ES2348097T3

ES2348097T3 - UN PROCEDIMIENTO PARA LA PRODUCCION DE UN L-AMINOACIDO USANDO UNA BACTERIA DE LA FAMILIA ENTEROBACTERIACEAE CON LA EXPRESION ATENUADA DEL GEN kefB.

Info

Publication number: ES2348097T3
Application number: ES06732646T
Authority: ES
Inventors: Mikhail Markovich Gusyatiner; Dmitriy Vladimirovich Filippov; Elvira Borisovna Voroshilova
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 2005-05-16
Filing date: 2006-05-12
Publication date: 2010-11-30
Anticipated expiration: 2026-05-12
Also published as: RU2005114823A

Abstract

Una bacteria que produce L-aminoácidos de la familia Enterobacteriaceae, en la que dicha bacteria ha sido modificada para atenuar la expresión del gen kefB.

Description

Campo técnico

La presente invención se refiere a la industria microbiológica, y específicamente a un procedimiento para la producción de un L-aminoácido usando una bacteria de la familia Enterobacteriaceae que ha sido modificada para atenuar la expresión del gen kefB. Antecedentes en la técnica

La proteína KefB codificada por el gen kefB es un transportador de potasio que pertenece a la familia CPA2 de antiportadores de cationes monovalentes/protones. El sistema de expulsión de potasio KefB está regulado por el glutatión y desempeña un papel en la respuesta a cambios en la presión osmótica y en proteger a la célula de la toxicidad electrófila. La expulsión de potasio por la KefB se activa por aductos formados mediante la reacción de glutatión con compuestos electrófilos tales como metilglioxal y clorodinitrobenceno (Ferguson, G.P. y col., MoI. Microbiol., 1993, 9(6): 1297-1303). La expulsión de potasio mediado por la KefB da lugar a la acidificación del citoplasma, que protege a la célula de la toxicidad electrófila (Ferguson,

G.P.: y col., MoI. Microbiol, 1995, 17(6):1025-1033; Ferguson, G.P. y col., J. Bacteriol. 1997, 179(4): 10071012). La KefB presenta una gran similitud con la KefC, un sistema de expulsión de potasio adicional, a nivel tanto de la secuencia primaria como de la organización de dominios. A pesar del alto grado de similitud de secuencia, la KefB y la KefC presentan sensibilidades diferentes a las mismas mutaciones específicas de sitio (Ness, L.S. y Booth, I.R.,

J.: Biol. Chem., 1999, 274(14):9524-9530). Además de KefB y KefC, existen sistemas de expulsión de potasio sin identificar, capaces de mediar a una tasa elevada de expulsión de K+ (Bakker, E.P. y col., J. Bacteriol., 1987, 169(8):3743-3749).

Pero actualmente, no hay referencias de la inactivación del gen kefB con el propósito de producir L-aminoácidos. Divulgación de la invención

Los objetos de la presente invención incluyen la mejora de la productividad de cepas que producen L-aminoácidos y la proporción de un procedimiento para la producción de un Laminoácido usando estas cepas.

Los objetos anteriores se consiguieron encontrando que la atenuación de la expresión del gen kefB puede mejorar la producción de L-aminoácidos, tales como L-treonina, Llisina, L-cisteína, L-metionina, L-leucina, L-isoleucina, Lvalina, L-histidina, glicina, L-serina, L-alanina, Lasparagina, ácido L-aspártico, L-glutamina, ácido Lglutámico, L-prolina, L-arginina, L-fenilalanina, Ltirosina, y L-triptófano.

La presente invención proporciona una bacteria de la familia Enterobacteriaceae que presenta una capacidad incrementada de producir aminoácidos, tales como L-treonina, L-lisina, L-cisteína, L-metionina, L-leucina, L-isoleucina, L-valina, L-histidina, glicina, L-serina, L-alanina, Lasparagina, ácido L-aspártico, L-glutamina, ácido Lglutámico, L-prolina, L-arginina, L-fenilalanina, Ltirosina, y L-triptófano.

Es un objeto de la presente invención proporcionar una bacteria de la familia Enterobacteriaceae que produzca Laminoácidos, en la que la bacteria ha sido modificada para atenuar la expresión del gen kefB.

Es un objeto adicional de la presente invención proporcionar la bacteria que se ha descrito anteriormente, en la que la expresión del gen kefB se atenúa por la inactivación del gen kefB.

Es un objeto adicional de la presente invención proporcionar la bacteria descrita anteriormente, en la que la bacteria pertenece al género Escherichia.

Es un objeto adicional de la presente invención proporcionar la bacteria descrita anteriormente, en la que la bacteria pertenece al género Pantoea.

Es un objeto adicional de la presente invención proporcionar la bacteria descrita anteriormente, en el que dicho L-aminoácido se selecciona del grupo constituido por un L-aminoácido aromático y un L-aminoácido no aromático.

Es un objeto adicional de la presente invención proporcionar la bacteria descrita anteriormente, en el que dicho L-aminoácido aromático se selecciona del grupo constituido por L-fenilalanina, L-tirosina, y L-triptófano.

Es un objeto adicional de la presente invención proporcionar la bacteria descrita anteriormente, en el que dicho L-aminoácido no aromático se selecciona del grupo constituido por L-treonina, L-lisina, L-cisteína, Lmetionina, L-leucina, L-isoleucina, L-valina, L-histidina, glicina, L-serina, L-alanina, L-asparagina, ácido Laspártico, L-glutamina, ácido L-glutámico, L-prolina, y Larginina.

Es un objeto adicional de la presente invención proporcionar un procedimiento para la producción de un Laminoácido que comprende:

-el cultivo de la bacteria descrita anteriormente en un medio, y

-la recolección de dicho L-aminoácido del medio.

Es un objeto adicional de la presente invención proporcionar el procedimiento descrito anteriormente, en el que dicho L-aminoácido se selecciona del grupo constituido por un L-aminoácido aromático y un L-aminoácido no aromático.

Es un objeto adicional de la presente invención proporcionar el procedimiento descrito anteriormente, en el que dicho L-aminoácido aromático se selecciona del grupo constituido por L-fenilalanina, L-tirosina, y L-triptófano.

Es un objeto adicional de la presente invención proporcionar el procedimiento descrito anteriormente, en el que dicho L-aminoácido no aromático se selecciona del grupo constituido por L-treonina, L-lisina, L-cisteína, Lmetionina, L-leucina, L-isoleucina, L-valina, L-histidina, glicina, L-serina, L-alanina, L-asparagina, ácido L

aspártico, L-glutamina, ácido L-glutámico, L-prolina, y Larginina.

La presente invención se describe con detalle a continuación. Descripción detallada de las realizaciones preferidas

1. Bacteria de la presente invención

La bacteria de la presente invención es una bacteria que produce L-aminoácidos de la familia Enterobacteriaceae, en la que la bacteria ha sido modificada para atenuar la expresión del gen kefB.

En la presente invención, "bacteria que produce Laminoácidos" significa una bacteria que tiene la capacidad de producir y secretar un L-aminoácido al medio, cuando la bacteria se cultiva en el medio.

El término "bacteria que produce L-aminoácidos" como se usa en el presente documento también significa una bacteria que es capaz de producir y causar la acumulación de un Laminoácido en un medio de cultivo en una cantidad mayor que una cepa parental o natural de la bacteria, por ejemplo, E. coli, tal como E. coli K-12, y preferentemente significa que la bacteria es capaz de causar la acumulación en un medio de una cantidad no inferior a 0,5 g/l, más preferentemente no inferior a 1,0 g/l, del L-aminoácido diana. El término "Laminoácido" incluye L-alanina, L-arginina, L-asparagina, ácido L-aspártico, L-cisteína, ácido L-glutámico, Lglutamina, glicina, L-histidina, L-isoleucina, L-leucina, Llisina, L-metionina, L-fenilalanina, L-prolina, L-serina, Ltreonina, L-triptófano, L-tirosina, y L-valina.

El término "L-aminoácido aromático" incluye Lfenilalanina, L-tirosina, y L-triptófano. El término "Laminoácido no aromático" incluye L-treonina, L-lisina, Lcisteína, L-metionina, L-leucina, L-isoleucina, L-valina, Lhistidina, glicina, L-serina, L-alanina, L-asparagina, ácido L-aspártico, L-glutamina, ácido L-glutámico, L-prolina, y Larginina. La L-treonina, L-lisina, L-cisteína, L-leucina, Lhistidina, ácido L-glutámico, L-fenilalanina, L-triptófano, L-prolina y L-arginina son particularmente preferidas.

La familia Enterobacteriaceae incluye bacterias que pertenecen al género Escherichia, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Pantoea, Photorhabdus, Providencia, Salmonella, Serratia, Shigella, Morganella, Yersinia, etc. Específicamente, se pueden usar aquéllas clasificadas en las Enterobacteriaceae según la taxonomía usada por la base de datos del NCBI (National Center for Biotechnology Information) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi? id=91347). Se prefiere una bacteria que pertenezca al género Escherichia o Pantoea.

La frase "una bacteria que pertenece al género Escherichia" significa que la bacteria está clasificada en el género Escherichia según la clasificación conocida por una persona experta en materia de microbiología. Ejemplos de bacterias que pertenecen al género Escherichia como se usa en la presente invención incluyen, pero no están limitados a, Escherichia coli (E. coli).

Las bacterias que pertenecen al género Escherichia que se pueden usar en la presente invención no están particularmente limitadas; no obstante, por ejemplo, las bacterias descritas por Neidhardt, F.C. y col. (Escherichia coli y Salmonella typhimurium, American Society for Microbiology, Washington D. C, 1208, Tabla 1) están englobadas por la presente invención.

La frase "una bacteria que pertenece al género Pantoea" significa que la bacteria está clasificada en el género Pantoea según la clasificación conocida por una persona experta en materia de microbiología. Algunas especies de Enterobacter agglomerans han sido recientemente reclasificadas en Pantoea agglomerans, Pantoea ananatis, Pantoea stewartii o similares, basándose en el análisis de la secuencia de nucleótidos del ARNr de 16S, etc. (Int. J. Syst. Bacteriol., 43, 162-173 (1993)).

