CZ290070B6 - Gen ldc kódující lysindekarboxylázu, mikroorganismus a způsob výroby L-lysinu - Google Patents

Gen ldc kódující lysindekarboxylázu, mikroorganismus a způsob výroby L-lysinu Download PDF

Info

Publication number
CZ290070B6
CZ290070B6 CZ19971746A CZ174697A CZ290070B6 CZ 290070 B6 CZ290070 B6 CZ 290070B6 CZ 19971746 A CZ19971746 A CZ 19971746A CZ 174697 A CZ174697 A CZ 174697A CZ 290070 B6 CZ290070 B6 CZ 290070B6
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
gene
lysine
leu
gly
ala
Prior art date
Application number
CZ19971746A
Other languages
English (en)
Other versions
CZ174697A3 (en
Inventor
Yoshimi Kikuchi
Tomoko Suzuki
Hiroyuki Kojima
Original Assignee
Ajinomoto Co., Inc.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=17956402&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=CZ290070(B6) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Ajinomoto Co., Inc. filed Critical Ajinomoto Co., Inc.
Publication of CZ174697A3 publication Critical patent/CZ174697A3/cs
Publication of CZ290070B6 publication Critical patent/CZ290070B6/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/08—Lysine; Diaminopimelic acid; Threonine; Valine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/88—Lyases (4.)

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Abstract

Popisuje se zp sob v²roby L-lysinu kultivac v kapaln m m diu za pomoci mikroorganismu rodu Escherichia, v n m byla aktivita dekarboxyl zy odpov dn za rozklad L-lysinu sn ena nebo u in na nefunk n , nap° klad bakterie rodu Escherichia se sn enou expres nov ho genu k duj c ho lysindekarboxyl zu a/nebo zn m ho genu cadA, p°i kter m se ponech L-lysin produkovat a akumulovat v kultiva n m m diu a potom se izoluje.\

Description

Oblast techniky
Předkládaný vynález se týká nového genu Escherichia coli pro lysindekarboxylázu, který odpovídá za rozklad L-lysinu, mikroorganismu náležejícího krodu Escherichia se sníženou expresí tohoto genu a/nebo dalšího genu pro lysindekarboxylázu, známého jako gen cadA a způsob výroby L-lysinu s použitím tohoto mikroorganismu. V poslední době totiž vzrůstá potřeba L-lysinu jako přídavku ke krmivům.
Dosavadní stav techniky
Lysindekarboxyláza, která katalyzuje dekarboxylaci L-lysinu za vzniku kadaverinu, je známa jako L-lysin rozkládající enzym bakterie Escherichia coli. Sekvence nukleotidů jejího genu, nazývaného cadA a aminokyselinová sekvence, kódovaná tímto genem, již byla popsána (Meng, S. a Bennett, G. N., J. Bacteriol., 174, 2659 (1992)). Existují dvě zprávy o lysindekarboxyláze kódované jiným genem než je gen cadA Escherichia coli, které popisují mírnou aktivitu, detekovanou u mutantního kmene Escherichia coli (Goldemberg, S. H., J. Bacteriol., 141, 1428 (1980); Wertheimer, S. J. a Leifer, Z., Biochem. Biophys. Res. Commun., 114, 882 (1983)). Goldemberg uvádí, že po působení tepla 60 °C po dobu 4 minut klesá enzymová aktivita přibližně o 30 %, zatímco Wertheimer uvádí, že tento jev nebyl pozorován. Přítomnost druhé dekarboxylázy lysinu je proto nejistá.
Na druhé straně je L-lysin vyráběn známými metodami za použití Escherichia coli, včetně způsobu, zahrnujícího kultivaci mutantního kmene, rezistentního k analogu lysinu nebo rekombinantního kmene, nesoucího vektor s vloženou deoxyribonukleovou kyselinou, která deoxyribonukleovou kyselinou, která nese genetickou informaci odpovídající biosyntéze L-lysinu (zveřejněná japonská patentová přihláška No. 56 18596). Není tam však žádná zmínka o výrobě L-lysinu s použitím mikroorganismu z rodu Escherichia se sníženou expresí genu pro lysindekarboxylázu.
Podstata vynálezu
Předmětem předkládaného vynálezu je nový gen pro lysindekarboxylázu Escherichia coli, vytvoření mikroorganismu z rodu Escherichia produkujícího L-lysin se sníženou expresí tohoto genu a/nebo genu cadA a způsob výroby L-lysinu kultivací mikroorganismu z rodu Escherichia.
Když byl autory vynálezu vytvořen kmen Escherichia coli, ve kterém byl vyřazen z funkce gen cadA, známý jako gen pro lysindekarboxylázu, bylo zjištěno, že tento kmen dále produkuje kadaverin jako produkt rozkladu L-lysinu. Byl tedy předpoklad, že v Escherichia coli by měl být přítomen neznámý gen pro lysindekarboxylázu, a že by mohl značně ovlivnit výrobu L-lysinu fermentací spoužitím mikroorganismu zrodu Escherichia. Výsledkem pokusů pro dosažení klonování tohoto genu bylo získání nového genu pro lysindekarboxylázu, který je odlišný od genu cadA. Bylo rovněž zjištěno, že enzymová aktivita rozkládající L-lysin se podstatně snížila nebo zmizela omezením exprese tohoto genu, a omezením exprese genu cadA v bakterii Escherichia coli produkující L-lysin, čímž výrazně vzrostla produktivita jeho výroby.
Předkládaný vynález poskytuje nový gen, kódující lysindekarboxylázu, pocházející z Escherichia coli. Tento gen byl označen jako „Idc“.
V dalším hledisku poskytuje předkládaný vynález mikroorganismus z rodu Escherichia produkující L-lysin se sníženou nebo chybějící lysindekarboxylázovou aktivitou.
-1 CZ 290070 B6
V ještě dalším aspektu poskytuje předkládaný vynález způsob výroby L-lysinu, který zahrnuje kroky kultivace mikroorganismu z rodu Escherichia popsaného výše v kapalném médiu, ve kterém se L-lysin vytváří a akumuluje, a jeho získání.
Mikroorganismus z rodu Escherichia popisovaný výše zahrnuje mikroorganismus, ve kterém je aktivita lysindekarboxylázy v buňkách snížena nebo odstraněna omezením exprese genu Idc a/nebo cadA. Předkládaný vynález je zevrubně popisován dále.
(1) Příprava fragmentu DNA, obsahující nový gen pro lysindekarboxylázu
Fragment DNA, obsahující nový gen lysindekarboxylázy (Idc) podle předkládaného vynálezu, je možno získat z dostupného kmene Escherichia coli, například kmene K-12 nebo odvozených kmenů následujícím způsobem.
Nejprve se získá gen cadA, který je genem známé lysindekarboxylázy, z chromozomální DNA kmene W3110 pocházejícího z Escherichia coli K-12 s použitím PCR (polymerázové řetězové reakce). Sekvence nukleotidů genu cadA a jím kódovaná sekvence aminokyselin je uvedena v SEQ ID NO: 5 a 6. Běžnými metodami pro práci s plazmidovými nebo fágovými vektory jsou klonovány z knihovny chromozomální DNA bakterie Escherichia coli W3110 fragmenty DNA se sekvencí podobnou genu cadA pro potvrzení, jestli je nový gen pro lysindekarboxylázu obsažen ve fragmentech DNA. Potvrzení faktu, že je předmětný gen přítomen, může být provedeno hybridizací podle Southema s použitím sondy, připravené metodou PCR.
Sekvence nukleotidů genu, obsaženého v takto získaném fragmentu DNA se určuje následujícím způsobem. Jako první krok je fragment DNA Iigován s plazmidovým vektorem, který se v buňkách Escherichia coli autonomně replikuje, a takto připravená rekombinantní DNA je potom zavedena do kompetentních buněk Escherichia coli. Získaný transformant je kultivován v kapalném médiu a rekombinantní DNA se získá z rozmnožených buněk. Úplná nukleotidová sekvence fragmentu DNA, obsaženého v získané rekombinantní DNA, se určuje dideoxymetodou (Sanger, F. a další, Proč. Nati. Acad. Sci., 74 5463 (1977)). Struktura DNA se analyzuje proto, aby bylo možno určit existující pozice promotoru, operátoru, sekvence SD, iniciačního kodonu, terminačního kodonu, otevřeného čtecího rámce apod.
Nový gen lysindekarboxylázy podle předkládaného vynálezu má sekvenci od 1005-1007 ATG do 3141-3143 GGA úplné nukleotidové sekvence fragmentu DNA, ukázaného v SEQ ID NO: 3 výpisu sekvencí. Tento gen kóduje lysindekarboxylázu se sekvencí aminokyselin, ukázanou v SEQ ID NO: 4 výpisu sekvencí. Bylo zjištěné, že homologie mezi novou lysindekarboxylázou a lysindekarboxylázou, kódovanou genem cadA, je 69,4 °/o.
