SK283478B6 - Gén, ktorý kóduje lyzínovú dekarboxylázu, mikroorganizmus a spôsob výroby L-lyzínu - Google Patents

Gén, ktorý kóduje lyzínovú dekarboxylázu, mikroorganizmus a spôsob výroby L-lyzínu Download PDF

Info

Publication number
SK283478B6
SK283478B6 SK702-97A SK70297A SK283478B6 SK 283478 B6 SK283478 B6 SK 283478B6 SK 70297 A SK70297 A SK 70297A SK 283478 B6 SK283478 B6 SK 283478B6
Authority
SK
Slovakia
Prior art keywords
leu
lysine
gly
gene
ala
Prior art date
Application number
SK702-97A
Other languages
English (en)
Other versions
SK70297A3 (en
Inventor
Yoshimi Kikuchi
Tomoko Suzuki
Hiroyuki Kojima
Original Assignee
Ajinomoto Co., Inc.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=17956402&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=SK283478(B6) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Ajinomoto Co., Inc. filed Critical Ajinomoto Co., Inc.
Publication of SK70297A3 publication Critical patent/SK70297A3/sk
Publication of SK283478B6 publication Critical patent/SK283478B6/sk

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/08—Lysine; Diaminopimelic acid; Threonine; Valine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/88—Lyases (4.)

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Abstract

L-lyzín sa hospodárne vyrobí kultiváciou mikroorganizmu patriaceho k rodu Escherichia, ktorý má zníženú alebo potlačenú lyzínovú dekarboxylázovú aktivitu, relevantnú pre rozklad L-lyzínu. Výhodne kultiváciou baktérií patriacich k rodu Escherichia s potlačenou expresiou génu, kódujúceho lyzínovú dekarboxylázu, a/alebo génu cadA v tekutom prostredí, umožňujúcom tvorbu a akumuláciu L-lyzínu v kultivačnom médiu a oddelením L-lyzínu. ŕ