La frase "la bacteria ha sido modificada para atenuar la expresión del gen kefB" significa que la bacteria ha sido modificada de tal forma que la bacteria modificada contiene

una cantidad reducida de la proteína KefB, comparada con una bacteria sin modificar o que la bacteria modificada es incapaz de sintetizar la proteína KefB. La frase "la bacteria ha sido modificada para atenuar la expresión del gen kefB" también significa que el gen diana está modificado de tal forma que el gen modificado codifica una proteína KefB mutante que tiene una actividad reducida.

La frase "inactivación del gen kefB" significa que el gen modificado codifica una proteína completamente no funcional. También es posible que la región de ADN modificado sea incapaz de expresar el gen de forma natural debido a la delección de una parte del gen, el desplazamiento del marco de lectura del gen, la introducción de una mutación(es) de aminoácido/finalizadora, o la modificación de una región adyacente del gen, incluyendo secuencias que controlan la expresión del gen, tales como un promotor, potenciador, atenuador, sitio de unión a ribosomas, etc.

El gen kefB codifica la proteína KefB, un transportador CPA2 de potasio (sinónimos -B3350, TrkB). El gen kefB de E. coli (posiciones de nucleótidos 3.478.629 a 3.476.824; Nº de acceso de GenBank NC_000913.2; gi:49175990; SEQ ID NO: 1) está localizado entre los genes slyD y kef G en el cromosoma de E. coli K-12. La secuencia de nucleótidos del gen kefB y la secuencia de aminoácidos de KefB codificada por el gen kefB se muestran en la SEQ ID NO: 1 y la SEQ ID NO: 2, respectivamente.

Puesto que puede haber algunas diferencias en las secuencias de ADN entre los géneros o cepas de la familia Enterobacteriaceae, el gen kefB que se debe inactivar en el cromosoma no está limitado al gen mostrado en la SEQ ID NO: 1, sino que puede incluir genes homólogos a la SEQ ID NO: 1 que codifiquen una variante de la proteína KefB. La frase "proteína variante" como se usa en la presente invención significa una proteína que presenta cambios en la secuencia, ya sean delecciones, inserciones, adiciones, o sustituciones de aminoácidos, pero que aún mantiene la actividad del

producto como proteína KefB. El número de cambios en la proteína variante depende de la posición o el tipo de restos aminoácidos en la estructura tridimensional de la proteína. Pueden ser de 1 a 30, preferentemente de 1 a 15, y más preferentemente de 1 a 5 en la SEQ ID NO: 2. Estos cambios en las variantes pueden producirse en regiones de la proteína que no son críticas para la función de la proteína. Esto es debido a que algunos aminoácidos tienen una alta homología entre sí, de forma que la estructura tridimensional o la actividad no se ven afectadas por ese cambio. Estos cambios en la proteína variante se pueden producir en regiones de la proteína que no son críticas para la función de la proteína. Por tanto, la proteína variante codificada por el gen kefB puede tener una homología no inferior al 80%, preferentemente no inferior al 90%, y lo más preferentemente no inferior al 95%, con respecto a la secuencia completa de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 2, mientras se mantenga la capacidad de la proteína KefB de provocar la expulsión de potasio antes de su inactivación.

La homología entre dos secuencias de aminoácidos se puede determinar usando procedimientos muy conocidos, por ejemplo, el programa de ordenador BLAST 2.0, que calcula tres parámetros: la puntuación, la identidad y la similitud.

Además, el gen kefB puede ser una variante que hibride en condiciones rigurosas con la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO: 1, o una sonda que se pueda preparar a partir de la secuencia de nucleótidos en condiciones rigurosas, siempre que codifique una proteína KefB funcional antes de su inactivación. "Condiciones rigurosas" incluyen aquéllas bajo las cuales se forma un híbrido específico, por ejemplo, un híbrido que tiene una homología no inferior al 60%, preferentemente no inferior al 70%, más preferentemente no inferior al 80%, aún más preferentemente no inferior al 90%, y lo más preferentemente no inferior al 95%, y no se forma un híbrido no específico, por ejemplo, un híbrido que tiene una homología inferior a lo anterior. Por ejemplo, las condiciones rigurosas están

ejemplificadas lavando una o más veces, preferentemente dos

o tres veces, a una concentración salina de 1 X SSC, 0,1% de SDS, preferentemente 0,1 X SSC, 0,1% de SDS a 60°C. La duración del lavado depende del tipo de membrana usada para la transferencia y, como norma, puede ser lo recomendado por el fabricante. Por ejemplo, la duración del lavado recomendada para la membrana del nylon Hybond™ N+ (Amersham) en condiciones rigurosas es de 15 minutos. Preferentemente, el lavado se puede llevar a cabo de 2 a 3 veces. La longitud de la sonda se puede seleccionar de manera conveniente, dependiendo de las condiciones de hibridación, y normalmente varía entre 100 bp y 1 kbp.

La expresión del gen kefB se puede atenuar introduciendo una mutación dentro del gen en el cromosoma de manera que se reduce la actividad intracelular de la proteína codificada por el gen, comparada con una cepa sin modificar. Esa mutación sobre el gen puede ser la sustitución de una o más bases para provocar la sustitución de aminoácidos en la proteína codificada por el gen (mutación de aminoácido), la introducción de un codón de detención (mutación finalizadora), la delección de una o dos bases para provocar un desplazamiento en el marco de lectura, la inserción de un gen de resistencia a fármacos, o la delección de una parte del gen o de todo el gen (Qiu, Z. y Goodman, M.F., J. Biol. Chem., 272, 8611-8617 (1997); Kwon, D. H. y col, J. Antimicrob. Chemother., 46, 793-796 (2000)). La expresión del gen kefB también se puede atenuar modificando una secuencia que regule la expresión tal como el promotor, la secuencia de Shine-Dalgarno (SD), etc. (documento WO95/34672, Carrier, T.A. y Keasling, J.D., Biotechnol Prog 15, 58-64 (1999)).

Por ejemplo, se pueden emplear los siguientes procedimientos para introducir una mutación mediante recombinación genética. Se prepara un gen mutante que codifica una proteína mutante que tiene una actividad reducida, y una bacteria a modificar se transforma con un fragmento de ADN que contiene el gen mutante. A

continuación, se reemplaza el gen nativo en el cromosoma por el gen mutante mediante recombinación homóloga, y se selecciona la cepa resultante. Ese reemplazo génico usando recombinación homóloga se puede llevar a cabo mediante el procedimiento que emplea un ADN lineal, que es conocido como "integración de red impulsada" (Datsenko, K.A. y Wanner, B.L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97, 12, p 6640-6645 (2000)), o mediante procedimientos que emplean un plásmido que tiene una replicación sensible a la temperatura (patente de EE.UU. 6.303.383 o JP 05-007491A). Además, la incorporación de una mutación específica de sitio por sustitución génica usando recombinación homóloga, como se expone anteriormente, también se puede llevar a cabo con un plásmido que carezca de la capacidad de replicarse en el hospedador.

La expresión del gen también se puede atenuar mediante la inserción de un transposón o un factor IS en la región codificante del gen (patente de EE.UU. Nº 5.175.107), o mediante procedimientos convencionales, tales como tratamiento de mutagénesis usando radiación UV o tratamiento con nitrosoguanidina (N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina).

La presencia de actividad de la proteína KefB se puede detectar por complementación de mutación kefB-mediante el procedimiento descrito, por ejemplo, en Ness, L.S. y Booth, I.R., J. Biol. Chem., 1999, 274(14):9524-9530. Así, se puede determinar la actividad reducida o ausente de la proteína KefB en la bacteria según la presente invención cuando se compara con la bacteria parental sin modificar.

La presencia o ausencia del gen kefB en el cromosoma de una bacteria se puede detectar mediante procedimientos muy conocidos, incluyendo PCR, transferencia de Southern y similares. Además, el nivel de expresión génica se puede estimar midiendo la cantidad de ARNm transcrito a partir del gen usando diversos procedimientos muy conocidos, incluyendo transferencia de Northern, RT-PCR cuantitativa, y similares. La cantidad o el peso molecular de la proteína codificada por el gen se puede medir mediante procedimientos muy

conocidos, incluyendo SDS-PAGE seguido de ensayo de inmunotransferencia (análisis de transferencia de Western) y similares.

Los procedimientos para la preparación de plásmidos de ADN, digestión y ligadura de ADN, transformación, selección de un oligonucleótido como cebador, y similares, pueden ser procedimientos ordinarios muy conocidos por aquellos expertos en la materia. Estos procedimientos se describen, por ejemplo, en Sambrook, J., Fritsch, E.F., y Maniatis, T., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989). Bacterias que producen L-aminoácidos

Como bacteria de la presente invención que ha sido modificada para atenuar la expresión del gen kefB, se pueden usar bacterias que sean capaces de producir L-aminoácidos tanto aromáticos como no aromáticos.

La bacteria de la presente invención se puede obtener atenuando la expresión del gen kefB en una bacteria que posea la capacidad inherente de producir un L-aminoácido. Alternativamente, la bacteria de la presente invención se puede obtener confiriendo la capacidad de producir un Laminoácido a una bacteria que ya tenga atenuada la expresión del gen kefB. Bacterias que producen L-treonina

Ejemplos de cepas parentales para la obtención de las bacterias que producen L-treonina de la presente invención incluyen, pero no están limitados a, cepas que pertenecen al género Escherichia tal como E. coli TDH-6/ρVIC40 (VKPM B3996) (patente de EE.UU. Nº 5.175.107, patente de EE.UU. Nº 5.705.371), E. coli 472T23/pYN7 (ATCC 98081) (patente de EE.UU. Nº 5.631.157), E. coli NRRL-21593 (patente de EE.UU. Nº 5.939.307), E. coli FERM BP-3756 (patente de EE.UU. Nº 5.474.918), E. coli FERM BP-3519 y FERM BP-3520 (patente de EE.UU. Nº 5.376.538), E. coli MG442 (Gusyatiner y col., Genetika (en ruso), 14, 947-956 (1978)), E. coli VL643 y VL2055 (documento EP 1149911 A), y similares.