Gen podle předkládaného vynálezu může být takový, který kóduje lysindekarboxylázu se sekvencí aminokyselin, ukázanou v SEQ ID NO: 4 výpisu sekvencí, jejíž sekvence nukletidů však není omezena na výše popsanou sekvenci nukleotidů. Lysindekarboxyláza kódovaná genem podle předkládaného vynálezu, může mít substituce, delece nebo inzerce jednoho nebo více aminokyselinových zbytků výše popsané sekvence aminokyselin bez podstatného poškození aktivity lysindekarboxylázy. Geny, kódující lysindekarboxylázu s takovou delecí, inzercí nebo substitucí je možno získat z variant, spontánně mutovaných kmenů nebo uměle mutovaných kmenů Escherichia coli nebo z mikroorganismů patřících k rodu Escherichia jiných než je Escherichia coli. Mutantní geny kódující lysindekarboxylázu s delecí, inzercí nebo substitucí mohou být také získány provedením mutace in vitro nebo místně specifické mutageneze genu, kódujícího lysindekarboxylázu, který má sekvencí aminokyselin, ukázanou v SEQ ID NO: 4. Tyto mutace je možno provádět v oboru dobře známým způsoby, jak je popsáno níže.
Gen, který kóduje lysindekarboxylázu se substitucí, delecí nebo inzercí jednoho nebo více aminokyselinových zbytků, jak se zde popisuje, však zahrnuje geny, které pocházejí z „genu Idc“ a je možno je pokládat za v podstatě stejné jako gen Idc. Význam nemá být rozšířen na geny,
-2CZ 290070 B6 které mají různý původ. Je nemožné konkrétně předepsat určité rozmezí „plurality“. Odborníkům v oboru je však jasně zřejmé, že například gen cadA, kódující protein, který se neliší více než 200 zbytky aminokyselin od proteinu s aminokyselinovou sekvencí uvedenou v SEQ ID NO: 3, se liší od genu podle předkládaného vynálezu, a geny, které kódují proteiny se stejnou lysindekarboxylázovou aktivitou jsou zahrnuty do předkládaného vynálezu, i když se liší od genu s aminokyselinovou sekvencí podle SEQ ID: 3 o 2 nebo 3 aminokyselinové zbytky.
(2) Vytvoření mikroorganismu rodu Escherichia se sníženou expresí lysindekarboxylázového genu
Mikroorganismus rodu Escherichia podle předkládaného vynálezu je mikroorganismus, který patří do rodu Escherichia, a u kterého je aktivita lysindekarboxylázy v buňkách snížena nebo úplně odstraněna. Mikroorganismus rodu Escherichia zahrnuje Escherichia coli. Lysindekarboxylázová aktivita v buňkách se sníží nebo zmizí například omezením exprese jak nového genu lysindekarboxylázy (Idc), tak i známého genu cadA, který se popisuje výše. Alternativně může být snížena nebo odstraněna lysindekarboxylázová aktivita v buňkách snížením nebo odstraněním specifických účinků lysindekarboxylázových enzymů kódovaných těmito geny modifikací struktury enzymů.
Prostředkem pro omezení exprese genu Idc a známého genu cadA je například způsob snížení exprese genů na transkripční úrovni způsobením substituce, delece, inzerce, adice nebo inverze jednoho nebo více nukleotidů v promotorových sekvencích těchto genů a snížením účinnosti promotoru (M. Rosenberg a D. Court, Ann. Rev. Genetics 13 (1979) str. 319 a P. Youderian, S. Bouvier a M. Sussking, Cell 30 (1982) str. 843-853). Alternativně může být exprese těchto genů omezena na úrovni translace substitucí, delecí, inzercí, adicí nebo inverzí jednoho nebo více nukleotidů v oblasti mezi SD sekvencí a iniciačním kodonem (J. J. Dunn, R. Buzash-Pollert a F. W. Studier, Proč. Nat. Acad. Sci. U.S.A., 75 (1978) str. 2743). Navíc je pro snížení nebo odstranění specifické aktivity lysindekarboxylázy k dispozici způsob, kterým je modifikována nebo vyřazena z funkce kódovací oblast lysindekarboxylázy způsobením substituce, delece, inzerce, adice nebo inverze jednoho nebo více nukleotidů v sekvenci nukleotidů kódující oblasti.
Geny, kterých se může týkat substituce, delece, inzerce, adice nebo inverze, mohou být navíc k genům Idc nebo cadA geny Idc nebo cadA, u kterých se vyskytuje substituce, delece, inzerce, adice nebo inverze jednoho nebo více zbytků aminokyselin, která nezničí podstatnou část aktivity kódované lysindekarboxylázy.
Způsob provedení substituce, delece, inzerce, adice nebo inverze v genu zahrnuje zvláště místně specifickou metodou mutageneze (Kramer, W. a Frits, H. J., Methods in Enzymology, 154, 350 (1987)) a působení chemického prostředku, jako je dithioničitan sodný a hydroxylamin (Shořte, D. aNathans, D„ Proč. Nati. Acad. Sci. U.S.A., 75, 270 (1978)).
Místně specifická metoda mutageneze je také metoda použití syntetického oligonukleotidu, která umožní zavedení případné substituce, delece, inzerce, adice nebo inverze do omezeného páru nukleotidů. Aby bylo možno využít této metody, je nejprve připravena jednořetězcová DNA denaturaci plazmidů, který obsahuje klonovaný gen s určenou nukleotidovou sekvencí DNA. Potom je syntetizován oligonukleotid komplementární k části, ve které má být způsobena mutace. Při tomto postupu však nesmí mít syntetický oligonukleotid úplně komplementární sekvenci, ale je navržen tak, aby se v něm vyskytla případná substituce, delece, inzerce, adice nebo inverze nukleotidu. Potom se jednořetězcová DNA nechá spojit se syntetickým oligonukleotidem, který obsahuje případnou substituci, deleci, inzerci, adici nebo inverzi nukleotidu. Kompletní dvojřetězcový plazmid je syntetizován použitím T4 ligázy a Klenowova fragmentu DNA polymerázy I, a ten se potom zavede do kompetentních buněk Escherichia coli. Některé z transformantů tedy mají plazmid obsahující gen s případnou substitucí, delecí, inzercí, adicí nebo inverzí nukleotidů. Jako podobná metoda, schopná zavést do genu mutaci, aby byl
-3CZ 290070 B6 modifikován nebo vyřazen, je použitelná rekombinantní metoda PCR (PCR Technology, Stockton press (1989).
Metoda mutace chemickými prostředky je způsob, ve kterém je nukleotidová substituce, delece, inzerce, adice nebo inverze náhodně zavedena do fragmentu DNA působením dithioničitanu sodného, hydroxylaminu a podobných látek na fragment DNA, obsahující předmětný gen.
Exprese genu Idc a/nebo cadA může být omezena náhradou normálního genu v chromozomu mikroorganismu rodu Escherichia modifikovaným nebo nefunkčním genem, který je získán zavedením mutace jak je popsáno výše. Způsob náhrady genu zahrnuje způsoby, které používají homologní rekombinace (Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory press (1972); Matsuyama, S. a Mizushima, S., J. Bacteriol., 162, 1196 (1985). Homologní rekombinace je založena na schopnosti, kterou mají obecně mikroorganismy rodu Escherichia. Když je plazmid nebo podobná homologní sekvence k sekvenci v chromozomu zaveden do buňky, vyskytne se s určitou frekvencí na místě sekvenční homologie rekombinace a celý zavedený plazmid se inkorporuje do chromozomu. Je také možné, že se na místě homologní sekvence k sekvenci na chromozomu vyskytne další rekombinace, takže plazmid z chromozomu opět vypadne. V průběhu tohoto procesu však gen se zavedenou mutací je fixován přednostně na chromozom v závislosti na poloze, ve které k rekombinaci dojde, a originální původní gen vypadne z chromozomu spolu s plazmidem. Selekce takových mikrobiálních kmenů umožňuje získat mikrobiální kmen, ve kterém je normální gen na chromozomu substituován modifikovaným nebo nefunkčním genem, získaným zavedením mutace působením substituce, delece, inzerce, adice nebo inverze nukleotidové sekvence.
Mikroorganismus z rodu Escherichia, který má být vystaven substituci genu, je mikroorganismus produkující L-lysin. Mikroorganismus roku Escherichia, produkující L-lysin, například mikrobiální kmen Escherichia coli, může být získán působením mutace na kmen bez produkce L-lysinu tak, aby tento kmen získal rezistenci k analogu lysinu, jako je S-(2-aminoethyl)-Lcystein (dále označovaný jako „AEC“). Mutace může být způsobena vystavením buněk Escherichia coli chemickým prostředkům, jako je N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin a kyselina dusitá nebo působení ultrafialového záření, rentgenového záření apod. Takovým mikrobiálním kmenem je zvláště Escherichia coli AJ13069 (FERM P-14690). Tento mikrobiální kmen byl získán přidáním AEC rezistence do kmenu W3110, který vychází z Escherichia coli K-12. Escherichia coli AJ13069 byla uložena ve sbírce National Institute of Bioscience and Human Technology of Agency of Industrial Science and Technology, postál code 305, 1-3, Higashi 1-chrome, Tsukuba-shi, Ibarakiken, Japan, pod depozitním číslem FERM P-14690 6. prosince 1994, převedena na mezinárodní uložení podle budapešťské smlouvy 29. září 1995 a opatřena depozitním číslem FERM PB-5252.