Description

Oblasť vynálezu
Vynález sa týka nového lyzínového dekarboxylázového génu Escherichia coli, relevantného pre rozklad L-lyzínu, ďalej sa týka mikroorganizmu, ktorý patrí k rodu Escherichia a ktorý má potlačenú expresiu uvedeného génu a/alebo iného lyzínového dekarboxylázového génu, známeho ako gén cadA a ďalej sa týka spôsobu prípravy L-lyzínu s využitím uvedeného mikroorganizmu. V poslednom období sa stále zvyšuje dopyt po L-lyzínu ako prísady do krmív.
Doterajší stav techniky
Lyzínová dekarboxyláza, ktorá katalyzuje reakciu vzniku kadaverínu dekarboxyláciou L-lyzínu je známa ako enzým, ktorý rozkladá L-lyzín v Escherichia coli. Nukleotidová sekvencia tohto génu sa označuje ako cadA a sekvencia aminokyselín, kódovaná uvedeným génom už bola opísaná (Meng, S. a Bennett, G. N., J. Bacteriol., 174. 2659 (1992)). O lyzínovej dekarboxylázc, kódovanej iným génom ako cadA z Escherichia coli, sú známe dve práce, v ktorých sa opisuje, že taká lyzínová dekarboxyláza má v mutantnom kmeni Escherichia coli iba slabú účinnosť (Goldemberg, S. H., J. Bacteriol., 141, 1428 (1980); Wertenheimer, S. J. a Leifer, Z., Biochem. Biophys. Comm., 114, 882 (1983)). Pritom však Goldemberg, S. H. uvádza, že sa účinnosť enzýmu znižuje po tepelnom spracovaní pri 60 °C počas 4 minút v rozsahu asi o 30 %, zatiaľ čo Wertheimer, S. J. so spolupracovníkmi uvedený jav nepozorovali. Podľa toho je prítomnosť druhej lyzínovej dekarboxylázy neurčitá.
Na druhej strane sa L-lyzín vyrába známymi spôsobmi s použitím Escherichia coli vrátane spôsobu, ktorý zahŕňa kultiváciu mutantného kmeňa, odolného k lyzínovému analógu alebo rekombinantný kmeň, kotviaci vektor s vloženou deoxyribonukleovou kyselinou, ktorá nesie genetickú informáciu, relevantnú k biosyntéze L-lyzinu (zverejnený japonský patent číslo 56-18 596). Nie je však známa nijaká informácia o produkcii L-lyzínu s použitím mikroorganizmu, ktorý patrí k rodu Escherichia a ktorý má potlačenú expresiu lyzínového dekarboxylázového génu.
Podstata vynálezu
Podstatou tohto vynálezu je získať nový lyzínový dekarboxylázový gén od Escherichia coli, vytvoriť mikroorganizmus produkujúci L-lyzín, ktorý patrí do rodu Escherichia a ktorý má potlačenú expresiu uvedeného génu a/alebo cadA génu a poskytnúť spôsob prípravy L-lyzínu, založený na kultivácii uvedeného mikroorganizmu, ktorý patrí k rodu Escherichia.
Keď autori tohto vynálezu vytvorili kmeň Escherichia coli, v ktorom bol zničený cadA ako známy lyzínový dekarboxylázový gén, zistilo sa, že v tomto mikrobiálnom kmeni sa stále ako rozkladný produkt L-lyzínu účinkom lyzínovej dekarboxylázy produkoval kadaverín. Autori tohto vynálezu usúdili, že v Escherichia coli musí byť prítomný nový lyzínový dekarboxylázový gén a tento môže pri fermentácii s použitím mikroorganizmu patriaceho k rodu Escherichia značne ovplyvňovať produkciu L-lyzínu. V pokusoch o dosiahnutie klonovania uvedeného génu boli autori tohto vynálezu úspešní v tom, že ako výsledok získali nový lyzínový dekarboxylázový gén, odlišný od génu cadA. Tiež sa zistilo, že potlačením expresie uvedeného génu v mikroorganizme Escherichia coli, produkujúcom L
-lyzín, sa významne znížila účinnosť rozkladu L-lyzínu a že sa významne zvýšila produktivita tvorby L-lyzínu. Tým sa súčasný vynález dokončil.
Tento vynález menovite uvádza nový gén, ktorý kóduje pre lyzínovú dekarboxylázu, vznikajúcu v Escherichia coli. Tento gén sa označil ako gén „ldc“.
Z iného pohľadu súčasný vynález poskytuje mikroorganizmus, ktorý patri k rodu Escherichia, schopný produkcie L-lyzínu, ktorý má v bunkách zníženú alebo potlačenú účinnosť lyzínovej dekarboxylázy.
Ešte z iného hľadiska poskytuje tento vynález spôsob prípravy L-lyzinu, zahŕňajúci výrobné kroky: krok kultivácie mikroorganizmu, patriaceho k rodu Escherichia a opísaného skôr, v kvapalnom prostredí, umožňujúcom vznik a akumuláciu L-lyzínu v uvedenom prostredí a krok oddelenie L-lyzínu.
Uvedený mikroorganizmus, patriaci k rodu Escherichia a opísaný skôr zahŕňa mikroorganizmus, v ktorého bunkách je znížená alebo potlačená účinnosť lyzínovej dekarboxylázy potlačením expresie génu ldc a/alebo génu cadA.
Podrobnejší opis vynálezu je v ďalšom texte.
<1> Príprava fragmentu DNA, ktorý obsahuje nový lyzínový dekarboxylázový gén
Fragment DNA, ktorý obsahuje nový lyzínový dekarboxylázový gén (ldc) podľa tohto vynálezu sa môže získať ďalej uvedeným spôsobom z dostupného kmeňa Escherichia coli, napríklad z kmeňa K-12, alebo z kmeňa od neho odvodeného.
Najprv sa z chromozomálnej DNA kmeňa W3110, vznikajúceho z Escherichia coli K-12, s použitím polymerázovej reťazcovej reakcie (v ďalšom texte označovanej ako „spôsob PCR“) získa gén cadA. čo jc známy gén lyzínovej dekarboxylázy. Nukleotidová sekvencia génu cadA, ako aj sekvencia aminokyselín, kódovaná uvedeným génom sa uvádza v SEQ ID NO: 5 a 6 Zoznamu sekvencii na konci textu. Fragmenty DNA, ktoré majú podobné sekvencie ako gén cadA sú klonované z chromozomálnej knižnice DNA Escherichia coli W3110 spôsobom, využívajúcim plazmidový vektor alebo fágový vektor na potvrdenie, či je, alebo nie je vo fragmentoch DNA obsiahnutý nový lyzínový dekarboxylázový gén. Potvrdenie skutočnosti, že predmetný gén je obsiahnutý, sa môže vykonať Southemovým hybridizačným spôsobom s použitím vzorky pripravenej spôsobom PCR.
Nukleotidová sekvencia génu v takto získanom fragmente DNA sa stanovila nasledovne. Najprv sa fragment DNA podrobil ligácii s autonómne replikovateľným (v bunkách Escherichia coli) vektorom, aby sa pripravila rekombinantná DNA, ktorá sa vložila do príslušných buniek Escherichia coli. Získaný transformant sa kultivoval v kvapalnom prostredí a z rozmnožených buniek sa získala rekombinantná DNA. Úplná nukleotidová sekvencia fragmentu DNA, obsiahnutého v získanej rekombinantnej DNA sa stanovila spôsobom dideoxy (Sanger, F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 74, 5463 (1977)). Štruktúra DNA sa analyzovala tak, aby sa zistili polohy promótora, operátora, SD sekvencie, iniciačného kodóna, otvoreného čítacieho rámca a podobne.
Nový lyzínový dekarboxylázový gén podľa tohto vynálezu má sekvenciu od 1005. až 1007. ATG až po 3141 až 3143. GGA úplnej nukleotidovej sekvencie DNA fragmentu, uvedenú v Zozname sekvencii v SEQ ID NO: 3. Tento gén kóduje pre lyzínovú dekarboxylázu, ktorá má sekvenciu aminokyselín, uvedenú v SEQ ID NO: 4 Zoznamu sekvencii. Zistilo sa, že homológia medzi novou lyzí novou dekarboxylázou a lyzínovou dekarboxylázou, kódovanou génom cadA je 69,4 %.
Gén podľa tohto vynálezu môže byť taký, ktorý kóduje pre lyzínovú dekarboxylázu a ktorý má sekvenciu aminokyselín, uvedenú v SEQ ID NO: 4 Zoznamu sekvencií, a ktorého nukleotidová sekvencia nie je obmedzená na nukleotidovú sekvenciu uvedenú skôr. Lyzinová dekarboxyláza, kódovaná génom podľa tohto vynálezu, môže mať v uvedenej sekvencií aminokyselín substitúciu, deléciu, alebo inzerciu jedného alebo viacerých aminokyselinových zvyškov bez podstatného poškodenia lyzinovej dekarboxylázovej účinnosti. Gény, ktoré kódujú pre lyzínovú dekarboxylázu, ktorá má takú deléciu, inzerciu, alebo substitúciu sa môžu získať z variantov, spontánne mutantných kmeňov, alebo z umelých mutantných kmeňov Escherichia coli, alebo z mikroorganizmov, iných ako Escherichia coli, ktoré patria k rodu Escherichia. Mutantné gény, ktoré kódujú pre lyzínovú dekarboxylázu a ktoré majú deléciu, inzerciu, alebo substitúciu sa môžu tiež získať vykonaním mutácie in vitro, alebo polohovo usmernenou mutagenézou pre gény, kódujúce pre lyzínovú dekarboxylázu, ktorá má sekvenciu aminokyselín uvedenú v SEQ ID NO:4. Tieto mutácie sa môžu vykonať uvedenými spôsobmi, ktoré sú dobre známe odborníkom, skúseným v danej oblasti.
Gén, ktorý kóduje pre lyzínovú dekarboxylázu a ktorý má substitúciu, deléciu, alebo inzerciu jedného alebo viacerých aminokyselinových zvyškov ako sa tu uvádza, zahŕňa však gény, ktoré vznikajú z „ldc génu“ a môžu byť považované za v podstate rovnaké ako gén ldc. Nie je zámerom rozširovať rozsah na také gény, ktoré majú rozdielny pôvod. Je nemožné celkom presne vyznačiť určitý rozsah výrazu „viaceré“. Odborníkom v danej oblasti je však ľahko pochopiteľné, že napríklad gén cadA. ktorý kóduje pre proteín, a je rozdielny v nie menej ako v 200 aminokyselinových zvyškoch od génu, ktorý má sekvenciu aminokyselín uvedenú v SEQ ID NO: 3, je potom rozdielny od génu z tohto vynálezu; a gény, ktoré kódujú pre proteíny a ktoré majú rovnocennú lyzínovú dekarboxylázovú účinnosť, sú v tomto vynáleze zahrnuté, aj keď sú rozdielne od génu, ktorý má aminokyselinovú sekvenciu uvedenú v SEQ ID NO: 3, napríklad v dvoch alebo troch zvyškoch aminokyselín.
<2> Vytvorenie mikroorganizmu, patriaceho k rodu Escherichia, s potlačenou expresiou lyzinového dekarboxylázového génu
Mikroorganizmus, patriaci k rodu Escherichia podľa tohto vynálezu je mikroorganizmus, ktorý patrí k rodu Escherichia, v ktorom je v bunkách znížená alebo celkom potlačená aktivita lyzinovej dekarboxylázy. Mikroorganizmus, patriaci k rodu Escherichia zahŕňa Escherichia coli. Aktivita lyzinovej dekarboxylázy je v bunkách znížená alebo celkom potlačená napríklad potlačením expresie niektorého alebo obidvoch génov, génu lyzinovej dekarboxylázy (ldc) a známeho génu cadA, opísaného skôr. Voliteľne sa aktivita lyzinovej dekarboxylázy v bunkách môže znížiť alebo celkom potlačiť znížením alebo vynechaním špecifických aktivít lyzinových dekarboxylázových enzýmov, kódovaných týmito génmi, prostredníctvom modifikácie štruktúry enzýmov.
Prostriedky na potlačenie expresie génu ldc a známeho génu cadA zahŕňajú napríklad spôsob potlačenia expresie génov na úrovni transkripcie vyvolaním substitúcie, delécie, inzercie, adície, alebo inverzie jedného alebo viacerých nukleotidov v sekvenciách promótora týchto génov a spôsob znížením promótorových aktivít (Rosenberg, M. a Court, D., Ann. Rev. Genetics 13, 319 (1979) a Youderian,
D., Bouviere, S., a Susskind, M., Celí 30, 843 až 853 (1982). Expresia uvedených génov môže byť voliteľne potlačená na translačnej úrovni vyvolaním substitúcie, delécie, inzercie, adície, alebo inverzie jedného alebo viacerých nukleotidov v oblasti medzi sekvenciou SD a iniciačným kodónom (Dunn, J. J., Buzash - Pollert, E., a Studier, F., W., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 75, 2743 (1978)). Na zníženie alebo zrušenie špecifickej aktivity lyzinového dekarboxylázového enzýmu je navyše využiteľný spôsob, v ktorom je kódujúca oblasť lyzinového dekarboxylázového génu modifikovaná alebo zrušená vplyvom substitúcie, delécie, inzercie, adície, alebo inverzie jedného alebo viacerých nukleotidov v sekvencií nukleotidov v kódujúcej oblasti.
Uvedené gény, na ktorých môže nastať substitúcia, delécia, inzercia, adícia, alebo inverzia ich nukleotidov môžu byť gén ldc alebo gén cadA. ako aj gény ldc alebo cadA gény, ktoré majú substitúciu, deléciu, alebo inzerciu jedného alebo viacerých aminokyselinových zvyškov, ktorá však nepoškodzuje základnú aktivitu kódovanej lyzinovej dekarboxylázy.
Spôsob, ktorým sa v géne vyvolá nukleotidová substitúcia, delécia, inzercia, adícia, alebo inzercia zahŕňa spôsob polohovo orientovanej mutagenézy (Kramer, W. a Frits, H. J., Methods in Enzymology, 154. 350 (1987)) a spôsob s použitím chemického činidla, ako je ditioničitan sodný a hydroxylamín (Shortle, D. a Nathans, D., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 270(1978)).