La cepa TDH-6 es deficiente en el gen thrC, así como en

el de asimilación de sacarosa, y el gen ilvA tiene una mutación defectuosa. Esta cepa también tiene una mutación en el gen rhtA, que confiere resistencia a concentraciones elevadas de treonina u homoserina. La cepa B-3996 contiene el plásmido pVIC40 que se obtuvo mediante la inserción de un operón thrA*BC que incluye un gen thrA mutante en un vector derivado de RSFlOlO. Este gen thrA mutante codifica una aspartoquinasa homoserina deshidrogenasa I que sustancialmente está desensibilizada a la inhibición por retroalimentación mediante treonina. La cepa B-3996 fue depositada el 19 de Noviembre de 1987 en el Ail-Union Scientific Center of Antibiotics (Nagatinskaya Street 3-A, 117105 Moscú, Federación rusa) con el número de acceso RIA 1867. La cepa también fue depositada en la Russian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM) (Rusia, 117545 Moscú, 1 Dorozhny proezd. 1) el 7 de Abril de 1987 con el número de acceso VKPM B-3996.

También se puede usar E. coli VKPM B-5318 (documento EP 0593792B) como cepa parental para obtener las bacterias que producen L-treonina de la presente invención. La cepa B-5318 es prototrófica con respecto a la isoleucina, y un represor CI y un promotor PR del fago lambda sensibles a la temperatura reemplazan la región reguladora del operón de treonina en el plásmido pVIC40. La cepa VKPM B-5318 fue depositada en la Russian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM) el 3 de Mayo de 1990 con el número de acceso VKPM B-5318.

Preferentemente, la bacteria de la presente invención se modifica adicionalmente para mejorar la expresión de uno

o más de los siguientes genes:

-el gen thrA mutante que codifica la aspartoquinasa homoserina deshidrogenasa I resistente a la inhibición por retroalimentación mediante treonina;

-el gen thrB que codifica la homoserina quinasa;

-el gen thrC que codifica la treonina sintasa;

-el gen rhtA que codifica una proteína transmembrana

putativa;

-el gen asd que codifica para la aspartato-βsemialdehído deshidrogenasa; y

-el gen aspC que codifica la aspartato aminotransferasa (aspartato transaminasa);

El gen thrA que codifica la aspartatoquinasa homoserina deshidrogenasa I de Escherichia coli ha sido elucidado (posiciones de los nucleótidos 337 a 2799, número de acceso del GenBank NC_000913.2, gi: 49175990). El gen thrA está localizado entre los genes thrL y thrB en el cromosoma de E. coli K-12 . El gen thrB que codifica la homoserina quinasa de Escherichia coli ha sido elucidado (posiciones de los nucleótidos 2801 a 3733, número de acceso del GenBank NC_000913.2, gi: 49175990). El gen thrB está localizado entre los genes thrA y thrC en el cromosoma de E. coli K-12 . El gen thrC que codifica la treonina sintasa de Escherichia coli ha sido elucidado (posiciones de los nucleótidos 3734 a 5020, número de acceso del GenBank NC_000913.2, gi: 49175990). El gen thrC está localizado entre el gen thrB y el marco de lectura abierto yaaX en el cromosoma de E. coli K-12. Los tres genes funcionan como un único operón de treonina. Para mejorar la expresión del operón de treonina, la región atenuadora que afecta a la transcripción se elimina de manera deseable del operón (documento WO2005/049808, WO2003/097839).

Se puede obtener un gen thrA mutante que codifica la aspartoquinasa homoserina deshidrogenasa I resistente a la inhibición por retroalimentación mediante treonina, así como los genes thrB y thrC como un operón del conocido plásmido pVIC40 que está presente en la cepa de E. coli que produce treonina VKPM B-3996. El plásmido pVIC40 se describe con detalle en la patente de EE.UU. Nº 5.705.371.

El gen rhtA existe en 18 min en el cromosoma de E. coli próximo al operón glnHPQ, que codifica componentes del sistema transportador de glutamina. El gen rhtA es idéntico a ORFl (gen ybiF, posiciones de los nucleótidos 764 a 1651, número de acceso del GenBank AAA218541, gi:440181) y está localizado entre los genes pexB y ompX. La unidad que

expresa una proteína codificada por el ORFl se ha designado gen rhtA (rht: resistencia a homoserina y treonina). Además, se descubrió que la mutación rhtA23 es una sustitución de A por G en la posición -1 con respecto al codón de iniciación ATG (ABSTRACTS del 17th International Congress of Biochemistry and Molecular Biology junto con el Annual Meeting of the American Society for Biochemistry and Molecular Biology, San Francisco, California 24-29 de Agosto de 1997, resumen Nº 457, EP 1013765 A).

El gen asd de E. coli ya ha sido elucidado (posiciones de los nucleótidos 3572511 a 3571408, número de acceso del GenBank NC_000913.1, gi:16131307), y se puede obtener mediante PCR (reacción en cadena de la polimerasa; confróntese White, TJ. y col., Trends Genet., 5, 185 (1989)) utilizando cebadores preparados basándose en la secuencia de nucleótidos del gen. Los genes asd de otros microorganismos se pueden obtener de manera similar.

Además, el gen aspC de E. coli ya ha sido elucidado (posiciones de los nucleótidos 983742 a 984932, número de acceso del GenBank NC_000913.1, gi:16128895), y se puede obtener mediante PCR. Los genes aspC de otros microorganismos se pueden obtener de manera similar. Bacterias que producen L-lisina

Ejemplos de bacterias que producen L-lisina que pertenecen al género Escherichia incluyen mutantes que presentan resistencia a un análogo de L-lisina. El análogo de L-lisina inhibe el crecimiento de la bacteria que pertenece al género Escherichia, pero esta inhibición está parcial o completamente desensibilizada cuando coexiste Llisina en el medio. Ejemplos del análogo de L-lisina incluyen, pero no están limitados a, oxalisina, hidroxamato de lisina, S-(2-aminoetil)-L-cisteína (AEC), γ-metil-lisina, α-clorocaprolactama, etc. Los mutantes que presentan resistencia a estos análogos de lisina se pueden obtener sometiendo a las bacterias que pertenecen al género Escherichia a un tratamiento convencional de mutagénesis artificial. Ejemplos específicos de cepas bacterianas útiles

para la producción de L-lisina incluyen Escherichia coli AJ11442 (FERM BP-1543, NRRL B-12185; véase patente de EE.UU. Nº 4.346.170) y Escherichia coli VL611. En estos microorganismos, la inhibición por retroalimentación de la aspartato quinasa mediante la L-lisina está desensibilizada.

La cepa WC196 se puede usar como bacteria de Escherichia coli productora de L-lisina. Esta cepa bacteriana se generó confiriendo resistencia a AEC a la cepa W3110, que se obtuvo de Escherichia coli K-12. La cepa resultante se designó cepa Escherichia coli AJ 13069 y fue depositada en el National Institute of Bioscience and Human- Technology, Agency of Industrial Science and Technology (actualmente National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary, Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-8566, Japón) el 6 de Diciembre de 1994 y recibió el número de acceso de FERM P-14690. A continuación, se convirtió en un depósito internacional conforme a las disposiciones del Tratado de Budapest el 29 de Septiembre de 1995, y recibió el número de acceso de FERM BP-5252 (patente de EE.UU. Nº 5.827.698).

Ejemplos de cepas parentales para la obtención de bacterias que producen L-lisina de la presente invención también incluyen cepas en las que se ha mejorado la expresión de uno o más genes que codifican una enzima biosintética de la L-lisina. Ejemplos de esos genes incluyen, pero no están limitados a, genes que codifican la dihidropicolinato sintasa (dapA), aspartoquinasa (lysC), dihidropicolinato reductasa (dapB), diaminopimelato descarboxilasa (lysA), diaminopimelato deshidrogenasa (ddh) (patente de EE.UU. Nº 6.040.160), fosfoenolpiruvato carboxilasa (ppc), aspartato semialdehído deshidrogenasa (asd), y aspartasa (aspA) (documento EP 1253195 A). Además, las cepas parentales pueden tener un nivel de expresión incrementado del gen involucrado en la eficacia energética (cyo) (documento EP 1170376 A), el gen que codifica la nicotinamida nucleótido transhidrogenasa (pntAB) (patente de

EE.UU. Nº 5.830.716), el gen ybjE (documento WO2005/073390),

o sus combinaciones.

Ejemplos de cepas parentales para la obtención de bacterias que producen L-lisina de la presente invención también incluyen cepas que tienen una actividad reducida o eliminada de una enzima que cataliza una reacción para la generación de un compuesto distinto de la L-lisina apartándose de la vía biosintética de la L-lisina. Ejemplos de enzimas que catalizan una reacción para la generación de un compuesto distinto de la L-lisina apartándose de la vía biosintética de la L-lisina incluyen la homoserina deshidrogenasa, la lisina descarboxilasa (patente de EE.UU. Nº 5.827.698), y la enzima málica (documento WO2005/010175). Bacterias que producen L-cisteína

Ejemplos de cepas parentales para la obtención de bacterias que producen L-cisteína de la presente invención incluyen, pero no están limitados a, cepas que pertenecen al género Escherichia, tales como E. coli JM15 que está transformada con alelos cysE diferentes que codifican para serina acetiltransferasas resistentes por retroalimentación (patente de EE.UU. Nº 6.218.168, solicitud de patente rusa 2003121601); E. coli W3110 que tiene genes sobreexpresados que codifican proteínas adecuadas para la secreción de sustancias tóxicas para las células (patente de EE.UU. Nº 5.972.663); cepas de E. coli que presentan una actividad cisteína desulfohidrasa disminuida (documento JP11155571 A2); E. coli W3110 con una actividad incrementada de un regulador transcripcional positivo para el regulón de cisteína codificado por el gen cysB (documento WO0127307A1), y similares. Bacterias que producen L-leucina

Ejemplos de cepas parentales para la obtención de bacterias que producen L-leucina de la presente invención incluyen, pero no están limitadas a, cepas que pertenecen al género Escherichia, tales como cepas de E. coli resistentes a leucina (por ejemplo, la cepa 57 (VKPM B-7386, patente de EE.UU. Nº 6.124.121)) o análogos de leucina incluyendo β-2

tienilalanina, 3-hidroxileucina, 4-azaleucina, 5,5,5trifluoroleucina (documento JP 62-34397 B y JP 8-70879 A); cepas de E. coli obtenidas mediante los procedimientos de ingeniería genética descritos en el documento WO96/06926; E. coli H-9068 (documento JP 8-70879 A), y similares.

