook of Molecular and Cellular Methods in Biology and Medicine, CRC Press, Boca Raton, Florida(1995);Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology,B.R.Glick and J.E.Thompson, eds., CRC Press, Boca Raton, Florida(1993); and P.F.Smith-Keary,Molecular Genetics of Escherichia coli,The Guilford Press, New York, NY(1989)]에 개시되어 있다.

본 발명의 균주들은 개선된 라피네이트 내성 표현형을 보유하는데, 이는 황산암모늄 함량으로 측정되는 바와 같이 사용된 선별 배지에서 라피네이트 농도로 결정된다. 제1 구체예에서, 표현형 선별은 약 1% 이상의 라피네이트를 함유하는 배지에서 실시할 수 있다. 가장 바람직한 구체예에서, 본 발명의 미생물은 약 5% 라피네이트를 함유하는 배지에서 선별한다. 다른 예로는 개선된 라피네이트 내성 균주의 선별에 사용하기 위한 약 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7% 및 8% 이상의 라피네이트 함유 배지가 있다.

본 발명은 일반적으로 라피네이트 내성이 개선되고 성장 특성이 향상된 신규 미생물을 제공하며, 이들 미생물은 아미노산을 고수율로 생산할 수 있다. 본 발명의 방법, 공정 또는 미생물의 중요한 성분 또는 특성은 라피네이트 내성에 관한 것이다.

발효 아미노산 생산 분야의 업자는 본 명세서에서 사용된 용어 "라피네이트"를 잘 알 것이다. 그러나, 본출원인의 발명을 더욱 완전하게 상세히 설명할 목적으로 라피네이트의 정의 및 그 제조 방법을 제공한다.

용어 "라피네이트"는 액체-액체 추출 영역의 화공 분야와 가장 밀접하게 관련이 있다. "용해되지 않고 남아 있으며 선택 용매에 의해 제거되지 않는 처리 액체 혼합물의 일부"로서 용매 정제에서 정의된다(Dictionary of Scientific and Technical Terms, Sybil P.Parker, ed., McGraw-Hill(1989)). 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 이 용어는 아미노산 분리시 이온 교환 크로마토그래피의 적용과 관련이 있다. 액체-액체 추출의 공정에서와 유사한 방식으로, 이온 교환 크로마토그래피와 관련하여 사용된 라피네이트는 크로마토그래피 수지에 선택적으로 결합되지 않은 액체 혼합물의 일부를 말한다. 더욱 구체적으로, 아미노산의 발효 생산과 관련하여 라피네이트는 크로마토그래피 컬럼에 결합되지 않은 세포 배양 배지의 일부이다. 라피네이트는 아미노산의 이온 교환 크로마토그래피 정제 과정에서 생성된 육즙(broth) 용출물 폐류 생성물이다. 통상적으로, 본 명세서에 사용된 바와 같이, 라피네이트는 이온 교환 수지에 성장 배지를 처음 적용한 후에 생성된 제1 폐류 생성물을 의미한다.

각종 이온 교환 크로마토그래피법을 아미노산 정제에 이용할 수 있다. 통상적으로, 리신 정제에 양이온 교환 수지를 이용한다. 고정층 또는 모의 이동층 수지를 이용하여 이온 교환 크로마토그래피를 실시할 수 있다. 예를 들어, Van Valsern 및 Thompson은 리신을 분리하기 위한 모의 이동층 기법을 설명하고 있다(Van Walsem, H.J. 및 Thompson, M.C.,J.Biotechnology59:127-132(1997)). 미국 특허 제4,714,767호 및 제5,684,190호는 아미노산 정제에 사용되는 고정층 크로마토그래피법의 용도를 설명하고 있고, Wolfgang 및 Prior는 탄수화물 분리시 연속 조작 모드를 달성하기 위해서 환상 크로마토그래피를 이용한다(Wolfgang J 및 Prior A.,Separation Science and Technology32:71-82(1997)). 따라서, 라피네이트를 형성하는 특정 크로마토그래피법은 다양할 수 있지만, 라피네이트를 정의하는 기초 원리는 일정하다.

단지 예시의 목적으로, 출원인은 세포 성장 배지 보충물로서 사용하기 위한 라피네이트 제조에 대한 상세한 설명을 실시예 5에 제공한다. 당업자가 알고 있는 바와 같이, 라피네이트는, 그 라피네이트가 분리된 발효 배지에서 생성된 특정 아미노산에 따라서 정량적으로 특성 규명할 수 있다. 예를 들어, 리신 발효 배지로부터 분리된 경우 라피네이트는 리신 라피네이트로 알려질 수 있으며, 글리신 발효 배지로부터 분리되는 경우 글리신 라피네이트로, 이소로이신 발효 배지로부터 분리되는 경우 이소로이신 라피네이트로 알려질 수 있다. 일반 라피네이트 용어가 본 명세서에 사용된 경우 선택된 특정 유형의 라피네이트는 전문가의 고안에 따라 달라진다는 것을 당업자는 쉽게 이해할 것이다.

