CN104120157A - 使用具有弱化的yjjK 基因的表达的肠杆菌科细菌生产L-氨基酸的方法 - Google Patents

使用具有弱化的yjjK 基因的表达的肠杆菌科细菌生产L-氨基酸的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及使用具有弱化的yjjK基因的表达的肠杆菌科细菌生产L-氨基酸的方法。具体地，本发明提供通过利用肠杆菌科的细菌，尤其是属于埃希氏菌属的细菌发酵来产生L-氨基酸的方法，所述细菌已经通过修饰而弱化了yjjK基因的表达。

Description

使用具有弱化的yjjK 基因的表达的肠杆菌科细菌生产L-氨基酸的方法
发明背景 
本发明涉及微生物工业，更具体地涉及一种通过发酵已通过修饰而减弱了yjjK基因表达的肠杆菌科细菌来产生L-氨基酸的方法。 
背景技术
传统上，L-氨基酸是利用从自然资源获得的微生物菌株，或其突变体，通过发酵方法生产的。典型地，将微生物加以修饰以提高L-氨基酸的产量。 
已经报道了许多用于提高L-氨基酸产量的技术，包括使用重组DNA转化微生物(见例如美国专利No.4,278,765)和改变调控区，例如启动子、前导序列和/或衰减子或其它本领域技术人员已知的区域(见例如US20060216796和WO9615246A1)。其它可用于提高产量的技术包括提高参与氨基酸生物合成的酶的活性，和/或使目标酶对由产物L-氨基酸所致的反馈抑制脱敏(见例如WO9516042A1,EP0685555A1或美国专利4,346,170,5,661,012,和6,040,160)。 
另一种提高L-氨基酸产量的方法是弱化涉及目标L-氨基酸的降解的一种或几种基因、使目标L-氨基酸的前体从L-氨基酸生物合成途径改道的基因、涉及碳、氮和磷流的再分布的基因、以及编码毒素的基因等等的表达。 
yjjK基因产物已经通过双向凝胶电泳得到了鉴定(Link A.J.et al.,Comparing the predicted and observed properties of proteins encoded in the genome of Escherichia coli K-12,Electrophoresis,1997,18(8):1259-1313)。Yjjk 蛋白质随后被定性为一种推定的ABC转运子(ATP结合盒，ATP binding cassette)，是已知的最大的蛋白质家族之一的成员。ABC转运子具有共同的独特构造，由包埋于膜双层中的两个跨膜域(TMD)和位于细胞质中的两个核苷酸结合域(NBD)构成(Rees D.C.et al.,ABC transporters:the power to change,Nat.Rev.Mol.Cell Biol.,2009,10(3):218-227)。原核ABC转运子能够将结合蛋白质募集到转位底物。ATP对核苷酸结合域的结合以及水解驱动构象变 化，导致底物的转位。ABC转运子发挥转入子(importer)或转出子(exporter)的作用，能够转运多种多样的底物，包括离子、毒素、抗生素、脂质、多糖、营养物质例如氨基酸、肽、糖等等。关于Yjjk蛋白质的功能知之甚少(Linton K.J.and Higgins C.F.,The Escherichia coli ATP-binding cassette(ABC)proteins,Mol.Microbiol.,1998,28(1):5-13)。仅仅是通过序列相似性手段推测该蛋白质是ABC超家族的一个成员，具有NBD-NBD域组织的转运子亚家族3，的ATP结合组分。 
迄今为止，还没有显示弱化yjjK基因对修饰的肠杆菌科细菌菌株的L-氨基酸产生的影响的数据被报道。 
发明内容
本发明的一个方面是提供一种属于肠杆菌科的细菌，其可能属于埃希氏菌属，更具体地属于大肠埃希氏菌(大肠杆菌)种，其已经过修饰而弱化了yjjK基因的表达。 
本发明的另一个方面是提供一种使用如下文所述的肠杆菌科细菌产生L-氨基酸，例如L-丙氨酸、L-精氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-瓜氨酸、L-半胱氨酸、L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、甘氨酸、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸、L-甲硫氨酸、L-鸟氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸、和L-缬氨酸的方法。 
这些目标通过如下出人预料的发现而得以实现，即弱化属于肠杆菌科的细菌(其可以属于埃希氏菌属，更具体地，属于大肠杆菌种)的染色体上的yjjK基因的表达，尤其是失活yjjK基因，可赋予该微生物更高的L-氨基酸(包括但不限于L-缬氨酸和L-组氨酸)生产力。 
本发明的一个方面是提供一种产生L-氨基酸的方法，包括： 
(i)在培养基中培养肠杆菌科的细菌从而在该细菌和/或培养基中产生所述L-氨基酸， 
(ii)从所述细菌和/或所述培养基中收集所述L-氨基酸， 
其中所述细菌已经过修饰而弱化了yjjK基因的表达。 
本发明的另一方面是提供如上所述的方法，其中所述细菌属于埃希氏菌属。 
本发明的另一方面是提供如上所述的方法，其中所述细菌属于大肠杆菌 种。 
本发明的另一方面是提供如上所述的方法，其中所述细菌属于泛菌属。 
本发明的另一方面是提供如上所述的方法，其中所述细菌属于Pantoea ananatis种。 
本发明的另一方面是提供如上所述的方法，其中所述表达是由于yjjK基因的失活而导致的。 
本发明的另一方面是提供如上所述的方法，其中所述基因缺失。 
本发明的另一方面是提供如上所述的方法，其中所述yjjK基因由SEQ ID NO:1核苷酸序列或SEQ ID NO:1的核苷酸序列的变异体所编码。 
本发明的另一方面是提供如上所述的方法，其中所述L-氨基酸选自芳香族氨基酸和非芳香族氨基酸。 
本发明的另一方面是提供如上所述的方法，其中所述芳香族氨基酸选自L-苯丙氨酸、L-色氨酸和L-酪氨酸。 
本发明的另一方面是提供如上所述的方法，其中所述非芳香族氨基酸选自L-丙氨酸、L-精氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-瓜氨酸、L-半胱氨酸、L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、甘氨酸、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸、L-甲硫氨酸、L-鸟氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、和L-缬氨酸。 
优选实施方案的说明 
下面详细说明本发明。 
1.细菌 
短语“L-氨基酸产生细菌”可以表示属于肠杆菌科的细菌，该细菌在培养基中培养时具有产生、排出、分泌和/或导致L-氨基酸在培养基或细菌细胞中积累的能力。 
短语“L-氨基酸产生细菌”还可以表示这样的细菌，其能够以高于野生型株或亲本株，例如大肠杆菌K-12的量产生、排出或分泌L-氨基酸，和/或导致L-氨基酸的积累，而且可以表示微生物能够以不少于0.5g/L、或不少于1.0g/L的量导致目标L-氨基酸在培养基中积累。所述细菌可以以单独的形式，或者以两种或更多种氨基酸的混合物的形式产生某种氨基酸。 
短语“L-氨基酸产生能力”可以表示细菌的这样的能力：当该细菌在培养基中培养时，在培养基或细菌细胞中以这样的水平产生、排出或分泌L-氨基酸、和/或导致L-氨基酸积累，使得能够从培养基或细菌细胞收集该L-氨基酸。 
术语“L-氨基酸”可以表示L-丙氨酸、L-精氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-瓜氨酸、L-半胱氨酸、L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、甘氨酸、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸、L-甲硫氨酸、L-鸟氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸、和L-缬氨酸。 
术语“芳香族L-氨基酸”包括例如L-苯丙氨酸、L-酪氨酸、和L-色氨酸。 
术语“非芳香族氨基酸”包括例如L-丙氨酸、L-精氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-瓜氨酸、L-半胱氨酸、L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、甘氨酸、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸、L-甲硫氨酸、L-鸟氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、和L-缬氨酸。 
L-氨基酸可以属于一个或多个氨基酸家族。作为实例，L-氨基酸可以属于：谷氨酸家族，包括L-精氨酸、L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、和L-脯氨酸；丝氨酸家族，包括L-半胱氨酸、甘氨酸和L-丝氨酸；天冬氨酸家族，包括L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-异亮氨酸、L-赖氨酸、L-甲硫氨酸、和L-苏氨酸；丙酮酸家族，包括L-丙氨酸、L-异亮氨酸、L-缬氨酸和L-亮氨酸；和芳香族家族，包括L-苯丙氨酸、L-色氨酸和L-酪氨酸。 
L-精氨酸、L-半胱氨酸、L-谷氨酸、L-组氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸和L-缬氨酸是具体的例子。L-组氨酸和L-缬氨酸是优选的例子。 
属于肠杆菌科的细菌可以包括来自肠杆菌属(Enterobacter)、欧文氏菌属(Erwinia)、埃希氏菌属(Escherichia)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、摩根氏菌属(Morganella)、泛菌属(Pantoea)、发光杆菌属(Photorhabdus)、普罗威斯登氏菌属(Providencia)、沙门氏菌属(Salmonella)、耶尔森氏菌属(Yersinia)等，并具有产生L-氨基酸的能力的细菌。具体地，可以使用可根据NCBI(美国国家生物技术信息中心)数据库(www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi?id=543)中使用的分类法分类到肠杆菌科的细菌。可以修饰的肠杆菌科菌株的实例包括埃希氏菌属、肠杆菌属或泛菌属的细菌。 
可以加以修饰从而获得根据本公开主题的埃希氏菌属细菌的埃希氏菌属菌株没有特别的限制，具体地说，可以使用在Neidhardt等的工作中描述的那些(Bachmann,B.J.,Derivations and genotypes of some mutant derivatives of E.coli K-12,2460-2488页.该文收载于F.C.Neidhardt等(编辑),E.coli and Salmonella:cellular and molecular biology,第二版.ASM Press,Washington,D.C.,1996)。大肠杆菌种是一个具体实例。大肠杆菌的具体实例包括大肠杆菌W3110(ATCC27325),大肠杆菌MG1655(ATCC47076)等，其来自于原型野生型菌株K-12。这些菌株可以从例如美国典型微生物菌种保藏中心(P.O.Box1549,Manassas,VA20108,United States of America)获得。也就是说，每一个菌株均有登录号，并且这些菌株可以通过这些登录号进行订购(参考www.atcc.org)。菌株的登录号在美国典型微生物菌种保藏中心的目录中列出。 