Mikrobiální kmen Escherichia coli produkující L-lysin může být také získán zavedením a zesílením DNA, která nese genetickou informaci vztahující se k biosyntéze L-lysinu, pomocí rekombinantní genové technologie. Zavedeny mají být geny, které kódují enzymy biosyntetické dráhy L-lysinu, jako je aspartokináza, dihydrodipikolinát syntetáza, dihydrodipikolinát reduktáza, sukcinyldiaminopimelát transamináza a sukcinyldiaminopimelát deacyláza. V případě genu pro enzym, který podléhá zpětnovazební inhibici L-lysinem, jako je aspartokináza a dihydrodipikolinát syntetáza je žádoucí použít mutantního typu genu, který kóduje enzym k uvedené inhibici necitlivý. Pro zavedení a zesílení genu je k dispozici metoda, při které je gen ligován do vektoru autonomně se replikujícího v buňkách Escherichia coli za účelem přípravy rekombinantní DNA, kterou je Escherichia coli transformována. Alternativně může být také gen zaveden do chromozomu hostitele s využitím transdukce, transpozonu (Berg, D. E. a Berg, C. M., Bio/Technol., 1, 417 (1983), fága Mu (japonská zveřejněná přihláška No. 2-109985) nebo homologní rekombinace (Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. (1972)).
Další způsoby pro získání mikroorganismu rodu Escherichia s vyřazenou funkcí genu zahrnují mutaci genu působením chemického činidla, jako je N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidinu
-4CZ 290070 B6 a kyseliny dusité nebo působením ozáření ultrafialovým světlem, rentgenovým zářením apod. na buňky rodu Escherichia, který uvedený gen obsahují.
V níže popsaném příkladu byl vytvořen kmen Escherichia coli s vyřazenou funkcí lysindekarboxylázového genu delecí části jeho kódovací oblasti a vložením genu pro rezistenci k léčivu na její místo s cílem získat lysindekarboxylázový gen, který byl použit pro náhradu lysindekarboxylázového genu chromozomu Escherichia coli podle způsobu, využívajícího výše popsané homologní rekombinace.
Je možné omezit expresi některého z nového lysindekarboxylázového genu podle předkládaného vynálezu a genu cadA nebo omezit expresi obou z nich v jediném mikrobiálním kmenu. Exprese lysindekarboxylázového genu může být omezena v mikroorganismu rodu Escherichia produkujícím L-lysin, nebo může být schopnost produkovat L-lysin vložena do mikroorganismu rodu Escherichia s omezenou expresí lysindekarboxylázového genu výše popsaným způsobem.
(3) Produkce L-lysinu mikroorganismem rodu Escherichia s omezenou expresí lysindekarboxylázového genu
V kultivační kapalině se při kultivaci mikroorganismu rodu Escherichia s omezenou expresí lysindekarboxylázového genu, získaného výše popsaným způsobem, produkuje a hromadí značné množství L-lysinu. Množství akumulovaného L-lysinu je zvýšeno pouze omezením exprese známého genu cadA. Pro zvýšení akumulovaného množství L-lysinu je však účinnější omezit expresi nového lysindekarboxylázového genu podle předkládaného vynálezu. Nejvýhodnější výsledky při výrobě L-lysinu se získají použitím kmenu, ve kterém je omezena exprese jak genu cadA, tak i nového genu podle předkládaného vynálezu.
Médium pro výrobu L-lysinu je obyčejné médium, obsahující zdroj uhlíku, dusíku, anorganické ionty a popřípadě další organické stopové živy. Jako zdroj uhlíku je možné použít cukry jako je glukóza, laktóza, galaktóza, fruktóza a hydrolyzáty škrobu; alkoholy, jako glycerol a sorbitol; a organické kyseliny jako je kyselina fumarová, citrónová a jantarová. Jako zdroj dusíku je možno použít anorganické amonné soli jako je síran amonný, chlorid amonný a fosforečnan amonný; organické zdroje dusíku jako je sojový hydrolyzát; plynný amoniak; a vodný roztok amoniaku. Jako anorganické ionty se přidávají v malých množstvích fosforečnan draselný, síran hořečnatý, iont železa, manganu apod. Kromě výše uvedených živin je vhodné přidat vhodné množství vitaminu Bi a kvasničného extraktu jako zdrojů organických stopových živných látek.
Kultivace se s výhodou provádí za aerobních podmínek po dobu přibližně 16 až 72 hodin. Teplota kultivace je nastavena na 30 až 45 °C a pH na hodnotu 5 až 7. Pro nastavení pH je možno použít anorganických nebo organických, kyselých nebo alkalických látek, nebo plynného amoniaku a podobně.
Po skončení kultivace je možno vhodným způsobem izolovat L-lysin z fermentačního média kombinací obvyklé metody s použitím iontoměničové pryskyřice, srážecí metody a dalších známých metod.
Přehled obrázků na výkresech
Obr. 1 ukazuje strukturu plazmidu pUC6F5HH5 obsahující nový gen pro lysindekarboxylázu.
Obr. 2 ukazuje strukturu teplotně citlivého plazmidu pTS6F5HH5 obsahujícího nový gen pro lysindekarboxylázu a konstrukci plazmidu pTS6F5HH5Cm, ve kterém je část genu nahrazena fragmentem s genem pro rezistenci na chloramfenikol.
-5CZ 290070 B6
Obr. 3 ukazuje porovnání enzymatických aktivit rozkládajících L-lysin v kmenu WC 196 nesoucím normální gen pro lysindekarboxylázu a kmenů WC196C, WC196L a WC196LC s nefunkčními geny pro lysindekarboxylázu.
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1 (1) Klonování nového genu pro lysindekarboxylázu
Obvyklým způsobem byla z buněk kmene W3110 Escherichia coli K-12, získaného zNational Institute of Genetics (Yata 1111, Mishima-shi, Shizuoka-ken, Japonsko) extrahována chromozomální DNA. Zároveň byly syntetizovány pomocí obvyklé metody dva syntetické DNA primeiy, jak je ukázáno v SEQ ID NO: 1 a 2 výpisu sekvencí, založená na nukleotidoví sekvenci genu cadA (viz SEQ ID NO: 5), popsané v Meng, S. a Bennett, G. N., J. Bacteriol., 174, 2659 (1992). Jejich sekvence byly homologní k 5'-koncové části proti směru a 3'-koncové části genu cadA. Pro provedení metody PCR podle Erlich a další, PCR Technology, Stockton press (1989) byla použita chromozomální DNA a DNA primery. Byl tak získán fragment DNA o velikosti 2,1 kbp obsahující téměř všechny části genu cadA. Tento fragment byl označen soupravou Random Primer Labeling Kit (firma Takara Shuzo) a [a-32P]dCTP (firma Amersham Japonsko), čímž byla připravena sonda pro hybridizaci.
Obvyklým způsobem byla pak provedena hybridizace podle (Molecular Cloning, 2. vydání, Cold Spring Harbor Laboratory press (1989) s použitím připravené sondy a Escherichia coli/Gene Mapping Membrane (firmy Takara Suzo). Na Escherichia coli/Gene Mapping Membrane byla adsorbována knihovna podle Kohara a další (lambda phage library of Escherichia coli chromasomal DNA, viz Kohara, viz Kohara, Y. a další Cell, 50, 495-508 (1987)). Klony fágu lambda se sekvencemi podobnými cadA genu byly získány zmírněním podmínek pro omývání sondy (2 x SSC, 55 °C, 30 min) při provádění hybridizace. Výsledkem bylo, že se podařilo najít slabé signály ze tří klonů E2B8, 6F5H a 10F9 navíc k silným signálům z klonů, obsahujícím genovou oblast cadA (21H11, 5G7). Sekvence tří klonů fágu lambda E2B8, 6F5H a 10F9 na chromozomu Escherichia coli sousedí, přičemž se vzájemně překrývají. DNA fága lambda 6F5H z knihovny podle Kohara, Y. a další, Cell, 50, 495-508 (1987) byla oddělena obvyklým způsobem, štěpena různými restrikčními enzymy pro provedení Southem blot hybridizace s použitím výše popsané sondy podobným způsobem jako je popsáno výše. Bylo zjištěno, že v DNA fragmentu o délce přibližně 5 kbp, získaném štěpením Hindlll, byla přítomna sekvence podobná genu cadA.