본 명세서에 제공된 실시예는 라피네이트, 특히 리신 라피네이트 제조의 일례이다. 당업자에게는 명백한 바와 같이, 라피네이트 형성시 다른 방법을 이용할 수 있다.

3. 본 발명의 개선된 라피네이트 내성 균주

본 발명의 또 다른 목적은 라피네이트 내성이 개선되고 아미노산을 생산하는 미생물을 제공하는 것이다. 당업자라면 알고 있는 바와 같이, 임의의 특정 유형의 라피네이트, 예컨대 글리신 라피네이트, 발린 라피네이트, 이소로이신 라피네이트,리신 라피네이트 등에 대한 내성이 개선된 미생물을 선별할 수 있다. 특히 바람직한 구체예에서, 미생물은 리신 라피네이트에 대한 개선된 내성을 보유한다.

본 발명의 특정 구체예에서, 라피네이트 내성 미생물은

(a) 어버이 박테리아 균주 A를 돌연변이유발시키고;

(b) 상기 돌연변이된 어버이 균주 A와 황산암모니아 함량을 기준으로 약 1% 이상의 라피네이트를 함유하는 배지를 접촉시키며;

(c) 라피네이트 내성 박테리아 균주 B를 선별하고;

(d) 상기 라피네이트 내성 박테리아 균주 B의 아미노산 생산을 측정하는 공정으로 제조된다.

어버이 박테리아 균주의 선별, 돌연변이유발 및 라피네이트 내성이 개선된 본 발명의 미생물 선별은 전술한 바와 같이 실시할 수 있다.

본 발명의 더욱 특정 구체예는 코리네박테리아 또는 브레비박테리아이며, L-리신을 생산하는 코리네박테리아 또는 브레비박테리아가 특히 바람직하다.

또한, 본 발명은 약 1% 이상의 라피네이트를 함유하는 배지에서 성장시 24시간 내에 약 10 g 이상의 L-리신/ℓ을 생산하는 코리네박테리아 균주를 제공한다.

본 발명의 특히 바람직한 구체예는 L-리신을 생산하는 코리네박테리아 균주에 관한 것으로서, 상기 균주는 NRRL B-30059, NRRL B-30060, NRRL B-30061, NRRL B-30062, NRRL B-30063 및 이의 돌연변이체로 구성된 군에서 선택된다.

4. 아미노산 생산 및 정제

본 발명의 다른 구체예들은 라피네이트 함유 배지에서 아미노산의 생산 공정에 관한 것이다. 이러한 공정은 (a) 개선된 라피네이트 내성 박테리아 균주를 배양하는 단계 및 (b) 배양 배지로부터 아미노산을 회수하는 단계를 포함한다.

제1 특정 구체예에서, 본 발명은

(a) (i) 아미노산을 생산하는 어버이 박테리아 균주 A를 선별하고;

(ii) 어버이 균주 A를 돌연변이유발시키고;

(iii) 라피네이트 내성이 개선된 박테리아 균주 B를 선별하여 얻은 박테리아 B 균주를 라피네이트를 함유하는 배지에서 배양하는 단계;

(b) 배양 배지로부터 아미노산을 회수하는 단계를 포함하는 아미노산 생산 공정을 제공한다.

본 발명의 더욱 특정 구체예에서, 기타 공정은 L-리신을 생산하는 코리네박테리아 또는 브레비박테리아로 구성된 군에서 선택된 어버이 균주에 적용되며, 본 발명의 가장 바람직한 구체예는 어버이 균주인 아미노산 L-리신을 생산하는 브레비박테리아이다.

본 발명의 공정은 본 발명의 미생물을 배양하는 특정 방법에 따라 추가로 달라질 수 있다. 따라서, 아미노산 생산에 관한 본 발명의 공정에 사용할 수 있는 각종 발효 기법은 당업계에 공지되어 있다.