肠杆菌属细菌的实例包括成团肠杆菌(Enterobacter agglomerans)、产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)等。泛菌属细菌的例子包括Pantoea ananatis等等。成团肠杆菌的一些菌株最近根据16S rRNA的核苷酸序列分析等被重新分类为成团泛菌(Pantoea agglomerans)、Pantoea ananatis或斯氏泛菌(Pantoea stewartii)。可以使用属于肠杆菌属或泛菌属中任一属的细菌，只要它是可被归类到肠杆菌科的细菌即可。当通过遗传工程技术繁育Pantoea ananatis菌株时，可以使用Pantoea ananatis AJ13355菌株(FERM BP-6614)、AJ13356菌株(FERM BP-6615)、AJ13601菌株(FERM BP-7207)及其衍生物。当这些菌株被分离时，它们被鉴定为成团肠杆菌，并以成团肠杆菌的名义保藏。然而，根据如上所述的其16S rRNA的核苷酸序列等，它们最近被重新归类为Pantoea ananatis。 
L-氨基酸产生细菌 
可以使用本发明的属于肠杆菌科、经过修饰而弱化了yjjK基因的表达的细菌，其能够产生芳香族或非芳香族L-氨基酸。 
所述细菌可以固有地具有L-赖氨酸产生能力，亦可为利用突变法或重组DNA技术，经修饰使其具有L-赖氨酸产生能力。所述细菌可通过将固有地具有L-氨基酸产生能力的细菌中的yjjK基因表达弱化而获得。或者，所述 细菌可以通过对已经具有弱化的yjjK基因表达的细菌赋予L-氨基酸产生能力而获得。 
L-精氨酸产生细菌 
可以用于衍生L-精氨酸产生细菌的亲本菌株的实例包括，但不限于，属于埃希氏菌属的细菌，例如大肠杆菌菌株237(VKPM B-7925)(美国专利申请2002/058315A1)及其带有突变N-乙酰谷氨酸合酶的衍生菌株(RU2215783)；大肠杆菌菌株382(VKPM B-7926)(EP1170358A1)，一种其中引入了编码N-乙酰谷氨酸合成酶的argA基因的精氨酸生产菌株(EP1170361A1)，等等。 
可用于衍生L-精氨酸产生细菌的亲本菌株的实例还包括如下菌株，其中一种或多种编码L-精氨酸生物合成酶的基因的表达被提高。这些基因的实例包括编码如下蛋白的基因：N-乙酰-γ-谷氨酰磷酸还原酶(argC)，鸟氨酸乙酰转移酶(argJ)，N-乙酰谷氨酸激酶(argB)，乙酰鸟氨酸转氨酶(argD)，鸟氨酸氨甲酰转移酶(argF)，精氨琥珀酸合成酶(argG)，精氨酸酶(argH)，和氨甲酰磷酸合成酶(carAB)。 
L-瓜氨酸产生细菌 
可用于衍生L-瓜氨酸产生细菌的亲本菌株的例子包括，但不限于属于埃希氏菌属的菌株，例如大肠杆菌突变型N-乙酰谷氨酸合酶菌株237/pMADS11,237/pMADS12,和237/pMADS13(RU2215783C2,EP1170361B1,US6790647B2)，大肠杆菌菌株333(VKPM B-8084)和374(VKPMB-8086)，二者都携带突变体反馈抗性氨基甲酰磷酸合成酶(俄罗斯专利RU2264459C2)，增加了α-酮戊二酸合酶活性，而且还修饰了铁氧还蛋白NADP+还原酶、丙酮酸合酶或α-酮戊二酸脱氢酶活性的大肠杆菌菌株(EP2133417A1)，以及P.ananantis NA1sucAsdhA菌株，其中降低了琥珀酸脱氢酶和α-酮戊二酸脱氢酶活性(美国专利申请2009286290)，等等。 
由于L-瓜氨酸是L-精氨酸生物合成途径的中间体，可以用于衍生L-瓜氨酸产生细菌的亲本菌株的例子包括其中提高了一种或多种编码L-精氨酸合成酶的基因的表达的菌株。这样的基因的例子包括但不限于编码N-乙酰谷氨酸合酶(argA)、N-乙酰谷氨酸激酶(argB)、N-乙酰谷氨酰磷酸还原酶(argC)、乙酰鸟氨酸转氨酶(argD)、乙酰鸟氨酸脱乙酰酶(argE)、鸟氨酸氨基 甲酰转移酶(argF/I)、和氨基甲酰磷酸合成酶(carAB)的基因，或它们的组合。 
L-瓜氨酸产生细菌还可以容易地从任何L-精氨酸产生细菌，例如大肠杆菌382菌株(VKPM B-7926)，通过失活由argG基因编码的精氨琥珀酸合酶来获得。 
L-半胱氨酸产生细菌 
可用于衍生L-半胱氨酸产生细菌的亲本菌株的实例包括，但不限于，属于埃希氏菌属的菌株，例如大肠杆菌JM15，其用编码抗反馈抑制的丝氨酸转乙酰基酶的不同cysE等位基因转化而得(美国专利No.6,218,168,俄罗斯专利申请2279477)；大肠杆菌W3110，其过表达编码适合于分泌对细胞有毒物质的蛋白的基因(美国专利No.5,972,663)；具有低活性半胱氨酸脱巯基酶的大肠杆菌菌株(JP11155571A2)；大肠杆菌W3110，其具有活性增加的正向转录调控子，用于调控由cysB基因编码的半胱氨酸调控子(WO0127307A1)；等。大肠杆菌JM15(ydeD)(美国专利6,218,168)等等。 
L-谷氨酸产生细菌 
可用于衍生L-谷氨酸产生细菌的亲本菌株包括，但不限于，属于埃希氏菌属的菌株，例如大肠杆菌VL334thrC+(EP1172433)。大肠杆菌VL334(VKPM B-1641)是一种L-异亮氨酸和L-苏氨酸营养缺陷菌株，在thrC和ilvA基因(美国专利No.4,278,765)中具有突变。通过使用在野生型大肠杆菌菌株K12(VKPM B-7)细胞上生长的噬菌体P1进行的一般转导方法进行转移thrC基因的野生型等位基因。结果，获得了L-亮氨酸营养缺陷型菌株VL334thrC+(VKPM B-8961)，其能够产生L-谷氨酸。 
可以用于衍生L-谷氨酸产生细菌的亲本菌株包括，但不限于，其中一种或多种编码L-谷氨酸生物合成酶的基因的表达被增强的菌株。这样的基因的实例包括编码下列酶的基因：谷氨酸脱氢酶(gdhA)，谷氨酰胺合成酶(glnA)，谷氨酸合成酶(gltAB)，异柠檬酸脱氢酶(icdA)，乌头酸水合酶(acnA,acnB)，柠檬酸合酶(gltA)，磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(ppc)，丙酮酸羧化酶(pyc)，丙酮酸脱氢酶(aceEF,lpdA)，丙酮酸激酶(pykA,pykF)，磷酸烯醇丙酮酸合酶(ppsA)，烯醇化酶(eno)，磷酸甘油酸变位酶(pgmA,pgmI)，磷酸甘油酸激酶(pgk)，甘油醛3-磷酸脱氢酶(gapA)，磷酸丙糖异构酶(tpiA)，果糖二磷酸醛缩酶(fbp)，磷酸果糖激酶(pfkA,pfkB)，和葡萄糖磷酸异构酶(pgi)。 
被修饰从而增强了柠檬酸合成酶基因、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因、和/或谷氨酸脱氢酶基因的表达的菌株实例包括在EP1078989A2,EP955368A2,和EP952221A2中公开的菌株。 
可用于衍生L-谷氨酸产生细菌的亲本菌株还包括如下菌株，其中催化从L-谷氨酸生物合成通路分支而合成L-谷氨酸之外的化合物的酶的活性被降低或消除。这些酶的实例包括异柠檬酸裂解酶(aceA)，α-酮戊二酸脱氢酶(sucA)，磷酸转乙酰基酶(pta)，乙酸激酶(ack)，乙酰羟酸合酶(ilvG)，乙酰乳酸合酶(ilvI)，甲酸乙酰转移酶(pfl)，乳酸脱氢酶(ldh)，和谷氨酸脱羧酶(gadAB)。属于埃希氏菌属且α-酮戊二酸脱氢酶活性缺陷或具有降低的α-酮戊二酸脱氢酶活性的细菌以及用于获得它们的方法在美国专利Nos.5,378,616和5,573,945中有描述。具体地，这些菌株包括下列： 
大肠杆菌W3110sucA::KmR
大肠杆菌AJ12624(FERM BP-3853) 
大肠杆菌AJ12628(FERM BP-3854) 
大肠杆菌AJ12949(FERM BP-4881) 
大肠杆菌W3110sucA::KmR是通过破坏大肠杆菌W3110的α-酮戊二酸脱氢酶基因(下文称作“sucA基因”)获得的菌株。该菌株的α-酮戊二酸脱氢酶是完全缺陷的。 
L-谷氨酸产生细菌的其它实例包括属于埃希氏菌属并对天冬氨酸抗代谢物耐受的细菌。这些菌株也可以是α-酮戊二酸脱氢酶活性缺陷的，并且包括例如大肠杆菌AJ13199(FERM BP-5807)(美国专利No.5,908,768),FFRM P-12379,其还具有低L-谷氨酸分解能力(美国专利No.5,393,671);AJ13138(FERM BP-5565)(美国专利No.6,110,714)等。 
L-谷氨酸产生细菌的实例包括属于泛菌属的突变菌株，其是α-酮戊二酸脱氢酶活性缺陷型或者α-酮戊二酸脱氢酶活性降低，并可以如上所述地获得。这些菌株包括Pantoea ananatisAJ13356(美国专利No.6,331,419)。Pantoea ananatis AJ13356于1998年2月19日保藏在工业技术院生命工学工业技术研究所(现为独立行政法人制品评价技术基盘国际专利生物保藏中心(NITE IPOD)，地址#120，2-5-8Kazusakamatari,Kisarazu-shi,Chiba-ken292-0818,JAPAN)，保藏号为FERM P-16645。后来其根据布达佩斯条约的规 定于1999年1月11日根据布达佩斯条约的条款转为国际保藏，保藏号为FERM BP-6615。Pantoea ananatis AJ13356由于αKGDH-E1亚单位基因(sucA)的破坏而导致α-酮戊二酸脱氢酶活性缺陷。当上述菌株被分离时曾被鉴定为成团肠杆菌，并以成团肠杆菌AJ13356的名义保藏。然而，最近根据16S rRNA的核苷酸序列等，它被重新归类为Pantoea ananatis。尽管AJ13356在前述保藏时是作为成团肠杆菌保藏的，但是为本专利说明书的目的，它们被作为Pantoea ananatis描述。 
L-组氨酸产生细菌 
用于衍生L-组氨酸产生细菌的亲本菌株的实例包括，但不限于，属于埃希氏菌属的菌株，例如大肠杆菌菌株24(VKPM B-5945,RU2003677C1)，大肠杆菌菌株80(VKPM B-7270,RU2119536C1)，大肠杆菌NRRL B-12116–B12121(美国专利No.4,388,405)，大肠杆菌H-9342(FERM BP-6675)和H-9343(FERM BP-6676)(美国专利No.6,344,347);大肠杆菌H-9341(FERMBP-6674)(EP1085087);大肠杆菌AI80/pFM201(美国专利No.6,258,554)等。 
可用于衍生L-组氨酸产生细菌的亲本菌株的实例还包括如下菌株，其中一种或多种编码L-组氨酸生物合成酶的基因的表达被增强。这些基因的实例包括编码如下蛋白的基因：ATP磷酸核糖转移酶(hisG)，磷酸核糖AMP环化水解酶(hisI)，磷酸核糖-AMP环化水解酶/磷酸核糖-ATP焦磷酸酶(hisIE)，磷酸核糖亚胺甲基-5-氨基咪唑甲酰胺核苷酸异构酶(phosphoribosylformimino-5-aminoimidazole carboxamide ribotide isomerase)(hisA)，酰胺转移酶(hisH)、组氨醇磷酸氨基转移酶(hisC)、组氨醇磷酸酶(hisB)，组氨醇脱氢酶(hisD)等。 
已知由hisG和hisBHAFI编码的L-组氨酸生物合成酶被L-组氨酸抑制，因此还可以通过在ATP磷酸核糖转移酶中引入对反馈抑制提供抵抗的突变来高效地增强L-组氨酸的生产能力(俄罗斯专利Nos.2003677和2119536)。 