Las bacterias de la presente invención se pueden mejorar aumentando la expresión de uno o más genes involucrados en la biosíntesis de L-leucina. Los ejemplos incluyen genes del operón leuABCD, que preferentemente están representados por un gen leuA mutante que codifica para la isopropilmalato sintasa exenta de la inhibición por retroalimentación mediante L-leucina (patente de EE.UU. 6.403.342). Además, las bacterias de la presente invención se pueden mejorar aumentando la expresión de uno o más genes que codifican proteínas que secretan L-aminoácidos desde la célula bacteriana. Ejemplos de esos genes incluyen los genes b2682 y b2683 (genes ygaZH) (documento EP 1239041 A2). Bacterias que producen L-histidina

Ejemplos de cepas parentales para la obtención de bacterias que producen L-histidina de la presente invención incluyen, pero no están limitados a, cepas que pertenecen al género Escherichia tales como E. coli cepa 24 (VKPM B-5945, RU2003677); E. coli cepa 80 (VKPM B-7270, RU2119536); E. coli NRRL B-12116 -B12121 (patente de EE.UU. Nº 4.388.405);

E. coli H-9342 (FERM BP-6675) y H-9343 (FERM BP-6676) (patente de EE.UU. Nº 6.344.347); E. coli H-9341 (FERM BP6674) (documento EP1085087); E. coli AI80/pFM201 (patente de EE.UU. Nº 6.258.554) y similares.

Ejemplos de cepas parentales para la obtención de bacterias que producen L-histidina de la presente invención también incluyen cepas en las que está aumentada la expresión de uno o más genes que codifican una enzima biosintética de L-histidina. Ejemplos de esos genes incluyen genes que codifican ATP fosforribosiltransferasa (hisG), fosforribosil AMP ciclohidrolasa (hisI), fosforribosil-ATP pirofosfohidrolasa (hisIE), fosforribosilformimino-5aminoimidazol carboxamida ribótido isomerasa (hisA),

amidotransferasa (hisH), histidinol fosfato aminotransferasa (hisC), histidinol fosfatasa (hisB), histidinol deshidrogenasa (hisD), etc.

Es sabido que las enzimas biosintéticas de L-histidina codificadas por hisG e hisBHAFI son inhibidas por la Lhistidina, y por tanto también se puede mejorar eficazmente la capacidad productora de L-histidina introduciendo una mutación que confiera resistencia a la inhibición por retroalimentación de la ATP fosforribosiltransferasa (patentes rusas Nº 2003677 y 2119536).

Ejemplos específicos de cepas que tienen una capacidad productora de L-histidina incluyen E. coli FERM-P 5038 y 5048 que han sido introducidas con un vector que lleva un ADN que codifica una enzima biosintética de L-histidina (documento JP 56-005099A), cepas de E. coli introducidas con rht, un gen para exportar un aminoácido (documento EP1016710A), E. coli cepa 80 a la que se le confiere sulfoguanidina, DL-1,2,4-triazol-3-alanina, y resistencia a estreptomicina (VKPM B-7270, patente rusa Nº 2119536), etc. Bacterias que producen ácido L-glutámico

Ejemplos de cepas parentales para la obtención de bacterias que producen ácido L-glutámico de la presente invención incluyen, pero no están limitados a, cepas que pertenecen al género Escherichia, tales como E. coli VL334thrC+ (documento EP 1172433). E. coli VL334 (VKPM B1641) es una cepa auxótrofa en L-isoleucina y L-treonina que tiene mutaciones en los genes thrC e ilvA (patente de EE.UU. Nº 4.278.765). Un alelo natural del gen thrC fue transferido mediante el procedimiento de transducción general usando un bacteriófago P1 crecido sobre células de la cepa natural de

E. coli K-12 (VKPM B-7). Como resultado, se obtuvo una cepa auxótrofa en L-isoleucina VL334thrC+ (VKPM B-8961), que es capaz de producir ácido L-glutámico.

Ejemplos de cepas parentales para la obtención de bacterias que producen ácido L-glutámico de la presente invención incluyen, pero no están limitados a, cepas en las que se ha mejorado la expresión de uno o más genes que

codifican una enzima biosintética del ácido L-glutámico. Ejemplos de esos genes incluyen genes que codifican la glutamato deshidrogenasa (gdh), glutamina sintetasa (glnA), glutamato sintetasa (gltAB), isocitrato deshidrogenasa (icdA), aconitato hidratasa (acnA, acnB), citrato sintasa (gltA), fosfoenolpiruvato carboxilasa (ppc), piruvato deshidrogenasa (aceEF, lpdA), piruvato quinasa (pykA, pykF), fosfoenolpiruvato sintasa (ppsA), enolasa (eno), fosfogliceromutasa (pgmA, pgmI) fosfoglicerato quinasa (pgk), gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (gapA), triosa fosfato isomerasa (tpiA), fructosa bifosfato aldolasa (fbp), fosfofructoquinasa (pfkA, pfkB), y glucosa fosfato isomerasa (pgi).

Ejemplos de cepas modificadas de manera que la expresión del gen de la citrato sintetasa, el gen de la fosfoenolpiruvato carboxilasa, y/o el gen de la glutamato deshidrogenasa está/están mejorados incluyen aquéllas descritas en los documentos EP 1078989A, EP 955368A, y EP 952221A.

Ejemplos de cepas parentales para la obtención de las bacterias que producen ácido L-glutámico de la presente invención también incluyen cepas que tienen una actividad reducida o eliminada de una enzima que cataliza la síntesis de un compuesto distinto del ácido L-glutámico apartándose de una vía de la biosíntesis de ácido L-glutámico. Ejemplos de esos genes incluyen genes que codifican la isocitrato liasa (aceA), α-cetoglutarato deshidrogenasa (sucA), fosfotransacetilasa (pta), acetato quinasa (ack), acetohidroxi ácido sintasa (ilvG), acetolactato sintasa (ilvI), formato acetiltransferasa (pfl), lactato deshidrogenasa (ldh), y glutamato descarboxilasa (gadAB). Las bacterias que pertenecen al género Escherichia deficientes en la actividad α-cetoglutarato deshidrogenasa o que tienen una actividad α-cetoglutarato deshidrogenasa reducida y los procedimientos para su obtención se describen en las patentes de EE.UU. Nº 5.378.616 y 5.573.945. Específicamente, estas cepas incluyen las siguientes:

E. coli W3110sucA::Kmr

E. coli AJ12624 (FERM BP-3853)

E. coli AJ12628 (FERM BP-3854)

E. coli AJ12949 (FERM BP-4881)

E. coli W3110sucA::Kmr es una cepa obtenida interrumpiendo el gen de la α-cetoglutarato deshidrogenasa (en lo sucesivo denominado "gen sucA") de E. coli W3110. Esta cepa es completamente deficiente en la α-cetoglutarato deshidrogenasa.

Otros ejemplos de bacterias que producen ácido Lglutámico incluyen aquellas que pertenecen al género Escherichia y que tienen resistencia a un antimetabolito del ácido aspártico. Estas cepas también pueden ser deficientes en la actividad α-cetoglutarato deshidrogenasa e incluyen, por ejemplo, E. coli AJ13199 (FERM BP-5807) (patente de EE.UU. Nº 5.908.768), FFRM P-12379, que adicionalmente tiene una baja capacidad de descomposición del ácido L-glutámico (patente de EE.UU. Nº 5.393.671); AJ13138 (FERM BP-5565) (patente de EE.UU. Nº 6.110.714), y similares.

Ejemplos de bacterias que producen ácido L-glutámico, incluyen cepas mutantes que pertenecen al género Pantoea que son deficientes en la actividad α-cetoglutarato deshidrogenasa o tienen una actividad α-cetoglutarato deshidrogenasa reducida, y se pueden obtener como se ha descrito anteriormente. Esas cepas incluyen Pantoea ananatis AJ13356 (patente de EE.UU. Nº 6.331.419). Pantoea ananatis AJ 13356 ha sido depositada en el National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry (actualmente, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary, Central 6, 1-1, Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-8566, Japón) el 19 de Febrero de 1998 con el número de acceso de FERM P-16645. A continuación se convirtió en un depósito internacional conforme a las disposiciones del Tratado de Budapest el 11 de Enero de 1999 y recibió el número de acceso de FERM BP

6615. Pantoea ananatis AJ13356 es deficiente en la actividad α-cetoglutarato deshidrogenasa como resultado de la interrupción de la subunidad αKGDH-EI del gen (sucA). La cepa anterior fue identificada como Enterobacter agglomerans cuando se aisló, y se depositó como Enterobacter agglomerans AJ13356. No obstante, recientemente fue reclasificada como Pantoea ananatis basándose en la secuenciación de nucleótidos del ARNr 16S, etcétera. Aunque la AJ13356 fue depositada en el depositario como Enterobacter agglomerans, para los propósitos de esta solicitud, se describe como Pantoea ananatis. Bacterias que producen L-fenilalanina

Ejemplos de cepas parentales para la obtención de bacterias que producen L-fenilalanina de la presente invención incluyen, pero no están limitadas a, cepas que pertenecen al género Escherichia, tales como E. coli AJ12739 (tyrA::Tnl0, tyrR) (VKPM B-8197); E. coli HW1089 (ATCC 55371) que alberga el gen mutante pheA34 (patente de EE.UU. Nº 5.354.672); E. coli MWEC101-b (KR8903681); E. coli NRRL B-12141, NRRL B-12145, NRRL B-12146 y NRRL B-12147 (patente de EE.UU. Nº 4.407.952). Además, como cepa parental, se puede usar E. coli K-12 [W3110 (tyrA)/pPHAB (FERM BP-3566),

E. coli K-12 [W3110 (tyrA)/pPHAD] (FERM BP-12659), E. coli K-12 [W3110 (tyrA)/pPHATerm] (FERM BP-12662) y E. coli K-12 [W3110 (tyrA)/pBR-aroG4, pACMAB] denominada AJ 12604 (FERM BP-3579) (documento EP 488424 Bl). Adicionalmente, también se pueden usar bacterias que producen L-fenilalanina que pertenecen al género Escherichia con una actividad mejorada de la proteína codificada por el gen yedA o el gen yddG (solicitudes de patente de EE.UU. 2003/0148473 Al y 2003/0157667 Al). Bacterias que producen L-triptófano

