CN105176907B - L-异亮氨酸基因工程生产菌 - Google Patents
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Abstract
本发明通过基因工程构建了一种L‑异亮氨酸生产菌，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 2015557。该L‑异亮氨酸生产菌在发酵过程中能够实现发酵液中L‑异亮氨酸的有效积累，具有较高的L‑异亮氨酸产量及糖酸转化率，生产成本低，具有广泛的工业应用前景。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体地说，涉及一种L-异亮氨酸基因工程生产菌。
背景技术
L-异亮氨酸，化学名为L-α-氨基-γ-甲基戊酸，是一种天冬氨酸族非极性、输水性的氨基酸，也是人体必需八种氨基酸之一，具有促进蛋白质合成和抑制分解的效果。成年人每天需要从外界摄取20mg/kg(体重)的L-异亮氨酸。因此，L-异亮氨酸在食品、医药、饲料和运动保健领域具有广泛的商业价值。
由于异亮氨酸具有2个不对称碳原子，所以用化学合成方法生产比较困难，成本很高。生物转化制造L-异亮氨酸是将α氨基丁酸和α-氧代丁酸等作为前体原料进行生物合成，但由于原料昂贵，同样存在生产成本过高的问题。通过发酵来生产L-异亮氨酸是一种发展趋势。日本味之素1995年申请的中国专利CN1117524A中，利用大肠杆菌，通过导入质粒来增强前体苏氨酸合成、以及异亮氨酸代谢途径上相关解除抑制的基因的表达，使得异亮氨酸产率达0.30g/g(葡萄糖，糖酸转化率为30％)。江南大学2014年申请的专利CN104480057A中，利用谷氨酸棒杆菌，通过质粒表达异亮氨酸合成的基因簇，并增加质粒的稳定性，使得异亮氨酸产率达0.124g/g(葡萄糖，糖酸转化率为12.4％)。
目前，国内己有厂家进行批量生产L-异亮氨酸，但是这些厂家采用的菌株的产酸能力都较低，产量不能满足市场需求。因此，改善菌株生产能力、优化工艺流程、配备先进设备成为本领域亟待解决的问题。
发明内容
为了克服现有L-异亮氨酸生产技术的上述缺陷，得到理想的L-异亮氨酸生产菌，本发明利用基因工程技术来改造大肠杆菌，通过增强相关基因，获得一株高产L-异亮氨酸的生产菌株，其发酵过程中能有效地积累L-异亮氨酸，从而降低生产成本，具有广阔的工业应用前景。
因此，本发明的第一个目的在于提供一种L-异亮氨酸基因工程生产菌。
本发明的第二个目的在于提供一种L-异亮氨酸基因工程生产菌的构建方法。
本发明的第三个目的在于提供所述L-异亮氨酸基因工程生产菌用于生产L-异亮氨酸的应用。
为了达到上述目的，本发明对于大肠杆菌中与L-异亮氨酸代谢途径相关的基因进行了系统的研究和筛选，并且设计出包括如下步骤的基因工程菌构建方案：
A.以L-苏氨酸基因工程生产菌CCTCC M 2015556作为原始菌株，其特征包括：敲除了基因tdh、tdcC和thrL，增强了基因thrA*BC(G433R)和rhtC，并且基因ppc、aspA、pntAB、thrA*(G433R)和lysC*(T342I)在基因组中以多个拷贝的形式存在；
B.构建包含大肠杆菌MG1655基因簇ilvGMEDA的重组质粒，该基因簇包含编码解除L-异亮氨酸抑制的苏氨酸脱氨酶的ilvA基因且除去了减弱作用所必需的区域的ilvGMEDA操纵子；
C.将步骤B中所述重组质粒导入步骤A中所述原始菌株中，获得L-异亮氨酸生产菌。
通过上述基因工程构建和筛选，得到一种高产L-异亮氨酸的菌株，现保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 2015557。
根据本发明的第三个方面，提供了上述基因工程菌CCTCC M 2015557在生产L-异亮氨酸中的应用。
在上述应用中，通过上述基因工程菌CCTCC M 2015557的直接发酵生产L-异亮氨酸。
根据本发明的优选实施例，发酵培养基组成如下：葡萄糖40g/L，(NH4)2SO4 16g/L，KH2PO4 1.0g/L，MgSO4·7H2O 1g/L，MnSO4·5H2O 0.01g/L，FeSO4·7H2O 0.01g/L，酵母粉2.0g/L，CaCO3 30g/L，pH7.0。
本发明所构建的L-异亮氨酸生产菌在发酵过程中能够实现发酵液中L-异亮氨酸的有效积累，提高了L-异亮氨酸的产量及糖酸转化率，L-异亮氨酸产量可高达16.31g/L，糖酸转化率达40.78％，因而具有广泛的工业应用前景。
本发明构建的L-异亮氨酸生产菌的拉丁学名是Escherichia coli，中文名称是大肠杆菌，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期是2015年9月18日，保藏地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内的武汉大学保藏中心，保藏编号为CCTCC M2015557。