적절한 탄소원의 예로는 탄수화물, 예컨대 글루코스, 프럭토스, 수크로스, 전분 가수분해물, 셀룰로스 가수분해물 및 당밀; 유기산, 예컨대 아세트산, 프로피온산, 포름산, 말산, 구연산 및 푸마르산, 및 알코올, 예컨대 글리세롤 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

적절한 질소원의 예로는, 암모니아 가스 및 수성 암모니아를 비롯한 암모니아, 염화암모늄, 인산암모늄, 황산암모늄 및 아세트산암모늄 등의 무기산이나 유기산의 암모늄염과, 기타 질소 함유 물질, 예컨대 육류 추출물, 펩톤, 옥수수 침지액, 카제인 가수분해물, 대두 케이크 가수분해물 및 효모 추출물 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

일반적으로, 회분식 또는 유가식과 같은 발효 공정으로 본 발명으로부터 아미노산을 상업적으로 생산할 수 있다. 회분식 발효에서, 모든 영양소는 발효 초기에 첨가한다. 유가식 또는 연장형 유가식 발효에서 하나 또는 다수의 영양소는 발효 개시 직후 또는 배양물이 어떤 단계에 도달한 후에, 또는 공급된 영양소(들)가 배양 유체로부터 고갈되는 경우, 배양물에 연속적으로 공급한다. 유가식의 변형인 연장형 회분식 발효는 반복형 유가식 또는 충전-및-배출 발효로서, 발효기 내용물의 일부는 어떤 시점, 예컨대 발효기가 충전되는 시점에서 제거되는 반면, 영양소의 공급은 계속된다. 이러한 방식에서는 발효를 장시간 연장할 수 있다.

또 다른 종류의 발효인 연속 발효 또는 케모스타트 배양은 완전 배지의 연속 공급을 이용하는 반면, 배양 유체는 발효기 내의 육즙 부피가 대략 일정하게 남도록 하는 방식으로 연속 또는 반연속 배출된다. 연속 발효는 원리적으로는 무한 시간 동안 유지될 수 있다.

회분식 발효에서, 배지 내의 필수 영양소 중 하나가 고갈될 때까지, 또는 발효 조건이 바람직하지 않게 될 때까지(예, pH가 미생물 성장을 저해하는 값으로 감소되는 경우) 유기체가 성장한다. 유가식 발효에서, 예컨대 pH 조절을 이용하여 바람직한 성장 조건을 유지하도록 일반적으로 기준을 정하고, 필수 영양소(들)를 배양물에 공급하여 1종 이상의 필수 영양소의 고갈을 방지한다. 영양소 공급 속도에 의해 결정되는 성장 속도로 미생물은 계속 증식할 것이다. 일반적으로 단일 영양소, 가장 흔하게는 탄소원이 성장의 제한인자가 된다. 동일한 원리가 연속 발효에 적용되어, 일반적으로 배지 공급물 중 하나의 영양소는 제한 인자이고, 모든 다른 영양소는 과량으로 존재한다. 제한 영양소는 매우 낮은 농도로, 종종 측정할 수 없는 낮은 농도로 배양 유체에 존재한다. 다른 종류의 영양소 제한을 이용할 수 있다. 탄소원 제한이 가장 흔히 사용된다. 다른 예로는, 질소원에 의한 제한, 산소에 의한 제한, 비타민 또는 아미노산과 같은 특정 영양소에 의한 제한(미생물이 그 화합물에 대한 영양요구성인 경우), 황에 의한 제한 및 인에 의한 제한이 있다.

아미노산, 특히 L-리신의 회수 및 정제 방법은 당업계에 공지되어 있다. 통상적으로, 원심분리 및 여과로 세포를 제거한 후에, 양이온 교환에 의해 성장 배지로부터 아미노산을 회수할 수 있다. 미국 특허 제5,684,190호는 (1) 1차 양이온 교환 수지 상에 아미노산 함유 수용액을 통과시켜 등전점보다 낮은 pH에서 수지 상에 아미노산을 흡수시킨 후, 수산화암모늄으로 pH를 증가시켜 아미노산을 용출시킴으로써 제1 용액을 생성하는 단계; 및 (2) 유사한 방식으로 2차 양이온 교환 수지 상에 상기 제1 용액을 통과시켜 불순물을 추가로 제거하는 단계를 포함하여 L-리신과 같은 아미노산을 회수하는 것에 관해 개시하고 있다.

또 다른 예는 미국 특허 제4,714,767호에 의해 제공되는데, 상기 특허는 일련의 양이온 교환 수지탑을 사용하여 수용액으로부터 염기성 아미노산을 분리하는 방법을 제공한다. 이 공정은 반복적 흡착 및 용출 단계를 차례로 포함하고, 이 방법에서 흡착 및 용출 단계에 사용된 세척수는 후속 사이클의 제1탑 흡착 단계 또는 용출 단계로부터 방출된 액체의 나중 부분을 재순환시켜 얻는다.

이러한 양이온 교환 분리 절차로부터 얻은 용출제는 증발시켜 농축할 수 있으며, 이로서 암모니아를 추가로 제거할 수 있다. 그 다음 염산을 보유한 용액으로부터 아미노산을 결정화하여, 예컨대 L-리신·HCl·2H₂O를 생산할 수 있다. 원심분리 또는 여과 후에, 분리된 L-리신 결정을 건조한다.