具有产L-组氨酸的能力的菌株的具体实例包括大肠杆菌FERM-P5038和5048，它们中引入了携带编码L-组氨酸生物合成酶的DNA的载体(JP56-005099A)，引入了用于氨基酸外排的rht基因的大肠杆菌菌株(EP1016710A)，被赋予了对磺胺脒、DL-1,2,4-三唑-3-丙氨酸、和链霉素的抗性的大肠杆菌80菌株(VKPM B-7270,RU2119536)，和大肠杆菌 MG1655+hisGr hisL'_ΔΔpurR(RU2119536C1,Doroshenko V.G.et al.,The directed modification of Escherichia coli MG1655to obtain histidine-producing mutants,Prikl.Biochim.Mikrobiol.(Russian),2013,49(2):149-154.)等。 
L-异亮氨酸产生细菌 
可用于衍生L-异亮氨酸产生细菌的亲本菌株的实例包括，但不限于，对6-二甲基氨基嘌呤有抗性的突变体(JP5-304969A)，对异亮氨酸类似物如硫代异亮氨酸和异亮氨酸羟肟酸(isoleucine hydroxamate)有抗性的突变体，和额外具有对DL-乙硫氨酸(DL-ethionine)和/或精氨酸羟肟酸(arginine hydroxamate)抗性的突变体(JP5-130882A)。此外，也可以使用用编码参与L-异亮氨酸生物合成的蛋白(例如苏氨酸脱氨酶和乙酰羟酸合酶)的基因转化的重组菌株作为亲本菌株(JP2-458A,EP0356739A1,和美国专利No.5,998,178)。 
L-亮氨酸产生细菌 
可用于衍生L-亮氨酸产生细菌的亲本菌株的实例包括，但不限于，属于埃希氏菌属的菌株，例如对亮氨酸耐受的大肠杆菌菌株(例如菌株57(VKPM B-7386,美国专利No.6,124,121))或对亮氨酸类似物包括β-2-噻吩丙氨酸、3-羟基亮氨酸、4-氮亮氨酸、5,5,5-三氟亮氨酸耐受的大肠杆菌菌株(JP62-34397B和JP8-70879A)；通过WO96/06926中所述基因工程方法获得的大肠杆菌菌株；大肠杆菌H-9068(JP8-70879A)等。 
细菌可以通过增强一种或多种参与L-亮氨酸生物合成的基因的表达加以改良。实例包括leuABCD操纵子基因，其代表是如下所述的突变型leuA基因，该基因编码不被L-赖氨酸反馈抑制的异丙基苹果酸合酶(美国专利6,403,342)。此外，细菌可以通过增强一种或多种编码将L-氨基酸分泌出细菌细胞的蛋白的基因的表达进行改良。这些基因的实例包括b2682和b2683基因(ygaZH基因)(EP1239041A2)。 
L-赖氨酸产生细菌 
属于埃希氏菌家族的L-赖氨酸产生细菌的实例包括具有对L-赖氨酸类似物的抗性的突变体。L-赖氨酸类似物抑制属于埃希氏菌属的细菌的细菌的生长，但这种抑制在当培养基中存在L-赖氨酸时被全部或部分解除(desensitize)。L-赖氨酸类似物的实例包括，但不限于，氧代赖氨酸(oxalysine)、 赖氨酸异羟肟酸(lysine hydromate)、S-(2-氨基乙基)-L-半胱氨酸（AEC）、γ-甲基赖氨酸、α-氯代己内酰胺（α-chlorocaprolactam)等。可通过对属于埃希氏菌属的细菌施以常规人工诱变处理来获得对这些赖氨酸类似物有抗性的突变体菌株。L-赖氨酸产生细菌的具体实例包括大肠杆菌AJ11442(FERM BP-1543,NRRL B-12185,见美国专利No.4,346,170)和大肠杆菌VL611。在这些微生物中，L-赖氨酸对天冬氨酸激酶的反馈抑制被解除。 
可以用来衍生L-赖氨酸产生细菌的亲本菌株还包括其中增加了编码L-赖氨酸生物合成酶的一种或多种基因的表达的菌株。此类基因的例子包括，但不限于编码二氢吡啶二羧酸(dihydrodipicolinate)合酶基因(dapA)、天冬氨酸激酶(lysC)、二氢吡啶二羧酸还原酶(dapB)、二氨基庚二酸(diaminopimelate)脱羧酶(lysA)、二氨基庚二酸脱氢酶(ddh)(美国专利6,040,160)、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(ppc)、天冬氨酸半醛脱氢酶(asd)、和天冬氨酸酶(aspA)的基因(EP1253195A1)。此外，亲本菌株可以具有更高表达水平的涉及能量效率的基因(cyo)(EP1170376A1)，编码烟酰胺核苷酸转氢酶的基因(pntAB)(美国专利No.5,830,716),和ybjE基因(WO2005/073390)，或它们的组合。 
L-氨基酸产生细菌中催化导致从L-氨基酸生物合成通路发生分支、并产生另一种化合物的反应的酶可以是已被降低活性的或是没有活性的。另外，该细菌中对L-氨基酸合成或积累有负面影响的酶可以是已被降低活性的或是没有活性的。这些参与L-赖氨酸生产的酶的实例包括高丝氨酸脱氢酶、赖氨酸脱羧酶(cadA,ldcC)、苹果酸酶等，这些酶的活性降低或缺失的菌株在WO95/23864,WO96/17930,WO2005/010175等中公开。 
为了使赖氨酸脱羧酶活性降低或缺损，可降低或缺失编码赖氨酸脱羧酶的cadA基因和ldcC基因这两者的表达。降低这两个基因的表达可以按照WO2006/078039中所述的方法来进行。 
L-赖氨酸产生细菌的例子可以包括大肠杆菌WC196ΔcadAΔldcC/pCABD2株(WO2006/078039)。该菌株是通过在破坏了编码赖氨酸脱羧酶的cadA和ldcC基因的WC196株中导入包含赖氨酸生物合成系统基因的质粒pCABD2(美国专利第6,040,160号)而构建的。 
WC196株是由大肠杆菌K-12来源的W3110株出发，用突变型lysC基因替换W3110株染色体上的野生型lysC基因，而后赋予AEC抗性而培育得 到的菌株(美国专利第5,827,698号)，所述突变型lysC基因编码第352位的苏氨酸被替换成异亮氨酸，从而解除了L-赖氨酸反馈抑制的天冬氨酸激酶III(美国专利第5,661,012号)。WC196株被命名为大肠杆菌AJ13069，已于1994年12月6日保藏在工业技术院生命工学工业技术研究所(现为独立行政法人制品评价技术基盘国际专利生物保藏中心(NITE IPOD)、#120,2-5-8Kazusakamatari,Kisarazu-shi,Chiba-ken292-0818,JAPAN)，被给予保藏号FERM P-14690。然后，其于1995年9月29日转为基于布达佩斯条约的国际保藏，被给予保藏号FERM BP-5252(美国专利第5,827,698号)。 
WC196ΔcadAΔldcC本身也是示例性的L-赖氨酸产生细菌。WC196ΔcadAΔldcC被命名为AJ110692，并于2008年10月7日国际保藏于工业技术院生命工学工业技术研究所(现为独立行政法人制品评价技术基盘国际专利生物保藏中心(NITE IPOD)，#120,2-5-8Kazusakamatari,Kisarazu-shi,Chiba-ken292-0818,JAPAN)，保藏号FERM BP-11027。 
L-甲硫氨酸产生细菌 
L-甲硫氨酸产生细菌和可以用于用于衍生L-甲硫氨酸产生细菌的亲本菌株的例子包括但不限于埃希氏菌属细菌菌株，诸如菌株AJ11539(NRRL B-12399),AJ11540(NRRL B-12400),AJ11541(NRRL B-12401),AJ11542(NRRL B-12402)(GB专利GB2075055)；对正亮氨酸、L-甲硫氨酸类似物等等有抗性的菌株218(VKPM B-8125)(俄罗斯专利RU2209248C2)和73(VKPM B-8126)(俄罗斯专利RU2215782C2)等等。大肠杆菌73菌株已经于2001年5月14日保藏于俄罗斯国立工业微生物保藏中心(VKPM)(Russian Federation,117545Moscow,1st Dorozhny proezd,1)，保藏号为VKPM B-8126，并于2002年2月1日根据布达佩斯条约转为国际保藏。此外，还可以使用缺损了甲硫氨酸阻遏物的菌株、用编码高丝氨酸转琥珀酰酶、胱硫醚γ-合酶等L-甲硫氨酸生物合成相关蛋白质的基因转化过的重组菌株作为亲本株(JP2000-139471A)。 
L-鸟氨酸产生细菌 
L-鸟氨酸产生细菌可以从任何L-精氨酸产生细菌，例如大肠杆菌382株(VKPM B-7926)，通过失活由argF与argI基因二者编码的鸟氨酸氨基甲酰转移酶来容易地获得。本文中描述了用于失活鸟氨酸氨基甲酰转移酶的方 法。 
L-苯丙氨酸产生细菌 
可以用于衍生L-苯丙氨酸产生细菌的亲本菌株包括，但不限于，属于埃希氏菌属的菌株，例如大肠杆菌AJ12739(tyrA::Tn10,tyrR)(VKPMB-8197)；包含突变的pheA34基因的大肠杆菌HW1089(ATCC55371)(美国专利No.5,354,672);大肠杆菌MWEC101-b(KR8903681);大肠杆菌NRRLB-12141,NRRL B-12145,NRRL B-12146和NRRL B-12147(美国专利No.4,407,952)。另外，作为亲本菌株，可以使用大肠杆菌K-12[W3110(tyrA)/pPHAB(FERM BP-3566),大肠杆菌K-12[W3110(tyrA)/pPHAD](FERM BP-12659),大肠杆菌K-12[W3110(tyrA)/pPHATerm](FERM BP-12662)和大肠杆菌K-12[W3110(tyrA)/pBR-aroG4,pACMAB]，其被命名为AJ12604(FERM BP-3579)(EP488424B1)。而且，也可以使用属于埃希氏菌属且由yedA基因或yddG基因编码的蛋白的活性增强的产L-苯丙氨酸细菌(美国专利申请2003/0148473A1和2003/0157667A1)。 
L-脯氨酸产生细菌 
可以用于衍生L-脯氨酸产生细菌的亲本菌株的实例包括，但不限于，属于埃希氏菌属的细菌，例如大肠杆菌702ilvA(VKPM B-8012)，其是ilvA基因缺陷的并能够产生L-脯氨酸(EP1172433A1)。可以通过提高一种或多种参与L-脯氨酸生物合成的基因的表达对细菌进行改良。这些可以用于产L-脯氨酸的细菌的基因的实例包括proB基因，其编码解除了L-脯氨酸所致的反馈抑制的谷氨酸激酶(DE3127361A1)。此外，可以通过提高一种或多种编码将L-氨基酸从细菌细胞外泌的蛋白的基因的表达来对细菌进行改良。这些基因的实例是b2682和b2683基因(ygaZH基因)(EP1239041A2)。 
属于埃希氏菌属并具有产生L-脯氨酸的能力的细菌实例包括如下大肠杆菌菌株：NRRL B-12403和NRRL B-12404(GB专利2075056),VKPMB-8012(俄罗斯专利申请2000124295),在DE3127361A中描述的质粒突变体,在Bloom F.R.等(The15th Miami winter symposium,1983,第34页)中描述的质粒突变体，等。 
L-苏氨酸产生细菌 
可用于衍生L-苏氨酸产生细菌的亲本菌株的实例包括，但不限于，属 于埃希氏菌属的菌株，例如大肠杆菌TDH-6/pVIC40(VKPM B-3996)(美国专利No.5,175,107,美国专利No.5,705,371),大肠杆菌472T23/pYN7(ATCC98081)(美国专利No.5,631,157),大肠杆菌NRRL-21593(美国专利No.5,939,307),大肠杆菌FERM BP-3756(美国专利No.5,474,918),大肠杆菌FERM BP-3519和FERM BP-3520(美国专利No.5,376,538),大肠杆菌MG442(Gusyatiner M.et al.,Genetika(俄语),1978:14,947-956),大肠杆菌VL643和VL2055(EP1149911A2)等。 