Fragment o délce přibližně 5 kbp, získaný štěpením DNA fága lambda F65H enzymem Hindlll byl tedy ligo ván splazmidem pUC19 (firmy Takara Suzo), který byl rovněž štěpen Hindlll, s použitím T4 DNA ligázy. Tato reakční směs byla použita pro transformaci Escherichia coli JM109 (firma Takara Suzo), aby byly získány kmeny rezistentní na ampicilin, rostoucí na plotnách s kompletním médiem (obsahující 10 g polypeptonu, 5g kvasničného extraktu, 5g chloridu sodného v 1 1 vody) s přídavkem 50 mg/1 ampicilinu. Byl tak získán mikrobiální kmen, kteiý nesl plazmid s inzertem fragmentu o délce přibližně 5 kbp, získaný štěpením DNA fága lambda 6F5H Hindlll. Plazmid byl extrahován z buněk a tak byl získán plazmid pUC6F5HH5. Strukturu tohoto plazmidu ukazuje obr. 1.
Kmen Escherichia coli JM109/pUC6F5HH5 nesoucí tento plazmid byl označen jako AJ13068, uložen vNational Institute of Bioscience and Human Technology of Agency of Industrial Science and Technology pod depozitním číslem FERM P-14689 6. prosince 1994, převeden na mezinárodní uložení podle budapešťské smlouvy 29. září 1995 a označen depozitním číslem FERM BP-5251.
-6CZ 290070 B6 (2) Určení sekvence nukleotidů nového genu pro lysindekarboxylázu
Metodou, popsanou vMolecular Cloning, 2. vydání, Cold Spring Harbor Laboratory press (1989), byla určena sekvence oblasti mezi restrikčními štěpícími místy Clal a HindlII získaného plazmidu pUC6F5HH5. Bylo zjištěno, že jde o sekvenci nukleotidů podle SEQ ID NO: 3 výpisu sekvence. Tato sekvence DNA obsahuje otevřený čtecí rámec, který kóduje sekvenci aminokyselin ukázanou v SEQ ID NO: 4 výpisu sekvence.
(3) Příprava Escherichia coli produkující L-lysin
Escherichia coli W3110 byla kultivována při 37 °C 4 hodiny v kompletním médiu (obsahujícím 10 g polypeptonu, 5 g kvasničního extraktu a 5 g chloridu sodného v 1 1 vody) a takto získané buňky byly vystaveny mutačnímu působení 30 min při 37 °C v roztoku N-methyl-N-nitro-Nnitrosoguanidinu v koncentraci 200 pg/ml, promyty a potom naneseny na plotny s minimálním médiem (obsahujícím 7 g hydrogenfosforečnanu sodného, 3 g dihydrogenfosforečnanu draselného, 1 g chloridu amonného, 0,5 g chloridu sodného, 5 g glukózy, 0,25 g heptahydrátu síranu hořečnatého a 15 g agaru v 1 1 vody) s přídavkem 5 g/1 AEC. AEC - rezistentní kmeny byly získány oddělením kolonií, které se objevily po 48 hodinové kultivaci při 37 °C. Mezi nimi produkoval L-lysin také kmen WC 196. Kmen WC 196 byl označen jako AJ 13069, uložen v National Institute of Bioscience and Human Technology of Agency of Industrial Science and Technology pod depozitním číslem FERM P-14690 6. prosince 1994, převeden na mezinárodní uložení podle budapešťské smlouvy 29. září 1995 a označen depozitním číslem FERM BP-5252.
(4) Vytvoření kmene WC 196 se zničenou funkcí nového genu pro lysindekarboxylázu
Fragment o délce přibližně 5 kbp, získaný štěpením DNA fága lambda 6F5H enzymem HindlII popsaný výše, byl ligován s teplotně citlivým plazmidem pMAN031, štěpeným HindlII (Yasueda, H. a další, Appl. Microbiol. Biotechnol., 36, 211 (1991)) pomocí T4 DNA ligázy. Tato reakční směs byla použita pro transformaci Escherichia coli JMI09, následovanou 24 hodinovou kultivací při 37 °C na plotnách s kompletním médiem s přídavkem 50 mg/1, kde vyrostly kmeny s rezistencí na ampicilin. Byly tak získány kmeny, nesoucí plazmid s vloženým fragmentem o délce přibližně 5 kbp, získaným štěpením DNA fága lambda 6F5H enzymem HindlII.
Plazmid byl z buněk extrahován a byl získán plazmid p6S6F5HH5. Plazmid pTS6F5HH5 byl štěpen EcoRV pro odstranění fragmentu DNA o délce přibližně 1 kbp. Potom byla použita T4 ligáza pro vložení fragmentu genu pro chloramfenikolovou rezistenci o délce přibližně 1 kbp, který byl získán štěpením pHSG399 (vytvořený od Takara Suzo) enzymem Accl. Tak byl zkonstruován plazmid pTS6FRHH5Cm. Byl tedy úspěšně vytvořen plazmid nesoucí fragment DNA s vyřazenou funkcí nového genu pro lysindekarboxylázu. Strukturu plazmidu pTS6FRHH5 a plazmidu pTS6FRHH5Cm ukazuje obr. 2.
Potom byl technikou homologní rekombinace (Matsuyama, S. a Mizushima, S. J. Bacteriol., 162, 1196 (1985)) vytvořen kmen, ve kterém byl nový gen pro lysindekarboxylázu na chromozomu kmene WC 196 nahrazen fragmentem DNA s vyřazenou funkcí nového genu lysindekarboxylázy s využitím citlivosti plazmidu pTS6F5HH5Cm k teplotě. Nejdřív byl transformován kmen WC196 plazmidem pTS6F5HH5Cm, aby byl získán kmen rezistentní k ampicilinu a rezistentní k chloramfenikolu při 30 °C. Potom byl tento kmen použit pro získání kmene, který byl rezistentní k ampicilinu a rezistentní k chloramfenikolu při 40 °C. Dále byl tento kmen použit pro získání kmene, který je senzitivní na ampicilin a rezistentní k chloramfenikolu při 30 °C. Tak byl vytvořen výše popsaný kmen, ve kterém byl nahrazen nový lysindekarboxylázový gen na chromozomu kmene WC 196 fragmentem DNA s vyřazenou funkcí nového lysindekarboxylázového genu. Tento kmen byl označen jako WC196L.
-7CZ 290070 B6 (5) Příprava kmene WC196 a WC196L s chybějícím genem cadA
Escherichia coli, ve které je nefunkční gen známé lysindekarboxylázy cadA, je již známý, jako například kmen GNB10181, který pochází z Escherichia coli K-12 (viz Auger, E. A. a další, Mol. Microbiol., 3, 609 (1986); tento mikrobiální kmen je například dostupný ve sbírce Escherichia coli Genetic Stock Center (Connecticut, USA). Bylo zjištěno, že v tomto mikrobiálním kmenu chybí oblast genu cadA. Tato genová deficience cadA kmene GNB10181 byla transdukována do kmene WC 196 podle obecné metody s použitím fága PÍ (A Short Course in Bacterial Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1992) za vytvoření kmene WC196C. Nepřítomnost genu cadA kmene WC 196 byla potvrzena hybridizací typu Southem blot. Navíc byl podobným způsobem jak je popsáno výše vytvořen z kmene WC196L kmen WC196LC s chybějícím genem cadA.
Příklad 2 (1) Potvrzení aktivity enzymů rozkládajících L-lysin kmenů WC 196, EC195C, WC196L aWC196LC
Čtyři výše popsané kmeny byly kultivovány při 37 °C po dobu 17 hodin na médiu pro produkci L-lysinu (obsahující 40 g glukózy, 16 g síranu amonného, 1 g dihydrogenfosforečnanu draselného, 2 g kvasničného extraktu, 10 mg pentahydrátu síranu manganatého a 10 mg heptahydrátu síranu železnatého v 1 1 vody; pH bylo nastaveno hydroxidem draselným na 7,0 a potom bylo přidáno 30 g odděleně sterilizovaného uhličitanu vápenatého). Získané mikrobiální buňky byly dvakrát promyty fyziologickým roztokem, suspendovány v médiu pro testování rozkladu L-lysinu (obsahujícím 17 g dodekahydrátu hydrogenfosforečnanu sodného, 3 g dihydrogenfosforečnanu draselného, 0,5 g chloridu sodného a lOg hydrochloridu L-lysinu v 11 vody) a kultivovány 31 hodin při 37 °C.