본 발명은 일반적으로 라피네이트 내성이 개선되고 성장 특성이 향상된 신규 미생물을 제공한다. 이 미생물을 이용하면 아미노산을 고 수율로 제조할 수 있다.

본 발명의 제1 목적은 아미노산을 생산하는 능력이 증가된 미생물을 제조하는 신규 방법을 제공하는 것이다. 본 발명의 제1 구체예에서, 아미노산을 생산하는 어버이 박테리아 균주를 돌연변이유발시킨 후, 본 발명의 개선된 라피네이트 내성균주를 선별하여 신규 균주를 제조하는 방법이 제공된다. 본 발명의 더욱 특정한 구체예에서, 이 방법은 아미노산을 생산하는 어버이 박테리아 균주(예, 코리네박테리아 및 브레비박테리아)에 적용된다. 특히 바람직한 구체예는 개선된 라피네이트 내성이 있는 아미노산 생산 박테리아 균주, 즉 L-리신을 생산하는 브레비박테리아의 제조 방법에 관한 것이다.

본 발명의 제2 목적은 개선된 라피네이트 내성과 개선된 성장 특성을 보유하고, 다량의 아미노산을 생산하는 신규 박테리아 균주에 관한 것이다. 제1 구체예에서, 본 발명의 박테리아 균주는, 어버이 박테리아 균주를 돌연변이유발시키고, 라피네이트 내성, 성장 특성 및 아미노산 생산이 모두 향상된 돌연변이 자손 박테리아를 선별하는 방법으로 제조된다. 더욱 특정 구체예는 라피네이트 내성이 향상되고, 성장 특성이 개선되며, 아미노산 생산이 증가된 신규 코리네박테리아 또는 브레비박테리아 미생물에 관한 것이다. 본 발명의 특히 바람직한 구체예는 다량의 L-리신을 생산하는 브레비박테리아에 관한 것이다. 특히 바람직한 구체예는 균주 ADM L63.148(NRRL B-30059), ADM L64.132(NRRL B-30060), ADM L69.53(NRRL B-30061), ADM L69.74(NRRL B-30062) 및 ADM L69,100(NRRL B-30063), 또는 이들의 돌연변이체에 관한 것이다.

본 발명의 제3 목적은 (a) 라피네이트 함유 배지에서 박테리아를 배양하는 단계 및 (b) 배양 배지로부터 아미노산을 회수하는 단계를 포함하는 아미노산 생산 방법을 제공하는 것이다. 바람직한 구체예에서 단계 (a)의 배양된 박테리아는, 아미노산을 생산하는 어버이 박테리아 균주를 돌연변이유발시키고, 라피네이트 내성,성장 특성 및 아미노산 생산이 모두 개선된 자손을 선별하는 방법으로 얻는다. 바람직한 구체예는 코리네박테리아 또는 브레비박테리아를 이용하는 아미노산 생산 방법에 관한 것이다. 아미노산 생산 방법에 대한 본 발명의 특히 바람직한 구체예는 L-리신을 생산하는 브레비박테리아를 이용하는 것이다.

전술한 일반적인 설명과 후술하는 상세한 설명은 단지 예시적이고 설명을 위한 것으로서, 청구하고자 하는 본 발명에 대한 추가의 설명을 제공하려는 것으로 이해해야 한다.

실시예 1

라피네이트 내성이 개성된 미생물의 돌연변이유발, 스크리닝 및 선별

성장이 고농도의 라피네이트에 의해 저해되는 T125, L58.23 및 96T116과 같은 리신 생산 균주를 돌연변이유발시키고, 고농도의 라피네이트에 대한 내성을 나타내는 돌연변이체를 회수하였다. 돌연변이유발을 위해서, 박테리아 배양물을 배지 B(표 1)에서 중간 대수기로 성장시킨 다음, 원심분리로 펠렛화하고, 15 ㎖ 폴리프로필렌 원뿔형 관에서 필터 살균된 TM 완충액(트리스.HCl 6.0 g/ℓ, 말산 5.8 g/ℓ, (NH₄)₂SO₄1.0 g/ℓ, Ca(NO₃)₂5 ㎎/ℓ, MgSO₄.7H₂O 0.1 g/ℓ, FeSO₄.7H₂O 0.25 ㎎/ℓ, KOH를 사용하여 pH6.0으로 조정) 2 ㎖에 재현탁시켰다. 2 ㎖ 세포 현탁액을5.0 ㎎/ℓN'-니트로-N-니트로소구아니딘(NTG) 용액 50 ㎕와 혼합한 다음, 30분 동안 30℃에서 항온배양하였다. 사멸 속도를 추정하기 위한 대조군으로서 미처리된 세포 현탁액을 유사하게 항온배양하였다. 항온배양 후에, TM 완충액 10 ㎖를 각 관에 첨가하고, 세포를 원심분리로 펠렛화한 후, TM 완충액에서 2회 세척하고, KOH를 사용하여 pH 7.2로 조정한 0.1M NaH₂PO₄(인산염 완충액) 4.0 ㎖에 재현탁시켰다. 세척된 세포 현탁액을 인산염 완충액에서 추가로 희석하고, 분액을 배지 A(표 1)의 평판에 도말하였다. 4∼6일 동안 30℃에서 항온배양한 후에, 배지 A 아가에서 성장하는 콜로니를 취하여, 진탕 플라스크 및 발효기에서 덱스트로스로부터 L-리신의 생산 가능성의 향상에 대해 시험하였다.