菌株TDH-6是thrC基因缺陷的，具有蔗糖同化性（sucrose assimilability)，并且ilvA基因具有渗漏突变。该菌株在rhtA基因中也有突变，其赋予对高浓度苏氨酸或高丝氨酸的抗性。菌株B-3996包含质粒PVIC40，其通过将包含突变thrA基因的thrA*BC操纵子插入到RSF1010衍生载体中获得。该突变thrA基因编码天冬氨酸激酶高丝氨酸脱氢酶I，其对苏氨酸所致的反馈抑制基本上解除(美国专利No.5,175,107)。菌株B-3996于1987年11月19日以保藏号RIA1867保藏在全联盟抗生素联合科学中心(All-Union Scientific Center of Antibiotics)(Russian Federation，117105Moscow，Nagatinskaya Street3-A）。该菌株还于1987年4月7日以登录号B-3996保藏在俄罗斯国立工业微生物保藏中心(Russian National Collection of Industrial Microorganisms)(Russian Federation，117545Moscow，1st Dorozhny proezd,1)。 
大肠杆菌VKPM B-5318(EP0593792A1)也可以用作用于衍生L-苏氨酸产生细菌的亲本菌株。菌株B-5318是异亮氨酸自养的，温度敏感型λ噬菌体C1阻遏物和PR启动子代替了质粒pVIC40中苏氨酸操纵子的调控区。菌株VKPM B-5318于1990年5月3日以保藏号VKPM B-5318保藏在俄罗斯国立工业微生物保藏中心(Russian National Collection of Industrial Microorganisms)(VKPM)。 
细菌可以被额外修饰以增强下述一个或多个基因的表达： 
-突变的thrA基因，其编码对L-苏氨酸所致的反馈抑制有抗性的天冬氨酸激酶高丝氨酸脱氢酶I； 
-thrB基因，其编码高丝氨酸激酶； 
-thrC基因，其编码苏氨酸合酶； 
-rhtA基因，其编码推测的苏氨酸和高丝氨酸外流系统跨膜蛋白； 
-asd基因，其编码天冬氨酸-β-半醛脱氢酶；和 
-aspC基因，其编码天冬氨酸氨基转移酶(天冬氨酸转氨酶)； 
编码大肠杆菌的天冬氨酸激酶I和高丝氨酸脱氢酶I的thrA基因已经被阐明(KEGG条目号b0002;GenBank登录号NC_000913.2;核苷酸位置:337-2,799;基因ID:945803)。在大肠杆菌K-12的染色体上，thrA基因位于thrL和thrB基因之间。 
编码大肠杆菌高丝氨酸激酶的thrB基因已经被阐明(KEGG条目号b0003;GenBank登录号NC_000913.2;核苷酸位置:2,801-3,733;基因ID:947498)。在大肠杆菌K-12的染色体上，thrB基因位于thrA和thrC基因之间。 
编码大肠杆菌苏氨酸合酶的thrC基因已经被阐明(KEGG条目号b0004;GenBank登录号NC_000913.2;核苷酸位置:3,734-5,020;基因ID:945198)。在大肠杆菌K-12的染色体上，thrC基因位于thrB和yaaX基因之间。所有三个基因作为一个苏氨酸操纵子thrABC发挥功能。为了增强苏氨酸操纵子的表达，从操纵子除去影响转录的衰减子区是理想的(WO2005049808A1,WO2003097839A1)。 
编码对L-苏氨酸所致的反馈抑制抵抗的天冬氨酸激酶I和高丝氨酸脱氢酶I的突变thrA基因，以及thrB和thrC基因可以从众所周知的质粒pVIC40上作为一个操纵子获得，该质粒存在于产生苏氨酸的大肠杆菌菌株VKPMB-3996中。质粒pVIC40在美国专利No.5,705,371中有详细描述。 
编码大肠杆菌苏氨酸和高丝氨酸外流系统(一种内膜转运子)的rhtA基因已经被阐明(KEGG条目号b0813;GenBank登录号NC_000913.2;核苷酸位置:848,433-849,320,互补物;基因ID:947045)。在大肠杆菌K-12的染色体上，rhtA基因位于dps和ompX基因之间，接近编码谷氨酰胺转运系统组分的glnHPQ操纵子。rhtA基因与ybiF基因(KEGG条目号B0813)相同。 
编码大肠杆菌天冬氨酸-β-半醛脱氢酶的asd基因已经被阐明(KEGG条目号b3433;GenBank登录号NC_000913.2;核苷酸位置:3,571,798-3,572,901,互补物;基因ID:947939)。在大肠杆菌K-12的染色体上，asd基因位于相同链上的glgB和gntU基因(相反链上是yhgN基因)之间。 
另外，编码大肠杆菌天冬氨酸氨基转移酶的aspC基因已经被阐明 (KEGG条目号b0928;GenBank登录号NC_000913.2;核苷酸位置:983,742-984,932,互补物；基因ID:945553)。在大肠杆菌K-12的染色体上，aspC基因位于相反链上的ycbL基因和相同链上的ompF基因之间。 
L-色氨酸产生细菌 
可用于衍生L-色氨酸产生细菌的亲本菌株包括，但不限于，属于埃希氏菌属的菌株，例如大肠杆菌JP4735/pMU3028(DSM10122)和JP6015/pMU91(DSM10123)，其是由突变trpS基因编码的色氨酰-tRNA合成酶缺陷型(美国专利No.5,756,345)；大肠杆菌SV164(pGH5)，其具有编码不被丝氨酸反馈抑制的磷酸甘油酸脱氢酶的serA等位基因和编码不被色氨酸反馈抑制的邻氨基苯甲酸合成酶的trpE等位基因(美国专利No.6,180,373)；大肠杆菌AGX17(pGX44)(NRRL B-12263)和AGX6(pGX50)aroP(NRRL B-12264)，其色氨酸酶缺陷(美国专利No.4,371,614)；大肠杆菌AGX17/pGX50，pACKG4-pps，其中磷酸烯醇丙酮酸生产能力增强(WO9708333,美国专利No.6,319,696)等。也可以使用属于埃希氏菌属并且yedA基因或yddG基因所编码的特定蛋白的活性提高的产色氨酸细菌(美国专利申请2003/0148473A1和2003/0157667A1)。 
可用于衍生L-色氨酸产生细菌的亲本菌株的实例还包括其中一种或多种选自下组的酶的活性被增强的菌株：邻氨基苯甲酸合酶、磷酸甘油酸脱氢酶、和色氨酸合酶。邻氨基苯甲酸合酶和磷酸甘油酸脱氢酶均被L-色氨酸和L-丝氨酸反馈抑制，因此可以在这些酶中引入导致对该反馈抑制脱敏的突变。具有这种突变的菌株的具体实例包括大肠杆菌SV164，其包含脱敏的邻氨基苯甲酸合成酶，和通过向大肠杆菌SV164引入质粒pGH5获得的转化菌株(WO94/08031)，其含有编码解除了反馈的磷酸烯醇丙酮酸脱氢酶的突变serA基因。 
可用于衍生L-色氨酸产生细菌的亲本菌株的实例还包括如下菌株，其中已引入了含有编码脱敏的邻氨基苯甲酸合成酶基因的色氨酸操纵子(JP57-71397A,JP62-244382A,美国专利No.4,371,614)。而且，可以增强色氨酸操纵子(trpBA)中编码色氨酸合酶的基因的表达，来赋予生产L-色氨酸的能力。色氨酸合酶由α和β亚基构成，其分别由trpA和trpB基因编码。此外，可以通过增强异柠檬酸裂合酶-苹果酸合酶操纵子的表达来改善生产L-色氨 酸的能力(WO2005/103275)。 
L-缬氨酸产生细菌 
可用于衍生L-缬氨酸产生细菌的亲本菌株的实例包括，但不限于，已被修饰而过表达ilvGMEDA操纵子的菌株(美国专利No.5,998,178)。最好除去ilvGMEDA操纵子中为衰减作用所需要的区域，使得操纵子的表达不会被所产生的L-缬氨酸所弱化。而且，最好是破坏操纵子中的ilvA基因，以降低苏氨酸脱氨酶活性。 
用于衍生L-缬氨酸产生细菌的亲本菌株的实例还包括具有氨基-乙酰t-RNA合成酶突变的突变体(美国专利No.5,658,766)。例如，可以使用大肠杆菌VL1970，其在编码异亮氨酸tRNA合成酶的ileS基因中具有突变。大肠杆菌VL1970于1988年6月24日被保藏于俄罗斯国立工业微生物保藏中心(VKPM)(Russian National Collection of Industrial Microorganisms)(Russion Federation，117545Moscow，1st Dorozhny proezd,1)，保藏号为VKPM B-4411。 
而且，也可以使用需要类脂酸维持生长和/或缺少H+-ATP酶的突变体作为亲本菌株(WO96/06926)。 
L-缬氨酸产生菌株的例子包括大肠杆菌菌株H-81(VKPM B-8066),NRRL B-12287和NRRL B-12288(美国专利4,391,907),VKPM B-4411(美国专利5,658,766),VKPM B-7707(欧洲专利申请EP1016710A2)等等。 
本发明的属于肠杆菌科的细菌已经过修饰而弱化了yjjK基因的表达。 
短语“经过修饰而弱化了yjjK基因的表达的细菌”可以表示细菌已经通过这样的方式被修饰，使得在经过修饰的细菌中yjjK基因的表达相比于含有未修饰的yjjK基因的细菌，例如野生型或亲本菌株降低，或者yjjK基因失活。 
短语“yjjK基因失活”可以表示经修饰的基因编码完全无活性的或无功能的蛋白质。还有可能的是，经修饰的DNA区域由于缺失基因的一部分或缺失整个基因、替代一个或多个碱基而导致由所述基因编码的蛋白质中的氨基酸取代(错义突变)、导入终止密码子(无义突变)、缺失一个或两个碱基而导致基因阅读框移动、插入药物抗性基因和/或转录终止信号、或修饰基因的邻近区域，包括控制基因表达的序列如启动子、增强子、衰减子、核糖体结合位点(RBS)等等，而无法天然地表达该基因。基因的失活亦可通过，例如， 常规方法，如用UV辐照或亚硝基胍(N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍)进行的诱变处理，定点诱变，使用同源重组的基因破坏，和/或基于“λRed/ET驱动的整合”或“λRed/ET介导的整合”的插入-缺失诱变(Yu D.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,2000,97(11):5978-5983;Datsenko K.A.and Wanner B.L.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,2000,97(12):6640-6645;Zhang Y.et al.,Nature Genet.,1998,20:123-128))来进行。 
短语“弱化了yjjK基因的表达”可以表示，在弱化了yjjK基因的表达的经修饰的细菌中，与非修饰细菌如野生型或亲本菌株例如大肠杆菌K12相比，YjjK蛋白的量减少。 
短语“弱化了yjjK基因的表达”还可以表示经过修饰的细节含有与该基因可操作连接的区域，包括控制该基因的序列，诸如启动子、增强子、衰减子和转录终止信号，核糖体结合位点(RBS)、以及其他表达控制元件，所述区域经过修饰而导致yjjK基因表达水平的下降，以及其他实例(参见例如WO95/34672;Carrier T.A.and Keasling J.D.,Biotechnol.Prog.,1999,15:58-64))。 
yjjK基因的表达可以通过将该基因的表达控制序列(例如染色体DNA上的启动子)用更弱者替代来加以减弱。启动子的强度由RNA合成的起始行为的频率来定义。用于评价启动子强度的方法以及强启动子在Goldstein et al.,Prokaryotic promoters in biotechnology,Biotechnol.Annu.Rev.,1995,1:105-128等中描述。此外，还有可能在靶基因的启动子区中导入对数个核苷酸的核苷酸取代，以修饰要减弱的启动子，如国际专利公布WO00/18935公开的那样。此外，已知Shine-Dalgarno(SD)序列，和/或SD序列与起始密码子之间的间隔序列，和/或起始密码子直接上游和/或下游的核糖体结合位点(RBS)中的序列对mRNA翻译效率的影响很大。这种对RBS的修饰可以与降低yjjK基因的转录组合。 