Ejemplos de cepas parentales que se pueden usar para la obtención de bacterias que producen L-triptófano de la presente invención incluyen, pero no están limitadas a, cepas que pertenecen al género Escherichia, tales como E. coli JP4735/pMU3028 (DSM10122) y JP6015/pMU91 (DSM10123) que

es deficiente en la triptofanil-ARNt sintetasa codificada por el gen trpS mutante (patente de EE.UU. Nº 5.756.345); E. coli SV164 (pGH5) que tiene un alelo serA que codifica fosfoglicerato deshidrogenasa exenta de inhibición por retroalimentación mediante serina y un alelo trpE que codifica antranilato sintasa exenta de inhibición por retroalimentación mediante triptófano (patente de EE.UU. Nº 6.180.373); E. coli AGX17 (pGX44) (NRRL B-12263) y AGX6(pGX50)aroP (NRRL B-12264) que es deficiente en la enzima triptofanasa (patente de EE.UU. Nº 4.371.614); E. coli AGX17/pGX50,pACKG4-pps en la que se mejora la capacidad productora de fosfoenolpiruvato (documento WO9708333, patente de EE.UU. Nº 6.319.696), y similares. También se pueden usar bacterias que producen L-triptófano que pertenecen al género Escherichia con una actividad mejorada de la proteína codificada por el gen yedA o el gen yddG (Solicitudes de patente de EE.UU. 2003/0148473 Al y 2003/0157667 Al).

Ejemplos de cepas parentales para la obtención de bacterias que producen L-triptófano de la presente invención también incluyen cepas en las que se han mejorado una o más actividades de las enzimas seleccionadas entre antranilato sintasa, fosfoglicerato deshidrogenasa, y triptófano sintasa. La antranilato sintasa y la fosfoglicerato deshidrogenasa están ambas sometidas a la inhibición por retroalimentación mediante L-triptófano y L-serina, de manera que en estas enzimas se puede introducir una mutación que desensibilice la inhibición por retroalimentación. Ejemplos específicos de cepas que tienen esa mutación incluyen E. coli SV164 que alberga una antranilato sintasa desensibilizada y una cepa transformante obtenida introduciendo en E. coli SV164 el plásmido pGH5 (documento WO 94/08031), que contiene un gen serA mutante que codifica una fosfoglicerato deshidrogenasa desensibilizada a la retroalimentación.

Ejemplos de cepas parentales para la obtención de bacterias que producen L-triptófano de la presente invención

también incluyen cepas en las que se ha introducido el operón del triptófano que contiene un gen que codifica antranilato sintasa desensibilizada (documento JP 57-71397 A, JP 62-244382 A, patente de EE.UU. Nº 4,371,614). Además, la capacidad productora de L-triptófano se puede conferir mejorando la expresión de un gen que codifica la triptófano sintasa, entre operones del triptófano (trpBA). La triptófano sintasa consta de subunidades α y β que están codificadas por los genes trpA y trpB, respectivamente. Adicionalmente, la capacidad productora de L-triptófano se puede mejorar aumentando la expresión del operón de isocitrato liasa-malato sintasa (documento WO2005/103275). Bacterias que producen L-prolina

Ejemplos de cepas parentales para la obtención de bacterias que producen L-prolina de la presente invención incluyen, pero no están limitadas a, cepas que pertenecen al género Escherichia, tales como E. coli 702ilvA (VKPM B-8012) que es deficiente en el gen ilvA y es capaz de producir Lprolina (documento EP 1172433). Las bacterias de la presente invención se pueden mejorar aumentando la expresión de uno o más genes involucrados en la biosíntesis de L-prolina. Ejemplos de esos genes para bacterias que producen L-prolina que se prefieren incluyen el gen proB que codifica para la glutamato quinasa de cuya inhibición por retroalimentación mediante L-prolina está desensibilizado (Patente de DE 3127361). Además, las bacterias de la presente invención se pueden mejorar aumentando la expresión de uno o más genes que codifican para proteínas que secretan L-aminoácidos desde células bacterianas. Esos genes están ejemplificados por los genes b2682 y b2683 (genes ygaZH) (documento EP1239041 A2).

Ejemplos de bacterias que pertenecen al género Escherichia, que tienen actividad para producir L-prolina incluyen las siguientes cepas de E. coli: NRRL B-12403 y NRRL B-12404 (Patente de GB 2075056), VKPM B-8012 (solicitud de patente rusa 2000124295), plásmidos mutantes descritos en la patente alemana 3127361, plásmidos mutantes descritos por

Bloom F.R. y col. (15º simposio de invierno de Miami, 1983, p.34), y similares. Bacterias que producen L-arginina

Ejemplos de cepas parentales para la obtención de bacterias que producen L-arginina de la presente invención incluyen, pero no están limitados a, cepas que pertenecen al género Escherichia, tal como E. coli cepa 237 (VKPM B-7925) (Solicitud de patente de EE.UU. 2002/058315 Al) y sus cepas derivadas que albergan N-acetilglutamato sintasa mutante (solicitud de patente rusa Nº 2001112869), E. coli cepa 382 (VKPM B-7926) (documento EP1170358A1), una cepa que produce arginina en la que se introduce el gen argA que codifica la N-acetilglutamato sintetasa (documento EP1170361 Al), y similares.

Ejemplos de cepas parentales para la obtención de bacterias que producen L-arginina de la presente invención también incluyen cepas en las que se ha mejorado la expresión de uno o más genes que codifican una enzima biosintética de la L-arginina. Ejemplos de esos genes incluyen genes que codifican la N-acetilglutamil fosfato reductasa (argC), ornitina acetiltransferasa (argJ), Nacetilglutamato quinasa (argB), acetilornitina transaminasa (argD), ornitina carbamoil transferasa (argF), ácido argininosuccínico sintetasa (argG), ácido argininosuccínico liasa (argH), y carbamoil fosfato sintetasa (carAB). Bacterias que producen L-valina

Ejemplos de bacterias parentales para la obtención de bacterias que producen L-valina de la presente invención incluyen, pero no están limitados a, cepas que han sido modificadas para sobreexpresar el operón ilvGMEDA (patente de EE.UU. Nº 5.998.178). Es deseable eliminar la región del operón ilvGMEDA que es necesaria para la atenuación, de manera que la expresión del operón no se vea atenuada por la L-prolina que se produce. Adicionalmente, de manera deseable se interrumpe el gen ilvA en el operón, de forma que se reduce la actividad treonina desaminasa.

Ejemplos de cepas parentales para la obtención de

bacterias que producen L-valina de la presente invención también incluyen mutantes que tienen una mutación de la aminoacil ARNt sintetasa (patente de EE.UU. Nº 5.658.766). Por ejemplo, se puede usar E. coli VL1970, que tiene una mutación en el gen ileS que codifica la isoleucina ARNt sintetasa. E. coli VL1970 ha sido depositada en la Russian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM) (Rusia, 113545 Moscú, 1 Dorozhny Proezd, 1) el 24 de Junio de 1988 con el número de acceso VKPM B-4411.

Adicionalmente, como cepas parentales también se pueden usar mutantes que requieran ácidos lipoicos para el crecimiento y/o que carezcan de H+-ATPasa (documento WO96/06926). Bacterias que producen L-isoleucina

Ejemplos de cepas parentales para la obtención de bacterias que producen L-isoleucina de la presente invención incluyen, pero no están limitados a, mutantes que tienen resistencia a la 6-dimetilaminopurina (documento JP 5-304969 A), mutantes que tienen resistencia a un análogo de isoleucina tal como tiaisoleucina e hidroxamato de isoleucina, y mutantes que tienen adicionalmente resistencia a DL-etionina y/o hidroxamato de arginina (documento JP 5130882 A). Además, como cepas parentales también se pueden usar cepas recombinantes transformadas con genes que codifican proteínas involucradas en la biosíntesis de Lisoleucina, tales como treonina desaminasa y acetohidroxato sintasa (documentos JP 2-458 A, FR 0356739, y patente de EE.UU. Nº 5.998.178).

2. Procedimiento de la presente invención

El procedimiento de la presente invención es un procedimiento para la producción de un L-aminoácido que comprende el cultivo de la bacteria de la presente invención en un medio de cultivo para producir y excretar el Laminoácido al medio, y la recolección del L-aminoácido del medio.

En la presente invención, el cultivo, la recolección, y la purificación de un L-aminoácido del medio y similares se

puede llevar a cabo de manera análoga a procedimientos de fermentación convencionales en los que se produce un aminoácido usando una bacteria.

El medio usado para el cultivo puede ser un medio tanto sintético como natural, siempre y cuando el medio incluya una fuente de carbono y una fuente de nitrógeno y minerales y, si fuera necesario, cantidades apropiadas de nutrientes que la bacteria necesite para su crecimiento. La fuente de carbono puede incluir diversos carbohidratos tales como glucosa y sacarosa, y diversos ácidos orgánicos. Dependiendo del modo de asimilación del microorganismo usado, se puede usar alcohol, incluyendo etanol y glicerol. Como fuente de nitrógeno, se pueden usar diversas sales de amonio tales como amoníaco y sulfato de amonio, otros compuestos nitrogenados tales como aminas, una fuente de nitrógeno natural tal como peptona, hidrolizado de soja, y microorganismos fermentadores digeridos. Como minerales, se pueden usar monofosfato de potasio, sulfato de magnesio, cloruro sódico, sulfato ferroso, sulfato de manganeso, cloruro cálcico, y similares. Como vitaminas, se pueden usar tiamina, extracto de levadura, y similares.

El cultivo preferentemente se lleva a cabo en condiciones aeróbicas, tal como un cultivo con agitación, o un cultivo en agitación con aireación, a una temperatura de 20 a 40°C, preferentemente de 30 a 38°C. El pH del cultivo normalmente está entre 5 y 9, preferentemente entre 6,5 y 7,2. El pH del cultivo se puede ajustar con amoníaco, carbonato de calcio, diversos ácidos, diversas bases, y tampones. Normalmente, un cultivo de 1 a 5 días da lugar a la acumulación del L-aminoácido diana en el medio líquido.