실시예 2

라피네이트 배지에서의 균주들의 성장

각 시험된 균주(표 2)에 대해, 20 ㎖ 라피네이트 배지 C(표 1)를 함유하는 방지재가 구비된 250 ㎖ 플라스크에 냉동 배양물 0.1 ㎖를 접종하고, 240 rpm에서 30℃에서 18시간 동안 항온배양하였다. 항온배양 후에, 배양물 50 ㎕를 제거하고, 0.1N HCl 용액에서 1:100의 비율로 희석하였다. 희석된 샘플의 광학 밀도(OD)는 분광기로 660 nm에서 측정하였다. 결과는 표 2에 제시되어 있다. 라피네이트 내성(RF)이 개선된 모든 균주, 즉 L63.148, L64.132, L69.53 및 L69.74는 이들의 어버이 균주 108T125, L58.23 및 96T116보다 라피네이트 배지 C에서 더욱 잘 성장하였다(OD가 더 높음).

실시예 3

진탕 플라스크 발효에서 덱스트로스 소비, 성장 및 리신 생산

각 균주에 대해, 종자 배지 C 20 ㎖를 함유하는 방지재가 구비된 250 ㎖ 플라스크에 냉동된 배양물 0.1 ㎖을 접종하고, 30℃, 240 rpm에서 18 시간 동안 항온배양하였다. 종자 배양물 2 ㎖를 사용하여 방지재가 구비된 250 ㎖ 플라스크 중 발효 배지 D 20 ㎖를 접종하였다. 플라스크를 30℃ 및 240 rpm에서 24 시간 동안 진탕하였다. 발효 24시간 후에, 분석을 위해 샘플을 제거하였다. 덱스트로스 농도를 측정하기 위해서, 샘플 100 ㎕를 제거하고, 탈이온(DI)수로 1:50 희석하고, YSI 생화학 분석기(옐로 스프링 인스트루먼트 캄파니, 인코포레이티드)로 측정하였다. L-리신 농도는 HPLC로 측정하였다. 광학 밀도를 측정하여 실시예 2에 개시된 바와 같이 성장을 측정하였다. 결과는 표 3에 제시되어 있다. 모든 라피네이트 내성 균주 L63.148, L64.132, L69.53 및 L69.74는 이들의 어버이 균주 108T125, L58.23 및 96T116보다 더욱 잘 성장하고, 더 효과적으로 덱스트로스를 이용하였으며, 더 많은 양의 L-리신을 생산하였다.

벤치 스케일 발효기에서의 성장 및 L-리신 생산

벤치 스케일 발효는 2단계 접종 프로토콜을 사용하여 설정하였다. 제1 단계 배지는 50.0 g/ℓ 수크로스, 3.0 g/ℓ K₂HPO₄, 3.0 g/ℓ 우레아, 0.5 g/ℓ MgSO₄.7H₂O, 30.0 g/ℓ대두 펩톤, 5.0 g/ℓ 효모 추출물, 0.765 ㎎/ℓ 비오틴, 3.0 ㎎/ℓ 티아민 HCl, 및 0.125 g/ℓ니아신아미드로 구성되었다. 이 배지 500 ㎖를 함유하는 방지재가 구비된 2ℓ진탕 플라스크에 배양물을 접종하고, 30℃ 및 250 rpm에서 19시간 동안 배양하였다. 이 시점에서, 성숙 제1 배양물 22.5 ㎖를 사용하여 제2 단계 접종 배지에 접종하였다.

6.6 ℓ발효기에 배지 3000 ㎖와 함께 제2 단계 접종물을 준비하였다. 배지 배합물은 20.0 g/ℓ(db) 옥수수 침지액, 라피네이트로서의 10.0 g/ℓ황산암모늄, 12.0 ㎎/ℓ MnSO₄.H₂O, 3.0 ㎎/ℓ 비오틴, 3.0 g/ℓ 티아민 HCl, 125 ㎎/ℓ 니아신아미드 0.5 ㎖/ℓ 소포제, 및 60 g/ℓ 덱스트로스였으며, 360 g/ℓ 용액으로서 별도로 살균하고, 접종 직전에 발효기에 첨가하였다. 발효기는 32℃, 1.2 vvm 공기, 600 rpm 및 7.2의 pH 조절점에서 조작하였다. pH는 NH₃또는 NH₄OH를 첨가하여 조절하였다. 18∼20 시간 후에, 접종물은 성숙된 것으로 간주하고 생산 단계 용기에 접종하는데 사용하였다.