构建上述L-异亮氨酸生产菌CCTCC M 2015557所使用的原始菌株L-苏氨酸基因工程生产菌CCTCC M 2015556的拉丁学名是Escherichia coli，中文名称是大肠杆菌，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期是2015年9月18日，保藏地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内的武汉大学保藏中心，保藏编号为CCTCC M 2015556。
附图说明
图1为本发明构建的重组质粒pMW-ilvGAM的示意图，可过表达解除抑制型ilvGMEDA基因。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。
本文中涉及到多种物质的添加量、含量及浓度，其中所述的百分含量，除特别说明外，皆指质量百分含量。
在本文中，当用于本发明时，术语“L-异亮氨酸基因工程生产菌”、“L-异亮氨酸生产菌”、“基因工程菌”、“L-异亮氨酸基因工程菌”、“生产L-异亮氨酸的基因工程菌”、“CIBTS1800菌株”、“大肠杆菌CIBTS1800”表示相同的意义，都是指L-异亮氨酸生产菌CCTCCM 2015557。
本发明中涉及的基因名称解释如下：
tdh：L-异亮氨酸3-脱氢酶；
thrL：异亮氨酸操纵子前导肽；
thrA：天冬氨酸激酶及Ⅰ-高丝氨酸脱氢酶；
rhtC：异亮氨酸转运体；
lysC：天冬氨酸激酶；
tdcC：L-异亮氨酸/L-丝氨酸转运体；
dacA：D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶；
thrB：高丝氨酸激酶；
thrC：异亮氨酸合成酶；
yihF：DU945家族蛋白；
ppc：磷酸烯醇式羧化酶；
aspA：天冬氨酸氨裂解酶；
pntAB：吡啶核苷酸转氢酶；
cadB:赖氨酸：尸胺反向转运体；
yidJ:假定的硫酸脂酶；
ilvG：乙酰乳酸合成酶；
ilvM：乙酰乳酸合成酶II；
ilvE：支链氨酸转移酶；
ilvD：二羟基酸脱水酶；
ilvA：苏氨酸脱氢酶。
根据大肠杆菌中L-异亮氨酸的代谢途径，本发明在苏氨酸基因工程生产菌CCTCCM 2015556基础上，构建载体组合表达ilvGMEDA基因簇，该基因簇包含编码解除L-异亮氨酸抑制的苏氨酸脱氨酶的ilvA基因且除去了减弱作用所必需的区域的ilvGMEDA操纵子，构建出L-异亮氨酸基因工程菌。
至于表达ilvGMEDA的载体的构建方法，参考Ken-ichi HASHIGUCHI等报道的文献(Construction of an L-Isoleucine Overproducing Strain of Escherichia coli K-12,Ken-ichi HASHIGUCHI,et al.Biosci Biotechnol Biochem.1999)。
实施例
以下实施例中，所述氨苄霉素在培养基中的终浓度为100μg/ml。
以下实施例中使用的引物序列信息如表1所示。
表1、引物序列
实施例1：质粒pMW-ilvGAM的构建
1.1、pMW-ilvGMEDA的构建
以pMW119载体(购自Nippon Gene公司)利用HindIII/EcoRI双酶切，回收4.1kb片段；以MG1655基因组为模板，ilvG119F/ilvG119R为引物，PCR扩增ilvGMEDA片段，约9kb；上述片段进行GIBSON连接(参考Enzymatic assembly of DNA molecules up to severalhundred kilobases，Daniel G Gibson,et al.Nature Methods.2009)，得到pMW-ilvGMEDA质粒。
1.2、pMW-ilvGAM的构建
以pMW-ilvGMEDA质粒为模板，分别以PilvGMF/ilvAMF为引物，PCR扩增yifB与pMW119载体片段，约7kb；以ilvGMR/ilvAMR为引物，PCR扩增ilvGMEDA部分片段，约6.2kb；以ilvGMF/PilvGMR为引物，PCR扩增ilvG部分片段，约1.1kb；上述片段进行GIBSON连接，得到pMW-ilvGAM质粒。pMW-ilvGAM质粒参照文献(Construction of an L-IsoleucineOverproducing Strain of Escherichia coli K-12,Ken-ichi HASHIGUCHI,etal.Biosci Biotechnol Biochem.1999)中的质粒pMWD5，删除了ilvG基因前面的阻遏蛋白基因序列，对ilvG基因进行了重排，使其表达的蛋白具有活性，对ilvA进行了点突变，解除了异亮氨酸的抑制作用。
实施例2：L-异亮氨酸表达菌株的获得