Después del cultivo, los elementos sólidos tales como las células se pueden retirar del medio líquido por centrifugación o filtración con membrana, y a continuación el L-aminoácido se puede recoger y purificar mediante procedimientos de intercambio iónico, concentración, y/o cristalización. Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 muestra las posiciones relativas de los cebadores kefBL y kefBR sobre el plásmido pACYC184, que se usan para la amplificación del gen cat.

La Figura 2 muestra la construcción del fragmento de ADN cromosómico que contiene el gen kefB inactivado. Ejemplos

La presente invención se explicará a continuación con mayor concreción con referencia a los siguientes Ejemplos no limitantes. Ejemplo 1. Construcción de una cepa con un gen kefB inactivado

1. Deleción del gen kefB

Se construyó una cepa que tenía una delección del gen kefB mediante el procedimiento desarrollado inicialmente por Datsenko, K.A. y Wanner, B.L. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97(12): 6640-6645) denominado "integración de red impulsada". Según este procedimiento, se construyeron los cebadores de la PCR kefBL (SEQ ID NO: 3) y kefBR (SEQ ID NO: 4), que son homólogos a ambas regiones adyacentes al gen kefB y al gen que confiere resistencia a antibióticos, respectivamente, en el plásmido molde. El plásmido pACYC184 (NBL Gene Sciences Ltd., RU) (GenBank/EMBL, número de acceso X06403) se usó como molde en la reacción de la PCR. Las condiciones para la PCR eran las siguientes: etapa de desnaturalización: 3 min a 95°C; perfil para los dos primeros ciclos: 1 min a 95°C, 30 s a 50°C, 40 s a 72°C; perfil para los últimos 25 ciclos: 30 s a 95°C, 30 s a 54°C, 40 s a 72°C; etapa final: 5 min a 72°C.

Se obtuvo un producto de la PCR de 1152 bp (Fig. 1) y se purificó en gel de agarosa y se usó para la electroporación de E. coli MG1655 (ATCC 700926), que contiene el plásmido pKD46 que presenta una replicación sensible a la temperatura. El plásmido pKD46 (Datsenko, K.A. y Wanner, B.L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97(12):6640-6645) incluye un fragmento de ADN de 2154 nucleótidos del fago  (posiciones de los nucleótidos 31088 a 33241, número de acceso del GenBank J02459), y contiene genes del sistema de recombinación homólogo Red (, β, exogenes) bajo el control del promotor ParaB inducible por arabinosa. El plásmido pKD46 es necesario para la integración del producto de la PCR en el cromosoma de la cepa MG1655. La cepa MG1655 se puede obtener en la American Type Culture Collection. (P.O. Box 1549 Manassas, VA 20108, Estados Unidos de América).

Se prepararon células electrocompetentes de la manera siguiente: E. coli MG1655/pKD46 se hicieron crecer durante toda la noche a 30°C en medio LB que contenía ampicilina (100 mg/l), y el cultivo se diluyó 100 veces con 5 ml de medio SOB (Sambrook y col, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) con ampicilina y L-arabinosa (1 mM). Las células se hicieron crecer con aireación a 30°C a una DO600 de ≈0,6 y a continuación se hicieron electrocompetentes concentrando 100 veces y lavando tres veces con H2O desionizada enfriada en hielo. La electroporación se llevó a cabo usando 70 µl de células y ≈100 ng del producto de la PCR. Después de la electroporación las células se incubaron con 1 ml de medio SOC (Sambrook y col, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) a 37°C durante 2,5 horas y a continuación se cultivaron en placa sobre L-agar que contiene cloranfenicol (30 µg/ml) y se hicieron crecer a 37°C para seleccionar CmR recombinantes. A continuación, para eliminar el plásmido pKD46, se llevaron a cabo dos pases sobre L-agar con Cm a 42°C y las colonias obtenidas se probaron para su sensibilidad a la ampicilina.

2. Verificación de la delección del gen kefB mediante PCR

Se verificaron los mutantes que tenían el gen kefB deleccionado y se marcaron con el gen de resistencia a Cm mediante PCR. Para la verificación en la PCR se usaron los cebadores específicos de locus kefBl (SEQ ID NO: 5) y kefB2 (SEQ ID NO: 6). Las condiciones para la verificación mediante la PCR fueron las siguientes: etapa de desnaturalización: 3 min a 94°C; perfil para los 30 ciclos:

30 s a 94°C, 30 s a 54°C, 1 min a 72°C; etapa final: 7 min a 72°C. El producto de la PCR obtenido en la reacción con la cepa MG1655 kefB+ parental como molde tenía una longitud de 2086 bp. El producto de la PCR obtenido en la reacción con la cepa mutante como molde tenía una longitud de 1360 bp (Fig.2). La cepa mutante se denominó MG1655 ΔkefB::cat. Ejemplo 2. Producción de L-treonina por E. coli B-3996-ΔkefB

Para probar el efecto de la inactivación del gen kefB sobre la producción de treonina, se transfirieron fragmentos de ADN procedentes del cromosoma de la cepa de E. coli MG1655 ΔkefB::cat descrita anteriormente a la cepa de E. coli productora de treonina VKPM B-3996 mediante transducción P1 (Miller, J.H. Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, 1972, Plainview, NY) para obtener la cepa B-3996-ΔkefB.

Ambas cepas de E. coli, B-3996 y B-3996-ΔkefB, se hicieron crecer durante 18-24 horas a 37°C sobre placas de L-agar. Para obtener un cultivo de siembra, las cepas se hicieron crecer en un agitador rotatorio (250 rpm) a 32°C durante 18 horas en tubos de ensayo de 20 x 200 mm que contienen 2 ml de caldo de cultivo L suplementado con glucosa al 4%. A continuación, el medio de fermentación fue inoculado con 0,21 ml (10%) del material de siembra. La fermentación se llevó a cabo en 2 ml de medio mínimo para la fermentación en tubos de ensayo de 20 x 200 mm. Las células se hicieron crecer durante 65 horas a 32°C con agitación a 250 rpm.

Después del cultivo, la cantidad de L-treonina, que se había acumulado en el medio, se determinó mediante cromatografía en papel usando la siguiente fase móvil: butanol -ácido acético -agua = 4 : 1 : 1 (v/v). Se usó una disolución de ninhidrina (2%) en acetona como reactivo de visualización. Se recortó una mancha que contenía la Ltreonina, la L-treonina se eluyó con una disolución acuosa al 0,5% de CdCl2, y la cantidad de L-treonina se estimó espectrofotométricamente a 540 nm. En la Tabla 1 se muestran los resultados de 10 fermentaciones en tubos de ensayo

independientes. La composición del medio de fermentación (g/l) era la siguiente: Glucosa 80,0

5 (NH4)2SO4 22,0 NaCl 0,8 KH2PO4 2,0 MgSO4·7H2O 0,8 FeSO4·7H2O 0,02

10 MnSO4·5H2O 0,02 Tiamina·HCl 0,0002 Extracto de levadura 1,0 CaCO3 30,0 La glucosa y el sulfato de magnesio se esterilizaron

15 por separado. El CaCO3 se esterilizó por calor seco a 180°C durante 2 horas. El pH se ajustó a 7,0. El antibiótico se introdujo en el medio después de la esterilización.

Tabla 1

Cepa: DO540 Cantidad de L-treonina, g/l

B-3996: 19,6 ± 0,7 23,6 ± 0,3

B-3996-ΔkefB: 20,4 ± 0,6 24,9 ± 1,0

De la Tabla 1 se infiere que B-3996-ΔkefB produjo una 20 acumulación de una mayor cantidad de L-treonina, comparada con B-3996.

Ejemplo 3. Producción de L-lisina por la cepa de E. coli WC196-ΔkefB

25 Para probar el efecto de la inactivación del gen kefB sobre la producción de lisina, se transfirieron fragmentos de ADN procedentes del cromosoma de la cepa de E. coli MG1655 ΔkefB::cat descrita anteriormente a la cepa de E. coli productora de lisina WC196 (FERM BP-5252) mediante

30 transducción P1 (Miller, J.H. Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, 1972, Plainview, NY) para obtener la cepa WC196-ΔkefB. Ambas cepas de E. coli, WC196 y WC196-ΔkefB, se hicieron crecer en un agitador rotatorio (250 rpm) a 32°C

durante 18 horas en tubos de ensayo de 20 x 200 mm que contenían 2 ml de medio diluido dos veces comparado con el medio de fermentación descrito anteriormente. A continuación se inocularon 0,21 ml (10%) del medio de siembra en 2 ml del

5 medio de fermentación en tubos de ensayo de 20 x 200 mm. La fermentación se llevó a cabo a 32°C durante 24 horas con agitación a 250 rpm.

Después del cultivo, la cantidad de L-lisina, que se había acumulado en el medio, se determinó mediante 10 cromatografía en papel usando la siguiente fase móvil: butanol -ácido acético -agua = 4 : 1 : 1 (v/v). Se usó una disolución de ninhidrina (2%) en acetona como reactivo de visualización. Se recortó una mancha que contenía la Llisina, la L-lisina se eluyó con una disolución acuosa al

15 0,5% de CdCl2, y la cantidad de L-lisina se estimó espectrofotométricamente a 540 nm. En la Tabla 2 se muestran los resultados de 5 fermentaciones en tubos de ensayo independientes. La composición del medio de fermentación (g/l) era la

20 siguiente: Glucosa 40,0 (NH4)2SO4 24,0 KH2PO4 1,0 MgSO4·7H2O 1,0

25 FeSO4·7H2O 0,01 MnSO4·5H2O 0,01 Extracto de levadura 2,0 CaCO3 30,0 La glucosa, el fosfato de potasio y el sulfato de

30 magnesio se esterilizaron por separado. El CaCO3 se esterilizó por calor seco a 180°C durante 2 horas. El pH se ajustó a 7,0. Tabla 2

Cepa: DO540 Cantidad de L-lisina, g/l

WC196: 26,2 ± 0,5 2,1 ± 0,1

WC196-ΔkefB: 28,6 ± 1,1 2,4 ± 0,1

De la Tabla 2 se infiere que WC196-ΔkefB produjo una

acumulación de una mayor cantidad de L-lisina, comparada con WC196. Ejemplo 4. Producción de L-cisteína por E. coli JM15(ydeD)ΔkefB

Para probar el efecto de la inactivación del gen kefB sobre la producción de L-cisteína, se transfirieron fragmentos de ADN procedentes del cromosoma de la cepa de E. coli MG1655 ΔkefB::cat descrita anteriormente a la cepa de

E. coli productora de L-cisteína WC196 JM15(ydeD) mediante transducción P1 (Miller, J.H. Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, 1972, Plainview, NY) para obtener la cepa JM15(ydeD)-ΔkefB.