생산 단계 배지는 40 g/ℓ(db) 옥수수 침지액, 20 g/ℓ 라피네이트로서의 황산암모늄, 12.0 ㎎/ℓMnSO₄.H₂O, 0.75 ㎖/ℓ소포제 및 12 g/ℓ 덱스트로스로 구성하였고, 250 g/ℓ용액으로서 별도로 살균한 다음, 접종 직전에 첨가하였다. 배지 배합물은 접종물로서 성숙 제2 단계 육즙 500 ㎖를 함유하는 2.1 ℓ초기 부피를 기준으로 하였다. 조작 변수는 다음과 같았다. 32℃, 2.1 vvm 공기 및 초기 및 조절점 pH 7.2. pH는 NH₃또는 NH₄OH로 조절하였다. 처음에는 600 rpm으로 교반하고, 9시간 배양 시간 동안 700 rpm으로 증가시켜 교반한 다음, 19시간의 배양 시간 동안 900 rpm에서 교반하였다. 덱스트로스 고갈에 따른 pH 증가가 나타나면, 필요시 덱스트로스 및 황산암모늄의 혼합물을 공급하여 발효시켰다. 공급물은 2310 g 덱스트로스 + 800 ㎖ 물과 황산암모늄 총 176 g을 함유하는 라피네이트 용적을 별도로 살균한 다음, 상온으로 냉각시 2개의 용액을 혼합하여 제조하였다. 총 발효 시간은 48 시간이었다. 용기 크기는 제2 단계 접종물 형성을 위해 사용된 것과 동일하였다.

벤치 스케일 발효에서 전술한 분리물과 어버이 균주를 비교한 실험 결과는 표 4에 제시되어 있다.

실시예 5

라피네이트 생산

전술한 바와 같이, 라피네이트가 분리된 발효 배지에서 생산된 특정 아미노산에 따라 라피네이트를 정량적으로 특성규명할 수 있다. 본 명세서에 제공된 실시예는 리신 라피네이트 생산에 관한 것이다. 그러나, 당업자라면 다른 종류의 라피네이트, 예컨대 발린 라피네이트, 또는 이소로이신 라피네이트 등도, 단순히 적절한 발효 배지, 예컨대 발린 또는 이소로이신 발효 배지 등으로부터 출발하여 유사하게 제조할 수 있음을 알 것이다.

리신 라피네이트 생산에서의 제1 단계로서, 리신 발효 성장 배지를 리신 농도 65.5 g/ℓ로 희석한다. 한외여과로 리신 농도가 40.3 g/ℓ인 투과물을 형성한 후에, 이 투과물을 123 g/ℓ리신으로 농축하며, 총 건조 고형분 농도는 207 g/ℓ이다.

크로마토그래피 분리 시스템, 예컨대 어드밴스드 세파레이션 테크놀러지즈 인코포레이티드(미국 플로리다주 세인트 피터스버그 소재)가 제조한 I-SEP 또는 C-SEP로 투과 농축물을 공급한다. 이온 교환 크로마토그래피 분리 시스템은, 본 명세서에서 참고로 인용한 미국 특허 제4,808,317호 및 제4,764,276호에 예시된 바와 같이 당업계에 일반적으로 공지되어 있다. 이로부터 얻은 폐 용출물은 "묽은 리신 라피네이트" 용액으로 간주된다. 묽은 리신 라피네이트 용액은 pH가 5.1이고, 34.3 g/ℓ황산암모늄 및 2.8 g/ℓ리신을 함유하며 총 고형분 수치는 67 g/ℓ이다.

묽은 리신 라피네이트 용액은 295 g/ℓ의 총 고형분으로 농축한다. "농축된 리신 라피네이트" 용액의 정량 성분은 137.9 g/ℓ황산암모늄, 14.8 g/ℓ 리신, 8.7 g/ℓ발린, 8.1 g/ℓ알라닌, 2.4 g/ℓ젖산 및 2.2 g/ℓ 아세트산을 포함한다. 농축된 리신 라피네이트 용액은 배지 제조시 사용된다.

하기 표들은 실시예 부분에서 참조한다.