Spôsob plohovo orientovanej mutagenézy je spôsob využívajúci syntetický oligonukleotid, čo je technika, umožňujúca vloženie voliteľnej substitúcie, delécie, inzercie, adície, alebo inverze do voliteľného a obmedzeného nukleotidového páru. Aby sa tento spôsob mohol využiť, najprv sa pripraví jedno vlákno denaturáciou plazmidu, ktorý má predmetný gén klonovaný určitou nukleotidovou sekvenciou DNA. Potom sa syntetizuje syntetický oligonukleotid komplementárne k časti, o ktorej sa uvažuje, že spôsobí mutáciu. V tomto postupe však nie je dovolené, aby syntetický oligonukleotid mal úplnú komplementárnu sekvenciu, ale je navrhnutý tak, aby mal voliteľnú nukleotidovú substitúciu, deléciu, inzerciu, adíciu alebo inverziu. Potom sa na jednovláknovú DNA nechá pôsobiť syntetický oligonukleotid, ktorý má voliteľnú nukleotidovú substitúciu, deléciu, inzerciu, adíciu, alebo inverziu. Úplný dvojvláknový plazmid sa syntetizuje použitím T4 ligázy a Klenowho fragmentu DNA polymerázy I, ktorá sa vloží do príslušných buniek Escherichia coli. Niektoré z takto získaných transformantov majú plazmid obsahujúci gén, v ktorom je fixovaná voliteľná nukleotidová substitúcia, delécia, inzercia, adícia, alebo inverzia. Ako podobný spôsob, schopný umožniť vloženie mutácie do génu na jeho modifikáciu alebo zničenie, je spôsob rekombinantnej PCR (PCR Technology, Stockton Press (1989)).
Spôsob, využívajúci chemické činidlo je spôsob, v ktorom sa mutácia nukleotidovou substitúciou, deléciou, inzerciou, adíciou, alebo inverziou náhodne vloží do fragmentu DNA, obsahujúceho predmetný gén, priamo ditioničitanom sodným, hydroxylamínom alebo podobnými činidlami.
Expresia génu ldc a/alebo génu cadA v bunkách môže byť potlačená substitúciou normálneho génu na chromozóme mikroorganizmu, ktorý patrí do rodu Escherichia, s modifikovaným alebo znehodnoteným génom, získaným vložením mutácie, ako sa opisuje skôr. Spôsob substitúcie génu zahŕňa spôsoby, ktoré využívajú homológnu rekombináciu (Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1972); Matsuyama, S. a Mizushima, S., J. Bacteriol., 162, 1196 (1985)). Homológna re kombinácia je založená na spôsobilosti, ktorú mikroorganizmus patriaci k rodu Escherichia vo všeobecnosti má. Keď sa plazmid alebo podobná časť, ktoré majú homológiu k sekvencii na chromozóme, vloží do buniek, s určitou početnosťou nastáva rekombinácia v polohe sekvencie, ktorá má homológiu. Vkladaný plazmid sa ako celok zabuduje na chromozóm. Ak potom nastáva ďalšia rekombinácia v mieste sekvencie, ktorá má homológiu na chromozóme, plazmid znova z chromozómu odpadne. V priebehu tohto procesu však gén s vloženou mutáciou sa príležitostne fixuje prednostne na chromozóme, v závislosti od polohy, v ktorej nastala rekombinácia a pôvodný normálny gén spolu s plazmidom z chromozómu odpadne. Selekcia takýchto mikrobiálnych kmeňov umožňuje získať mikrobiálny kmeň, v ktorom je normálny gén na chromozóme substituovaný modifikovaným alebo znehodnoteným génom, získaným vložením mutácie, ktorá má nukleotidovú substitúciu, deléciu, inzerciu, adíciu alebo inverziu.
Uvedený mikroorganizmus, patriaci k rodu Escherichia, ktorý sa má podrobiť substitúcii génu je mikroorganizmus, patriaci k rodu Escherichia, ktorý produkuje L-lyzín; napríklad mikrobiálny kmeň Escherichia coli sa môže získať použitím mutácie kmeňa, ktorý neprodukuje I.-lyzín tak, aby získal odolnosť k analógom lyzínu, ako je S-(2-aminoetyl)-L-cysteín (v ďalšom texte označovaný ako „AEC“). Spôsoby mutácie zahŕňajú spôsoby, pri ktorých sa bunky Escherichia coli vystavia pôsobeniu chemického činidla, ako je N-metyl-N-mtro-N-nitrózoguanidín a kyselina dusitá, alebo ožiareniu ultrafialovým svetlom, radiácii a podobne. Uvedený mikrobiálny kmeň špecificky zahŕňa Escherichia coli AJ13069 (FERM P-14690). Tento kmeň bol skonštruovaný dodaním AEC rezistencie do kmeňa W3110, vznikajúceho zEscherichia coli K-12. Escherichia coli AJ13069 bol 6. decembra 1994 uložený v Národnom ústave pre Biologické vedy a humánne technológie Agentúry pre priemyselnú vedu a technológiu (National Inštitúte of Bioscience and Human Technology of Agency of Industrial Science and Technology, poštový kód 305, 1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibarakiken, Japan) pod prístupovým číslom FERM P-14690) a prevedený na medzinárodné uloženie podľa Budapeštianskej dohody 29. septembra 1995 s prideleným prístupovým číslom FERM BP-5252.
Mikrobiálny kmeň Escherichia coli, ktorý produkuje L-lyzín sa môže tiež skonštruovať vložením posilnenej DNA, ktorá nesie genetickú informáciu, relevantnú k biosyntéze L-lyzínu, spôsobmi génovej rekombinantnej technológie. Vkladaný gén je z génov, ktoré kódujú pre enzýmy biosyntetickej cesty tvorby L-lyzínu, ako sú aspartokináza, dihydropikolinátová syntetáza, dihydropikolinátová reduktáza, sukcinyldiaminopimelátová transamináza a sukcinyldiaminopimelátová deacyláza. V prípade génu enzýmu, ktorý podlieha spätnej inhibícii L-lyzínom, ako je aspartokináza a dihydropikolinátová syntetáza, treba použiť mutatný typ génu, kódujúceho pre enzým, ktorý je znecitlivený proti uvedenej inhibícii. Na vloženie a posilnenie génu je dostupný spôsob, v ktorom sa gén liguje s vektorom, autonómne replikovateľným v bunkách Escherichia coli, čím sa pripraví rekombinantná DNA, s ktorou sa transformuje Escherichia coli. Voliteľne sa gén môže tiež zabudovať do chromozómu hostiteľa spôsobom, využívajúcim transdukciu, transpozón (Berg, D. E. a Berg, C. M., Bio/Technol. 1, 417 (1983)), Mufág (japonský zverejnený patent číslo 2-109985), alebo homológnu rekombináciu (Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. (1972)).
Ďalšie spôsoby získavania mikroorganizmu, patriaceho k rodu Escherichia s potlačenou funkciou génu, zahŕňajú spôsob vyvolania genetickej mutácie využitím účinku chemického Činidla, ako je N-metyl-N-nitro-N-nitrózoguanidín a kyselina dusitá, alebo ožiarenia ultrafialovým svetlom, radiáciou a podobných spôsobov na bunky mikroorganizmu, patriaceho k rodu Escherichia, ktoré obsahujú uvedený gén.
V ďalej uvedenom príklade sa kmeň Escherichia coli s potlačenou funkciou lyzínovej dekarboxylázy vytvoril deléciou časti jej kódujúcej oblasti a jej nahradením génom odolným proti liečivu, aby sa získal lyzínový dekarboxylázový gén, ktorý sa potom použil na substitúciu lyzínového dekarboxylázového génu na chromozóme Escherichia coli v zhode s opísaným spôsobom, využívajúcim homológnu rekombináciu.
V jednom mikrobiálnom kmeni možno potlačiť expresiu niektorého z lyzínových dekarboxylázových génov, nového génu podľa tohto vynálezu alebo génu cadA. alebo potlačiť expresiu obidvoch uvedených génov. Expresia lyzínového dekarboxylázového génu sa môže potlačiť v mikroorganizme, patriacom k rodu Escherichia, ktorý produkuje L-lyzín, alebo sa môže produkcia L-lyzínu vyvolať u mikroorganizmu, patriacemu k rodu Escherichia, ktorý’ má potlačenú expresiu lyzínového dekarboxylázového génu spôsobom opísaným skôr.
<3> Produkcia L-lyzínu mikroorganizmom, ktorý patrí k rodu Escherichia a ktorý' má potlačenú expresiu lyzínového dekarboxylázového génu
Kultiváciou mikroorganizmu patriaceho k rodu Escherichia, ktorý má potlačenú expresiu lyzínového dekarboxylázového génu a získaného uvedeným spôsobom, sa produkuje významné množstvo L-lyzínu a akumuluje sa v kultivačnom prostredí. Akumulované množstvo L-lyzínu sa zvýšilo iba potlačením expresie známeho cadA génu. Na zvýšenie akumulovaného množstva L-lyzínu je oveľa účinnejšie potlačiť expresiu nového lyzínového dekarboxylázového génu podľa tohto vynálezu. Najpriaznivejšie výsledky produkcie L-lyzínu sa dosiahli použitím mikrobiálneho kmeňa, v ktorom bola potlačená expresia obidvoch génov, génu cadA aj nového génu podľa tohto vynálezu.
Na kultiváciu sa použije kultivačné prostredie, ktoré sa bežne používa, obsahujúce zdroj uhlíka, zdroj dusíka, anorganické ióny a voliteľne ďalšie stopové množstvá organickej mikrovýživy. Ako zdroj uhlíka možno použiť cukry, ako je glukóza, laktóza, galaktóza, fruktóza, a škrobové hydrolyzáty; ďalej možno použiť alkoholy, ako je glycerol a sorbitol; organické kyseliny, ako je kyselina fumarová, kyselina citrónová a kyselina jantárová.
Ako zdroj dusíka možno použiť anorganické soli, ako je síran amónny, chlorid amónny a fosforečnan amónny; organický dusík, ako je sójový hydrolyzát; plynný amoniak a vodný roztok amoniaku. Ako anorganické ióny sa v malých množstvách pridávajú fosforečnan draselný, síran horečnatý, železitý ión, mangánatý ión.
Čo sa týka zdrojov organickej mikrovýživy, vyžaduje sa, aby v dostatočných množstvách obsahovali látky, ako je vitamín B, alebo kvasinkový extrakt alebo podobné látky.
Kultivácia sa výhodne vykonáva v aeróbnych podmienkach počas 16 až 72 hodín. Teplota kultivácie je v priebehu kultivácie výhodne udržiavaná na 30 °C až 45 °C. pH sa v priebehu kultivácie výhodne udržiava na hodnotách 5 až 7. Na udržiavanie pil sa môžu použiť anorganické alebo organické látky, kyslé alebo zásadité látky, alebo plynný amoniak a iné podobné látky.
L-lyzín sa môže od kultúry oddeľovať bežným spôsobom viazaním na ionexovej živici, zrážacím spôsobom a ďalšími známymi spôsobmi.
Prehľad obrázkov na výkresoch
Obr. 1 znázorňuje stavbu plazmidu pUC6F5HH5, obsahujúceho nový lyzínový dekarboxylázový gén.
Obr. 2 znázorňuje stavbu teplotné citlivého plazmidu pTS6F5HH5, obsahujúceho nový lyzínový dekarboxylázový gén a konštrukciu plazmidu pTS6F5HH5Cm, v ktorom časť génu je substituovaná fragmentom, obsahujúcom gén, odolný chloramfenikolu.
Obr. 3 znázorňuje porovnanie aktivity pri rozklade L-lyzínu v kmeni WC196, kotviacom normálny lyzínový dekarboxylázový gén a v kmeňoch WC196C, WC196L a WC196LC s potlačenými génmi lyzínovej dekarboxylázy.
Príklady uskutočnenia vynálezu
Vynález sa podrobnejšie vysvetľuje v ďalšom texte pomocou príkladov.
Príklad 1 (1) Klonovanie nového lyzínového dekarboxylázového génu
Z buniek kmeňa W3110 Escherichia coli K-12 sa bežným spôsobom extrahovala chromozomálna DNA. Uvedený kmeň sa získal z Národného ústavu pre genetiku (National Inštitúte of Genetics, Yata 1111, Mishima-shi, Shizuoka-ken, Japonsko). Ďalej sa syntetizovali dva syntetické DNA priméry, ako sú uvedené v SEQ ID NO: 1 a 2 Zoznamu sekvencií. Syntéza sa vykonala bežným spôsobom na základe nukleotidovej sekvencie génu cadA (pozri SEQ ID NO: 5), opísanej v práci autorov Meng, S. a Bennett, G. N., J. Bacteriol., 174, 2659 (1992). Uvedené priméiy mali sekvencie homológne k 5-koncovej protismemej časti a k 3-koncovej časti cadA génu. Uvedená chromozomálna DNA a priméry DNA sa použili pri PCR, spôsobom podľa Erlicha et al. (PCR Technology, Stockton Press (1989). Získal sa tak fragment DNA o 2,1 kbp, obsahujúci takmer všetky časti génu cadA. Tento fragment sa na prípravu vzorky na hybridizáciu označil pomocou súpravy Random Primer Labeling Kit (vyrábanej firmou Takara Shuzo) a [a-32P]dCTP (vyrábanej firmou Amersham, Japonsko).
Ďalej sa bežným spôsobom (Molecular Cloning, 2. vydanie, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)) vykonala hybridizácia pripravenej vzorky s Escherichia co/í/génovou zobrazovacou membránou (Gene Mapping Membráne, vyrábanou firmou Takara Shuzo). Knižnica Koharu et al. (lambda fágová knižnica chromozomálnej DNA Escherichia coli: pozri Kohara, Y., et al., Celí, 50, 495 až 508 (1987)) sa adsorbovala na Escherichia co/í/génovej zobrazovacej membráne. Po ukončení hybridizácie sa Lambda-fágové klony, ktoré mali podobné sekvencie ako gén cadA, vytrieďovali pomocou zmierňovania podmienok pri premývaní vzorky (2x SSC, 55 °C, 30 minút). Výsledkom bolo úspešné zaznamenanie slabých signálov z troch klonov E2B8, 6F5H a 10F9 popri silných signáloch z klonov, obsahujúcich génovú oblasť cadA (21H11, 5G7). Inzerčné sekvencie uvedených lambda fágových klonov E2B8, 6F5H a 10F9 pokračujú na chromozóme Escherichia coli, kým sa neprekrýva jedna s druhou. Lambda fágová
DNA 6F5H, patriaca do knižnice Koharu et. al. (Kohara, Y. et al., Celí, 50, 495 až 508 (1987)) sa potom bežnými spôsobmi oddelila a digerovala s rôznymi reštrikčnými enzýmami na vykonanie hybridizácie Southemovým prenosom použitím opísanej vzorky podobným spôsobom, ako bol opísaný. Výsledkom bolo zistenie, že vo fragmente o približne 5 kbp, získanom digesciou s HindlII bola prítomná sekvencia podobná génu cadA.