Obrázek 3 ukazuje změny množství zbývajícího L-lysinu v kultivačních médiích v závislosti na době kultivace. Množství L-lysinu bylo kvantitativně stanovováno použitím analyzátoru Biotech Analyzer AS-210 (firma Asahi Chiemical Industry). U kmene WČ196 byl pozorován výrazný rozklad L-lysinu. Tato aktivita byla poněkud snížena v kmenu WC196C s chybějícím genem cadA pro známý gen pro lysindekarboxylázu. Rozklad L-lysinu nebyl pozorován u kmenů WC196L a WC196LC s nefunkčním novým genem lysindekarboxylázy. Koncentrace L-lysinu v kultivačním médiu klesala v průběhu přibližně tří hodin od začátku kultivace u všech mikrobiálních kmenů. Tento jev však byl způsoben inkorporací L-lysinu do mikrobiálních buněk a nebyl způsoben rozkladem.
(2) Produkce L-lysinu kmeny WC 196, WC 196C, WC 196L a WC 196LC
Výše popsané čtyři kmeny byly kultivovány 20 hodin při 37 °C ve výše popsaném médiu pro produkci L-lysinu. Bylo měřeno množství vyprodukovaného L-lysinu a kadaverinu, akumulované v kultivačním médiu. Množství L-lysinu bylo kvantitativně stanoveno s použitím analyzátoru Biotech Analyzer AS-210 jak je popsáno výše. Množství kadaverinu bylo kvantitativně stanoveno použitím HPLC.
Výsledky jsou ukázány v tabulce 1. U kmene WC196C s nefunkčním genem cadA se ve srovnání s kmenem WC 196 a u kmene WC196L s nefunkčním novým genem lysindekarboxylázy ve srovnání s kmeny WC196 a WC196C byla zvýšena akumulace L-lysinu a snížena akumulace kadaverinu jako rozkladného produktu L-lysinu. Akumulace L-lysinu byla dále zvýšena a přítomnost kadaverinu jako rozkladného produktu L-lysinu nebyla zjištěna u kmene WC196LC s nefunkčními oběma geny pro lysindekarboxylázu.
-8CZ 290070 B6
Tabulka 1
Kmen Akumulace L-lysinu Akumulace kadaverinu ígZD
WC 196 1,4 0,6
WC196C 1,9 0,4
WC196L 2,3 0,1
WC196LC 3,3 nebyla detekována
Příklad 3
Escheria coli WC196LC bez aktivity rozkládající lysin byla transformována plazmidem pUC6F5HH5, který obsahuje nový lysindekarboxylázový gen, aby byl získán kmen rezistentní kampicilinu. Kmeny WC196LC a WC196LC/pUC6F5HH5 byly kultivovány 16 hod při 37 °C v médiu pro produkci L-lysinu doplněném 5 g/1 L-lysinu a bylo měřeno množství vyprodukovaného kadaverinu.
Výsledky jsou ukázány v tabulce 2. Kmen WC196LC L-lysin na kadaverin nepřeměňoval, zatímco kmen WC196LC/pUC6F5HH5 měl schopnost přeměňovat L-lysin na kadaverin.
Tabulka 2
Kmen
WC196LC
WC196LC/pUC6F5HH5
Vyprodukované množství kadaverinu (g/1) nebylo detekováno
0,93
Průmyslová využitelnost
Nový lysindekarboxylázový gen podle předkládaného vynálezu se účastní rozkladu L-lysinu v Escherichia coli. L-lysin může být tedy produkován levně a účinně kultivací bakterie rodu Escherichia produkující L-lysin s omezenou expresí výše popsaného genu a/nebo genu cadA.
VÝPIS SEKVENCÍ (1) Obecné informace:
(i) Žadatel: Ajinomoto Co., Ind.
(ii) Název vynálezu: Gen kódující lysindekarboxylázu, mikroorganismus a způsob výroby L-lysinu (iii) Počet sekvencí: 6 (iv) Adresa pro korespondenci:
(A) Jméno:
(B) Ulice:
(C) Město:
(E): Země:
-9CZ 290070 B6 (F) PSČ:
(v) Počítačová forma:
(A) Typ média: disketa (B) Počítač: IBM PC kompatibilní (C) Operační systém: PC-DOS/MS-DOS (D) Software: FastSEQ Version 1.5 (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 1 (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 20 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: j iná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = „syntetic DNA“ (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) V OPAČNÉM SMYSLU: ne (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 1:
TGGATAACCA CACCGCGTCT 20 (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 2:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 20 bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = „syntetic DNA“ (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) V OPAČNÉM SMYSLU: ano (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 2:
GGAAGGATCA TATTGGCGTT 20
-10CZ 290070 B6 (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 3:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 3269 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: dvojitý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: genomová DNA (A) POPIS: /desc = „syntetic DNA“ (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) V OPAČNÉM SMYSLU: ne (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:
(A) ORGANISMUS: Escherichia coli (B) KMEN: W3110 (ix) ZNAKY:
(A) JMÉNO/KLÍČ: CDS (B) UMÍSTĚNÍ: 1005 ..3143 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 3:
-11 CZ 290070 B6
ATCGATTCTC GAAGTGCATC GGTGCATGGC GTTCGCCTGG AAAGCTATCG CAAAAAGGTC GGTTACCGCA ACCTTTATCG GAAGCCATTG GTTATCGGTG ATGCTGCAAT AAGAGCGCCG AAAGAACTGA CCGGAAGCGA GTGTTAAGCA GCGTAATTCG TTTGAGCAGG
TGACTGCGGT GTCTGCGTGA AGATTGCGCA CATTTGATGA TCGGTGGTAT GTGAAACCAA AAGCACTGCG ACACCCCGGG CACGCAACCT AAGGTGGTTC ACAGCACCTA ACAAAGCGCC AACTGATCGA TGGCGGCATC CTGAAGATTT CAAAAGTTCT CTATGATTAA
TAGCCGTCAG AAAAAGCGTA ACTGGCACGC ATTTGACGAA CGCCCGTCTC AGAAAAAATT TCTGATGCAA GGCTTATCCT GCGTGAAATG TGGCGGTGCG TTCCGTTATC GCTGGCGGCT CTCCATCATC GTTGAAAGCG AAAAAATCGT GAAAAAGGGT GGAAGGATTT
GATGAGAAAC GAACTGACAC CATCCACAGC CTGGCTGGCG GATGGTCGTC CGCCGTAACT ATGGCTGAAC GGCGTGGGCG TCTCGCCTCG CTGGCGATTG TCGCCGGAAG GAAGCGATGG CCGGAACCAC CAACTGCTGG CGTTATCAGC CACTTCGGTG TCCAGGAGGA
TGGATATTAA GTAAAATCTT GTCCTTATAC ACCGCGCGTA CGGTGATGAT TTGGTATGCC GCTTTAAGAT CAGAAGAGCG GCGTACCGGT GCGTGGGCGA GTTGTGCGTC GTATCATTGC TGGGTGGTGC CGGATCTGGC GCCTGATGAG GCCCTTTTTT
CATCGATGAA CGCCGATCTC CCTGGATTAC TGCAGACGAT CATTGGTCAT AGCGCCAGAA GCCTATCATC TGGTCAGTCT AGTTTGTACG TAAAGTGAAT CATTCTGTGG TCCGCGTCTG TCACCGTAAC CGÁTCTCGAC CTACGGTTAC ATCGCCACGG