yjjK基因的表达还可以通过将转座子或插入序列(IS)插入该基因的编码区域(美国专利5,175,107)或插入控制基因表达的区域，或者插入yjjK基因结构的近端部分(其中yjjK为远端部分)，或者通过常规方法诸如用紫外照射(UV)、辐射或亚硝基胍(N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍)诱变，来加以弱化。此外，位点特异性突变的导入可以通过已知的染色体编辑方法(例如基于 λRed/ET介导的重组)来进行。 
基因的拷贝数、存在或不存在可以通过例如这样的方法来测量：限制(restricting)染色体DNA，然后使用基于基因序列的探针进行Southern印迹、荧光原位杂交（FISH），等等。基因表达的水平可以通过用公知方法测量自该基因转录的mRNA的量来测定，这些方法包括Northern印迹、定量RT-PCR等等。由该基因编码的蛋白质的量可以使用已知的方法测量，此类方法包括SDS-PAGE后续免疫印迹测定(Western印迹分析)，或对蛋白质样品的质谱分析，等等。 
用于DNA重组分子的操作和分子克隆的方法，例如质粒DNA的制备、DNA的消化、连接和转化、作为引物的寡核苷酸的选择、突变的导入等等，可以是本领域技术人员公知的通常方法。这些方法在例如Sambrook J.,Fritsch E.F.and Maniatis T.,“Molecular Cloning:A Laboratory Manual”,2nd ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)或Green M.R.and Sambrook J.R.,“Molecular Cloning:A Laboratory Manual”,4th ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press(2012);Bernard R.Glick,Jack J.Pasternak and Cheryl L.Patten,“Molecular Biotechnology:principles and applications of recombinant DNA”,4th ed.,Washington,DC,ASM Press(2009)中记载。 
yjjK基因编码融合的预测的ABC超家族的转运子亚单位，ATP结合组分YjjK((KEGG,Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,entry No.b4391;Protein Knowledgebase,UniProtKB/Swiss-Prot,accession No.P0A9W3)。yjjK基因(GenBank accession No.NC_000913.2;核苷酸位置:4626878至4628545,互补体;Gene ID:948909)位于大肠杆菌菌株K-12染色体上的相对链上的nadR与slt基因之间。yjjK基因的核苷酸序列和由yjjK基因编码的YjjK蛋白的氨基酸序列分别由SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示。 
来自属于肠杆菌科的其他细菌种的ABC转运子ATP结合蛋白YjjK的氨基酸序列是已知的。示例的YjjK蛋白质列于，例如：Protein Knowledgebase,UniProtKB/Swiss-Prot(www.uniprot.org/)登录号F2EU25(Pantoea ananatis,AJ13355株,FERM BP-6614),D0ZV61(鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium),14028s/SGSC2262株，The Salmonella Genetic Stock Centre(SGSC),Department of Biological Sciences,2500University Dr.N.W.Calgary, Alberta,Canada T2N1N4),P0A9W5(福氏志贺氏菌(Shigella flexneri))或来自福氏志贺氏菌Castellani和Chalmers,ATCC29903，B2VH30(Erwinia tasmaniensis,DSM17950/Et1/99株,Leibniz Institute,DSMZ-German Collection of Microorganisms and Cell Cultures,Inhoffenstrasse7B,38124Braunschweig,Germany),C7BJV0(Photorhabdus asymbiotica subsp.asymbiotica,ATCC43949/3105-77株)，等等。 
由于大肠杆菌科的各属、种或株的DNA序列之间可能有某些差异，因此yjjK基因不限于SEQ ID NO:1所示的基因，还可以是SEQ ID NO:1的变异核苷酸序列或与SEQ ID NO:1同源，且编码YjjK蛋白的变异体。 
短语“变异蛋白质”可表示与SEQ ID NO:2相比在序列中有一个或几个改变的蛋白质，无论所述改变是一个或几个氨基酸残基的取代、缺失、插入和/或添加，但仍然维持与YjjK蛋白相似的活性或功能，或者YjjK蛋白的三维结构相比于野生型或非修饰蛋白质没有显著的改变。变异蛋白中的改变的数目取决于在蛋白质的三维结构中的位置或氨基酸残基的类型。在SEQ ID NO:2中，其可以是，但不严格限于1-30个，在另一个例子中是1-15个，在另一个例子中是1-10个，且在另一个例子中是1-5个。变异蛋白质中的这些改变可以在该蛋白质中对该蛋白质的活性或功能而言不是至关重要的区域发生。这是因为某些氨基酸相互之间有高同源性，使得活性或功能不受这样的改变的影响，或者YjjK的三维结构相对于野生型或非修饰型蛋白质没有显著的改变。因此，由yjjK基因基因编码的蛋白质变异体相对于SEQ ID NO:2中所示的完整氨基酸序列可具有不少于80%、不少于90%、不少于95%、或不少于98%的同源性(使用计算机程序BLAST时定义为参数“同一性”)，只要YjjK蛋白质的活性或功能得以维持，或者YjjK的三维结构相对于野生型或非修饰蛋白质没有显著的改变。 
一个或几个氨基酸残基的示例性的取代、缺失、插入和/或添加可以是保守突变。代表性的保守突变是保守取代。保守取代可以是，但不限于如下取代，其中如果取代位点是芳香族氨基酸，则取代在Phe、Trp和Tyr之间相互发生；如果取代位点是疏水氨基酸，则发生于Ala、Leu、Ile和Val之间；如果取代位点是是亲水性氨基酸，则发生于Glu、Asp、Gln、Asn、Ser、His和Thr之间；如果取代位点是极性氨基酸，则发生于Gln和Asn之间；如果 取代位点是碱性氨基酸，则发生于Lys、Arg和His之间；如果取代位点是酸性氨基酸，则发生于Asp和Glu之间；如果取代位点是具有羟基的氨基酸，则发生于Ser和Thr之间。保守取代的实例包括Ser或Thr取代Ala；Gln,His或Lys取代Arg；Glu,Gln,Lys,His或Asp取代Asn；Asn,Glu或Gln取代Asp；Ser或Ala取代Cys；Asn,Glu,Lys,His,Asp或Arg取代Gln；Asn,Gln,Lys或Asp取代Glu；Pro取代Gly；Asn,Lys,Gln,Arg或Tyr取代His；Leu,Met,Val或Phe取代Ile；Ile,Met,Val或Phe取代Leu；Asn,Glu,Gln,His或Arg取代Lys；Ile,Leu,Val或Phe取代Met；Trp,Tyr,Met,Ile或Leu取代Phe；Thr或Ala取代Ser；Ser或Ala取代Thr；Phe或Tyr取代Trp；His,Phe或Trp取代Tyr；Met,Ile或Leu取代Val。 
一个或几个氨基酸残基的示例性取代、缺失、插入和/或添加还可以是非保守突变，只要该突变被氨基酸序列中不同位置上的一个或几个第二突变所补偿，使得变异蛋白的活性或功能得以维持并与YjjK蛋白相似，或者YjjK的三维结构相对于野生型或非修饰蛋白质没有显著的改变。 
为了评估蛋白质或DNA同源性的程度，可以使用几种计算方法，例如BLAST检索、FASTA检索和ClustalW方法。BLAST(Basic Local Alignment Search Tool,www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)检索是blastp,blastn,blastx,megablast,tblastn和tblastx等程序应用的一种启发式检索算法；这些程序使用Samuel K和Altschul S.F.的统计学方法(“Methods for assessing the statistical significance of molecular sequence features by using general scoring schemes”Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1990,87:2264-2268;“Applications and statistics for multiple high-scoring segments in molecular sequences”.Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1993,90:5873-5877)给它们的搜寻结果归结显著性。计算机程序BLAST计算三个参数：得分、同一性和相似性。FASTA检索方法描述于Pearson W.R.(“Rapid and sensitive sequence comparison with FASTP and FASTA”,Methods Enzymol.,1990,183:63-98)。ClustalW法由Thompson J.D等人描述(“CLUSTAL W:improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting,position-specific gap penalties and weight matrix choice”,Nucleic Acids Res.,1994,22:4673-4680)。 
此外，yjjK基因可以是变异核苷酸序列。短语“变异核苷酸序列”可以表 示这样的氨基酸序列，其使用依照标准遗传密码子表(参见例如Lewin B.,“Genes VIII”,2004,Pearson Education,Inc.,Upper Saddle River,NJ07458)的任何同义氨基酸密码子编码YjjK蛋白质，或者YjjK蛋白质的“变异蛋白质”。yjjK基因可以是由于遗传密码的简并性所致的变异核苷酸序列。 
短语“变异核苷酸序列”还可以表示，但不限于这样的核苷酸序列：在严格条件下其与互补于SEQ ID NO:1中所示序列的核苷酸序列，或者能够在严格条件下从该核苷酸序列制备的探针杂交，条件是其编码功能性蛋白质。“严格条件”包括如下的条件，在该条件下能够形成特异的杂交体，例如同源性(当使用计算机程序BLAST时定义为参数“同一性”)不少于70%,不少于80%,不少于90%,不少于95%,不少于96%,不少于97%,不少于98%或不少于99%的杂交体，而不会形成非特异的杂交体，例如同源性小于上述的杂交体。例如，严格条件的实例可以是在1×SSC(标准柠檬酸钠或标准氯化钠),0.1%SDS(十二烷基硫酸钠)的盐浓度下，或者在另一个实例中在0.1×SSC,0.1%SDS的盐浓度下，在60℃或65℃下清洗1次或者更多次，或者在另一个实例中清洗2次或3次。清洗的持续时间取决于用于印迹的膜的类型，并且，原则上应当是制造商所推荐的。例如，对于Amersham HybondTM-N+正电荷尼龙膜(GE Healthcare)，在严格条件下的推荐清洗持续时间为15分钟。清洗步骤可以执行2-3次。作为探针，也可以使用与SEQ ID NO:1所示序列互补的序列的一部分。这类探针可以通过PCR产生，使用根据SEQ ID NO:1所示序列制备的寡核苷酸作为引物，和含有该核苷酸序列的DNA片段作为模板。探针的长度推荐为>50bp；它可以根据杂交条件合适地选出，通常为100bp-1kbp。例如，当使用长度为大约300bp的DNA片段作为探针时，杂交后的清洗条件的实例可以为2×SSC,0.1%SDS，50℃、60℃或65℃。 