실시예 1, 2 및 3에서 사용된 배지

성분(양/ℓ)	A	B	C	D
글루코스	20 g		30 g	68 g
수크로스		50 g
L-알라닌	0.5 g	0.5 g
L-메티오닌	0.5 g	0.5 g
L-트레오닌	0.25 g	0.25 g
비오틴	0.05 ㎎	0.756 ㎎	0.003 g	0.405 ㎎
티아민	0.2 ㎎	0.003 g	0.003 g
니아신아미드	0.05 g	0.125 g	0.125 g
폴리펩톤 펩톤(BBL)		20 g
육류 추출물(BBL)		5 g
옥수수 침지액¹			20 g
라피네이트²	60 g		10 g	40 g
우레아	2.5 g	3 g		50 g
황산암모니아	10 g
K₂HPO₄		3 g
KH₂PO₄	1 g
MgSO₄.7H₂O	0.4 g	0.5 g
MnSO₄.H₂O	0.01 g		0.01 g	0.01 g
NaCl	1 g
FeSO₄.7H₂O	0.01 g
CaCO₃			50 g	50 g
아가	15 g
pH(오토클레이브 전)	7.2	7.3	7.4	7.4
1. 옥수수 침지액의 양은 배지 1ℓ당 건조 고체 g으로 표시된다.2. 라피네이트의 양은 배지 1ℓ당 황산암모니아 g으로 표시된다.

라피네이트를 함유하는 배지 C에서의 균주 성장

균주	108T125 L63.148	L58.23 L64.132	96T116 L69.53 L69.74
종류	야생형¹RF²	야생형 RF	야생형 RF RF
OD₆₆₀	15.9 27.4	27.1 34.5	22.2 31.6 30.3
1. 균주 108T125, L58.23 및 96T116은 본 발명의 개선된 라피네이트 내성 균주를 형성하는데 사용된 어버이 야생형 균주이다.2. 균주 L63.148, L64.132, L69.53 및 L69.74는 개시된 바와 같이 야생형 어버이 균주로부터 유도된 개선된 라피네이트 내성(RF) 균주이다.

배지 D에서의 24시간 진탕 플라스크 발효시 균주의 덱스트로스 소비(Dex), 성장(OD₆₆₀) 및 리신 생산(Lys)

균주	108T125 L63.148	L58.23 L64.132	96T116 L69.53 L69.74
종류	야생형 RF	야생형 RF	야생형 RF RF
Dex, g/ℓ	25.9 66.7	40.6 68.8	45.8 78.8 76.6
OD₆₆₀	20.5 43.2	26.3 47.9	30.5 47.4 42.8
Lys, g/ℓ	9.4 18.8	14.1 23.3	15.5 24.6 23.2

6.6ℓ 발효기에서의 성장(OD₆₆₀) 및 L-리신 생산의 어버이 및 자손 비교

균주	OD 약 660 nm	총 생산량¹	g 리신/ℓ/hr²
96T116 야생형	83.8	583 g	5.78
L69.53 RF	112.5	776 g	7.70
L69.74 RF	122.4	807 g	8.01
L69.100 RF	93.3	745 g	7.48
1. 총 생산량은 수거시 발효기 중 리신의 총 g을 나타낸다.2. 계산은 초기 2.1ℓ 부피를 기준으로 한다.

Claims

(a) 어버이 박테리아 균주 A를 돌연변이유발시키는 단계;

(b) 상기 돌연변이된 어버이 균주 A와 황산암모니아 함량을 기준으로 약 1% 이상의 라피네이트를 함유하는 배지를 접촉시키는 단계;

(c) 라피네이트 내성 박테리아 균주 B를 선별하는 단계; 및

(d) 상기 라피네이트 내성 박테리아 균주 B의 아미노산 생산을 측정하는 단계

를 포함하는 라피네이트 내성이 개선된 아미노산 생산 박테리아 균주 B의 제조 방법.
제1항에 있어서, 상기 어버이 박테리아 균주를 무작위 화학 돌연변이유발시키는 것이 특징인 방법.
제1항에 있어서, 상기 어버이 박테리아 균주가

(a) 코리네박테리아 종(Corynebacterium sp.);

(b) 브레비박테리아 종(Brevibacterium sp.);

(c) 에스케리치아 콜리(Escherichia coli); 및

(d) 바실러스 종(Bacillus sp.)

으로 구성된 군에서 선택되는 것이 특징인 방법.
제1항에 있어서, 상기 박테리아 균주 B가

(a) 글리신;

(b) 알라닌;

(c) 메티오닌;

(d) 페닐알라닌;

(e) 트립토판;

(f) 프롤린;

(g) 세린;

(h) 트레오닌;

(i) 시스테인;

(j) 티로신;

(k) 아스파라긴;

(l) 글루타민;

(m) 아스파르트산;

(n) 글루탐산;

(o) 리신;

(p) 아르기닌;

(q) 히스티딘;

(r) 이소로이신;

(s) 로이신; 및

(t) 발린

으로 구성된 군에서 선택된 아미노산을 생산하는 것이 특징인 방법.
제1항에 있어서, 상기 어버이 박테리아 균주가 L-리신을 생산하는 코리네박테리아 종인 것이 특징인 방법.
(a) 어버이 박테리아 균주 A를 돌연변이유발시키고;