ACAC ATG AAC ATC ATT
120 180 240. 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960
1016
Met Asn Ile Ile
GCC ATT ATG GGA CCG CAT GGC GTC TTT TAT AAA GAT GAG CCC ATC AAA 1064
Ala Ile Met Gly Pro His Gly Val Phe Tyr Lys Asp Glu Pro Ile Lys
5 10 15 20
GAA CTG GAG TCG GCG CTG GTG GCG CAA GGC TTT CAG ATT ATC TGG CCA 1112
Glu Leu Glu Ser Ala Leu Val Ala Gin Gly Phe Gin Ile Ile Trp Pro
25 30 35
CAA AAC AGC GTT GAT TTG CTG AAA TTT ATC GAG CAT AAC CCT CGA ATT 1150
Gin Asn Ser Val Asp Leu Leu Lys Phe Ile Glu His Asn Pro Arg Ile
40 45 50
TGC GGC GTG ATT TTT GAC TGG GAT GAG TAC AGT CTC GAT TTA TGT AGC 1208
Cys Gly Val Ile Phe Asp Trp Asp Glu Tyr Ser Leu Asp Leu Cys Ser
55 60 < z 03
GAT ATC AAT CAG CTT AAT GAA TAT CTC CCG CTT TAT GCC TTC ATC AAC 1256
Asp Ile Asn Gin Leu Asn G1U Tyr Leu Pro Leu Tyr Ala Phe Ile Asn
70 75 80
ACC CAC TCG ACG ATG GAT GTC AGC GTG CAG GAT ATG CGG ATG GCG CTC 1304
Thr His Ser Thr Met Asp Val Ser Val Gin Asp Met Arg Met Ala Leu
85 90 95 100
TGG TTT TTT GAA TAT GCG CTG GGG CAG GCG GAA GAT ATC GCC ATT CGT 1352
Trp Phe Phe Glu Tyr Ala Leu Gly Gin Ala Glu Asp Ile Ala Ile Arg
105 110 115
ATG CGT CAG TAC ACC GAC GAA TAT CTT GAT AAC ATT ACA CCG CCG TTC 1400
Met Arg Gin Tyr Thr Asp Glu Tyr Leu Asp Asn Ile Thr Pro Pro Phe
120 125 130 1448
ACG AAA GCC TTG TTT ACC TAC GTC AAA GAG CGG AAG TAC ACC TTT TGT
Thr Lys Ala Leu Phe Thr Tyr Val Lys Glu Arg Lys Tyr Thr Phe Cys
135 140 145
ACG CCG GGG CAT ATG GGC GGC ACC GCA TAT CAA AAA AGC CCG GTT GGC 1496
Thr Pro Gly His Met Gly Gly Thr Ala Tyr Gin Lys Ser Pro Val Gly
150 155 160
TGT CTG TTT TAT GAT TTT TTC GGC GGG AAT ACT CTT AAG GCT GAT GTC 1544
Cys Leu Phe Tyr Asp Phe Phe Gly Gly Asn Thr Leu Lys Ala Asp Val
165 170 175 180 1592
TCT ATT TCG GTC ACC GAG CTT GGT TCG TTG CTC GAC CAC ACC GGG CCA
Ser Ile Ser Val Thr Glu Leu Gly Ser Leu Leu Asp His Thr Gly Pro
185 190 195
CAC CTG GAA GCG GAA GAG TAC ATC GCG CGG ACT TTT GGC GCG GAA CAG L64O
His Leu Glu Ala Glu Glu Tyr Ile Ala Arg Thr Phe Gly Ala Glu Gin
200 205 210
- 12CZ 290070 B6
AGT TAT ATC GTT ACC AAC GGA ACA TCG ACG TCG AAC AAA ATT GTG GGT 1688
Ser Tyr Ile Val Thr Asn Gly Thr Ser Thr Ser Asn Lys Ile Val Gly
215 220 225
ATG TAC GCC GCG CCA TCC GGC AGT ACG CTG TTG ATC GAC CGC AAT TGT 1736
Met Tyr Ala Ala Pro Ser Gly Ser Thr Leu Leu Ile Asp Arg Asn cys
230 235 240
CAT AAA TCG CTG GCG CAT CTG TTG ATG ATG AAC GAT GTA GTG CCA GTC 1734
His Lys Ser Leu Ala His Leu Leu Met Met Asn Asp Val Val Pro Val
245 250 255 260
TGG CTG AAA CCG ACG CGT AAT GCG TTG GGG ATT CTT GGT GGG ATC CCG 1332
Trp Leu Lys Pro Thr Arg Asn Ala Leu Glv Ile Leu Gly Gly Ile Pro
265 270 275
CGC CGT GAA TTT ACT CGC GAC AGC ATC GAA GaG AAA GTC GCT GCT ACC Í880
Arg Arg Glu Phe Thr Arg Asp Ser Ile Glu Glu Lys Val Ala Ala Thr
280 285 290
ACG CAA GCA CAA TGG CCG GTT CAT GCG GTG ATC ACC AAC TCC ACC TAT 1928
Thr Gin Ala Gin Trp Pro Val His Ala Val Ile Thr Asn Ser Thr Tyr
295 300 305
GAT GGC TTG CTC TAC AAC ACC GAC TGG ATC AAA CAG ACG CTG GAT GTC 1976
Asp Gly Leu Leu Tyr Asn Thr Asp Trp ILe Lys Gin Thr Leu Asp Val
310 315 320
CCG TCG ATT CAC TTC GAT TCT GCC TGG GTG CCG TAC ACC CAT CAT 2024
Pro Ser Ile His Phe Asp Ser Ala Trp Val Pro Tyr Thr His Phe His
325 330 335 340
CCG ATC TAC CAG GGT AAA AGT GGT ATG AGC GGC GAG CGT GTT GCG GGA 2072
Pro Ile Tyr Gin Gly Lys Ser Gly Met Ser Gly Glu Arg Val Ala Gly
345 350 355
AAA GTG ATC TTC GAA ACG CAA TCG ACC CAC AAA ATG CTG GCG GCG TTA 2120
Lys Val Ile Phe Glu Thr Gin Ser Thr His Lys Met Leu Ala Ala Leu
360 365 370
TCG CAG GCT TCG CTG ATC CAC ATT AAA GGC GAG TAT GAC GAA GAG GCC 2168
Ser Gin Ala Ser Leu Ile His Ile Lys Gly Glu Tyr Asp Glu Glu Ala
375 380 385
TTT AAC GAA GCC TTT ATG ATG CAT ACC ACC ACC TCG CCC AGT TAT CCC 2216
Phe Asn Glu Ala Phe Met Met His Thr Thr Thr Ser Pro Ser Tyr Pro
390 395 400
ATT GTT GCT TCG GTT GAG ACG GCG GCG GCG ATG CTG CGT GGT AAT CCG 2264
Ile Val Ala Ser Val Glu Thr Ala Ala Ala Met Leu Arg Gly Asn Pro
405 410 415 420
GGC AAA CGG CTG ATT AAC CGT TCA GTA GAA CGA GCT CTG CAT TTT CGC 2312
Gly Lys Arg Leu Ile Asn Arg Ser Val Glu Arg Ala Leu His Phe Arg
425 430 435
AAA GAG GTC CAG CGG CTG CGG GAA GAG TCT GAC GGT TGG TTT TTC GAT 2360
Lys Glu Val Gin Arg Leu Arg Glu Glu Ser Asp Gly Trp Phe Phe Asp
440 445 450
ATC TGG CAA CCG CCG CAG GTG GAT GAA GCC GAA TGC TGG CCC GTT GCG 2408
Ile Trp Gin Pro Pro Gin val Asp Glu Ala Glu Cys Trp Pro Val Ala
455 460 465
CCT GGC GAA CAG TGG CAC GGC TTT AAC GAT GCG GAT GCC GAT CAT ATG 2456
Pro Gly Glu Gin Trp His Gly Phe Asn Asp Ala Asp Ala Asp His Met
470 475 480
TTT CTC GAT CCG GTT AAA GTC ACT ATT TTG ACA CCG GGG ATG GAC GAG 2504
Phe Leu Asp Pro Val Lys Val Thr Ile Leu Thr Pro Gly Met Asp Glu
485 490 495 500
CAG GGC AAT ATG AGC GAG GAG GGG ATC CCG GCG GCG CTG GTA GCA AAA 2552
Gin Gly Asn Met Ser Glu Glu Gly Ile Pro Ala Ala Leu Val Ala Lys
505 510 515
-13 CZ 290070 B6
TTC CTC GAC GAA CGT GGG ATC GTA GTA GAG AAA ACC GGC CCT TAT AAC 2600
Phe Leu Asp Glu Arg Gly Ile Val Val Glu Lys Thr Gly Pro Tyr Asn
520 525 530
CTG CTG TTT CTC TTT AGT ATT GGC ATC GAT AAA ACC AAA GCA ATG GGA 2648
Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ile Gly Ile Asp Lys Thr Lys Ala Met Gly
535 540 545
TTA TTG CGT GGG TTG ACG GAA TTC AAA CGC TCT TAC GAT CTC AAC CTG 2696
Leu Leu Arg Gly Leu Thr Glu Phe Lys Arg Ser Tyr Asp Leu Asn Leu
550 555 560
CGG ATC AAA AAT ATG CTA CCC GAT CTC TAT GCA GAA GAT CCC GAT TTC 2744
Arg Ile Lys Asn Met Leu Pro Asp Leu Tyr Ala Glu Asp Pro Asp Phe
565 570 575 580
TAC CGC AAT ATG CGT ATT CAG GAT CTG GCA CAA GGG ATC CAT AAG CTG 2792
Tyr Arg Asn Met Arg Ile Gin Asp Leu Ala Gin Gly Ile His Lvs Leu
585 590 595