因为编码埃希氏菌属、泛菌属、志贺氏菌属、欧文氏菌属和发光杆菌属的YjjK蛋白质的基因已经得到阐明(见上文)，所以编码YjjK蛋白质的变异蛋白质的变异核苷酸序列可以使用根据yjjK基因的核苷酸序列制备的引物通过PCR(聚合酶链式反应；参见White T.J.et al.,The polymerase chain reaction,Trends Genet.,1989,5:185-189)获得，或者通过定点诱变方法在体外处理含有野生型或突变型yjjK基因(例如用羟胺处理)获得，或者通过用紫外线(UV)照射或诱变剂如常用于此类处理的N-甲基-N’-亚硝基胍(NTG)和亚硝 酸处理携带野生型或突变型yjjK基因的微生物(例如属于肠杆菌科的细菌)来获得，或者作为全基因结构化学合成。其他微生物的编码YjjK蛋白质或其变异蛋白质可以以类似的方式获得。 
短语“野生型”可以表示由肠杆菌科的野生型或亲本菌株，例如由野生型大肠杆菌MG1655菌株，自然产生的天然蛋白质。野生型蛋白质可以由野生型细菌的基因组中天然存在的野生型，或者非修饰型基因所编码。 
短语“可操作地连接”可以表示调节区域以这样的方式连接于感兴趣的核酸分子或基因的核苷酸序列，从而容许该核苷酸序列的表达(例如增强的、增加的、组成型的、基态的(basal)、反终止的(antiterminated)、弱化的、去调控的、降低的或受阻遏的表达)，优选是由核苷酸序列编码的基因产物的表达。 
如本文中描述的细菌可以通过弱化天然具有产生L-氨基酸能力的细菌中yjjK基因的表达来获得。或者，如本文中描述的细菌可以通过对yjjK基因表达已经弱化的细菌赋予L-氨基酸产生能力来获得。 
所述细菌除了已经描述的性质之后还可以具有其他特定性质，例如各种营养需求、药物抗性、药物敏感性、以及药物依赖性，而不偏离本发明的范围。 
2.方法 
本发明的方法包括用于产生L-氨基酸如L-丙氨酸、L-精氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-瓜氨酸、L-半胱氨酸、L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、甘氨酸、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸、L-甲硫氨酸、L-鸟氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸、和L-缬氨酸，或它们的盐、或它们的混合物的方法。用于产生L-氨基酸的方法可包括在培养基中培养细菌以允许L-氨基酸在培养基中产生、排出或积累，以及从培养基和/或细菌细胞收集该L-氨基酸的步骤。收集到的氨基酸可以进一步纯化。L-氨基酸可以作为其盐的形式产生。例如，通过该方法可以产生L-氨基酸的钠、钾、铵等盐。 
细菌的培养、以及L-氨基酸或其盐从培养基中的收集和纯化等可以按照使用微生物产生L-氨基酸的常规发酵方法来进行。用于产生L-氨基酸的培养基可以是合成培养基或天然培养基，例如含有碳源、氮源、硫源、无机离子 以及其他视需要的有机或无机成分的通常培养基。作为碳源，可以使用糖，如葡萄糖、乳糖、半乳糖、果糖、蔗糖、阿拉伯糖、麦芽糖、木糖、海藻糖、核糖和淀粉水解物；醇，如甘油、甘露醇和山梨醇；有机酸，如葡糖酸、延胡索酸(fumaric acid)、柠檬酸、苹果酸和琥珀酸，等等。作为氮源，可以使用无机铵盐，如硫酸铵、氯化铵和磷酸铵；有机氮，如大豆水解物；氨气；氨水，等等。硫源可包括硫酸铵、硫酸镁、硫酸铁、硫酸锰等等。维生素如维生素B1，所需物质，例如，有机营养物如核酸如腺嘌呤和RNA；或酵母提取物等可以以适当的量，或者甚至痕量存在。除这些之外，如有必要，也可添加小量的磷酸钙、铁离子、锰离子等。 
培养优选在需氧条件下进行16-72小时，或16-65小时，培养过程中的培养温度可以控制在30-45℃，或30-37℃，且pH可以控制在5-8，或6-7.5。pH可以通过使用无机或有机的酸性或碱性物质以及氨气来调节。 
培养之后，固体如细胞可以通过离心或膜过滤从液体培养基中去除，其后可以通过任何常规技术的组合（如浓缩、离子交换层析、和结晶）从发酵液回收目标L-氨基酸。 
收集到的目标L-氨基酸除了目标物质之外还可含有微生物细胞、培养基组分、水分、以及微生物的代谢副产物。收集到的目标物质的纯度在50%以上，85%以上，95%以上(美国专利5,431,933,日本专利1214636,美国专利4,956,471,4,777,051,4,946,654,5,840,358,6,238,714,美国专利申请公布2005/0025878)。 
实施例
下面参照下述非限制性的实施例对本发明进行更确切的说明。 
实施例1 
1.1yjjK基因失活的大肠杆菌菌株的构建 
利用Datsenko K.A.和Wanner B.L.(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,2000,97(12),6640-6645)开发的名为“λRed/ET驱动整合”的方法缺失yjjK基因。根据该方法，构建PCR引物P1(SEQ ID NO:3)和P2(SEQ ID NO:4)，它们与模板染色体中yjjK基因每一端的相邻区域，以及赋予卡那霉素抗性(KmR)的基因同源。使用大肠杆菌MG1655ΔattBphi80native IS5.11::LattBphi80-KmR-RattBphi80(Minaeva N.I.et al.,Dual-In/Out strategy for genes integration into bacterial chromosome:a novel approach to step-by-step construction of plasmid-less marker-less recombinant E.coli strains with predesigned genome structure.BMC Biotechnol.,2008,8:63)的染色体作为模板。PCR条件如下：初始变性为95℃，3min，最先两个循环的曲线：95℃1min、34℃30sec、72℃40sec。最后30个循环的曲线：95℃30sec、50℃30sec、72℃40sec；最后步骤：72℃5min。 
将所得的PCR产物1(SEQ ID NO:5)(1,922bp)使用琼脂糖凝胶电泳纯化，并用来电穿孔大肠杆菌MG1655ΔattBphi80native菌株(Minaeva N.I.et al.,BMC Biotechnol.,2008,8:63)，该菌株含有具备温度敏感性复制起点的质粒pKD46。质粒pKD46(Datsenko K.A.and Wanner B.L.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,2000,97:12:6640-45)包含噬菌体λ的2,154个核苷酸(31088-33241)的DNA片段(GenBank accession No.J02459)，且含有在阿拉伯糖诱导型启动子ParaB控制下的λRed/ET-介导的整合系统的基因(γ、β、exo基因)。质粒pKD46对于PCR产物整合到大肠杆菌MG1655ΔattBphi80native菌株的染色体中是必要的。 
电感受态细胞如下制备：将大肠杆菌MG1655ΔattBphi80native菌株在含有氨苄青霉素(100mg/L)的LB培养基中30℃培养过夜，将培养物用5mL含氨苄青霉素和L-阿拉伯糖(1mM)的SOB培养基(Sambrook J.,Fritsch E.F.and Maniatis T.,“Molecular Cloning:A Laboratory Manual”,2nd ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989))稀释100倍。将所得的培养物在通气下30℃培养至OD600～0.6，然后通过浓缩100倍并用冰冷的去离子水洗涤3次使其成为电感受态。使用70μL细胞和～100ng PCR产物1进行电转化。将细胞在1mL SOC培养基(Sambrook J.,Fritsch E.F.and Maniatis T.,“Molecular Cloning:A Laboratory Manual”,2nd ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989))中37℃培养2.5h，在含有溶原肉汤(Sambrook,J.and Russell,D.W.“Molecular Cloning:A Laboratory Manual”,3rd ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001))、琼脂(1.5%)和卡那霉素(50mg/L)的平板上铺板，在37℃培养以选择KmR重组体。在含有卡那霉素(50mg/L)的L-琼脂上42℃进行两次传代以消除pKD46质粒，使用标准程序检测所得的菌落对氨苄青霉 素的敏感性。由此获得了大肠杆菌MG1655ΔattBphi80nativeΔyjjK::KmR菌株。 
1.2通过PCR验证yjjK基因缺失 
通过PCR验证了含有yjjK基因缺失并带有卡那霉素抗性基因(kan)的突变体。PCR使用座位特异性引物P3(SEQ ID NO:6)和P4(SEQ ID NO:7)。条件如下所示：最初94℃变性3min，30个循环的曲线：94℃30sec、53℃30sec、72℃2min；最后步骤：72℃6min。当使用来自亲本yjjK+菌株大肠杆菌MG1655ΔattBphi80native的染色体DNA作为模板时，获得了PCR产物2(SEQ ID NO:8)(1,783bp)。当使用来自突变体MG1655ΔattBphi80nativeΔyjjK::KmR菌株的染色体DNA作为模板时，获得了PCR产物3(SEQ ID NO:9)(1,989bp)。 
实施例2.yjjK基因失活的大肠杆菌L-缬氨酸产生菌株的构建 
利用P1转导(Miller J.H.“Experiments in molecular genetics”,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor(1972))从大肠杆菌H-81L-缬氨酸产生株缺失了yjjK基因。H-81菌株(EP1239041A2)于2001年1月30日保藏于俄罗斯国立工业微生物保藏中心(VKPM)(Russian Federation,117545Moscow,1st Dorozhny proezd,1)，保藏号为VKPM B-8066，后于2002年2月1日根据布达佩斯条约转为国际保藏。使用大肠杆菌MG1655ΔattBphi80native ΔyjjK::KmR株(实施例1)作为供体。在含有溶原肉汤(Sambrook,J.and Russell,D.W.“Molecular Cloning:A Laboratory Manual”,3rd ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001))、琼脂(1.5%)和卡那霉素(50mg/L)的平板上选择大肠杆菌H-81的yjjK缺陷突变体。由此获得大肠杆菌H-81ΔyjjK::KmR菌株。如实施例1中所述通过PCR验证了ΔyjjK::KmR缺失。 
实施例3. 