Fragment o približne 5 kbp, získaný digesciou lambda fágovej DNA z 6F5H s HindlII, sa podrobil ligácii s digestom HindlII plazmidu pUC19 (vyrábaný firmou Takara Shuzo) s použitím T4 DNA ligázy. Táto reakčná zmes sa použila na transformáciu Escherichia coli JM109 (vyrábaný firmou Takara Shuzo) na získanie kmeňov rezistentných proti ampicilínu, ktoré rástli na úplnom tuhom médiu (obsahujúcom 10 g polypeptónu, 5 g kvasinkového extraktu a 5 g chloridu sodného v 1 dm3 vody) s prídavkom 50 mg.mľ1 ampicilínu. Z toho sa získal mikrobiálny kmeň, ktorý kotvil plazmid s inzerciou fragmentu o približne 5 kbp, získaný digesciou lambda fágovej DNA z 6F5H s HindlII. Z jeho buniek sa extrahoval plazmid. Tak sa získal plazmid pUC6F5HH5. Na obr. 1 je znázornená stavba plazmidu pUC6F5HH5.
Escherichia coli JM109/pUC6F5HH5, kotviaci tento plazmid sa označil ako AJ13068 a bol uložený 6. decembra 1994 v Národnom ústave pre Biologické vedy a humánne technológie Agentúry pre priemyselnú vedu a technológiu (National Inštitúte of Bioscience and Human Technology of Agency of Industrial Science and Technology, poštový kód 305, 1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibarakiken, Japan) pod prístupovým číslom FERM P-14689) a prevedený na medzinárodné uloženie podľa Budapeštianskej dohody 29. septembra 1995 s prideleným prístupovým číslom FERMBP-5251.
(2) Stanovenie nukleotidovej sekvencie nového lyzínového dekarboxylázového génu
Nukleotidová sekvencia oblasti medzi enzýmovými reštrikčnými miestami Clal a HindlII získaného pUC6F5HH5 sa stanovila spôsobom, opísaným v Molecular Cloning, 2. vydanie, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989). Výsledkom bolo zistenie, že bola kódovaná nukleotidová sekvencia, uvedená v SEQ ID NO: 3. Táto sekvencia DNA obsahuje otvorený čítací rámec, ktorý kóduje pre sekvenciu aminokyselín, uvedenú v SEQ ID NO: 4 zo Zoznamu sekvencií.
(3) Príprava Escherichia coli, ktorá produkuje lyzín
Na ďalšie spracovanie mutáciou sa najprv kultivovali Escherichia coli W3110 pri 37 °C počas 4 hodín v úplnom médiu (obsahujúcom 10 g polypetónu, 5 g kvasinkového extraktu a 5 g chloridu sodného v 1 dm3 vody). Získané mikrobiálne bunky sa podrobili mutácii pri 37 °C počas 30 minút v roztoku N-metyl-N-nitro-N-nitrózoguanidínu s koncentráciou 200 pg.mľ1, premyli a potom sa použili do tuhého minimálneho média (obsahujúceho 7 g hydrogenfosforečnanu disodného, 3 g dihydrogenfosforečnanu draselného, 1 g chloridu amónneho, 0,5 g chloridu sodného, 5 g glukózy, 0,25 g heptahydrátu síranu horečnatého a 15 g agaru v 1 dm3 vody) s prídavkom 5 g.dm3 AEC. Po 48 hodinovej kultivácii pri 37 °C a oddelení kolónií sa získali kmene, odolné proti AEC. Medzi nimi bol aj kmeň WC196, ktorý produkoval L-lyzín. Kmeň WC196 sa označil ako AJ13069 a bol uložený 6. decembra 1994 v Národnom ústave pre Biologické vedy a humánne technológie Agentúry pre priemyselnú vedu a technológiu (National Inštitúte of Bioscience and Human Technology of Agency of Industrial Science and Technology, poštový kód 305, 1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibarakiken, Japan) pod prístupovým číslom FERM P-14690) a prevedený na medzinárodné uloženie podľa Budapeštianskej dohody 29. septembra 1995 s prideleným prístupovým číslom FERM BP-5252.
(4) Vytvorenie kmeňa WC196 s potlačenou funkciou nového lyzinového dekarboxylázového génu
Opísaný fragment o približne 5 kbp, získaný digesciou lambda fágovej DNA 6F5H s HindlII sa podrobil ligácii s digestom HINDIII teplotné citlivého plazmidu pMANO31 (Yasueda, H. et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 36, 211 (1991)) a použitím T4 DNA ligázy. Táto reakčná zmes sa použila na transformáciu Escherichia coli JM109 na kmeň rezistentný proti ampicilínu, ktorá sa vykonala kultiváciou pri 37 °C počas 24 hodín na úplnom tuhom médiu s prídavkom 50 mg.dm'3 ampicilínu. Transformáciou sa získal mikrobiálny kmeň, ktorý kotvil plazmid s vloženým fragmentom o približne 5 kbp, získaným digesciou lambda fágovej DNA z 6F5H s HindlII. Z buniek tohto kmeňa sa extrahoval plazmid, čím sa získal plazmid pTS6F5HH5. Uvedený plazmid pTS6F5HH5 sa digeroval s EcoRV, aby sa odstránil fragment DNA o približne 1 kbp. Ďalej sa na vloženie fragmentu, ktorý má gén odolný proti chloramfenikolu o približne 1 kbp a ktorý sa získal digesciou pHSG399 (vyrábanej firmou Takara Shuzo) s Accl, použila T4 ligáza. Tak sa skonštruoval plazmid pTS6F5HH5Cm. Výsledkom uvedených operácií bola úspešná konštrukcia plazmidu, ktorý má fragment DNA s potlačenou funkciou nového lyzinového dekarboxylázového génu. Na obr. 2 je znázornená stavba plazmidov pTS6F5HH5 a pTS6F5HH5Cm.
Ďalej sa vytvoril kmeň, v ktorom bol nový lyzínový dekarboxylázový gén na chromozóme kmeňa WC196 nahradený fragmentom DNA s potlačenou funkciou z nového dekarboxylázového génu, spôsobom bežnej homológnej rekombinácie (Matsuyama, S. a Mizushima, S., J. Bacteriol., 162, 1196 (1985)) s využitím teplotnej citlivosti plazmidu pTS6F5HH5Cm. Bližšie, kmeň WC196 sa transformoval s plazmidom pTS6F5HH5Cm, čím sa najprv získal kmeň, ktorý' bol odolný proti ampicilínu a odolný proti chloramfenikolu pri 30 °C. Potom sa tento kmeň použil na prípravu kmeňa, ktorý bol odolný proti ampicilínu a odolný proti chloramfenikolu pri 42 °C, Tento kmeň sa ďalej použil na prípravu kmeňa, ktorý’ bol citlivý na ampicilín a odolný proti chloramfenikolu pri 30 °C.
Tak sa získal uvedený kmeň, v ktorom bol lyzínový dekarboxylázový gén na chromozóme kmeňa WC196 nahradený fragmentom DNA s potlačenou funkciou nového lyzinového dekarboxylázového génu. Tento kmeň sa označil ako kmeň WC196L.
(5) Vytvorenie kmeňa WC196 a kmeňa WC196L s deficitným génom cadA
Escherichia coli, v ktorom je potlačený dekarboxylázový gén cadA. je známy vrátane napríklad kmeňa GNB10181, pochádzajúceho z kmeňa K-12 Escherichia coli (pozri Auger, E. A. et al., Mol. Microbiol. 3, 609 (1989); tento mikrobiálny kmeň je dostupný napríklad z Genetického úložného strediska E. coli (E. coli Genetic Stock Center, Connecticut, USA). Zistilo sa, že oblasť génu cadA tohto kmeňa je deficitná. Tento znak cadA génovej deficitnej oblasti génu GNB10181 sa transdukoval do kmeňa WC196 bežným spôsobom s použitím fága Pl (A Short
Course in Bacterial Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1992)), čím sa vytvoril kmeň WC196C. Deficit v cadA génovej oblasti kmeňa WC196 sa potvrdil Soutbernovým hybridizačným prenosom. Ďalej sa ešte vytvoril kmeň WC196LC s deficitom v oblasti cadA génu, z kmeňa WC196L podobným spôsobom, ako bol opísaný.
Príklad 2 (1) Potvrdenie vplyvu kmeňov WC196, WC196C, WC196L a WC196LC na rozkladnú reakciu L-lyzínu
Štyri uvedené vytvorené kmene sa kultivovali pri 37 °C počas 17 hodín s použitím média na produkciu L-lyzínu (ktoré obsahovalo 40 g glukózy, 16 g síranu amónneho, 1 g dihydrogenfosforečnanu draselného, 2 g kvasinkového extraktu, 10 mg tetra- až pentahydrátu síranu manganatého a 10 mg heptahydrátu síranu železnatého v 1 dm3 vody; pH sa nastavilo na hodnotu 7,0 pomocou hydroxidu draselného a potom sa pridalo 30 g osobitne sterilizovaného uhličitanu vápenatého). Získané mikrobiálne bunky' sa dvakrát premyli fyziologickým soľným roztokom, suspendovali v prostredí na skúšanie rozkladnej reakcie L-lyzínu (ktoré obsahovalo 17 g dodekahydrátu hydrogenfosforečnanu disodného, 3 g dihydrogenfosforečnanu draselného, 0,5 g chloridu sodného a 10 g hydrochloridu L-lyzínu v 1 dm3 vody) a kultivovali sa pri 37 °C počas 31 hodín.
Na obr. 3 je znázornená závislosť množstva L-lyzínu, ostávajúceho v kultivačných kvapalinách od doby kultivácie. Množstvo L-lyzínu sa stanovovalo kvantitatívne s použitím analyzátora Biotech Analyzer AS-210 (vyrábaného firmou Asahi Chemical Industry). Významný rozklad L-lyzínu sa pozoroval u kmeňa WC196. Rozklad bol trocha potlačený u kmeňa WC196C s deficitom v oblasti cadA génu, ako známeho L-lyzínového dekarboxylázového génu. Rozklad L-lyzínu sa však nezistil u kmeňov WC196L a WC196LC, ktoré mali potlačenú funkciu nového lyzínového dekarboxylázového génu. Množstvo L-lyzínu, ktoré zostávalo v kultivačnej kvapaline sa znižovalo v časovom intervale do troch hodín kultivácie u všetkých mikrobiálnych kmeňov. Tento jav bol však spôsobený zabudovávaním L-lyzínu do mikrobiálnych buniek a nebol spôsobený rozkladom L-lyzínu.
(2) Produkcia L-lyzínu kmeňmi WC196, WC196C, WC196L a WC196LC
Štyri opísané kmene sa kultivovali pri 37 °C počas 20 hodín v prostredí vhodnom na produkciu lyzínu, uvedenom skôr. V kultivačnej tekutine sa stanovovali vyprodukované a akumulované množstvá L-lyzínu a kadaverínu. Množstvo L-lyzínu sa kvantitatívne stanovilo použitím zariadenia Biotech Analyzer AS-210, opísanom skôr. Množstvo kadaverínu sa kvantitatívne stanovilo použitím vysokoúčinnej kvapalinovej chromatografie.
Výsledky sú uvedené v tabuľke 1. V kmeni WC196C s potlačeným génom cadA sa v porovnaní s kmeňom WC196 zvýšila akumulácia L-lyzínu a znížila sa akumulácia kadaverínu ako rozkladného produktu L-lyzínu. Rovnako sa zaznamenal rozdiel medzi kmeňom WC196L s potlačenou funkciou nového lyzinového dekarboxylázového génu v porovnaní s kmeňmi WC196 a WC196C. Akumulácia L-lyzínu sa ďalej zvýšila a akumulácia kadaverínu ako rozkladného produktu L-lyzínu sa vôbec nezaznamenala v kmeni WC196LC s potlačenou funkciou obidvoch lyzínových dekarboxy lazových génov.
Tabuľka 1
Mikrobiálny kmeň Akumulácia L-lyzínu (g.dm'3) Akumulácia kadaverínu (g.dm-3)
UC196 1,4 0,6
VC196C 1,9 0,4
VC196L 2,3 0,1
VC196LC 3.3 nedokázaná
Príklad 3
Na získanie kmeňa, rezistentného proti ampicilínu sa kmeň WC196LC Escherichia coli s potlačenou rozkladnou účinnosťou proti L-lyzínu transformoval plazmidom pUC6F5HH5, obsahujúcom novy- lyzínový dekarboxylázový gén. Kmeň WC196LC a kmeň WC196LC/pUC6F5HH5 sa kultivovali pri 37 °C počas 16 hodín v prostredí vhodnom na produkciu lyzínu s prídavkom 5 g.dm3 L-lyzínu a stanovovalo sa množstvo vytvoreného kadaverínu.
Výsledky sú uvedené v tabuľke 2. Kmeň WC196LC nespôsobil premenu L-lyzínu na kadavcrín, zatiaľ čo kmeň WC196LC/pUC6F5HH5 mal schopnosť konvertovať L-lyzin na kadaverín.
Tabuľka 2
Mikrobiálny Vyprodukované množstvo
kmeň kadaverínu (g.dm J)
VC196LC nedokázané
VC196LC/pUC6F5HH5 0,95
Priemyselná využiteľnosť
Nový lyzínový dekarboxylázový gén podľa tohto vynálezu sa zúčastňuje na rozklade L-lyzínu v Escherichia coli. L-lyzín sa môže vyrábať nenákladným a hospodárnym spôsobom kultivácie baktérií, patriacich k rodu Escherichia, ktorc produkujú L-lyzín a majú potlačenú expresiu uvedeného génu a/alebo génu cadA.
Zoznam sekvencií (1) Všeobecné informácie (i) Prihlasovateľ: Ajinomoto Co., Inc.
(ii) Názov vynálezu: Nový lyzínový dekarboxylázový gén a spôsob výroby L-lyzínu (iii) Počet sekvencií: 6 (iv) Adresa pre korešpondenciu:
(A) Adresát:
(B) Ulica:
(C) Mesto:
(D) Krajina:
(E) ZIP:
(v) Počítačom čitateľný tvar:
(A) Druh média: pružný disk (B) Počítač: IBM PC kompatibilný (C) Operačný systém: PC-DOS/MS-DOS (D) Softvér: FastSEQ Version 1.5 (vi) Údaje o tejto prihláške (A) Číslo prihlášky:
(B) Dátum podania:
(C) Zatriedenie:
(vii) Údaje o predchádzajúcej prihláške:
(A) Číslo prihlášky:
(B) Dátum podania:
(viii) Informácia o právnom zástupcovi:
(A) Meno:
(B) Registračné číslo:
(ix) Telekomunikačné informácie:
(A) Telefón:
(B) Telefax:
(2) Údaje o SEQ ID NO: 1 (1) Charakteristika sekvencie (A) DÍžka: 20 párov báz (B) Druh: nukleová kyselina (C) Vláknitosť: jednovláknová (D) Topológia: lineárna (ii) Molekuíový typ: iná nukleová kyselina (A) Opis: /dese = „Synthetic DNA“ (iii) Hypotetická: nie (iv) Anti-sense: áno (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 1:
TGGATAACCA CACCGCGTCT 20 (2) Údaje o SEQ IDNO:2 (1) Charakteristika sekvencie (A) Dĺžka: 20 párov báz (B) Druh: nukleová kyselina (C) Vláknitosť: jednovláknová (D) Topológia: lineárna (ii) Molekulový typ: iná nukleová kyselina (A) Opis: /dese = „Synthetic DNA“ (iii) Hypotetická: nie (iv) Anti-sense: áno (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 2:
GGAAGGATCA TATTGGCGTT 20 (2) Údaje o SEQ ID NO: 3 (i) Charakteristika sekvencie (A) Dĺžka: 3269 párov báz (B) Druh: nukleová kyselina (C) Vláknitosť: dvoj vláknová (D) Topológia: lineárna (ii) Molekulový typ: genómová DNA (iii) Hypotetická: nie (iV) Anti-sense: nie (vi) Pôvodný zdroj:
(A) Organizmus: Escherichia coli (B) Kmeň: W3110 (ix) Znak:
(A) Meno/kľúč: CDS (B) Lokácia: 1005 až 3143 (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 3:
ATCGATTCTC T5ACTGCGGT TAGCCGTCAG GXAGTGCATC GľCTGCGTGA AAMAGCGTA GGTGCäTGGC AfiATTGCGCA ACTGGCACGC GTTCGCCTGG CATTTGATGA ATTTGACGAA AAAGCTATCG TCGGTGGTAT CGCCCGTCTC CAAAMGGTC GTGAAACCAA AGAAAAAMT GGTTACCGCA AAGCACTGCG TCTGATGCAA ACCTTIATC6 ACACCCCGGG SCCTTATCCT GAAGCCATTG CACGCAACCT GCGTGAAATG GTTATCGGTG AAGGTGGTTC TGGCGGTGCG ATGCTGCAAT ACAGCACCTA TTCCGTTATC AAGAGCGCCG ACAAAGCČCC GCTGGCGGCT AAAGAACTGA AACTGATCGA GTCCATCATC CCGGAAGCGA TGGCGGCATC GľTGAAAGCG GTGTTAAGCA CTGAAGATM AAAAAATCGT GCGTAATTCG CAAAAGTTCT GAAAAAGGGT TTTGAGCAGG CTATGATTAA GGAAGGAT1T
GATGAGAAAC TGGATATTAA CATCGATGAA€0
GAACTGACAC GTAAAATCTT CGCCGATCTC120
CATCCACÄGC GŤCCTTATAC CCTGGATTAC180
CTGGCTGGCG ACCGCGCGTA TGCAGACGAT240
GATGGTCGTC CGGTGATGAT CATTGGTCAT300
CGCCGTAACT TTGGTATGCC AGCGCCAGAA360
ATGGCTGAAC GCTTTAAGAT GCCTATCATC420
GGCGTGSGCG CAGAAGAQCG TGGTCAGTCT480
TCTCGCCTCG GCGTACCGGT AGTTTGTACG540
CTGGCGAMG GCGTGGGCGA TAAAGTGAA?600
TCGCCGGAAG GTTGTGCGTC CAITCTGTGG660
GAAGCGATGG GTATCMTGC ICCGCGTCTG720
CCGGAACCAC TGGGTGGTGC TCACCGTAAC780
CAACTGCTGG CGGATCTGGC CGATCfCGAC840
CGTTATCAGC GCCTGATGAG CTACGGTTAC900
CACTTCGGTG GCCCTJtTTT ATCGCCACGG960
TCCAGGAGGA ACAC MG AAC ATC ATT 1016
Met Asn 11« Íle
GCC ATT ATG SGA CCG CAT GGC GTC TTT TAT AAA GAT GAG CCC ATC AAA 1064
Ala íle Met Gly Pro Hls Gly Val Phe Tyr lys Asp Glu Pro íle Lya
5 10 15 20
GAA CTG GAG TCG GCG CTG GTG GCG CAA GGC TTT CAG ATT ATC TGG CCA 1112
Glu Leu Glu Ser Ala Leu Val Ala Gin Gly Phe Gin íle íle Trp Pio
3035
CAA AAC AGC GTT GAT TTG CTG AAA TTT ATC GAG CAT AAC CCT CGA ATT1160
Gin Aen Ser Val Asp Leu Leu Lys Phe tie Glu Hls Asn Pro Argíle
15SO
TGC GGC GTG ATT TTT GAC TGG GAT GAG TAC AGT CTC GAT TTA TGT AGC1208
Cys Gly Val íle Phe Asp Trp Asp Glu Tyr Ser Leu Asp Leu CysSer
6065
GAT ATC AAT CAG CTT AAT GAA TAT CTC CCG CTT TAT GCC TTC ATC AAC 125«
Asp Ila Asn Gin Leu Asn Glu Tyr Leu Pro Leu Tyr Ala Phe íle Asn
70 75 80
ACC CAC TCG ACG ATG GAT GTC AGC GTG CAG GAT ATG CGG ATG GCG C7C 1304
Thr His Ser Thr Met Asp Val Ser Val Gin Asp Met Arg Met Ala Leu
95 90 9S 100
TGG TTT TTT GAA TAT GCG CTG GGG CAG GCG GAA GAT ATC CCC ATT CGT 1352
Trp Phe Phe Glu Tyr Ala Leu Gly Gin Ala Glu Asp 11« Ala íle Arg
105 11Q 115
ATG CGT CAG TAC ACC GAC GAA TAT CTT GAT AAC ATT ACA CCG CCG TTC 1400
Met Arg Gin Tyr Thr Asp Glu Tyr Leu Asp Asn íle Thr Pro Pro Phe
L20 12S 130
ACG AAA GCC TTG TTT ACC TAC GTC AAA GAG CGG AAG TAC ACC TTT TGT 1446
Thr Lys Ala Leu Phe Thr Tyr Val Lys Glu Arg Lys Tyr Thr Phe cys
135 140 145
ACG CCG GGG CAT ATG GGC GGC ACC GCA TAT CAA AAA AGC CCG GTT GGC 1496
Thr Pro Gly MÍS Met Gly Gly Thr Ala Tyr Gin Lys Ser Pro val Gly
150 155 160
TGT CTG TTT ΓΑΤ GAT TTT TTC GGC GGG AAT ACT CTT MG GCT GAT GTC 1544
Cys Leu Phe Tyr Asp Phe Phe Gly Gly Asn Thr Leu Lys Ala Asp Val
165 170 175 160
TCT ATT TCG GTC ACC GAG CTT GGT TCG TTG CTC GAC CAC ACC GGG CCA . 1592
ser íle Ser Val Thr Glu Leu Gly Ser Leu Leu Asp His Thr Gly Pro
195 190 195
CAC CTG GAA GCG GAA GAG TAC ATC GCG CGG ACT TTT GGC GCG GAA CAG 1640
His Leu Glu Ala Glu GLU Tyr 118 Ala Arg Thr Phe Gly Ala Glu Gin
200 205 210
AGT TAT ATC GTT ACC AAC GGA ACA TCS ACG TCG AAC AAA ATT GTG GGT 1688
Ser Tyr íle Val Thr Asn Gly Thr ser Thr Ser Asn Lys íle Val Gly
215 220 225
ATG TAC GCC GCG CCA TCC GGC AGT ACG CTG TTG ATC GAC CGC AAI TGT 1736
Met Tyr Ala Ala Pro Ser Gly Ser Thr Leu Leu 11« Asp Arg Asn cys
230 235 240
CAT AAA TCG CTG GCG •CAT CTG TTG ATG ATG AAC GAT GTA GTG CCA GTC 1784
Hls Lys Ser Leu Ala His Leu Leu Met Met Asn Asp Val Val Pro Val
245 250 25$ 260
TGG CTG AAA CCG ACG CGT AAT GCG TTG GGG ATT CTT GGT GGG ATC CCG 1832
Trp Leu Lys Pro Thr Arg Asn Ala Leu Gly 11« Leu Gly Gly íle Pro
265 270 275
CGC CGT GAA TTT ACT CGC GAC AGC ATC GAA GAG AAA GTC GCT GCT ACC 1880
Arg Arg G1U Phe Thr Arg Asp Ser íle G1U Glu Lys Val A) a Ala Thr
280 285 290
ACG CAA GCA CAA TGG CCG GTT CAT GCG GTG ATC ACC AAC TCC ACC TAT 1926
Thr Gin Ala Gin Trp Pro Val His Ala Val Tie Thr Asn Ser Thr Tyr
295 300 305
GAT GGC TTG CTC TAC AAC ACC GAC TGG ATC AAA CAG ACG CTG GAT GTC 1976
Asp Gly Leu Leu Tyr Asn Thr Asp Trp íle Lys Gin Thr Leu Asp Val
310 315 320
CCG TCG ATT CAC TTC GAT TCT GCC TGG GTG CCG TAC ACC CAT TTT CAT 2024
?ra Ser íle His Phe Asp Ser Ala Trp Val Pro Tyr Thr His Phe HÍS
325 330 335 340
CCG ATC TAC CAG GGT AAA AGT GGT ATG AGC GGC GAG CGT GTT GCG GGA 2072
Pro íle Tyr Gin Gly Lys Ser Gly Met Ser Gly Glu Arg Val Ala Gly
345 350 355
AAA GTG ATC TTC GAA ACG CAA TCS ACC CAC AAA ATG CTG GCG GCG TTA 2120
Lys Val 11« Phe Glu Thr Gin Ser Thr His Ly· Met Leu Ala Ala Leu
350 365 370
TCG CAG GCT TCG CTG ATC CAC ATT AAA GGC GAG TAT GAC GAA GAG GCC 2168
Ser Gin Ala Ser Leu íle His íle Lys Gly Glu Tyr Asp Glu Glu Ala
375 380 385
TTT AAC GAA GCC TTT ATG ATG CAT ACC ACC ACC TCG CCC AGT TAT CCC 2216
Phe Asn Glu Ala Phe Met Met His Thr Thr Thr Ser Pro Ser Tyr Pre
390 395 400
ATT GTT GCT TCG GTT GAG ACG GCG GCG GCG ATG CTG CGT GGT AAT. CCG 2264
11« Val Ala Ser Val Glu Thr Ala Ala Ala Met Leu Arg Gly Asn Pro
405 410 415 420
GGC AAA CGG CTG ATT AAC CGT TCA GTA GAA CGA GCT CTG CAT TTT CGC 2312
Gly Lys Arg Leu íle Asn Arg Ser Val Glu Arg Ala Leu His Phe Arg
425 430 435
AAA GAG GTC CAG CGG CTG CGG GAA GAG TCT GAC GGT TGG TTT TTC GAT 2360
Lys Glu Val Gin Arg Leu Arg Glu Glu Ser Asp Gly Trp Phe Phe Asp
440 445 450
ATC TGG CAA CCG CCG CAG GTG GAT GAA GCC GAA TGC TGG CCC GTT GCG : 2408
11« Trp Gin Pro Pro Gin Val Asp Glu Ala Glu Cys Trp Pro val Ala
455 460 465
CCT GGC GAA CAG TGG CAC GGC TTT AAC GAT GCG GAT GCC GAT CAT ATG 2456
Pro Gly G1U Gin Trp HÍS Gly Phe Asn Asp Ala Aap Ala Asp His Met
470 475 480
TTT CTC GAT CCG GTT AAA GTC ACT ATT TTG ACA CCG GGG ATG GAC GAG 2504
Phe Leu Asp Pro Val Lys Val Thr íle Leu Thr Pre Gly Met Asp Glu
«85 490 495 50«
CAG GGC AAT ATG AGC GAG GAG GGG ATC CCG GCG GCG CTG GTA GCA AAA 2552
Gin Gly Asn Mat Set Glu G1U Gly íle Pro Ala Ala Leu Val Ala Lys
505 510 515
TTC CTC GAC GAA CGT GGG ATC GTA GTA CAG AAA ACC GGC CCT TAT AAC 2600
Phe Leu Asp Glu Arg Gly íle Val Val Glu Lys Thr Gly Pro Tyr Asn
SŽO $25 530
CTG CTG TTT CTC TTT AGT ATT GGC ATC GAT AAA ACC AAA GCA ATG GGA 264«
Leu Leu Phe Leu Phe Ser íle Gly íle ASp Ly» Thr Lys Ala Met Gly
535 $40 54$
TTA TTG CGT GGG TTG ACG GAA TTC AAA CGC TCT TAC GAT CTC AAC CTG 2696
Leu Leu Arg Gly Leu Thr Glu Phe Lys Arg Ser Tyr Asp Leu Asn Leu
5SD 555 560
CGG ATC AAA AAT ATG CTA CCC GAT CTC TAT GCA GAA GAT CCC GAT TTC 2744
Arg íle Lys Asn Met Leu Pro Asp Leu Tyr Ala Glu Asp Pro Asp Phe
565 570 575 580
TAC CGC AAT ATG CGT ATT CAG GAT CTG GCA CAA GGG ATC CAT AAG CTG 2792
Tyr Arg Asn Met Arg íle Gin Asp Leu Ala Gin Gly íle His Lys Leu
585 590 595
ATT CGT AAA CAC GAT CTT CCC GGT TTG ATG TTG CGG GCA TTC GAT ACT 2840
íle Arg Lye His Asp Leu Pro Gly Leu Met Leu Arg Ala Phe Asp Thr
600 605 610
TTG CCG GAG ATG ATC ATG ACG CCA CAT CAG GCA TGG CAA CGA CAA ATT 2888
Leu Pro Glu Met íle Het Thr Pro Hla Sln Ala Trp Gin Arg Gin Tie
«15 620 625
AAA GGC GAA GTA GAA ACC ATT GCG CTG GAA CAA CTG GTC GGT AGA GTA 293«
Lys Gly Glu Val G1U Thr íle Ala Leu Glu Gin Leu Val Gly Arg val
630 «35 640
TCG GCA AAT ATG ATC CTG CCT TAT CCA CCG GGC GTA CCG CTG TTG ATC 2984
Ser Ala Asn Mat íle' Leu Pro Tyr Pro Pro Gly Val Pro Leu Leu Met
645 650 «55 ««0
CCT GGA CAA ATG CTG ACC AAA GAG AGC CGC ACA GTA CTC GAT TTT CTA 3032
Pro Gly Glu Met Leu Thr Lys G1U Ser Arg Thr Val Leu Asp Phe Leu
6£S 670 «75
CTG ATG CTT TGT TCC GTC GGG CAA CAT TAC CCC GGT TTT GAA ACG GAT 3080
Leu Mtt Leu Cys Ser Val Gly Gin His ryr Pro Gly Phe Glu Thr Aap
600 685 690
ATT CAC GGC GCG AAA CAG GAC GAA GAC GCC GTT TAC CGC GTA CGA GTC 3128
íle Hla Gly Ala Ly» Gin Asp Glu Asp Gly Val Tyr Arg Val Arg Val
69S 700 705
CTA AAA ATG GCG GGA TAACTTGCCA GAGCGGCTTC CGGGCGAGTA ACGTTCTGTT 3163 Leu Lys Met Ala Gly
710
AACAAATAAA GGAGACGTTA TGCTGGGTTT AAAACAGGTT CACCATATTG CGATTATTGC 3243 GACGGATTAT GCGGTGAGCA AAGCTT 3269
2) Údaje o sekvencií SEQ ID NO: 4:
(i) Charakteristika sekvencie:
(A) Dĺžka: 713 aminokyselín (B) Druh: aminokyselina (D) Topológia: lineárna (ii) Molekulový typ: proteín (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 4:
Met Asn 11« íle Ala íle Met Gly Pro His Gly Val Phe Tyr Lys Asp
1 5 10 15
Glu Pro 11« Lys Glu Leu Glu Ser Ala Leu Val Ala Gin Gly Phe Gin
20 25 30
íle íle Trp Pro Gin Asn Ser val Asp Leu Leu Lys Phe Íle Glu His
35 40 «5
Asn Pro Arg 11« Cys Gly Val íle Phe Asp Trp Asp Glu Tyr Ser Leu
50 55 60
Asp Leu Cys Ser Asp 11« Asn Gin Leu Asn Glu Tyr Leu Pro Leu Tyr
65 70 75. 80
Ala Phe íle Asn Thr His Ser Thr Met Asp Val Ser Val Gin Asp Met
85 90 95
Arg Met Ala Leu Trp Phe Phe Glu Tyr Ala Leu Gly Gin Ala Glu Asp
100 105 110
íle Ala íle Arg Met Arg Gin Tyr Thr Asp Glu Tyr Leu Asp Asn íle
115 120 125
Thr Pro Pro Phe Thr Lys Ala Leu Phe Thr Tyr Val Lys Glu Arg Lys
130 L3S 140
Tyr Thr Phe Cys Thr Pro Gly His Met Gly Gly Thr Ala Tyr Gin Lys
145 150 155 160
Ser Pro Val Gly Cys Leu Phe Tyr Asp Phe Phe Gly Gly Asn Thr Leu
165 170 175
Lys Ala Asp val Ser íle ser Val Thr Glu Leu Gly Ser Leu Leu Asp
180 185 190
His Thr Gly Pro His Leu Glu Ala Glu Glu Tyr íle Ala Arg Thr Phe
195 200 205
Gly Ala Glu Gin Ser Tyr íle Val Thr Asn Gly Thr Ser Thr Ser Asn
210 215 220
Lys íle Val Gly Met Tyr Ala Ala Pro Ser Gly Ser Thr Leu Leu íle
225 230 235 240
Asp Arg Asn Cys His Lya Ser Leu Ala His Leu Leu Met Met Asn Asp
245 250 255
Val Val Pro Val Trp Leu Lys Pro Thr Arg Asn Ala Leu Gly íle Leu
260 265 270
Gly Gly íle Pro Arg Arg Glu Phe Thr Arg Asp Ser íle Glu Glu Lys
275 280 285
Val Ala Ala Thr Thr Gin Ala Gin Trp Pre Val His Ala Val íle Thr
290 295 300
Asn Ser Thr Tyr Asp Gly Leu Leu Tyr Asn Thr Asp Trp íle Lys Gin
305 310 315 320
Thr Leu Aap Val Pro Ser íle His Phe Asp Ser Ala Trp Val Pro Tyr
325 330 335
Thr His Phe His Pro Tie Tyr Gin Gly Lys Ser Gly Met Ser Gly Glu
340 345 350
Arg Val Ala Gly Lys Val íle Phe Glu Thr Gin ser Thr His Lys Met
355 360 365
Leu Ala Ala Leu Ser Gin Ala Ser Leu íle His íle Lys Gly Glu Tyr
370 375 3Ô0
Asp Glu Glu Ala Phe Asn Glu Ala Phe Met Net His Thr Thr Thr Ser
385 390 395 400
Pro Ser Tyr Pro íle Val Ala ser val Glu Thr Ala Ala Ala Met Leu
405 410 415
Arg Gly Asn Pro Gly Lys Arg Leu íle Asn Arg Ser Val Glu Arg Ala
420 425 430
Leu His Phe Arg Lys Glu val Gin Arg Leu Arg Glu Glu Ser Asp Gly
435 440 H5
Trp Phe Phe Asp íle Trp Gin Pro Pro Gin val ÄSp Glu Ala Glu Cys
450 455 460
Trp Pro Val Ala Pro Gly Glu Gin Trp His Gly Phe Asn Asp Ala Asp
465 470 475 480
Ala Asp His Met Phe Leu Asp· Pro Val Lys Val Thr íle Leu Thr Pro
485 490 495
Gly Met Asp G1U Gin Gly Asn Met Ser Glu Glu Gly íle Pro Ala Ala
500 SOS 510
Leu Val Ala Lys Phe Leu Asp Glu Arg Gly íle Val Val Glu Lys Thr
515 520 925
Gly Pro Tyr Asn Leu Leu Phe Leu Phe Ser íle Gly Tie Asp Lys Thr
530 535 540
Lys Ala Met Gly Leu Leu Arg Gly Leu Thr Glu phe Lys Arg ser Tyr
54S 550 555 560
Asp Leu Asn Leu Arg íle Lys Asn Met Leu Pro Asp Leu Tyr Ala Glu
565 570 575
Asp Pro Asp Phe Tyr Arg Asn Met Arg íle Gin Asp Leu Ala Gin Gly
580 585 590
íle His Lys Leu íle Arg Lys His Asp Leu Pro Gly Leu Mat Leu Arg
595 600 605
Ala Phe Asp Thr· Leu Pro Glu Met íle Met Thr Pro His Gin Ala Trp
610 615 620
Gin Arg Gin íle Lya Gly Glu Val Glu Thr Xl« Ala Leu Glu Gin Leu
625 630 635 640
Val Gly Arg Val Ser Ala Asn Met íle Leu Pro Tyr Pro Pro Gly Val
645 650 655
Pro Leu Leu Het Pro Gly Glu Met Leu Thr Lys Glu Ser Arg Thr val
660 665 670
Leu Asp Phe Leu Leu Met Leu Cys ser Val Gly Gin His Tyr Pre Gly
675 680 685
Phe Glu Thr Asp íle His Gly Ala Lys Gin Asp Glu Asp Gly Val Tyr
690 695 700
Arg Val Arg val Leu Lys Met Ala Gly
705 710
TAT ACT TTC ! TGT ' ACT 1 CCT • GGT CAC : ÄfG : GGC : GGT 1 ACT GCA . TTC CAG AAA 480