E. coli JM15(ydeD) es un derivado de E. coli JM15 (patente de EE.UU. Nº 6.218.168), que se puede transformar con ADN que tiene el gen ydeD que codifica una proteína de membrana, y que no está involucrado en ninguna vía biosintética de ningún L-aminoácido (patente de EE.UU. Nº 5.972.663). La cepa JM15 (CGSC# 5042) se puede obtener en la The Coli Genetic Stock Collection en el E. coli Genetic Resource Center, MCD Biology Department, Universidad de Yale (http://cgsc.biology.yale.edu/).

Las condiciones de fermentación para la evaluación de la producción de L-cisteína se describen con detalle en el Ejemplo 6 de la patente de EE.UU. Nº 6.218.168. Ejemplo 5. Producción de L-leucina por E. coli 57-ΔkefB

Para probar el efecto de la inactivación del gen kefB sobre la producción de L-leucina, se pueden transferir fragmentos de ADN procedentes del cromosoma de la cepa de E. coli MG1655 ΔkefB::cat descrita anteriormente a la cepa de

E. coli productora de L-leucina 57 (VKPM B-7386, patente de EE.UU. Nº 6.124.121) mediante transducción de P1 (Miller,

J.H. Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, 1972, Plainview, NY) para obtener la cepa 57ΔkefB. La cepa 57 ha sido depositada en la Russian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM) (Rusia, 117545 Moscú, 1 Dorozhny proezd, 1) el 1 de Mayo de 1997 con el número de acceso VKPM B-7386.

Ambas cepas de E. coli, 57 y 57-ΔkefB, se pueden cultivar durante 18-24 horas en placas de L-agar a 37°C. Para obtener el cultivo de siembra, las cepas se pueden crecer en un agitador rotatorio (250 rpm) a 32°C durante 18 horas en tubos de ensayo de 20 x 200 mm que contienen 2 ml de caldo de cultivo L suplementado con sacarosa al 4%. A continuación, el medio de fermentación se puede inocular con 0,21 ml (10%) del material de siembra. La fermentación se puede llevar a cabo en 2 ml de un medio de fermentación mínimo en tubos de ensayo de 20 x 200 mm. Las células se pueden crecer durante 48-72 horas a 32°C con agitación a 250 rpm. La cantidad de L-leucina se puede medir mediante cromatografía en papel (composición de la fase líquida: butanol -ácido acético -agua = 4 : 1 : 1).

La composición del medio de fermentación (g/l) era la siguiente (pH 7,2):

Glucosa 60,0

(NH4)2SO4 25,0

KH2PO4 2,0

MgSO4·7H2O 1,0

Tiamina 0,01

CaCO3 25,0

La glucosa y el CaCO3 se esterilizaron por separado. Ejemplo 6. Producción de L-histidina por la cepa de E. coli 80-ΔkefB

Para probar el efecto de la inactivación del gen kefB sobre la producción de L-histidina, se pueden transferir fragmentos de ADN procedentes del cromosoma de la cepa de E. coli MG1655 ΔkefB::cat descrita anteriormente a la cepa de

E. coli productora de L-histidina 80 mediante transducción de P1 (Miller, J.H. Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, 1972, Plainview, NY) para obtener la cepa 80-ΔkefB. La cepa 80 ha sido descrita en la patente rusa 2119536 y depositada en la Russian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM) (Rusia, 117545 Moscú, 1 Dorozhny proezd, 1) el 15 de Octubre de 1999 con el número de acceso VKPM B-7270 y a continuación convertida en un

depósito bajo el Tratado de Budapest el 12 de Julio de 2004.

Ambas cepas de E. coli, 80 y 80-ΔkefB, se pueden cultivar en caldo de cultivo L durante 6 horas a 29°C. A continuación, 0,1 ml de los cultivos obtenidos se pueden inocular en 2 ml del medio de fermentación en un tubo de ensayo de 20 x 200 mm y se pueden cultivar durante 65 horas a 29°C con agitación en un agitador rotatorio (350 rpm). Después del cultivo, la cantidad de histidina que se acumula en el medio se puede determinar mediante cromatografía en papel. El papel se puede revelar con una fase móvil que consiste en n-butanol -ácido acético -agua = 4 : 1 : 1 (v/v). Como reactivo de visualización se puede usar una disolución de ninhidrina (0,5%) en acetona.

La composición del medio de fermentación (pH 6,0) era la siguiente (g/l):

Glucosa 100,0

Mameno (hidrolizado de soja) 0,2 del nitrógeno total

L-prolina 1,0

(NH4)2SO4 25,0

KH2PO4 2,0

MgSO4·7H2O 1,0

FeSO4·7H2O 0,01

MnSO4 0,01

Tiamina 0,001

Betaína 2,0

CaCO3 60,0

La glucosa, la prolina, la betaína y el CaCO3 se esterilizaron por separado. El pH se ajustó a 6,0 antes de la esterilización. Ejemplo 7. Producción del L-glutamato por E. coli VL334thrC+-ΔkefB

Para probar el efecto de la inactivación del gen kefB sobre la producción de L-glutamato, se pueden transferir fragmentos de ADN procedentes del cromosoma de la cepa de E. coli MG1655 ΔkefB::cat descrita anteriormente a la cepa de

E. coli productora de L-glutamato VL334thrC+ (documento EP 1172433) mediante transducción P1 (Miller, J.H. Experiments

in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, 1972, Plainview, NY) para obtener la cepa VL334thrC+-ΔkefB. La cepa VL334thrC+ ha sido depositada en la Russian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM) (Rusia, 117545 Moscú, 1 Dorozhny proezd, 1) el 6 de Diciembre de 2004 con el número de acceso VKPM B-8961 y a continuación se convirtió en un depósito bajo el Tratado de Budapest el 8 de Diciembre de 2004.

Ambas cepas de E. coli, VL334thrC+ y VL334thrC+-ΔkefB, se pueden cultivar durante 18-24 horas en placas de L-agar a 37°C. A continuación, se puede transferir una muestra de inoculación de las células a tubos de ensayo que contienen 2 ml de medio de fermentación. El medio de fermentación contiene glucosa (60 g/l), sulfato de amonio (25 g/l), KH2PO4 (2 g/l), MgSO4 (1 g/l), tiamina (0,1 mg/ml), Lisoleucina (70 µg/ml), y CaCO3 (25 g/l). El pH se debe ajustar a 7,2. La glucosa y el CaCO3 se esterilizaron por separado. El cultivo se puede llevar a cabo a 30°C durante tres días con agitación. Después del cultivo, la cantidad de ácido L-glutámico producido se puede determinar mediante cromatografía en papel (composición de la fase líquida: butanol -ácido acético -agua = 4 : 1 : 1) con la tinción subsiguiente con ninhidrina (disolución al 1% en acetona) y posterior elución de los compuestos en etanol al 50% con CdCl2 al 0,5%. Ejemplo 8. Producción de L-fenilalanina por E. coli AJ12739ΔkefB

Para probar el efecto de la inactivación del gen kefB sobre la producción de L-fenilalanina, se pueden transferir fragmentos de ADN procedentes del cromosoma de la cepa de E. coli MG1655 ΔkefB::cat descrita anteriormente a la cepa de

E. coli productora de L-fenilalanina AJ12739 mediante transducción P1 (Miller, J.H. Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, 1972, Plainview, NY) para obtener la cepa AJ12739-ΔkefB. La cepa AJ12739 ha sido depositada en la Russian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM) (Rusia, 117545 Moscú, 1

Dorozhny proezd, 1) el 6 de Noviembre de 2001 con el número de acceso VKPM B-8197 y a continuación se convirtió en un depósito bajo el Tratado de Budapest el 23 de Agosto de 2002.

Ambas cepas de E. coli, AJ12739-ΔkefB y AJ12739, se pueden cultivar durante 18 horas en un caldo de nutrientes a 37°C, y 0,3 ml de los cultivos obtenidos se pueden inocular en 3 ml de un medio de fermentación en tubos de ensayo de 20 x 200 mm y se pueden cultivar a 37°C durante 48 horas con agitación en un agitador rotatorio. Después del cultivo, la cantidad de fenilalanina que se acumula en el medio se puede determinar mediante TLC. Se pueden usar placas de TLC de 10 x 15 cm recubiertas con capas de 0,11 mm de gel de sílice Sorbfil que no contienen indicador fluorescente (Stock Company Sorbpolymer, Krasnodar, Rusia). Las placas de Sorbfil se pueden revelar con una fase móvil que consta de propan-2-ol : acetato de etilo: amoníaco acuoso al 25% : agua = 40 : 40 : 7 : 16 (v/v). Como reactivo de visualización se puede usar una disolución de ninhidrina (2%) en acetona.