ATT CGT AAA CAC GAT CTT CCC GGT TTG ATG TTG CGG GCA TTC GAT ACT 2840
Ile Arg Lys His Asp Leu Pro Gly Leu Met Leu Arg Ala Phe Asp Thr
600 605 610
TTG CCG GAG ATG ATC ATG ACG CCA CAT CAG GCA TGG CAA CGA CAA ATT 2883
Leu Pro Glu Met Ile Met Thr Pro His Gin Ala Trp Gin Arg Gin Ile
615 620 625
AAA GGC GAA GTA GAA ACC ATT GCG CTG GAA CAA CTG GTC GGT AGA GTA 2936
Lys Gly Glu Val Glu Thr Ile Ala Leu Glu Gin Leu Val Gly Arg Val
630 635 640
TCG GCA AAT ATG ATC CTG Ux- x TAT CCA CCG GGC GTA CCG CTG TTG ATG 2984
Ser Ala Asn Met Ile Leu Pro Tyr Pro Pro Gly Val Pro Leu Leu Met
645 650 655 660
CCT GGA GAA ATG CTG ACC AAA GAG AGC CGC ACA GTA CTC GAT TTT CTA 3032
Pro Gly Glu Met Leu Thr Lys Glu Ser Arg Thr Val Leu Asp Phe Leu
665 670 67 5
CTG ATG CTT TGT TCC GTC GGG CAA CAT TAC CCC GGT TTT GAA ACG GAT 3080
Leu Met Leu Cys Ser Val Gly Gin His Tyr Pro Gly Phe Glu Thr Asp
680 685 690
ATT CAC GGC GCG AAA CAG GAC GAA GAC GGC m TAC CGC GTA CGA GTC 3123
Ile His Gly Ala Lys Gin Asp Glu Asp Gly Val Tyr Arg Val Arg Val
695 700 705
CTA AAA ATG GCG GGA TAAC TTGCCA GAGCGGCTTC CGGGCGAGTA ACGTTCT 3183
Leu Lys Met Ala Gly
710
AACAAATAAA GGAGACGTTA TGCTGGGTTT AAAACAGGTT CACCATATTG CGATTATTGC 3243 GACGGATTAT GCGGTGAGCA AAGCTT 3269
- 14CZ 290070 B6 (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 4:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 713 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární ío (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 4:
Met Asn Ile Ile Ala Ile Met Gly Pro His Gly Val Phe Tyr Lys Asp
1 5 10 15
Glu Pro Ile Lys Glu Leu Glu Ser Ala Leu Val Ala Gin Gly Phe Gin
20 25 30
Ile Ile Trp Pro Gin Asn Ser Val Asp Leu Leu Lys Phe Ile Glu His
35 40 45
Asn Pro Arg Ile Cys Gly Val Ile Phe Asp Trp Asp Glu Tyr Ser Leu
50 55 60
Asp Leu Cys Ser Asp Ile Asn Gin Leu Asn Glu Tyr Leu Pro Leu Tyr
65 70 75 80
Ala Phe Ile Asn Thr His Ser Thr Met Asp Val Ser Val Gin Asp Met
85 90 95
Arg Met Ala Leu Trp Phe Phe Glu Tyr Ala Leu Gly Gin Ala Glu Asp
100 105 110
Ile Ala Ile Arg Met Arg Gin Tyr Thr Asp Glu Tyr Leu Asp Asn Ile
115 120 125
Thr Pro Pro Phe Thr Lys Ala Leu Phe Thr Tyr Val Lys Glu Arg Lys
130 135 140
Tyr Thr Phe Cys Thr Pro Gly His Met Gly Gly Thr Ala Tyr Gin Lys
145 150 155 160
Ser Pro Val Gly Cys Leu Phe Tyr Asp Phe Phe Gly Gly Asn Thr Leu
165 170 175
Lys Ala Asp Val Ser Ile Ser Val Thr Glu Leu Gly Ser Leu Leu Asp
180 185 190
His Thr Gly Pro His Leu Glu Ala Glu Glu Tyr Ile Ala Arg Thr Phe
195 200 205
Gly Ala Glu Gin Ser Tyr Ile Val Thr Asn Gly Thr Ser Thr Ser Asn
210 215 220
Lys Ile Val Gly Met Tyr Ala Ala Pro Ser Gly Ser Thr Leu Leu Ile
225 230 235 240
Asp Arg Asn Cys His Lys Ser Leu Ala His Leu Leu Met Met Asn Asp
245 250 255
Val Val Pro Val Trp Leu Lys Pro Thr Arg Asn Ala Leu Gly Ile Leu
260 265 270
Gly Gly Ile Pro Arg Arg Glu Phe Thr Arg Asp Ser Ile Glu Glu Lys
275 280 285
Val Ala Ala Thr Thr Gin Ala Gin Trp Pro Val His Ala Val Ile Thr
290 295 300
Asn Ser Thr Tyr Asp Gly Leu Leu Tyr Asn Thr Asp Trp Ile Lys Gin
305 310 315 320
Thr Leu Asp Val Pro Ser Ile His Phe Asp Ser Ala Trp Val Pro Tyr
325 330 335
-15CZ 290070 B6
Thr His Phe His Pro Ile Tyr Gin Gly Lys Ser Gly Met Ser Gly Glu
340 345 350
Arg Val Ala Gly Lys Val Ile Phe Glu Thr Gin Ser Thr His Lys Met
355 360 365
Leu Ala Ala Leu Ser Gin Ala Ser Leu Ile His Ile Lys Gly Glu Tyr
370 375 380
Asp Glu Glu Ala Phe Asn Glu Ala Phe Met Met His Thr Thr Thr Ser
385 390 395 400
Pro Ser Tyr Pro Ile Val Ala Ser Val Glu Thr Ala Ala Ala Met Leu
405 410 415
Arg Gly Asn Pro Gly Lys Arg Leu Ile Asn Arg Ser Val Glu Arg Ala
420 425 430
Leu His Phe Arg Lys Glu Val Gin Arg Leu Arg Glu Glu Ser Asp Gly
435 440 445
Trp Phe Phe Asp Ile Trp Gin Pro Pro Gin Val Asp Glu Ala Glu Cys
450 455 460
Trp Pro Val Ala Pro Gly Glu Gin Trp His Gly Phe Asn Asp Ala Asp
465 470 475 480
Ala Asp His Met Phe Leu Asp Pro val Lys Val Thr Ile Leu Thr Pro
485 490 495
Gly Met Asp Glu Gin Gly Asn Met Ser Glu Glu Gly Ile Pro Ala Ala
500 505 510
Leu Val Ala Lys Phe Leu Asp Glu Arg Gly Ile Val Val Glu Lys Thr
515 520 525
Gly Pro Tyr Asn Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ile Gly Ile Asp Lys Thr
530 535 540
Lys Ala Met Gly Leu Leu Arg Gly Leu Thr Glu Phe Lys Arg Ser Tyr
545 550 555 560
Asp Leu Asn Leu Arg Ile Lys Asn Met Leu Pro Asp Leu Tyr Ala Glu
565 570 575
Asp Pro Asp Phe Tyr Arg Asn Met Arg Ile Gin Asp Leu Ala Gin Gly
580 S8S 590
Ile His Lys Leu Ile Arg Lys His Asp Leu Pro Gly Leu Met Leu Arg
595 600 605
Ala Phe Asp Thr Leu Pro Glu Met Ile Met Thr Pro His Gin Ala Trp
610 615 620
Gin Arg Gin Ile Lys Gly Glu Val Glu Thr Ile Ala Leu Glu Gin Leu
625 630 635 640
Val Gly Arg val Ser Ala Asn Met Ile Leu Pro Tyr Pro Pro Gly Val
645 650 655
Pro Leu Leu Met Pro Gly Glu Met Leu Thr Lys Glu Ser Arg Thr Val
660 665 670
Leu Asp Phe Leu Leu Met Leu Cys Ser Val Gly Gin His Tyr Pro Gly
675 680 685
Phe Glu Thr Asp Ile His Gly Ala Lys Gin Asp Glu Asp Gly Val Tyr
690 695 700
Arg Val Arg Val Leu Lys Met Ala Gly
705 710
-16CZ 290070 B6 (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 5:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 2145 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: dvojitý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: genomová DNA (A) POPIS: /desc = „syntetic DNA“ (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) V OPAČNÉM SMYSLU: ne (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:
(A) ORGANISMUS: Escherichia coli (B) KMEN: CS520 (ix) ZNAKY:
(A) JMÉNO/KLÍČ: CDS (B) UMÍSTĚNÍ: 1 ..2145 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 5:
ATG AAC GTT ATT GCA ATA TTG AAT CAC ATG GGG GTT TAT TTT AAA GAA 48