大肠杆菌H-81ΔyjjK::KmR菌株的L-缬氨酸产生 
将修饰的大肠杆菌H-81ΔyjjK::KmR菌株和对照大肠杆菌H-81株分别在Luria-Bertani肉汤(又称溶原肉汤，如Sambrook,J.and Russell,D.W.“Molecular Cloning:A Laboratory Manual”,3rd ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001)中所述)中32℃培养18小时。然后将所得的培养物0.2 mL接种到20×200-mm试管中的2mL发酵培养基中，在250rpm的旋转摇床上30℃培养48小时。 
发酵培养基的组成(g/L)如下： 
将发酵培养基在116℃灭菌30min，但葡萄糖和CaCO3如下所述另行灭菌：葡萄糖为110℃30min，CaCO3为116℃30min。pH用KOH溶液调整到7.0。 
培养之后，使用薄层层析(TLC)测量积累的L-缬氨酸。TLC平板(10×20cm)用含非荧光指示物(Sorbpolymer,Krasnodar,Russian Federation)的0.11-mm的Sorbfil二氧化硅凝胶层包被。样品用Camag Linomat5加样器上样。Sorbfil平板用由异丙醇:乙酸乙酯:25%氨水:水(16:16:5:10,v/v)构成的流动相展开。使用茚三酮丙酮溶液(2%w/v)作为显色试剂。展开之后，将平板干燥并用Camag TLC Scanner3以吸光度模式进行扫描，于520nm进行检测，使用winCATS软件(1.4.2版本)。 
9个独立的试管发酵的结果示于表1。如从表1可见的，修饰的大肠杆菌H-81ΔyjjK::KmR株能够产生相比于亲本大肠杆菌H-81株更高量的L-缬氨酸(Val)。 
表1：L-缬氨酸的产生 
菌株 OD550 Val,g/L
大肠杆菌H-81(对照) 23±1 8.7±0.6
大肠杆菌H-81ΔyjjK::KmR 24±1 9.4±0.1
实施例4：yjjK基因失活的大肠杆菌L-组氨酸产生菌株的构建 
为了测试yjjK基因失活对L-组氨酸产生的效果，如实施例2中所述的 利用P1-转导(Miller J.H.“Experiments in molecular genetics”,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor(1972))将来自上述大肠杆菌MG1655ΔattBphi80nativeΔyjjK::KmR株(实施例1)的染色体的DNA片段转移到L-组氨酸产生菌株大肠杆菌MG1655+hisGr hisL'_ΔΔpurR。利用PCR验证了ΔyjjK::KmR缺失。由此获得了大肠杆菌MG1655+hisGr hisL'_ΔΔpurRΔyjjK::KmR菌株。 
大肠杆菌MG1655+hisGr hisL'_ΔΔpurR菌株已经在RU2119536C1和Doroshenko V.G.et al.,The directed modification of Escherichia coli MG1655to obtain histidine-producing mutants,Prikl.Biochim.Mikrobiol.(Russian),2013,49(2):149-154中有描述。 
实施例5大肠杆菌MG1655+hisGr hisL'_ΔΔpurR菌株的L-组氨酸产生 
将修饰的大肠杆菌MG1655+hisGr hisL'_ΔΔpurRΔyjjK::KmR和对照大肠杆菌MG1655+hisGr hisL'_ΔΔpurR菌株分别在2mL L-肉汤(Sambrook,J.and Russell,D.W.“Molecular Cloning:A Laboratory Manual”,3rd ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001))中30℃培养3小时。然后将所得的培养物0.1mL接种到20×200-mm试管中的2mL发酵培养基中，在旋转摇床上(250rpm)30℃培养65小时。 
发酵培养基的组成(g/L)如下： 
*Mameno是豆粕水解物(Ajinomoto Co,Inc.)。 
葡萄糖、硫酸镁、甜菜碱和CaCO3单独灭菌。在灭菌之前用6M KOH溶液将pH调节到6.0。 
培养之后，使用薄层层析(TLC)测量积累的L-组氨酸。TLC平板(10×20cm)用含非荧光指示物(Sorbpolymer,Krasnodar,Russian Federation)的0.11-mm的Sorbfil二氧化硅凝胶层包被。样品用Camag Linomat5加样器上样。Sorbfil平板用由异丙醇:丙酮:25%氨水:水(6:6:1.5:1,v/v)构成的流动相展开。使用茚三酮丙酮溶液(2%w/v)作为显色试剂。展开之后，将平板干燥并用Camag TLC Scanner3以吸光度模式进行扫描，于520nm进行检测，使用winCATS软件(1.4.2版本)。 
7个独立的试管发酵的结果示于表2。如从表2可见的，修饰的大肠杆菌MG1655+hisGr hisL'_ΔΔpurRΔyjjK::KmR株能够产生相比于亲本大肠杆菌MG1655+hisGr hisL'_ΔΔpurR株更高的L-缬氨酸(His)。 
表2L-组氨酸的产生 
实施例6大肠杆菌382ΔyjjK菌株的L-精氨酸产生 
为了测试yjjK基因失活对L-精氨酸产生的效果，如实施例2中所述的利用P1-转导(Miller,J.H.《Experiments in Molecular Genetics》,Cold Spring Harbor Lab.Press,Plainview,NY(1972))将来自上述大肠杆菌MG1655ΔattBphi80nativeΔyjjK::KmR的染色体的DNA片段转移到大肠杆菌L-精氨酸产生菌株382株而获得菌株382ΔyjjK。菌株382于2000年4月10日以保藏号VKPM B-7926保藏于俄罗斯国立工业微生物保藏中心(VKPM)(Russian Federation,117545Moscow,1st Dorozhny proezd,1)，后于2001年5月18日根据布达佩斯条约转为国际保藏。 
将382株和382ΔyjjK株分别在3mL的营养肉汤中在震荡(220rpm)下37℃培养18h，将所得的培养物0.3mL接种到20×200-mm试管中的2mL发酵培养基中，在旋转摇床(220rpm)上32℃培养48小时。 
培养之后，通过纸层析使用由正丁醇:乙酸:水=4:1:1(v/v)构成的流动相测定在培养基中积累的L-精氨酸的量。使用使用茚三酮丙酮溶液(2%w/v)作为显色试剂。切除含有L-精氨酸的斑点，用0.5%的CdCl2水溶液溶出L-精氨酸，以分光光度法在540nm估计L-精氨酸的量。 
发酵培养基的组成(g/L)如下： 
葡萄糖和硫酸镁单独灭菌。CaCO3在180℃干热灭菌2h。将pH调节到7.0。 
实施例7.大肠杆菌JM15(ydeD)ΔyjjK的L-半胱氨酸产生 
为了测试yjjK基因失活对L-半胱氨酸产生的效果，利用P1-转导将来自上述大肠杆菌MG1655ΔattBphi80nativeΔyjjK::KmR的染色体的DNA片段转移到大肠杆菌L-半胱氨酸产生菌株JM15(ydeD)。利用PCR验证了ΔyjjK::KmR缺失。由此获得了JM15(ydeD)ΔyjjK菌株。 
大肠杆菌JM15(ydeD)是大肠杆菌JM15(美国专利6,218,168)的衍生物，其经过具有编码膜蛋白之ydeD基因的DNA转化，且不涉及任何L-氨基酸的生物合成途径(美国专利5,972,663)。 
用于L-半胱氨酸产生的发酵条件和评估程序在美国专利6,218,168的实施例6中有详述。 
实施例8.大肠杆菌VL334thrC+ΔyjjK的L-谷氨酸产生 
为了测试yjjK基因失活对L-谷氨酸产生的效果，利用P1-转导将来自上述大肠杆菌MG1655ΔattBphi80nativeΔyjjK::KmR的染色体的DNA片段转移到大肠杆菌L-谷氨酸产生菌株VL334thrC+(EP1172433A1)而获得菌株VL334thrC+ΔyjjK。菌株VL334thrC+已于2004年12月6日以保藏号VKPMB-8961保藏于俄罗斯国立工业微生物保藏中心(VKPM)(Russian Federation,117545Moscow,1st Dorozhny proezd,1)，后于2004年12月8日根据布达佩斯条约转为国际保藏。 
将大肠杆菌VL334thrC+株和VL334thrC+ΔyjjK株分别在L-琼脂平板上37℃培养18-24h。然后，将1个环的细胞接种到含有2mL发酵培养基的试管中。 
发酵培养基的组成(g/L)如下： 
葡萄糖和CaCO3单独灭菌。pH调节到7.2。 
培养在30℃震荡下进行3天。在培养之后，如下测定所产生的L-谷氨酸的量：使用由正丁醇:乙酸:水=4:1:1构成的流动相进行纸层析，然后使用茚三酮(1%丙酮溶液)染色，用含0.5%的CdCl2的50%乙醇溶出化合物，再于540nm估计L-谷氨酸。 
实施例9.大肠杆菌57ΔyjjK的L-亮氨酸产生 
为了测试yjjK基因失活对L-亮氨酸产生的效果，利用P1-转导将来自上述大肠杆菌MG1655ΔattBphi80nativeΔyjjK::KmR的染色体的DNA片段转移到大肠杆菌L-谷氨酸产生菌株57(VKPM B-7386,美国专利6,124,121)而获得菌株57ΔyjjK。菌株57已于1997年5月19日以保藏号VKPM B-7386 保藏于俄罗斯国立工业微生物保藏中心(VKPM)(Russian Federation,117545Moscow,1st Dorozhny proezd,1)。 
将大肠杆菌57株和57ΔyjjK株分别在L-琼脂平板上37℃培养18-24h。为了获得种子培养物，将菌株在旋转摇床(250rpm)上在含有补加有蔗糖(4%)的2mL L-肉汤(Sambrook,J.and Russell,D.W.(2001)“Molecular Cloning:A Laboratory Manual”,3rd ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press)的20×200-mm试管中32℃培养18小时。然后，用0.2mL种子材料(10%)接种发酵培养基。发酵在20×200-mm试管中的2mL基础发酵培养基中进行。细胞在250rpm震荡下32℃培养48-72h。使用由正丁醇:乙酸:水=4:1:1构成的流动相进行纸层析测定培养基中积累的L-亮氨酸的量。 
发酵培养基的组成(g/L)如下： 
葡萄糖单独灭菌。CaCO3在180℃干热灭菌2h。pH调节到7.2。 
实施例10.大肠杆菌AJ11442ΔyjjK的L-赖氨酸产生 
为了测试yjjK基因失活对L-赖氨酸产生的效果，利用P1-转导将来自上述大肠杆菌MG1655ΔattBphi80nativeΔyjjK::KmR的染色体的DNA片段转移到大肠杆菌L-赖氨酸产生菌株AJ11442而获得AJ11442ΔyjjK菌株。菌株AJ11442已于1981年5月5日以保藏号FERM P-5084保藏于工业技术院发酵研究所(现为独立行政法人制品评价技术基盘国际专利生物保藏中心(NITE IPOD)，地址#120,2-5-8Kazusakamatari,Kisarazu-shi,Chiba-ken292-0818,JAPAN)，并于1987年10月29日基于布达佩斯条约转为国际保藏，保藏号为FERM BP-1543。pCABD2质粒包括：dapA基因，其编码具有解除L-赖氨酸反馈抑制的突变的二氢吡啶二羧酸合酶；lysC基因，其编码具有解除L-赖氨酸反馈抑制的突变的天冬氨酸激酶；dapB基因，其编码二 氢吡啶二羧酸还原酶；和ddh基因，其编码二氨基庚二酸脱氢酶(美国专利6,040,160)。 
将大肠杆菌AJ11442株和AJ11442ΔyjjK株分别在含有链霉素(20mg/L)的L-培养基中37℃培养，将0.3mL所得的培养物接种到500-mL烧瓶中的20mL含有所需要的药物的发酵培养基中。培养在37℃进行16h，使用摇动速度为115rpm的往复式摇床。在培养之后，通过已知方法(Biotech-analyzer AS210,Sakura Seiki Co.)测量培养基中L-赖氨酸和残余葡萄糖的量。然后，计算每种菌株的相对于消耗的葡萄糖的L-赖氨酸得率。 
