JP5236850B2 - 新規な細菌株、これを調製する方法、およびl−リジン産生のための発酵プロセスにおけるそれらの使用 - Google Patents
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Description
(発明の分野)
本発明は、微生物学および微生物遺伝学の分野に関する。より詳細には、本発明は、アミノ酸の発酵産生のために有用な、新規の細菌株、方法およびプロセスに関する。
Corynebacteriaは、アミノ酸の発酵産生のために有用であるという認識(S.Kinoshitaら、Proceedings of the International Symposium on Enzyme Chemistry 2:464〜468(1957))に従って、L−リジンの工業的生産は、経済的に重要な産業プロセスになった。この必須アミノ酸の商業的生産は、主に、グラム陽性のCorynebacterium glutamicum、Brevibacterium flavum、およびBrevibacterium lactofermentumを利用して行われる(Kleemann,A.ら、「Amino Acids」、ULLMANN’S ENCYCLOPEDIA OF INDUSTRIAL CHEMISTRY、第A2巻、57〜97頁、Weinham:VCH−Verlagsgesellschaft(1985))。これらの生物は、現在、年間に生成されるL−リジンの約250,000トンを占める。
本発明は一般的に、より高い収量のアミノ酸が産生されることを可能にする、改善されたラフィネート耐性および改善された増殖特性を有する新規の微生物を提供する。
(1.定義)
明細書および特許請求の範囲(このような用語が与えられる範囲を含む)の明確かつ一貫した理解を提供するために、以下の定義が提供される。
相対的増殖:本明細書中で使用される場合、この用語は、親株の増殖を、子孫の株の増殖と、規定された時間の期間にわたって、そして規定された培地を用いて直接比較することによって増殖の評価を提供する測定値をいう。
本発明は、多量のアミノ酸を産生し、そしてラフィネートに対する改善された耐性を有する微生物の産生のための方法を提供する。研究経過を通して、増殖およびアミノ酸生合成に必要とされる硫酸アンモニアが、ラフィネート(リジン回収のイオン交換操作からの廃流産物)で置換され得ることが今や見出された。ラフィネートは、多くの硫酸アンモニア、L−リジン、他のアミノ酸、塩および炭水化物(例えば、イソマルトース)を含む。しかし、培地を滅菌するための熱処理の間に、このラフィネート培地は、培養物の増殖阻害を引き起こす、多くのアミノ酸誘導体および他の代謝アンタゴニストを産生する。この問題を克服するために、培地中の高レベルのラフィネートに耐え得、そしてそれらのアミノ酸産生を増大させ得る株を選択するために方法が設計された。
(a)親細菌株Aを変異誘発に供する工程;
(b)上記変異誘発された親株Aを、硫酸アンモニア含有量に基づいて少なくとも約1%のラフィネートを含む培地と接触させる工程;
(c)ラフィネート耐性細菌株Bを選択する工程;および
(d)上記ラフィネート耐性細菌株BのL−リジン産生を決定する工程。
本発明の別の目的は、改善されたラフィネート耐性を有し、そしてアミノ酸を産生する微生物に関する。当業者にはわかるように、このような微生物は、任意の特定の型のラフィネート(例えば、グリシン−ラフィネート、バリン−ラフィネート、イソロイシン−ラフィネート、リジン−ラフィネートなど)に対する改善された耐性を有するように選択され得る。特に好ましい実施形態では、この微生物は、リジン−ラフィネートに対する改善された耐性を有する。
(a)親細菌株Aが変異誘発に供される;
(b)変異誘発された親株Aを、硫酸アンモニア含有量に基づいて少なくとも約1%のラフィネートを含有する培地と接触させる;
(c)ラフィネート耐性細菌株Bが選択される;および
(d)上記のラフィネート耐性細菌株Bのアミノ酸産生が決定される。
本発明の他の実施形態は、ラフィネート含有培地におけるアミノ酸の産生のためのプロセスに関する。このようなプロセスは、(a)改良されたラフィネート耐性細菌株の培養工程および(b)培養培地からのアミノ酸の回収工程、を包含する。
(a)ラフィネートを含む培地において、細菌B株を培養する工程であって、それによって株を、以下の方法によって得る、工程:
(i)アミノ酸を産生する親細菌株Aを選択する工程;
(ii)その親株Aを突然変異する工程;
(iii)改良されたラフィネート耐性細菌株B選択する工程;および
(b)培養培地からアミノ酸を回収する工程。
(実施例1.改良されたラフィネート耐性微生物の変異誘発、スクリーニングおよび選択)
より高い濃度のラフィネートによってその増殖が阻害されるリジン産生株(例えば、T125、L58.23および96T116)を、突然変異に供し、そしてより高い濃度のラフィネートに対する耐性を示す変異体を回収した。変異誘発について、細菌培養物を、培地Bにおいて中間の対数期まで増殖させ(表1)、遠心分離によってペレットにし、そして15mlのポリプロピレンコニカルチューブ内の2mLのフィルター滅菌されたTM緩衝液中(Tris.HCL 6.0g/L、マレイン酸 5.8g/L、(NH4)2SO41.0g/L、Ca(NO3)2 5mg/L、MgSO4.7H2O 0.1g/L、FeSO4.7H2O 0.25mg/L、KOHを使用してpH6.0に調整した)に再懸濁した。2mLの細胞懸濁液を、N’−ニトロ−N−ニトロソグアニジン(NTG)の50μLの5.0mg/L溶液(50μL)と混合し、次いで、30℃で30分間インキュベートした。未処理の細胞懸濁液を同様にコントロールとしてインキュベートし、死滅率を推定した。インキュベーション後、10mLのTM緩衝液を各チューブに添加し、そして細胞を遠心分離によってペレットにし、TM緩衝液で2度洗浄し、そして4.0mLの0.1M NaH2PO4(リン酸緩衝液)に再懸濁し、KOHを使用してpH7.2に調整した。洗浄した細胞懸濁液を、リン酸緩衝液にさらに希釈し、そしてアリコートを培地Aのプレートに広げた(表1)。30℃で4〜6日間インキュベートした後、培地A寒天上で増殖するコロニーを選び、そして振盪フラスコおよび発酵槽内のブドウ糖からL−リジンを産生する、改良された可能性について試験した。