Tyr Thr Phe i Cys . Thr Pro Gly His Met . Gly < Gly ’ Thr Ala Phe Gin Lys
145 150 155 160
AGC CCG GTA l GGT 1 AGC : CTG TTC TAT GAT TTC : TTT GGT CCG AAT ACC ATG 528
Ser Pro Val Gly Ser Leu Phe Tyr Asp Phe Phe Gly Pro Asn rhr Het
165 170 17 5
AAA TCT GAT ATT TCC ΑΤΓ TCA GTA TCT GAA . CTG GGT TCT CTG CTG GAT 576
Lys Ser Asp íle ser íle ser vai sex Glu . Leu Gly Ser Leu Leu Asp
180 185 190
CAC AGT GGT CCA CAC AAA GAA GCA GAA CAG TAT ATC GCT CGC GTC TTT 624
Hi· ser Gly Pro Hi· Lya Glu Ala Glu Gin Tyr lle Ale Arg Val Phe
195 200 205
AAC GCA GAC CGC AGC TAC ATG GTG ACC AAC GGT ACT TCC ACT GCG AAC 672
Asn Ala Asp Arg Ser Tyr Met Val Thr Aan Gly Thr Ser Thr Ala Asn
210 215 220
AAA ATT GTT GGT ATG TAC tct GCT CCA GCA GGC AGC ACC ATT CTG ATT 720
Lys íle Val Gly Met Tyr Ser Ala Pro Ala Gly Sex Thr íle Leu íle
225 230 235 240
GAC CGT AAC TGC CAC AAA TCG CTG ACC CAC CTG ATG ATG ATG AGC GAT 768
Asp Arg Asn Cys HÍS Lys Ser Leu Thr Kis Leu Met Met Met Ser Aap
245 250 255
GTT ACG CCA ATC TAT TTC CGC CCG ACC CGT AAC GCT TAC GCT ATT CTT B16
Val Thr Pro íle Tyr Phe Arg Pre Thr Arg Asn Ala Tyr Gly íle Leu
260 265 270
GGT GGT ATC CCA CAG AGT GAA TTC CAG CAC GCT ACC ATT GCT AAG CGC 864
Gly Gly íle Pre Gin Ser Glu Phe Gin His Ala Thr íle Ala Lya Arg
275 280 285
GTG AAA GAA ACA CCA AAC GCA ACC TGG CCG GTA CAT GCT GTA ATT ACC 912
Val Lys GlU Thr Pre Asn Ala Thr Trp Pro Val His AU Val íle Thr
290 295 300
AAC TCT ACC TAT GAT GGT CTG CTG TAC AAC ACC GAC TTC ATC AAG AAA 960
Asn Ser Thr Tyr Asp Gly Leu Leu Tyr Asn Thr· Asp Phe íle Lys tys
305 310 319 320
ACA CTG GAT GTG AAA TCC ATC CAC TTT GAC TCC GCG TGG GTG CCT TAC 1008
Thr Leu Asp Val Lys Ser íle His Phe Asp Ser Ala Trp Val Pro Tyr
325 330 335
ACC AAC TTC TCA CCG ATT TAC GAA GGT AAA TGC GG7 ATG AGC GGT GGC 1056
Thr Asn Phe Ser Pro íle Tyr Glu Gly Lys Cys Gly Met Set Gly Gly
340 345 350
CGT GTA GAA GGG AM GTG ATT TAC GAA ACC CAG TCC ACT CAC AAA CTG 1104
Arg Val Glu Gly Lys Val íle Tyr Glu Thr Gin Ser Thr His Lys Leu
355 360 365
CTG GCG GCG TTC TCT CAG GCT TCC ATG ATC CAC GTT AAA GGT GAC GTA 1152
Leu Ala Ala Phe Ser Gin Ala Ser Met íle HU Val Lys Gly Asp Val
370 375 380
AAC GAA GAA ACC TTT AAC GAA GCC TAC ATG ATG CAC ACC ACC ACT TCT 1200
Asn G1U G1U Thr Phe Asn Glu Ala Tyr Met Met His Thr Thr Thr Ser
385 390 395 400
CCG CAC TAC GGT ATC GTG GCG TCC ACT GAA ACC GCT GCG GCG . ATG ATG 1248
Pro His Tyx Gly íle val Ala Ser Thr Glu Thr Ala Ala Ala : Met Met
403 410 415
AAA 1 GGC . AAT GCA GGT AAG CGT CTG ATC AAC GGT TCT . ATT GAA 1 CGT GCG 1296
Lys 1 Gly Asn Ala Gly Lys Arg Leu íle Asn Gly Ser íle Glu Arg Ala
420 425 430 (2) Údaje o SEQ ID NO: 5 (i) Charakteristika sekvencie (A) Dĺžka: 2145 párov báz (B) Druh: nukleová kyselina (C) Vláknitosť: dvoj vláknová (D) Topológia: lineárna (ii) Molekulový typ: genómová DNA (iii) Hypotetická: nie (iV) Anti-sense: nie (vi) Pôvodný zdroj:
(A) Organizmus: Escherichia coli (B) Kmeň: CS520 (ix) Znak:
(A) Meno/kľúč: CDS (B) Lokácia: 1 až 2145 (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 5:
ATG AAC GTT ATT GCA •ΛΤΑ TTG AAT CAC ATG GGG GTT TAT TTT AAA GAA 48
Het Asn Val íle Ala íle Leu Asn His Met Gly Val Tyr Phe Lys Glu
1 5 10 15
GAA CCC ATC CGT GAA CTT CAT CGC GCG CTT GAA CGT CTG AAC TTC CAG 96
Glu Pro Ila Arg G1U Leu Kis Arg Ala Leu Glu Arg Leu Asn Phe Gin
20 25 30
ATT GTT TAC CCG AAC GAC CGT GAC GAC TTA TTA AAA CTG ATC GAA AAC 144
íle Val Tyr Pro Asn Asp Arg Asp Asp Leu Leu Lys Leu íle Glu Asn
35 40 45
AAT GCG CGT CTG TGC GGC GTT ATT TTT GAC TGG GAT AAA TAT AAT CTC 192
Asn Ala Arg Leu Cys Gly Val íle Phe Asp Trp Asp Lys Tyr Asn Leu
50 55 60
GAG CTG TGC GAA GAA ATT AGC AAA ATG AAC GAG AAC CTG CCG TTG TAC 240
Leu cys G1U Glu íle ser LyS Met Asn G1U Asn Leu Pro Leu Tyr
65 70 75 80
GCG TTC GCT AAT ACG TAT TCC ACT CTC GAT GTA AGC CTG AAT GAC CTG 288
Ala Phe Ala Asn m r Tyr Ser Thr Leu ASp Val Ser Leu Asn Asp Leu
85 90 95
CGT TTA CAG ATT AGC TTC ttt GAA TAT GCG CTG GGT GCT GCT GAA GAT 336
Arg Leu Gin íle Ser Phe Phe Glu Tyr Ala Leu Gly Ala Ala Glu Asp
100 105 no
ATT GCT AAT AAG ATC AAG CAG ACC ACT GAC GAA TAT ATC AAC ACT ATT 384
Π· Ala Asn Lys Zle Lys Gin Thr Thr Asp Glu Tyr íle Asn Thr íle
115 120 125
CTC CCT CCG CTG ACT AAA GCA CTG TTT AAA TAT GTT CGT GAA GGT AAA 432
Leu Pro Pro Leu Thr Lya Ala Leu Phe Lys Tyr Val Arg Glu Gly Lys
130 135 140
ATC AAA TTC CGT AAA GAG ATC AAA CGT CTG AGA ACG GAA TCT GAT GGC
íle Lys Phe Arg Lys G1U íle Lys Arg Leu Arg Thr Glu Ser Asp Gly
435 440 445
TGG TTC TTT GAT GTA TGG CAG CCG GAT CAT ATC GAT ACG ACT GAA TGC
Trp Phe Phe Asp Val Trp Gin Pro ASp His íle Aap Thr Thr Glu Cys
450 455 460
TGG CCG CTG CGT TCT GAC AGC ACC TGG CAC GGC TTC AAA AAC ATC GAT
Trp Pro Leu Arg Ser Asp Ser Thr Trp His Gly Phe Lys Asn íle Asp
46$ 470 475 4E0
AAC GAG CAC ATG TAT CTT GAC CCG ATC AAA GTC ACC CTG CTG ACT CCG
Aan Glu His Met Tyr Leu Asp Pre íle Lys Val Thr Leu Leu Thr Pro
485 490 495
GGG ATG GAA AAA GAC GGC ACC ATG AGC GAC TTT GGT ATT CCG GCC AGC
Gly Net Glu Lys Asp Gly Thr Met Ser Asp Phe Gly íle Pro Ale Ser
500 505 510
ATC GTG GCG AAA TAC CTC GAC GAA CAT GGC ATC GTT GTT GAG AAA ACC
íle val Ala tys Tyr Leu Asp Glu His Gly íle Val Val Glu Lys Thr
519 520 529
GGT CCG TAT AAC CTG CTG TTC CTG TTC AGC ATC GGT ATC GAT AAG ACC
Gly Ero Tyr Asn Leu Leu Phe Leu Phe ser íle Gly íle Asp Lys Thr
530 535 540
AAA GCA CTG AGC CTG· CTG CGT GCT CTG ACT GAC TTT AAA CGT GCG TTC
Lys Ala Leu Ser Leu Leu Arg Ala Leu Thr Asp Phe Lys Arg Ala Phe
545 550 5S5 560
GAC CTG AAC CTG CGT GTG AAA AAC ATG CTG CCG TCT CTG TAT CGT GAA
Asp Leu Aan Leu Arg Val Lys Asn Met Leu Pro ser Leu Tyr Arg Glu
565 570 575
GAT CCT GAA TTC TAT GAA AAC ATG CGT ATT CAG GAA CTG GCT CAG AAT
Asp Pro GLu Phe Tyr Glu Asn Met Arg íle Gin Glu Leu Ala Gin Asn
$80 585 590
ATC CAC AAA CTG ATT GTT CAC CAC AAT CTG CCG GAT CfG ATG TAT CGC
íle His Lys Leu íle Val Kis His Asn Leu Pro Asp Leu Met Tyr Arg
595 6C0 605
GCA TTT GAA GTG CTG CCG ACG ATG GTA ATG ACT CCG TAT GCT GCA TTC
Al* Ph* Glu V*1 Leu Pro Thr Met Val Met Thr Pro Tyr Ala Ala Phe
610 615 629
CAG AAA GAG CTG CAC GGT ATG ACC GAA GAA GTT TAC CTC GAC GAA ATG
Gin Lys Glu Leu His Gly Met Thr Glu Glu Val Tyr Leu A»P Glu Met
625 630 635 640
GTA GGT CGT ATT AAC GCC AAT ATG ATC CTT CCG TAC CCG CCG GGA GTT
Val Gly Arg íle Asn Al* Asn Met íle Leu Sro Tyr Pro Pro Gly val
645 $50 655
CCT CTG GTA ATG CCG GGT GAA ATG ATC ACC GAA GAA AGC CGT CCG GTT
Pro Leu Val Met Pro Gly Clu Met tie Thr Glu Glu Ser Arg Pro Val
660 665 670
CTG GAG TTC CTG CAG ATG CTG TGT GAA ATC GGC GCT CAC TAT CCG GGC
Leu Glu Phe Leu Gin Met Leu Cya Glu lle Gly Ala His Tyr Pro Gly
675 680 685
TTT GAA ACC CAT ATT CAC GGT GCA TAC CGT CAG GCT GAT GGC CGC TAT
Phe Glu Thr Asp íle His Gly Ala Tyr Arg Gin Ala Aap Gly Arg Tyr
690 695 700
ACC GTT AAG GTA TTG AAA GAA GAA AGC AAA AAA
Thr Val Lys Val Leu Lys Glu Glu Ser Lys tys
705 710 715
1344
1392
1440
1488
1536
1584
1632
1680
1728 1776
1924
1872
1920
1868
016 2064 2112
2145
2) Údaje o sekvencií SEQ ID NO: 6:
(i) Charakteristika sekvencie:
(A) Dĺžka: 715 aminokyselín (B) Druh: aminokyselina (D) Topológia: lineárna (ii) Molekulový typ: proteín (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 6:
Het Asn Val íle Ala íle Leu Asn His Het Gly Val Tyr Phe Lys G1U
1 5 10 15
Glu Pro íle Arg Glu Lau His Arg Ala Leu Glu Arg Leu Asn Phe Gin
20 25 30
íle Val Tyr Pro Asn Asp Arg Asp Asp Leu Leu Lys Leu íle Glu Asn
35 40 45
Asn Ala Arg Leu cys Gly Val Ila Phe Asp Trp Asp Lys Tyr Asn Leu
50 55 60
G1U Leu Cys Glu Glu 11· Ser Lys Met Asn Glu Asn Leu Pro Leu Tyr
65 70 75 80
Ala Phe Ala Asn Thr Tyr Ser Thr Leu Asp Val Ser Leu Asn ASP Leu
85 90 95
Arg Leu Gin íle Ser Phe Phe Glu Tyr Ala Leu Gly Ala Ala Glu ASp
100 105 110
íle Ala Asn Lys íle Lys Gin Thr Thr Asp Glu Tyr íle Asn Thr íle
115 120 125
Leu Pro Pro Leu Thr Lys Ala Leu Phe Lys Tyr Val Arg Glu Gly Ly»
130 135 .1^0
Tyr Thr Phe Cys Thr Pro Gly His Met Gly Gly Thr Ala Phe Gin Lys
145 150 155 160
Ser Pro val Gly Ser Leu Phe Tyr Asp Phe Phe Gly Pro Asn Thr Met
165 170 175
Lys Ser Asp íle Ser íle Ser Val Ser Glu Leu Gly Ser Leu Leu Asp
180 185 190
His Ser Gly Pro His Lys Glu Ala Glu Gin Tyr íle Ala Arg Val Phe
19S 200 203
Asn Ala Asp Arg Ser Tyr Met Val Thr Asn Gly Thr Ser Thr Ala Asn
210 215 220
Lys íle Val Gly Met Tyr ser Ala Pro Ala Gly Ser Thr íle Leu íle
225 230 235 240
Asp Arg Asn Cys His Lys ser Leu Thr His Leu Met Het Het Ser Asp
245 250 255
Val Thr Pro íle Tyr Phe Arg Pro Thr Arg Asn Ala Tyr Gly íle Leu
260 265 270
Gly Gly íle Pro Gin Ser Glu Phe Gin His Ala Thr íle Ala Lys Arg
275 280 285
Val Lys Glu Thr Pro Asn Ala Thr Trp Pro Val His Ala Val íle Thr
290 295 300
Asn Ser Thr Tyr Asp Gly Leu Leu Tyr Asn Thr Asp Phe íle Lys Lys
305 310 315 320
Thr Leu Asp Val Lys Ser Jle His Phe Asp Ser Ala Trp Val pro Tyr
325 330 335
Thr Asn Phe Ser Pro íle Tyr Glu Gly Lys cys Gly Met Ser Gly Gly
340 345 350
Arg Val Glu Gly Lys Val íle Tyr Glu Thr Gin Ser Thr Hia Lys Leu
355 360 365
Leu Ala Ala Phe Ser Gin Ala Ser Met íle His val Lys Gly Asp val
370 375 380
Asn Glu Glu Thr Phe Asn Glu Ala Tyr Het Met His Thr Thr Thr Ser
385 390 395 400
Pro His Tyr Gly íle Val Ala Ser Thr Glu Thr Ala Ala Ala Met Met
405 410 415
Lys Gly Asn Ala Gly Lys Arg Leu íle Asn Gly ser íle Glu Arg Ala
420 425 430
íle Lys Phe Arg Lys Glu íle Lys Arg Leu Arg Thr Glu Ser Asp Gly
435 440 445
Trp Phe Phe Asp Val Trp Gin Pro A*P His íle Asp Thr Thr Glu Cys
450 455 460
Trp Pro Leu Arg Ser Asp Ser Thr Trp His Gly Phe Lys Asn íle Asp
465 470 475 480
Asn Glu His Met Tyr Leu Asp Pro íle Lys Val Thr Leu Leu Thr Pro
435 490 495
Gly Met Glu Lys Asp Gly Thr Met Ser Asp Phe Gly íle Pro Ala Ser
500 505 510
íle Val Ala Lys Tyr Lau Asp Glu His Gly íle Val Val Glu Lys Thr
515 520 525
Gly Pro Tyr Asn Leu Leu Phe Leu Phe Ser íle Gly íle Asp Lys Thr
530 535 540
Lys Ala Leu Ser Leu Leu Arg Ala Leu Thr Asp Phe Lys Arg Ala Phe
545 550 555 560
Asp Leu Asn Leu Arg Val Lys Asn Met Leu Pro Ser Leu Tyr Arg Glu
565 570 575
Asp Pro Glu Phe Tyr Glu Asn Met Arg íle Gin Glu Leu Ala Gin Asn
580 585 590
íle His Lys Leu íle Val His His Asn Leu Pro Asp Leu Met Tyr Arg
5 95 600 605
Ala Phe G1U Val Leu Pro Thr Met Val Het Thr Pro Tyr Ala Ala Phe
610 615 620
Gin Lys Glu Leu' His Gly Met Thr Glu Glu Val Tyr Leu Asp Glu Met
625 630 635 640
Val Gly Arg íle Asn Ala Asn Met íle Leu Pro Tyr Pro Pro Gly Val
645 6S0 655
Pro Leu Val Met Pro Gly Glu Het íle Thr G1U GLu Ser Arg Pro Val
660 665 670
Leu Glu Phe Leu Gin Met Leu Cys Glu íle Gly Ala His Tyr Pro Gly
675 680 685
Phe Glu Thr Asp íle His Gly Ala Tyr Arg Gin Ala Asp Gly Arg Tyr
€90 695 700
Thr Val Lys Val Leu Lys Glu Glu Sex Lys Lys
705 710 715
4. Mikroorganizmus, ktorý’ patrí k rodu Escherichia, ktorý produkuje L-lyzín a má v bunkách zníženú alebo potlačenú dekarboxylázová aktivitu.
5. Mikroorganizmus podľa nároku 4, v ktorom uvedený mikroorganizmus je Escherichia coli.
6. Mikroorganizmus podľa nároku 4, v ktorom je lyzínová dekarboxylázová aktivita v bunkách znížená alebo zamedzená potlačením expresie génu, ktorý je určený niektorým z nárokov 1 až 3 a/alebo génu cadA.
7. Mikroorganizmus podľa nároku 6, v ktorom je expresia uvedeného génu potlačená zničením génu, ktorý je určený niektorým z nárokov 1 až 3 a/alebo génu cadA.
8. Mikroorganizmus podľa nároku 6, v ktorom gén určený niektorým z nárokov 1 až 3 a/alebo gén cadA sú/je zničený substitúciou, deléciou, inzerciou, adíciou, alebo inverziou jedného alebo viacerých nukleotidov v sekvencií alebo sekvenciách nukleotidov.
9. Spôsob výroby L-lyzínu, vyznačujúci sa t ý m , že zahŕňa výrobný krok kultivácie mikroorganizmu, patriaceho k rodu Escherichia, ktorý· produkuje L-lyzín a ktorý má v bunkách zníženú alebo potlačenú aktivitu lyzínovej dekarboxylázy, v tekutom prostredí, umožňujúcom tvorbu a akumuláciu L-lyzínu v kultivačnej tekutine, a výrobný krok oddelenia L-lyzínu.
10. Spôsob podľa nároku 9, vyznačujúci sa t ý m , že lyzínová dekarboxylázová aktivita je znížená alebo zničená potlačením expresie génu, ktorý· je určený niektorým z nárokov 1 až 3 a/alebo génu cadA.