将实施例1.2中获得的pMW-ilvGAM质粒转入到L-苏氨酸生产菌CCTCC M 2015556感受态细胞中(感受态细胞制备及转化具体方法参考《分子克隆实验指南》(第三版)，J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔(美)编著，黄培堂等译，科学出版社，北京，2002，第1章96页)，获得了用于生产L-异亮氨酸的基因工程菌CIBTS1800，其基因型为MG1655(Δtdh,ΔthrL,thrA*(G433R),Ptac-rhtC,lysC*(T342I),ΔtdcC,ΔdacA::thrA*BC,ΔyihF::thrA*BCΔcadB::Thr,ΔyidJ::Thr)/pMW-ilvGAM。
实施例3：L-异亮氨酸基因工程菌发酵生产L-异亮氨酸
利用L-异亮氨酸基因工程菌通过发酵生产L-异亮氨酸的方法如下所述：
挑取单菌落接种于400μl含氨苄霉素发酵培养基的96孔板中，37℃，290rpm培养40小时。
发酵结束，利用HPLC测定发酵液上清中的L-异亮氨酸含量，结果如表3所示。
其中，发酵培养基组成如下：葡萄糖40g/L，(NH4)2SO4 16g/L，KH2PO4 1.0g/L，MgSO4·7H2O 1g/L，MnSO4·5H2O 0.01g/L，FeSO4·7H2O 0.01g/L，酵母粉2.0g/L，CaCO330g/L，余量为水，pH7.0。HPLC检测方法如下：
色谱条件：ZORBAX Eclipse Plus C18(100mm)中性柱子、检测波长338nm、柱温：40℃。
衍生剂配置：取0.3430g邻苯二甲醛+5ml无水乙醇+0.1472g N-乙酰-L半胱氨酸，用0.05mol/L硼酸缓冲液(pH＝9.5)定溶到50ml，避光备用。
流动相A：10mmol/L Na2HPO4，10mmol/L Na2B4O7.10H2O，浓盐酸调pH8.2；
流动相B：甲醇:乙睛:水＝45:45:10
梯度洗脱程序如表2所示。
表2、HPLC梯度洗脱程序
| 时间(min) | 流动相B(％) | 流动相A(％) | 流速(ml/min) |
| 0 | 2 | 98 | 1.0 |
| 2 | 2 | 98 | 1.0 |
| 14.50 | 57 | 43 | 1.0 |
| 14.60 | 100 | 0 | 1.0 |
| 16.80 | 100 | 0 | 1.0 |
| 17.20 | 2 | 98 | 1.0 |
数据采集时间18min。
表3、基因工程菌L-异亮氨酸产量比较
| 编号 | L-异亮氨酸(g/L) | L-苏氨酸(g/L) |
| CTCC M 2015556 | 0 | 13.72±0.44 |
| CIBTS1800 | 16.05±0.16 | 0 |
从表3的结果可见，原始菌株CCTCC M 2015556在孔板上发酵的L-异亮氨酸产量为零；
将重组质粒pMW-ilvGAM转入CCTCC M 2015556后所得CIBTS1800菌株在96孔板上发酵产生了L-异亮氨酸而无苏氨酸的残留，表明构建的pMW-ilvGAM质粒实现了原始菌株CCTCC M 2015556中产物苏氨酸向异亮氨酸的转化，达到了利用大肠杆菌发酵法生产L-异亮氨酸的目的。L-异亮氨酸的产量为16.05±0.16g/L，糖酸转化率达40.78％，表明菌株能有效地生产L-异亮氨酸。因此，作为L-异亮氨酸生产菌，CIBTS1800菌株是较理想的菌株，将其保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 2015557。
综上所述，本发明所构建的L-异亮氨酸基因工程菌在发酵过程中能够实现发酵液中L-异亮氨酸的有效积累，具有较高的L-异亮氨酸产量及糖酸转化率，生产成本低，具有广泛的工业应用前景。
Claims (5)
1.一种L-异亮氨酸生产菌，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M2015557。
2.如权利要求1所述的L-异亮氨酸生产菌的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
A.以L-苏氨酸基因工程生产菌CCTCC M 2015556作为原始菌株；
B.构建包含大肠杆菌MG1655基因簇ilvGMEDA的重组质粒，该基因簇ilvGMEDA包含编码解除L-异亮氨酸抑制的苏氨酸脱氨酶的ilvA基因且除去了减弱作用所必需的区域的ilvGMEDA操纵子；
C.将步骤B中所述重组质粒导入步骤A中所述原始菌株中，获得L-异亮氨酸生产菌。
3.如权利要求1所述的L-异亮氨酸生产菌在生产L-异亮氨酸中的应用。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，通过如权利要求1所述的L-异亮氨酸生产菌的发酵来生产L-异亮氨酸。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，发酵培养基组成如下：葡萄糖40g/L，(NH4)2SO4 16g/L，KH2PO4 1.0g/L，MgSO4·7H2O 1g/L，MnSO4·5H2O 0.01g/L，FeSO4·7H2O 0.01g/L，酵母粉2.0g/L，CaCO3 30g/L，余量为水，pH7.0。
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