各試験株について(表2)、0.1mLの凍結培地を、20mLのラフィネート培地C(表1)を含む250mLのバッフルフラスコに接種し、次いで、30℃で240rpmで、18時間インキュベートした。インキュベーション後、50μlの培養物を取り出し、そして0.1N HCl溶液中に1:100の比に希釈した。分光光度計を用いて、希釈サンプルの光学密度(OD)を、660nmで測定した。結果を表2に示す。改良されたラフィネート耐性(RF)を有するすべての株、L63.148、L64.132、L69.53およびL69.74は、それらの親株、108T125、LS8.23および96T116よりも、ラフィネート培地C中で、優れて増殖した(より高いOD)。
各株について、0.1mLの凍結培地を、20mLの種培地Cを含む250mLのバッフルフラスコ(baffled flask)に接種し、そして18時間30℃で24rpmでインキュベートした。2mLの種培地を使用し、250mLバッフルフラスコ中に20mLの発酵培地Dを接種した。次いで、そのフラスコを、24時間30℃かつ240rpmで振盪した。24時間の発酵後、サンプルを分析のために取り出した。ブドウ糖濃度を測定するために、100μLのサンプルを取り出し、そして脱イオン(DI)水を用いて1:50に希釈し、そしてYSI生化学分析機(Yellow Springs Instrument Co.Inc.)を用いて測定した。L−リジン濃度を、HPLCにより決定した。光学密度測定を実施例2に記載されるように、増殖を測定するために行った。結果を表3に示す;すべてのラフィネート耐性株、L63.148、L64.132、L69.53およびL69.74は、優れて増殖し、ブドウ糖をより効率的に使用し、そしてL−リジンをそれらの親株、108T125、L58.23、および96T116よりも産生した。
2段階接種物プロトコルを使用してベンチスケール発酵槽を作動した。第1段階の培地は、50.0g/l スクロース、3.0g/l K2HPO4、3.0g/l 尿素、0.5g/l MgSO4−7H2O、30.0g/l ダイズペプトン、5.0g/l 酵母抽出物、0.765mg/l ビオチン、3.0mg/l チアミンHCl、および0.125g/l ナイアシンアミドからなる。500mlのこの培地を含む2リットルのバッフルフラスコに、培養物を接種し、そして30℃かつ250rpmで19時間インキュベートした。この時点で、22.5mlの成熟第1培養物を使用し、第2段階接種物培地をインキュベートした。
上記のように、ラフィネートは、ラフィネートが単離された発酵培地において産生される特定のアミノ酸によって定性的に特徴付けられ得る。本明細書中で提供される例は、リジンラフィネートの産生のための例である。しかし、当業者は、他の型のラフィネート(例えば、バリン−ラフィネート、またはイソロイシン−ラフィネートなど)が、単に適切な発酵培地(例えば、バリンまたはイソロイシン発酵培地など)を用いて開始することによって、同様に産生され得ることを知り得る。
以下の表を、実施例の節において参照する。
2.L63.148株、L64.132、L69.53株およびL69.74株は、改良されたラフィネート耐性(RF)株であり、それらは、記載されたそれらの野生型親株に由来する。
Claims (4)
- L−リジン産生細菌株であって、ここで該株が、
(a)NRRL B−30059;
(b)NRRL B−30060;
(c)NRRL B−30061;
(d)NRRL B−30062;
(e)NRRL B−30063;および
(f)(a)、(b)、(c)、(d)、または(e)の変異体であって、硫酸アンモ
ニウム含有量に基づいて少なくとも1%のラフィネートを含有する培地に耐性を有する変
異体(ただし、該ラフィネートは、137.9g/l 硫酸アンモニウム、14.8g/
l リジン、8.7g/l バリン、8.1g/l アラニン、2.4g/l 乳酸および2
.2g/l 酢酸含み、熱処理で滅菌されたものである。)、
からなる群から選択される、L−リジン産生細菌株。
- L−リジンの産生のためのプロセスであって、該プロセスは、
硫酸アンモニウム含有量に基づいて少なくとも2%のラフィネートを含有する細菌発酵
培地においてラフィネート耐性細菌株Bを培養する工程;及び
前記耐性細菌株Bが産生したL−リジンを該細菌発酵培地から回収する工程;
を含み、
前記ラフィネートは、137.9g/l 硫酸アンモニウム、14.8g/l リジン、
8.7g/l バリン、8.1g/l アラニン、2.4g/l 乳酸および2.2g/l
酢酸を含み、
前記ラフィネート耐性細菌株Bは、請求項1に記載のL−リジン産生細菌株である、プ
ロセス。
- 請求項2に記載のプロセスであって、前記細菌発酵培地は、硫酸アンモニウム
含有量に基づいて少なくとも4%のラフィネートを含有する、プロセス。
- 請求項2又は3に記載のプロセスであって、前記産生されるL−リジンの量は、24時
間で、前記発酵培地1リットル当たり少なくとも10gのL−リジンである、プロセス。
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