Claims (3)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Gén, ktorý kóduje pre lyzínovú dekarboxylázu a ktorý má sekvenciu aminokyselín uvedenú v SEQ ID NO: 4 zo Zoznamu sekvencií.
  2. 2. Gén podľa nároku 1, pričom uvedený gén má nukleotidovú sekvenciu kodónov od 1005. po 3143. uvedenú v SEQ ID NO: 3.
  3. 3. Gén podľa nároku 1, v ktorom uvedená sekvencia aminokyselín má substitúciu, deléciu, alebo inzerciu jedného alebo viacerých zvyškov aminokyselín bez podstatného poškodenia účinnosti lyzínovej dekarboxylázy.
SK702-97A 1994-12-09 1995-12-05 Gén, ktorý kóduje lyzínovú dekarboxylázu, mikroorganizmus a spôsob výroby L-lyzínu SK283478B6 (sk)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP30638694 1994-12-09
PCT/JP1995/002481 WO1996017930A1 (fr) 1994-12-09 1995-12-05 Nouveau gene de decarboxylase de lysine et procede de production de lysine l

Publications (2)

Publication Number Publication Date
SK70297A3 SK70297A3 (en) 1998-01-14
SK283478B6 true SK283478B6 (sk) 2003-08-05

Family

ID=17956402

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SK702-97A SK283478B6 (sk) 1994-12-09 1995-12-05 Gén, ktorý kóduje lyzínovú dekarboxylázu, mikroorganizmus a spôsob výroby L-lyzínu

Country Status (21)

Country Link
US (1) US5827698A (sk)
EP (1) EP0796912B9 (sk)
JP (1) JP3692538B2 (sk)
KR (1) KR100420743B1 (sk)
CN (2) CN101220366B (sk)
AU (1) AU703308B2 (sk)
BR (1) BR9509896A (sk)
CA (1) CA2207271C (sk)
CZ (1) CZ290070B6 (sk)
DE (1) DE69534801T3 (sk)
DK (1) DK0796912T4 (sk)
ES (1) ES2256850T5 (sk)
HU (1) HU223706B1 (sk)
MX (1) MX9704236A (sk)
MY (1) MY113738A (sk)
PE (1) PE59996A1 (sk)
PL (1) PL182903B1 (sk)
RU (1) RU2188235C2 (sk)
SK (1) SK283478B6 (sk)
WO (1) WO1996017930A1 (sk)
ZA (1) ZA9510442B (sk)

Families Citing this family (118)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1996017930A1 (fr) * 1994-12-09 1996-06-13 Ajinomoto Co., Inc. Nouveau gene de decarboxylase de lysine et procede de production de lysine l
DK1253195T3 (da) * 2000-01-21 2009-01-12 Ajinomoto Kk Fremgangsmåde til fremstilling af L-lysin
EP1484406B1 (en) * 2002-02-28 2016-04-13 Kyowa Hakko Bio Co., Ltd. Process for producing n-acetylneuraminic acid
BR0304860A (pt) * 2002-11-11 2004-08-31 Ajinomoto Kk Método para produzir uma substância alvo pela utilização de uma-bactéria pertencente ao gênero escherichia
DE60335774D1 (de) 2002-11-26 2011-03-03 Ajinomoto Kk Methode für die Produktion von L-Glutamin und L-Glutamin-produzierendes Bakterium
CA2510475A1 (en) * 2002-12-20 2004-07-08 Metanomics Gmbh & Co. Kgaa Method of producing amino acids in transgenic plants comprising expressing a nucleic acid encoding a threonine decomposing protein
JP2004254544A (ja) * 2003-02-25 2004-09-16 Ajinomoto Co Inc 新規リジンデカルボキシラーゼ遺伝子及びｌ−リジンの製造法
EP2818554A3 (en) 2004-10-07 2015-02-11 Ajinomoto Co., Inc. Method for producing a basic substance
RU2004137719A (ru) 2004-12-23 2006-06-10 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) (RU) Способ получения l-аминокислот с использованием бактерий семейства enterobacteriaceae
EP1838726A1 (en) * 2005-01-18 2007-10-03 Ajinomoto Co., Inc. L-amino acid producing microorganism and a method for producing l-amino acid
JP2007185184A (ja) * 2005-12-16 2007-07-26 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸生産菌及びｌ−アミノ酸の製造法
EP1979486B1 (en) 2006-01-30 2013-04-17 Ajinomoto Co., Inc. L-amino acid producing bacterium and method of producing l-amino acid
JP2009095237A (ja) * 2006-02-02 2009-05-07 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸の製造法
JP2009118740A (ja) * 2006-03-03 2009-06-04 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸の製造法
EP2184348B1 (en) 2006-03-23 2013-11-27 Ajinomoto Co., Inc. A method for producing an L-amino acid using bacterium of the Enterobacteriaceae family with attenuated expression of a gene coding for small RNA
JP2009060791A (ja) 2006-03-30 2009-03-26 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸生産菌及びｌ−アミノ酸の製造法
EP2007873B1 (en) 2006-04-18 2015-11-18 Ajinomoto Co., Inc. A METHOD FOR PRODUCING AN L-AMINO ACID USING A BACTERIUM OF THE ENTEROBACTERIACEAE FAMILY WITH ATTENUATED EXPRESSION OF THE sfmACDFH-fimZ CLUSTER OR THE fimZ GENE
JP2009165355A (ja) * 2006-04-28 2009-07-30 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸を生産する微生物及びｌ−アミノ酸の製造法
EP2021458A1 (en) 2006-05-23 2009-02-11 Ajinomoto Co., Inc. A method for producing an l-amino acid using a bacterium of the enterobacteriaceae family
BRPI0715584B8 (pt) * 2006-07-19 2017-02-21 Ajinomoto Kk método para produzir um l-aminoácido
JP2010017081A (ja) * 2006-10-10 2010-01-28 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸の製造法
US20080213305A1 (en) * 2006-12-08 2008-09-04 Martin Levine Vaccine for periodontitis and methods of use
WO2008072761A2 (en) * 2006-12-11 2008-06-19 Ajinomoto Co., Inc. Method for producing an l-amino acid
RU2006143864A (ru) 2006-12-12 2008-06-20 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) (RU) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АМИНОКИСЛОТ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ СЕМЕЙСТВА ENTEROBACTERIACEAE, В КОТОРОЙ ОСЛАБЛЕНА ЭКСПРЕССИЯ ГЕНОВ cynT, cynS, cynX, ИЛИ cynR, ИЛИ ИХ КОМБИНАЦИИ
JP2010041920A (ja) 2006-12-19 2010-02-25 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸の製造法
RU2006145712A (ru) * 2006-12-22 2008-06-27 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) (RU) Способ получения l-аминокислот методом ферментации с использованием бактерий, обладающих повышенной способностью к утилизации глицерина
BRPI0703692B1 (pt) 2006-12-25 2016-12-27 Ajinomoto Kk método para se obter os cristais de um hidrocloreto de aminoácido básico compreendendo gerar um aminoácido básico usando células microbianas por fermentação em um caldo de fermentação ou por um método enzimático em uma solução de reação de enzima usando as células como catalisadores
BRPI0806790B1 (pt) 2007-01-22 2017-02-14 Ajinomoto Kk microorganismo, e, método para produzir um l-aminoácido
DE102007005072A1 (de) 2007-02-01 2008-08-07 Evonik Degussa Gmbh Verfahren zur fermentativen Herstellung von Cadaverin
JP2010088301A (ja) * 2007-02-01 2010-04-22 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸の製造法
JP2010110217A (ja) * 2007-02-22 2010-05-20 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸生産菌及びｌ−アミノ酸の製造法
CN101939412B (zh) 2007-09-04 2016-01-20 味之素株式会社 生产氨基酸的微生物以及氨基酸的生产方法
RU2395579C2 (ru) * 2007-12-21 2010-07-27 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АМИНОКИСЛОТЫ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ, ПРИНАДЛЕЖАЩЕЙ К РОДУ Escherichia
JP2010263790A (ja) * 2007-09-04 2010-11-25 Ajinomoto Co Inc アミノ酸生産微生物及びアミノ酸の製造法
WO2009076226A1 (en) * 2007-12-07 2009-06-18 The Board Of Regents Of The University Of Oklahoma Mutants of lysine decarboxylase, vaccines for periodontitis, and methods of use
JP2011067095A (ja) 2008-01-10 2011-04-07 Ajinomoto Co Inc 発酵法による目的物質の製造法
BRPI0906795A2 (pt) 2008-01-23 2015-08-18 Ajinomoto Kk Método para produzir um l-aminoácido
RU2008105793A (ru) 2008-02-19 2009-08-27 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) (RU) Способ конструирования оперонов, содержащих трансляционно сопряженные гены, бактерия, содержащая такой оперон, способ продукции полезного метаболита и способ мониторинга экспрессии гена
JP2011512823A (ja) 2008-03-03 2011-04-28 グローバル バイオ−ケム テクノロジー グループ カンパニー リミテッド Ｌ−リシン製造のためのリコンビナント微生物および方法
EP2336347B1 (en) 2008-09-08 2017-03-15 Ajinomoto Co., Inc. An l-amino acid-producing microorganism and a method for producing an l-amino acid
JP2012029565A (ja) 2008-11-27 2012-02-16 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸の製造法
JP2010142200A (ja) 2008-12-22 2010-07-01 Ajinomoto Co Inc Ｌ−リジンの製造法
BRPI1007069A2 (pt) 2009-01-23 2015-08-25 Ajinomoto Kk Método para produzir um l-aminoácido.
JP5521347B2 (ja) 2009-02-16 2014-06-11 味の素株式会社 Ｌ−アミノ酸生産菌及びｌ−アミノ酸の製造法
DE102009030342A1 (de) 2009-06-25 2010-12-30 Evonik Degussa Gmbh Verfahren zur fermentativen Herstellung von organisch chemischen Verbindungen
WO2011013707A1 (ja) 2009-07-29 2011-02-03 味の素株式会社 Ｌ-アミノ酸の製造法
JP2012196144A (ja) 2009-08-03 2012-10-18 Ajinomoto Co Inc ビブリオ属細菌を用いたｌ−リジンの製造法
JP2012223092A (ja) 2009-08-28 2012-11-15 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸の製造法
JP2013013329A (ja) 2009-11-06 2013-01-24 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸の製造法
RU2460793C2 (ru) 2010-01-15 2012-09-10 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт "Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) Способ получения l-аминокислот с использованием бактерий семейства enterobacteriaceae
RU2010101135A (ru) 2010-01-15 2011-07-20 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт "Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) (RU) Бактерия семейства enterobacteriaceae - продуцент l-аспартата или метаболитов, производных l-аспартата, и способ получения l-аспартата или метаболитов, производных l-аспартата
JP2013074795A (ja) 2010-02-08 2013-04-25 Ajinomoto Co Inc 変異型ｒｐｓＡ遺伝子及びＬ−アミノ酸の製造法
RU2471868C2 (ru) 2010-02-18 2013-01-10 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт "Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) Мутантная аденилатциклаза, днк, кодирующая ее, бактерия семейства enterobacteriaceae, содержащая указанную днк, и способ получения l-аминокислот
US20130071888A1 (en) * 2010-04-12 2013-03-21 Toray Industries, Inc. Method for producing 1,5-pentanediamine
DE102010019059A1 (de) 2010-05-03 2011-11-03 Forschungszentrum Jülich GmbH Sensoren zur intrazellulären Metabolit-Detektion
RU2010122646A (ru) 2010-06-03 2011-12-10 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт "Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) (RU) Способ получения l-аминокислоты с использованием бактерии семейства enterobacteriaceae, в которой ослаблена экспрессия генов, кодирующих транспортер лизина/аргинина/орнитина
RU2471870C2 (ru) 2010-06-03 2013-01-10 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт "Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АРГИНИНА И L-ЦИТРУЛЛИНА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ СЕМЕЙСТВА ENTEROBACTERIACEAE, В КОТОРОЙ ОСЛАБЛЕНА ЭКСПРЕССИЯ ГЕНА pepA
RU2482188C2 (ru) 2010-07-21 2013-05-20 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт "Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АРГИНИНА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИЙ РОДА Escherichia, В КОТОРОЙ ИНАКТИВИРОВАН ОПЕРОН astCADBE
RU2501858C2 (ru) 2010-07-21 2013-12-20 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт "Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АМИНОКИСЛОТЫ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ СЕМЕЙСТВА Enterobacteriaceae
JP2014036576A (ja) 2010-12-10 2014-02-27 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸の製造法
CN103492553B (zh) * 2011-02-22 2018-06-12 巴斯夫欧洲公司 用于生产尸胺的方法和重组微生物
DE102011006716A1 (de) 2011-04-04 2012-10-04 Evonik Degussa Gmbh Mikroorganismus und Verfahren zur fermentativen Herstellung einer organisch-chemischen Verbindung
WO2012157699A1 (ja) 2011-05-18 2012-11-22 味の素株式会社 動物用免疫賦活剤、それを含む飼料及びその製造方法
DE102011118019A1 (de) 2011-06-28 2013-01-03 Evonik Degussa Gmbh Varianten des Promotors des für die Glyzerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase kodierenden gap-Gens
RU2011134436A (ru) 2011-08-18 2013-10-27 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО "АГРИ") Способ получения l-аминокислоты с использованием бактерии семейства enterobacteriaceae, обладающей повышенной экспрессией генов каскада образования флагелл и клеточной подвижности
JP2015013812A (ja) 2011-11-01 2015-01-22 味の素株式会社 植物ウイルスの感染抑制剤およびそれを用いた植物ウイルス感染抑制方法
RU2588665C2 (ru) * 2011-12-21 2016-07-10 СиДжей ЧеилДжеданг Корпорейшн Способ получения l-лизина с использованием микроорганизмов, обладающих способностью продуцировать l-лизин
CA2869683C (en) 2012-04-27 2020-04-21 Evonik Industries Ag Feedback-resistant .alpha.-isopropylmalate synthases
DE102012024435A1 (de) 2012-12-14 2014-07-10 Forschungszentrum Jülich GmbH Verfahren zur Identifizierung einer Zelle mit gegenüber ihrem Wildtyp erhöhten intrazellulären Konzentration eines bestimmten Metaboliten, wobei die Veränderung der Zelle durch Rekombi-neering erreicht wird, sowie ein Verfahren zur Herstellung einer gegenüber ihrem Wildtyp genetisch veränderten Produktionszelle mit optimierter Produktion eines bestimmten Metaboliten, ein Verfahren zur Herstellung dieses Metaboliten, sowie dafür geeignete Nukleinsäuren
EP2762571A1 (de) 2013-01-30 2014-08-06 Evonik Industries AG Mikroorganismus und Verfahren zur fermentativen Herstellung von Aminosäuren
RU2013118637A (ru) 2013-04-23 2014-10-27 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО "АГРИ") СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АМИНОКИСЛОТ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ СЕМЕЙСТВА ENTEROBACTERIACEAE, В КОТОРОЙ РАЗРЕГУЛИРОВАН ГЕН yjjK
MY185322A (en) 2013-05-13 2021-05-04 Ajinomoto Kk Method for producing l-amino acid
HUE032752T2 (en) 2013-06-03 2017-10-30 Evonik Degussa Gmbh A method for the preparation of L-valine using recombinant corynebacteria containing propionate-inducible ilvBN operon
RU2013140115A (ru) 2013-08-30 2015-03-10 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО "АГРИ") СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АМИНОКИСЛОТ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ СЕМЕЙСТВА Enterobacteriaceae, В КОТОРОЙ НАРУШЕНА ЭКСПРЕССИЯ КЛАСТЕРА ГЕНОВ znuACB
JP2016192903A (ja) 2013-09-17 2016-11-17 味の素株式会社 海藻由来バイオマスからのｌ−アミノ酸の製造方法
EP3053999B1 (en) 2013-10-02 2019-11-20 Ajinomoto Co., Inc. Ammonia control apparatus and ammonia control method
RU2013144250A (ru) 2013-10-02 2015-04-10 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО "АГРИ") СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АМИНОКИСЛОТ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ СЕМЕЙСТВА Enterobacteriaceae, В КОТОРОЙ ОСЛАБЛЕНА ЭКСПРЕССИЯ ГЕНА, КОДИРУЮЩЕГО ФОСФАТНЫЙ ТРАНСПОРТЕР
PL2886651T3 (pl) 2013-10-21 2018-11-30 Ajinomoto Co., Inc. Sposób wytwarzania l-aminokwasu
EP3061828A4 (en) 2013-10-23 2017-03-15 Ajinomoto Co., Inc. Method for producing target substance
RU2014105547A (ru) 2014-02-14 2015-08-20 Адзиномото Ко., Инк. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АМИНОКИСЛОТ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ СЕМЕЙСТВА ENTEROBACTERIACEAE, ИМЕЮЩЕЙ СВЕРХЭКСПРЕССИРУЕМЫЙ ГЕН yajL
RU2015120052A (ru) 2015-05-28 2016-12-20 Аджиномото Ко., Инк. Способ получения L-аминокислоты с использованием бактерии семейства Enterobacteriaceae, в которой ослаблена экспрессия гена gshA
KR101791837B1 (ko) * 2015-08-06 2017-10-31 서울대학교산학협력단 라이신 디카르복실라아제의 변이주 개발 방법 및 그의 응용
KR20180084756A (ko) 2015-12-07 2018-07-25 지머젠 인코포레이티드 코리네박테리움 글루타미컴으로부터의 프로모터
US11208649B2 (en) 2015-12-07 2021-12-28 Zymergen Inc. HTP genomic engineering platform
US9988624B2 (en) 2015-12-07 2018-06-05 Zymergen Inc. Microbial strain improvement by a HTP genomic engineering platform
BR112018017227A2 (pt) 2016-02-25 2019-02-05 Ajinomoto Kk método para produzir um l-aminoácido
WO2018005655A2 (en) 2016-06-30 2018-01-04 Zymergen Inc. Methods for generating a bacterial hemoglobin library and uses thereof
US10544411B2 (en) 2016-06-30 2020-01-28 Zymergen Inc. Methods for generating a glucose permease library and uses thereof
CN106222231A (zh) * 2016-07-12 2016-12-14 南京工业大学 一种快速生产高光学纯度d‑赖氨酸的方法
CN111601897A (zh) 2016-12-30 2020-08-28 奎多公司 用于确定细菌对抗生素或益菌剂的易感性的噬菌体介导的免疫分析和方法
CN110291101B (zh) 2016-12-30 2023-08-08 上海凯赛生物技术股份有限公司 修饰的赖氨酸脱羧酶
WO2018120025A1 (en) * 2016-12-30 2018-07-05 Cathay R&D Center Co., Ltd. Lysine decarboxylases having modifications at titratable amino acids
JP7066977B2 (ja) 2017-04-03 2022-05-16 味の素株式会社 Ｌ－アミノ酸の製造法
CN108795912B (zh) * 2017-05-05 2022-08-02 上海凯赛生物技术股份有限公司 赖氨酸脱羧酶突变体及其应用
DE102017004566A1 (de) 2017-05-11 2018-11-15 Forschungszentrum Jülich GmbH Pyruvatcarboxylase und für die Pyruvatcarboxylase kodierende DNA, Plasmid enthaltend die DNA, sowie Mikroorganismus zur Produktion und Verfahren zur Herstellung von Produkten, deren Biosynthese Oxalacetat als Vorstufe beinhaltet, Chromosom und Screeningverfahren
CN111748549B (zh) * 2017-05-16 2022-09-23 中国科学院天津工业生物技术研究所 新的赖氨酸脱羧酶突变体及其应用
DE102017004751A1 (de) 2017-05-18 2018-11-22 Forschungszentrum Jülich GmbH Pyruvatcarboxylase und für die Pyruvatcarboxylase kodierende DNA, Plasmid enthaltend die DNA, sowie Mikroorganismus zur Produktion und verfahren zur Herstellung von Produkten, deren Bioynthese Oxalacetat als Vorstufe beeinhaltet und Chromosom
DE102017004750A1 (de) 2017-05-18 2018-11-22 Forschungszentrum Jülich GmbH Pyruvvatcarboxylase und für die Pyrovatcarboxylase kodierende DNA, Plasmid enthaltend die DNA, sowie Mikroorganismen zur Produktion und Verfahren zur Herstellung von Produkten, deren Biosynthese Oxalacetat als Vorstufe beeinhaltet und Chromsom
KR20200026881A (ko) 2017-06-07 2020-03-11 지머젠 인코포레이티드 코리네박테리움 글루타미컴으로부터의 프로모터 및 보조 유전자 발현을 조절하는 데 이의 용도
EP3692160A1 (en) 2017-10-02 2020-08-12 Quidel Corporation Phage-based detection method for antimicrobial susceptibility testing and identification of bacterial species
WO2020071538A1 (en) 2018-10-05 2020-04-09 Ajinomoto Co., Inc. Method for producing target substance by bacterial fermentation
WO2020081958A2 (en) * 2018-10-18 2020-04-23 The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate Compositions and methods for identifying mutations of genes of multi-gene systems having improved function
JP7491312B2 (ja) 2018-12-27 2024-05-28 味の素株式会社 腸内細菌科の細菌の発酵による塩基性ｌ－アミノ酸またはその塩の製造方法
JP7491314B2 (ja) 2019-02-22 2024-05-28 味の素株式会社 ｙｄｉＪ遺伝子を過剰発現する腸内細菌科に属する細菌を用いたＬ－アミノ酸の製造方法
JP2022526181A (ja) 2019-04-05 2022-05-23 味の素株式会社 Ｌ－アミノ酸の製造方法
JP2022550084A (ja) 2019-09-25 2022-11-30 味の素株式会社 細菌の発酵によるｌ－アミノ酸の製造方法
CN111117940B (zh) * 2019-12-04 2022-06-28 天津大学 一种高产戊二胺的大肠杆菌工程菌与方法
TWI748408B (zh) * 2020-04-14 2021-12-01 中國石油化學工業開發股份有限公司 用於生產1,5-戊二胺之重組微生物及方法
CN117737102A (zh) * 2020-07-02 2024-03-22 中国科学院过程工程研究所 一种用于合成戊二胺的赖氨酸脱羧酶及其应用
EP4182450A1 (en) 2020-07-15 2023-05-24 Evonik Operations GmbH Polynucleotide encoding an amino acid sequence, encoding an oxidoreductase
CN117813315A (zh) 2021-08-09 2024-04-02 赢创运营有限公司 用于生产重组细菌胶原样蛋白(clp)的方法
EP4384537A1 (en) 2021-08-09 2024-06-19 Evonik Operations GmbH Method for producing a recombinant bacterial collagen-like protein (clp)
EP4384539A1 (en) 2021-08-09 2024-06-19 Evonik Operations GmbH Polynucleotide encoding a bacterial collagen-like protein
WO2023041689A1 (en) 2021-09-20 2023-03-23 Evonik Operations Gmbh Non-adhesive collagen-like hydrogels
WO2023161038A1 (en) 2022-02-25 2023-08-31 Evonik Operations Gmbh Sponges based on collagen-like proteins
WO2023165952A1 (en) 2022-03-01 2023-09-07 Evonik Operations Gmbh Biotechnological production of collagen proteins and bacterial collagen-like proteins by recombinant microorganisms
CN115089733B (zh) * 2022-06-28 2024-05-24 滨州医学院 用于治疗高赖氨酸血症的组合物及应用
CN114990043B (zh) * 2022-06-28 2024-04-30 滨州医学院 代谢赖氨酸的工程菌及其构建方法与应用