(b) 상기 돌연변이된 어버이 균주 A와 황산암모니아 함량을 기준으로 약 1% 이상의 라피네이트를 함유하는 배지를 접촉시키며;

(c) 상기 돌연변이된 어버이 균주로부터 라피네이트 내성 박테리아 균주 B를 선별하고;

(d) 상기 박테리아 균주 B의 아미노산 생산을 측정하는 방법으로 제조되는 아미노산을 생산하는 박테리아 균주 B.
제6항에 있어서, 어버이 박테리아 균주 A가

(a) 코리네박테리아 종;

(b) 브레비박테리아 종;

(c) 에스케리치아 콜리; 및

(d) 바실러스 종

으로 구성된 군에서 선택되는 것이 특징인 박테리아 균주.
제7항에 있어서, 상기 박테리아 균주 B가

(a) 글리신;

(b) 알라닌;

(c) 메티오닌;

(d) 페닐알라닌;

(e) 트립토판;

(f) 프롤린;

(g) 세린;

(h) 트레오닌;

(i) 시스테인;

(j) 티로신;

(k) 아스파라긴;

(l) 글루타민;

(m) 아스파르트산;

(n) 글루탐산;

(o) 리신;

(p) 아르기닌;

(q) 히스티딘;

(r) 이소로이신;

(s) 로이신; 및

(t) 발린

으로 구성된 군에서 선택된 아미노산을 생산하는 것이 특징인 박테리아 균주.
약 1% 이상의 라피네이트를 함유하는 배지에서 성장시 24 시간 내에 약 10 g/ℓ 이상의 L-리신을 생산하는 코리네박테리아 종 균주.
약 1% 이상의 라피네이트를 함유하는 배지에서 성장시 24 시간 내에 약 10 g/ℓ 이상의 L-리신을 생산하는 브레비박테리아 균주.
(a) NRRL B-30059;

(b) NRRL B-30060;

(c) NRRL B-30061;

(d) NRRL B-30062;

(e) NRRL B-30063; 및

(f) 상기 (a), (b), (c), (d) 또는 (e)의 돌연변이체

로 구성된 군에서 선택되는 L-리신을 생산하는 박테리아 균주.
제11항에 있어서, 상기 균주가 NRRL B-30059인 것이 특징인 균주.
제11항에 있어서, 상기 균주가 NRRL B-30060인 것이 특징인 균주.
제11항에 있어서, 상기 균주가 NRRL B-30061인 것이 특징인 균주.
제11항에 있어서, 상기 균주가 NRRL B-30062인 것이 특징인 균주.
제11항에 있어서, 상기 균주가 NRRL B-30063인 것이 특징인 균주.
(a) (i) 아미노산을 생산하는 어버이 박테리아 균주 A를 선별하고;

(ii) 어버이 균주를 돌연변이유발시키고;

(iii) 돌연변이된 어버이 균주로부터 라피네이트 내성이 개선된 박테리아 균주 B를 선별하여 얻은 박테리아 B 균주를 라피네이트 함유 배지에서 배양하는 단계;

(b) 배양 배지로부터 아미노산을 회수하는 단계

를 포함하는 아미노산 생산 방법.
제17항에 있어서, 라피네이트의 배지 농도가 황산암모니아 함량을 기준으로 약 1% 이상인 것이 특징인 방법.
제17항에 있어서, 생산된 L-리신의 양이 24 시간 내에 약 10 g/ℓ 이상의 L리신인 것이 특징인 방법.
제17항에 있어서, 라피네이트의 배지 농도는 황산암모니아 함량을 기준으로 약 1% 이상이고, 생산된 L-리신의 양이 24 시간 내에 약 10 g/ℓ 이상의 L-리신인 것이 특징인 방법.
제17항에 있어서, 라피네이트 농도는 황산암모니아 함량을 기준으로 약 5% 이고, 생산된 L-리신의 양이 24 시간 내에 약 10 g/ℓ이상의 L-리신인 것이 특징인 방법.
제17항에 있어서, 박테리아 B가

(a) 코리네박테리아 종;

(b) 브레비박테리아 종;

(c) 에스케리치아 콜리; 및

(d) 바실러스 종

으로 구성된 군에서 선택되는 것이 특징인 방법.
제22항에 있어서, 박테리아 B가

(a) NRRL B-30059;

(b) NRRL B-30060;

(c) NRRL B-30061;

(d) NRRL B-30062;

(e) NRRL B-30063; 및

(f) 상기 (a), (b), (c), (d) 또는 (e)의 돌연변이체

로 구성된 군에서 선택된 코리네박테리아 종인 것이 특징인 방법.