La composición del medio de fermentación (g/l) era la siguiente:

Glucosa 40,0

(NH4)2SO4 16,0

KH2PO4 0,1

MgSO4·7H2O 1,0

FeSO4·7H2O 0,01

MnSO4·5H2O 0,01

Tiamina·HCl 0,0002

Extracto de levadura 2,0

Tirosina 0,125

CaCO3 20,0

La glucosa y el sulfato de magnesio se esterilizaron por separado. El CaCO3 se esterilizó por calor seco a 180°C durante 2 horas. El pH se ajustó a 7,0. Ejemplo 9. Producción de L-triptófano por E. coli SV164 (pGH5)-ΔkefB

Para probar el efecto de la inactivación del gen kefB sobre la producción de L-triptófano, se pueden transferir fragmentos de ADN procedentes del cromosoma de la cepa de E. coli MG1655 ΔkefB::cat descrita anteriormente a la cepa de

5 E. coli productora de L-triptófano SV164 (pGH5) mediante transducción P1 (Miller, J.H. Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, 1972, Plainview, NY) para obtener la cepa SV164 (pGH5)-ΔkefB. La cepa SV164 tiene el alelo trpE que codifica la antranilato sintasa

10 exenta de inhibición por retroalimentación mediante triptófano. El plásmido pGH5 alberga un gen mutante serA que codifica fosfoglicerato deshidrogenasa exenta de inhibición por retroalimentación mediante serina. La cepa SV164 (pGH5) se describe con detalle en la patente de EE.UU. Nº

15 6.180.373. Ambas cepas de E. coli, SV164 (pGH5)-ΔkefB y SV164 (pGH5), se pueden cultivar durante 18 horas a 37°C en 3 ml de caldo de cultivo suplementado con tetraciclina (20 mg/l, marcador del plásmido pGH5). Los cultivos obtenidos (0,3 ml

20 cada uno) se pueden inocular en 3 ml de un medio de fermentación que contiene tetraciclina (20 mg/l) en tubos de ensayo de 20 x 200 mm, y se pueden cultivar a 37°C durante 48 horas en un agitador rotatorio a 250 rpm. Después del cultivo, la cantidad de triptófano que se acumula en el

25 medio se puede determinar mediante TLC como se describe en el Ejemplo 8. Los componentes del medio de fermentación están listados en la Tabla 3, y se esterilizan en grupos separados (A, B, C, D, E, F, y H), como se muestra, para evitar interacciones perjudiciales durante la

30 esterilización. Tabla 3

Grupos: Componente Concentración final, g/l

A: KH2PO4 NaCl (NH4)2SO4 L-metionina L-fenilalanina 1,5 0,5 1,5 0,05 0,1

L-tirosina Mameno (N total): 0,1 0,07

B: Glucosa MgSO4·7H2O 40,0 0,3

C: CaCl2 0,011

D: FeSO4·7H2O Citrato sódico 0,075 1,0

E: Na2MoO4·2H2O H3BO3 CoCl2·6H2O CuSO4·5H2O MnCl2·4H2O ZnSO4·7H2O 0,00015 0,0025 0,00007 0,00025 0,0016 0,0003

F: Tiamina·HCl 0,005

G: CaCO3 30,0

H: Piridoxina 0,03

El Grupo A tiene un pH de 7,1 ajustado con NH4OH. Cada uno de los grupos A, B, C, D, E, F y H se esterilizó por separado, se enfrió, y se mezclaron juntos, y a continuación se añadió CaCO3 esterilizado por calor seco al medio de

5 fermentación completo. Ejemplo 10. Producción de L-prolina por E. coli 702ilvAΔkefB

Para probar el efecto de la inactivación del gen kefB sobre la producción de L-prolina, se pueden transferir 10 fragmentos de ADN procedentes del cromosoma de la cepa de E. coli MG1655 ΔkefB::cat descrita anteriormente a la cepa de

E. coli productora de L-prolina 702ilvA mediante transducción P1 (Miller, J.H. Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, 1972, Plainview, 15 NY) para obtener la cepa 702ilvA-ΔkefB. La cepa 702ilvA ha sido depositada en la Russian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM) (Rusia, 117545 Moscú, 1 Dorozhny proezd, 1) el 18 de Julio de 2000 con el número de acceso VKPM B-8012 y a continuación se convirtió en un

20 depósito bajo el Tratado de Budapest el 18 de Mayo de 2001. Ambas cepas de E. coli, 702ilvA y 702ilvA-ΔkefB, se

pueden cultivar durante 18-24 horas a 37°C en placas de Lagar. A continuación, estas cepas se pueden cultivar en las mismas condiciones que en el Ejemplo 7. Ejemplo 11. Producción de L-arginina por la cepa de E. coli 382-ΔkefB

Para probar el efecto de la inactivación del gen kefB sobre la producción de L-arginina, se pueden transferir fragmentos de ADN procedentes del cromosoma de la cepa de E. coli MG1655 ΔkefB::cat descrita anteriormente a la cepa de

E. coli productora de L-arginina 382 mediante transducción P1 (Miller, J.H. Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, 1972, Plainview, NY) para obtener la cepa 382-ΔkefB. La cepa 382 ha sido depositada en la Russian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM) (Rusia, 117545 Moscú, 1 Dorozhny proezd, 1) el 10 de Abril de 2000 con el número de acceso VKPM B-7926 y a continuación se convirtió en un depósito bajo el Tratado de Budapest el 18 de Mayo de 2001.

Ambas cepas de E. coli, 382-ΔkefB y 382, se cultivaron con agitación a 37°C durante 18 horas en 3 ml de caldo de nutrientes. Los cultivos obtenidos (0,3 ml cada uno) se inocularon en 3 ml de un medio de fermentación en tubos de ensayo de 20 x 200 mm y se cultivaron a 32°C durante 72 horas en un agitador rotatorio.

Después del cultivo, se determinó la cantidad de Larginina que se acumula en el medio por cromatografía en papel usando la siguiente fase móvil: butanol -ácido acético -agua = 4 : 1 : 1 (v/v). Se usó una disolución de ninhidrina (2%) en acetona como reactivo de visualización. Se recortó una mancha que contiene la L-arginina, la Larginina se diluyó con una disolución acuosa al 0,5% de CdCl2, y se estimó espectrofotométricamente a 540 nm la cantidad de L-arginina. En la Tabla 4 se muestran los resultados de 10 fermentaciones en tubos de ensayo independientes.

La composición del medio de fermentación (g/l) era la siguiente:

Glucosa 48,0 (NH4)2SO4 35,0 KH2PO4 2,0 MgSO4·7H2O 1,0

5 Tiamina·HCl 0,0002 Extracto de levadura 1,0 L-isoleucina 0,1 CaCO3 5,0 La glucosa y el sulfato de magnesio se esterilizaron

10 por separado. El CaCO3 se esterilizó por calor seco a 180°C durante 2 horas. El pH se ajustó a 7,0.

Tabla 4

Cepa: DO540 Cantidad de L-arginina, g/l

382: 11,4 ± 3,8 11,1 ± 0,4

382-ΔkefB: 12,6 ± 1,7 11,8 ± 0,6

De la Tabla 4 se infiere que 382-ΔkefB causó una acumulación de una mayor cantidad de L-arginina, comparada con 382.

5 Aunque la invención se ha descrito en detalle con referencia a sus realizaciones preferidas, será evidente para alguien experto en la materia que se pueden introducir diversos cambios, y se pueden emplear equivalentes, sin apartarse del alcance de la invención. Todas las referencias

10 citadas en el presente documento se incorporan como parte de

esta solicitud por referencia. Aplicabilidad industrial Según la presente invención, se puede mejorar la

producción de L-aminoácidos de una bacteria de la familia 15 Enterobacteriaceae.

LISTA DE SECUENCIAS

<110> Ajimoto Co., Inc.

<120> UN PROCEDIMIENTO PARA LA PRODUCCIÓN DE UN L-AMINOÁCIDO

USANDO UNA BACTERIA DE LA FAMILIA ENTEROBACTERIACEAE CON LA 20 EXPRESIÓN ATENUADA DEL GEN kefB

<130> C481-C6108

<150> RU205114823

<151> 16-05-2005

<150> US60/736830 25 <151> 16-11-2005

<160> 6

<170> Patentin versión 3.1

<210> 1

<211> 1806 30 <212> ADN

<213> Escherichia coli

<220>

<221> CDS

<222> (1)...(1806)

<400> 1

imagen1

<210> 2

<211> 601

<212> PRT

<213> Escherichia coli

imagen1

<210> 3

<211> 57

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador

<400> 3

imagen1

10 <210> 4

<211> 57

<212> ADN

<213> Artificial

<220> 15 <223> cebador

<400> 4

imagen1

<210> 5

<211> 21 20 <212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador

<400> 5

imagen1

<210> 6

<211> 20

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador

<400> 6

imagen1

Claims

REIVINDICACIONES

1.

Una bacteria que produce L-aminoácidos de la familia Enterobacteriaceae, en la que dicha bacteria ha sido modificada para atenuar la expresión del gen kefB.
2.

La bacteria según la reivindicación 1, en la que dicha expresión del gen kefB se atenúa mediante la inactivación del gen kefB.
3.

La bacteria según la reivindicación 1, en la que dicha bacteria pertenece al género Escherichia.
4.

La bacteria según la reivindicación 1, en la que dicha bacteria pertenece al género Pantoea.
5.

La bacteria que produce L-aminoácidos según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que dicho L-aminoácido se selecciona del grupo constituido por un L-aminoácido aromático y un L-aminoácido no aromático.
6.

La bacteria que produce L-aminoácidos según la reivindicación 5, en la que dicho L-aminoácido aromático se selecciona del grupo constituido por L-fenilalanina, Ltirosina, y L-triptófano.
7.

La bacteria que produce L-aminoácidos según la reivindicación 5, en la que dicho L-aminoácido no aromático se selecciona del grupo constituido por L-treonina, Llisina, L-cisteína, L-metionina, L-leucina, L-isoleucina, Lvalina, L-histidina, glicina, L-serina, L-alanina, Lasparagina, ácido L-aspártico, L-glutamina, ácido Lglutámico, L-prolina, y L-arginina.
8.

Un procedimiento para la producción de un L-aminoácido que comprende: -el cultivo de la bacteria según cualquiera de las

reivindicaciones 1 a 7 en un medio, y -la recolección de dicho L-aminoácido del medio.
9.

El procedimiento según la reivindicación 8, en el que

5 dicho L-aminoácido se selecciona del grupo constituido por un L-aminoácido aromático y un L-aminoácido no aromático.
10. El procedimiento según la reivindicación 9, en el que

dicho L-aminoácido aromático se selecciona del grupo 10 constituido por L-fenilalanina, L-tirosina, y L-triptófano.
11. El procedimiento según la reivindicación 9, en el que dicho L-aminoácido no aromático se selecciona del grupo constituido por L-treonina, L-lisina, L-cisteína, L

15 metionina, L-leucina, L-isoleucina, L-valina, L-histidina, glicina, L-serina, L-alanina, L-asparagina, ácido Laspártico, L-glutamina, ácido L-glutámico, L-prolina, y Larginina.