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB820268A (en) * 1955-12-09 1959-09-16 Pfizer & Co C Preparation of lysine
JPS519393B2 (sk) * 1973-09-22 1976-03-26
WO1996017930A1 (fr) * 1994-12-09 1996-06-13 Ajinomoto Co., Inc. Nouveau gene de decarboxylase de lysine et procede de production de lysine l

Also Published As

Publication number Publication date
ES2256850T5 (es) 2013-04-15
EP0796912B9 (en) 2013-08-28
DK0796912T3 (da) 2006-04-10
CN101220366B (zh) 2011-10-05
WO1996017930A1 (fr) 1996-06-13
SK70297A3 (en) 1998-01-14
PL320645A1 (en) 1997-10-13
RU2188235C2 (ru) 2002-08-27
PL182903B1 (pl) 2002-03-29
JP3692538B2 (ja) 2005-09-07
AU703308C (en) 1996-06-26
AU703308B2 (en) 1999-03-25
MX9704236A (es) 1998-01-31
DE69534801D1 (de) 2006-04-27
CN1175280A (zh) 1998-03-04
EP0796912A4 (en) 2001-03-21
CZ290070B6 (cs) 2002-05-15
CN101220366A (zh) 2008-07-16
CA2207271C (en) 2010-09-21
EP0796912B2 (en) 2012-12-12
MY113738A (en) 2002-05-31
AU3994895A (en) 1996-06-26
CZ174697A3 (en) 1997-11-12
ES2256850T3 (es) 2006-07-16
KR100420743B1 (ko) 2004-05-24
DE69534801T3 (de) 2013-05-08
EP0796912B1 (en) 2006-02-22
ZA9510442B (en) 1996-06-19
EP0796912A1 (en) 1997-09-24
US5827698A (en) 1998-10-27
DE69534801T2 (de) 2006-10-05
HUT77752A (hu) 1998-07-28
CA2207271A1 (en) 1996-06-13
DE69534801T8 (de) 2008-09-04
PE59996A1 (es) 1996-12-26
BR9509896A (pt) 1997-12-30
DK0796912T4 (da) 2013-03-25
HU223706B1 (hu) 2004-12-28
CN100357431C (zh) 2007-12-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
SK283478B6 (sk) Gén, ktorý kóduje lyzínovú dekarboxylázu, mikroorganizmus a spôsob výroby L-lyzínu
JP3331472B2 (ja) 発酵法によるｌ−スレオニンの製造法
SK139297A3 (en) Dna coding for the aspartokinase iii, microorganism and method for producing l-amino acid
WO1995023864A1 (fr) Procede de production de l-lysine
US10526586B2 (en) Pyruvate dehydrogenase variants, a microorganism comprising the same and a method for producing L-amino acid using the same
SK163597A3 (en) Recombinant dna autonomously reproduced in the cells of coryneform bacterium, a coryneform bacterium and a process for producing l-lysine
ES2745561T3 (es) Variante del represor de gluconato, microorganismo que produce L-lisina que comprende esta variante y un procedimiento para producir L-lisina mediante su uso
US20040229311A1 (en) Novel lysine decarboxylase gene and method for producing L-lysine
SK170597A3 (en) Bacteria belonging to the genus serratia and process for producing l-lysine
CN112004926A (zh) 变体磷酸核糖焦磷酸酰胺转移酶及使用其制备嘌呤核苷酸的方法
RU2395580C2 (ru) Способ конструирования бактерии-продуцента (2s,3r,4s)-4-гидрокси-l-изолейцина, бактерия-продуцент (2s,3r,4s)-4-гидрокси-l-изолейцина и способ продукции (2s,3r,4s)-гидрокси-l-изолейцина или его соли
US20230332116A1 (en) Polypeptide with aspartate kinase activity and use thereof in production of amino acid
JP2007068437A (ja) 変異型アスパルトキナーゼとその利用方法
AU2020426558A1 (en) Novel Modified Polypeptide With Attenuated Activity Of Citrate Synthase And Method For Producing L-Amino Acid Using The Same
RU2133772C1 (ru) Модифицированная фосфоенолпируваткарбоксилаза, фрагмент днк, штамм escherichia coli, рекомбинантная днк, способ получения аминокислоты (варианты), способ селекции клеток escherichia coli, способ получения модифицированной фосфоенолпируваткарбоксилазы, способ получения фрагмента днк и способ получения микроорганизма
CN115806962A (zh) 磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶突变体及其应用
JP2006524032A (ja) コリネ型バクテリアの脱調節されたホスホグリセラート−デヒドロゲナーゼをコードするヌクレオチド配列並びにｌ−セリンの製造方法

Legal Events

Date Code Title Description
MK4A Expiry of patent

Expiry date: 20151205