发酵培养基的组成(g/L)如下： 
用KOH将pH调整到7.0，将培养基在115℃高温蒸汽灭菌10min。葡萄糖和硫酸镁单独灭菌。CaCO3在180℃干热灭菌2h，并以30g/L的终浓度加入培养基中。 
实施例11.大肠杆菌AJ12739ΔyjjK的L苯丙氨酸产生 
为了测试yjjK基因失活对L-苯丙氨酸产生的效果，利用P1-转导将来自上述大肠杆菌MG1655ΔattBphi80nativeΔyjjK::KmR的染色体的DNA片段转移到大肠杆菌L-苯丙氨酸产生菌株AJ12739而获得菌株AJ12739ΔyjjK。菌株AJ12739已于2001年11月6日以保藏号VKPM B-8197保藏于俄罗斯国立工业微生物保藏中心(VKPM)(Russian Federation,117545Moscow,1stDorozhny proezd,1)，后于2002年8月23日根据布达佩斯条约转为国际保藏。 
将大肠杆菌AJ12739株和AJ12739ΔyjjK株分别在营养肉汤中37℃培养18h，然后将所得的培养物0.3mL接种到20×200-mm试管中的3mL发酵培养基中，在旋转摇床上37℃培养48h。在培养之后，通过薄层层析(TLC) 测定了在培养基中积累的L-苯丙氨酸。使用以含非荧光指示物(Stock Company Sorbpolymer,Krasnodar,Russian Federation)的0.11-mm Sorbfil二氧化硅凝胶层包被的10×15-cm TLC平板。Sorbfil平板用由2-丙醇:乙酸乙酯:25%氨水:水=40:40:7:16(v/v)构成的流动相展开。使用茚三酮丙酮溶液(2%)作为显色试剂。 
发酵培养基的组成(g/L)如下： 
葡萄糖和硫酸镁单独灭菌。CaCO3在180℃干热灭菌2h。PH调节到7.0。 
实施例12.大肠杆菌702ilvAΔyjjK的L-脯氨酸产生 
为了测试yjjK基因失活对L-脯氨酸产生的效果，利用P1-转导将来自上述大肠杆菌MG1655ΔattBphi80nativeΔyjjK::KmR的染色体的DNA片段转移到大肠杆菌L-脯氨酸产生菌株702ilvA而获得菌株702ilvAΔyjjK。菌株702ilvA于2000年7月18日以保藏号VKPM B-8012保藏于俄罗斯国立工业微生物保藏中心(VKPM)(Russian Federation,117545Moscow,1st Dorozhny proezd,1)，后于2001年5月18日根据布达佩斯条约的保藏。 
将大肠杆菌702ilvA株和702ilvAΔyjjK株分别在L-琼脂平板上37℃培养18-24h。然后，将这些菌株在和实施例8(L-谷氨酸的产生)相同的条件下培养。 
实施例13.大肠杆菌B-3996ΔyjjK的苏氨酸产生 
为了测试yjjK基因失活对L-苏氨酸产生的效果，利用P1-转导将来自上述大肠杆菌MG1655ΔattBphi80nativeΔyjjK::KmR的染色体的DNA片段转移到大肠杆菌L-苏氨酸产生菌株VKPM B-3996而获得菌株B-3996ΔyjjK。菌株B-3996于1987年11月19日以保藏号RIA1867保藏于全联盟抗生素联合科学中心(All-Union Scientific Center of Antibiotics)(Russian Federation，117105Moscow，Nagatinskaya Street3-A)。该菌株还以保藏号B-3996保藏在俄罗斯国立工业微生物保藏中心(VKPM)(Russian Federation,117545Moscow,1st Dorozhny proezd,1)。 
将大肠杆菌B-3996株和B-3996ΔyjjK株分别在L-琼脂平板上37℃培养18-24h。为了获得种子培养物，将菌株在旋转摇床(250rpm)上在含有补加有葡萄糖(4%)的2mL L-肉汤(Sambrook,J.and Russell,D.W.(2001)“Molecular Cloning:A Laboratory Manual”,3rd ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press)的20×200-mm试管中32℃培养18小时。然后，用0.2mL种子材料(10%)接种发酵培养基。发酵在20×200-mm试管中的2mL基础发酵培养基中进行。细胞在250rpm震荡下32℃培养65h。 
培养之后，通过纸层析使用由正丁醇:乙酸:水=4:1:1(v/v)构成的流动相测定在培养基中积累的L-苏氨酸的量。使用使用茚三酮丙酮溶液(2%)作为显色试剂。切出含有L-苏氨酸的斑点，用0.5%的CdCl2水溶液溶出L-苏氨酸，以分光光度法在540nm估计L-苏氨酸的量。 
发酵培养基的组成(g/L)如下： 
葡萄糖和硫酸镁单独灭菌。CaCO3在180℃干热灭菌2h。pH调节到7.0。抗生素在灭菌之后导入培养基中。 
实施例14.大肠杆菌SV164(pGH5)ΔyjjK的色氨酸产生 
为了测试yjjK基因失活对L-色氨酸产生的效果，利用P1-转导将来自上述大肠杆菌MG1655ΔattBphi80nativeΔyjjK::KmR的染色体的DNA片段转移到大肠杆菌L-色氨酸产生菌株SV164(pGH5)而获得菌株SV164(pGH5)ΔyjjK。菌株SV164具有编码不受色氨酸反馈抑制的邻氨基苯甲酸合酶的trpE等位基因。质粒pGH5携带编码不受丝氨酸反馈抑制的磷酸甘油酸脱氢酶的突变型serA基因。菌株SV164(pGH5)在美国专利6,180,373或EP0662143B1中详细说明。 
将大肠杆菌SV164(pGH5)株和SV164(pGH5)ΔyjjK株分别在补充有四环素(20mg/L,pGH5质粒的标志物)的3mL营养肉汤中37℃震荡培养18h。将得到的培养物(各0.3mL)接种到20×200-mm试管中的3mL含有四环素(20mg/L)的发酵培养基中，用旋转摇床250rpm37℃培养48h。在培养之后，如实施例11(L-苯丙氨酸的产生)中所述通过TLC测定在培养基中积累的L-色氨酸的量。发酵培养基组分列于表3中，但应该如所示地分组(A、B、C、D、E、F和H)灭菌，以避免灭菌过程中不利的相互作用。 
表3. 
溶液的pH用NH4OH调节到7.1。 
*Mameno是豆粕水解物(Ajinomoto Co,Inc.)。 
实施例15.大肠杆菌382ΔargGΔyjjK的L-瓜氨酸产生 
为了测试yjjK基因失活对L-瓜氨酸产生的效果，利用P1-转导将来自上 述大肠杆菌MG1655ΔattBphi80nativeΔyjjK::KmR的染色体的DNA片段转移到大肠杆菌L-瓜氨酸产生菌株382ΔargG而获得菌株382ΔargGΔyjjK。菌株382ΔargG是通过使用最初由Datsenko K.A.与Wanner B.L.开发的名为“λRed/ET-介导的整合”(Datsenko K.A.and Wanner B.L.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,2000,97(12):6640-6645)的方法缺失382株(VKPM B-7926)染色体上的argG基因而获得的。根据该程序，构建与模板质粒中argG基因的邻近区域以及赋予抗生素抗性的基因同源的PCR引物。PCR反应使用质粒pMW118-λattL-cat-λattR(WO05/010175)作为模板。 
将大肠杆菌382ΔargG株和382ΔargGΔyjjK株分别在3mL营养肉汤中37℃震荡培养18h，将0.3mL得到的培养物接种到20×200-mm试管中的2mL发酵培养基中，在旋转摇床上32℃培养48h。 
培养之后，通过纸层析使用由正丁醇:乙酸:水=4:1:1(v/v)构成的流动相测定在培养基中积累的L-瓜氨酸的量。使用使用茚三酮丙酮溶液(2%)作为显色试剂。切除含有L-瓜氨酸的斑点，用0.5%的CdCl2水溶液溶出L-瓜氨酸，以分光光度法在540nm估计L-瓜氨酸的量。 
发酵培养基的组成(g/L)如下： 
葡萄糖和硫酸镁单独灭菌。CaCO3在180℃干热灭菌2h。pH调节到7.0。 
实施例16.大肠杆菌382ΔargFΔargIΔyjjK的L-鸟氨酸产生 
为了测试yjjK基因失活对L-鸟氨酸产生的效果，利用P1-转导将来自上述大肠杆菌MG1655ΔattBphi80nativeΔyjjK::KmR的染色体的DNA片段转移到大肠杆菌L-鸟氨酸产生菌株382ΔargFΔargI而获得菌株382ΔargFΔargIΔyjjK。菌株382ΔargFΔargI是通过使用最初由Datsenko K.A.与Wanner B.L.开发的名为“λRed/ET-介导的整合”(Datsenko K.A.and Wanner B.L.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,2000,97(12):6640-6645)的方法缺失382株(VKPM B-7926)染色体上的argF和argI基因而获得的。根据该程序，构建与模板质粒中argF或argI基因的邻近区域以及赋予抗生素抗性的基因同源的两对PCR引物。PCR反应使用质粒pMW118-λattL-cat-λattR(WO05/010175)作为模板。 
将大肠杆菌382ΔargFΔargI株和382ΔargFΔargIΔyjjK株分别在3mL营养肉汤中37℃震荡培养18h，将0.3mL得到的培养物接种到20×200-mm试管中的2mL发酵培养基中，在旋转摇床上32℃培养48h。 
培养之后，通过纸层析使用由正丁醇:乙酸:水=4:1:1(v/v)构成的流动相测定在培养基中积累的L-鸟氨酸的量。使用茚三酮丙酮溶液(2%)作为显色试剂。切出含有鸟氨酸的斑点，用0.5%的CdCl2水溶液溶出鸟氨酸，以分光光度法在540nm估计鸟氨酸的量。 
发酵培养基的组成(g/L)如下： 
葡萄糖和硫酸镁单独灭菌。CaCO3在180℃干热灭菌2h。pH调节到7.0。 
虽然已经结合本发明的优选实施方案详细描述了本发明，但本领域技 术人员容易想到可以进行各种变化，并应用各种等同物，而不偏离本发明的范围。援引并入本文中引证的所有参考文献作为本申请的一部分。 

Claims (11)

1.一种产生L-氨基酸的方法，包括：
(i)在培养基中培养肠杆菌科(Enterobacteriaceae)的细菌从而在该细菌和/或该培养基中产生所述L-氨基酸，
(ii)从该细菌、或该培养基、或该细菌与该培养基收集所述L-氨基酸，
其中所述细菌已经过修饰而弱化了yjjK基因的表达。
2.权利要求1的方法，其中所述细菌属于埃希氏菌属(Escherichia)。
3.权利要求2的方法，其中所述细菌属于大肠杆菌(Escherichia coli)种。
4.权利要求1的方法，其中所述细菌属于泛菌属(Pantoea)。
5.权利要求4的方法，其中所述细菌属于Pantoea ananatis种。
6.权利要求1-5中任一项的方法，其中所述表达是由于yjjK基因的失活而弱化的。
7.权利要求6的方法，其中所述基因缺失。
8.权利要求1-7中任一项的方法，其中所述yjjK基因是由SEQ ID NO:1的核苷酸序列或者SEQ ID NO:1的变异核苷酸序列编码的。
9.权利要求1-8中任一项的方法，其中所述L-氨基酸选自芳香族L-氨基酸和非芳香族L-氨基酸。
10.权利要求9的方法，其中所述芳香族L-氨基酸选自L-苯丙氨酸、L-色氨酸和L-酪氨酸。
11.权利要求9的方法，其中所述非芳香族L-氨基酸选自L-丙氨酸、L-精氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-瓜氨酸、L-半胱氨酸、L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、甘氨酸、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸、L-甲硫氨酸、L-鸟氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、和L-缬氨酸。
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