Met Asn Val Ile Ala Ile Leu Asn His Met Gly Val Tyr Phe Lys Glu
1 5 10 15
GAA CCC ATC CGT GAA CTT CAT CGC GCG k» Á X GAA CGT CTG AAC ttc CAG 96
Glu Pro Ile Arg Glu Leu His Arg Ala Leu Glu Arg Leu Asn Phe Gin
20 25 30
ATT GTT TAC CCG AAC GAC CGT GAC GAC TTA TTA AAA CTG ATC GAA AAC 144
Ile Val Tyr Pro Asn Asp Arg Asp Asp Leu Leu Lys Leu Ile Glu Asn
35 40 45
AAT GCG CGT CTG TGC GGC GTT ATT TTT GAC TGG GAT AAA TAT AAT CTC 192
Asn Ala Arg Leu Cys Gly Val Ile Phe Asp Trp Asp Lys Tyr Asn Leu
50 55 60
GAG CTG TGC GAA GAA ATT AGC AAA ATG AAC GAG AAC CTG CCG TTG TAC 240
Glu Leu Cys Glu Glu Ile Ser Lys Met Asn Glu Asn Leu Pro Leu Tyr
65 70 75 80
GCG TTC GCT AAT ACG TAT TCC ACT CTC GAT GTA AGC CTG AAT GAC CTG 288
Ala Phe Ala Asn Thr Tyr Ser Thr Leu Asp Val Ser Leu Asn Asp Leu
85 90 95
-17CZ 290070 B6
CGT TTA CAG ATT AGC TTC TTT GAA TAT GCG CTG GGT GCT GCT GAA GAT 336
Arg Leu Gin Ile Ser Phe Phe Glu Tyr Ala Leu Gly Ala Ala Glu Asp
100 105 110
ATT GCT AAT AAG ATC AAG CAG ACC ACT GAC GAA TAT ATC AAC ACT ATT 384
Ile Ala Asn Lys Ile Lys Gin Thr Thr Asp Glu Tyr Ile Asn Thx Ile
115 120 125
CTG CCT CCG CTG ACT AAA GCA CTG TTT AAA TAT GTT CGT GAA GGT AAA 432
Leu Pro Pro Leu Thr Lys Ala Leu Phe Lys Tyr Val Arg Glu Gly Lys
130 135 140
TAT ACT TTC TGT ACT CCT GGT CAC ATG GGC GGT ACT GCA TTC CAG AAA 480
Tyr Thr Phe Cys Thr Pro Gly His Met Gly Gly Thr Ala Phe Gin Lys
145 150 155 160
AGC CCG GTA GGT AGC CTG TTC TAT GAT TTC TTT GGT CCG AAT ACC ATG 528
Ser Pro Val Gly Ser Leu Phe Tyr Asp Phe Phe Gly Pro Asn Thr Met
165 170 175
AAA TCT GAT ATT TCC ATT TCA GTA TCT GAA CTG GGT TCT CTG CTG GAT 576
Lys Ser Asp Ile Ser Ile Ser Val Ser Glu Leu Gly Ser Leu Leu Asp
130 185 190
CAC AGT GGT CCA CAC AAA GAA GCA GAA CAG TAT ATC GCT CGC GTC TTT 624
His Ser Gly Pro His Lys Glu Ala Glu Gin Tyr Ile Ala Arg Val Phe
195 200 205
AAC GCA GAC CGC AGC TAC ATG GTG ACC AAC GGT ACT TCC ACT GCG AAC 672
Asn Ala Asp Arg Ser Tyr Met Val Thr Asn Gly Thr Ser Thr Ala Asn
210 215 220
AAA ATT GTT GGT ATG TAC TCT GCT CCA GCA GGC AGC ACC ATT CTG ATT 720
Lys Ile Val Gly Met Tyr Se *“ Ala Pro Ala Gly Ser Thr Ile Leu Ile
225 230 235 240
GAC CGT AAC TGC CAC AAA TCG CTG ACC CAC CTG ATG ATG ATG AGC GAT 768
Asp Arg Asn Cys His Lys Ser Leu Thr His Leu Met Met Met Ser Asp
245 250 255
GTT ACG CCA ATC TAT TTC CGC CCG ACC CGT AAC GCT TAC GGT ATT CTT 816
Val Thr Pro Ile Tyr Phe Arg Pro Thr Arg Asn Ala Tyr Gly Ile Leu
260 265 270
GGT GGT ATC CCA CAG AGT GAA TTC CAG CAC GCT ACC ATT GCT AAG CGC 864
Gly Gly Ile Pro Gin Ser Glu Phe Gin His Ala Thr Ile Ala Lys Arg
275 280 285
GTG AAA GAA ACA CCA AAC GCA ACC TGG CCG GTA CAT GCT GTA ATT ACC 912
Val Lys Glu Thr Pro Asn Ala Thr Trp Pro Val His Ala Val Ile Thr
290 295 300
AAC TCT ACC TAT GAT GGT CTG CTG TAC AAC ACC GAC TTC ATC AAG AAA 960
Asn Ser Thr Tyr Asp Gly Leu Leu Tyr Asn Thr Asp Phe Ile Lys Lys
305 310 315 320
ACA CTG GAT GTG AAA TCC ATC CAC TTT GAC TCC GCG TGG GTG CCT TAC 1008
Thr Leu Asp Val Lys Ser Ile His Phe Asp Ser Ala Trp Val Pro Tyr
32S 330 335 1056
ACC AAC TTC TCA CCG ATT TAC GAA GGT AAA TGC GGT ATG AGC GGT GGC
Thr Asn Phe ser Pro Ile Tyr G1U Gly Lys Cys Gly Met Ser Gly Gly
340 345 350
CGT GTA GAA GGG AAA GTG ATT TAC GAA ACC CAG TCC ACT CAC AAA CTG 1104
Arg Val Glu Gly Lys Val Ile Tyr Glu Thr Gin Ser Thr His Lys Leu
355 360 365
-18CZ 290070 B6
CTG GCG GCG TTC TCT CAG GCT TCC ATG ATC CAC GTT AAA GGT GAC GTA 1152
Leu Ala Ala Phe Ser Gin Ala Ser Met Ile His Val Lys Gly Asp Val
370 375 380
AAC GAA GAA ACC TTT AAC GAA GCC TAC ATG ATG CAC ACC ACC ACT TCT 1200
Asn Glu Glu Thr Phe Asn Glu Ala Tyr Met Met His Thr Thr Thr Ser
385 390 395 400
CCG CAC TAC GGT ATC GTG GCG TCC ACT GAA ACC GCT GCG GCG ATG ATG 1248
Pro His Tyr Gly Ile Val Ala Ser Thr Glu Thr Ala Ala Ala Met Met
405 410 415
AAA GGC AAT GCA GGT AAG CGT CTG ATC AAC GGT TCT ATT GAA CGT GCG 1296
Lys Gly Asn Ala Gly Lys Arg Leu Ile Asn Gly Ser Ile Glu Arg Ala
420 425 430
ATC AAA TTC CGT AAA GAG ATC AAA CGT CTG AGA ACG GAA TCT GAT GGC 1344
Ile Lys Phe Arg Lys Glu Ile Lys Arg Leu Arg Thr Glu Ser Asp Gly
435 440 445
TGG TTC TTT GAT GTA TGG CAG CCG GAT CAT ATC GAT ACG ACT GAA TGC 1392
Trp Phe Phe Asp Val Trp Gin Pro Asp His Ile Asp Thr Thr Glu Cys
450 455 460
TGG CCG CTG CGT TCT GAC AGC ACC TGG CAC GGC TTC AAA AAC ATC GAT 1440
Trp Pro Leu Arg Ser Asp Ser Thr Trp His Gly Phe Lys Asn ile Asp
465 470 475 480
AAC GAG CAC ATG TAT CTT GAC CCG ATC AAA GTC ACC CTG CTG ACT CCG 1488
Asn G1U His Met Tyr Leu Asp Pro Ile Lys Val Thr Leu Leu Thr Pro
485 490 495
GGG ATG GAA AAA GAC GGC ACC ATG AGC GAC TT” GGT ATT CCG GCC AGC 1536
Gly Met Glu Lys Asp Gly Thr Met Ser Asp Phe Gly Ile Pro Ala Ser
500 505 510
ATC GTG GCG AAA TAC CTC GAC GAA CAT GGC ATC GTT GTT GAOa AAA ACC 1584
Ile Val Ala Lys Tyr Leu Asp Glu His Gly Ile Val val Glu Lys Thr
515 520 525
GGT CCG TAT AAC CTG CTG TTC CTG TTC AGC ATC GGT ATC GAT AAG ACC 1632
Gly Pro Tyr Asn Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ile Gly Ile Asp Lys Thr
530 535 540
AAA GCA CTG AGC CTG CTG CGT GCT CTG ACT GAC TTT AAA CGT GCG TTC 1680
Lys Ala Leu Ser Leu Leu Arg Ala Leu Thr Asp Phe Lys Arg Ala Phe
545 550 555 560
GAC CTG AAC CTG CGT GTG AAA AAC ATG CTG CCG TCT CTG TAT GAA 1723
Asp Leu Asn Leu Arg Val Lys Asn Met Leu Pro Ser Leu Tyr Arg Glu
565 570 575
GAT CCT GAA TTC TAT GAA AAC ATG CGT ATT CAG GAA CTG GCT CAG AAT 1776
Asp Pro Glu Phe Tyr Glu Asn Mec Arg Ile Gin Glu Leu Ala Gin Asn
580 585 590
ATC CAC AAA CTG ATT GTT CAC CAC AAT CTG CCG GAT CTG ATG TAT CGC 1324
Ile His Lys Leu Ile Val His His Asn Leu Pro Asp Leu Met Tyr Arg
595 600 605
GCA TTT GAA GTG CTG CCG ACG ATG GTA ATG ACT CCG TAT GCT GCA TTC 1372
Ala Phe Glu Val Leu Pro Thr Met Val Met Thr Pro Tyr Ala Ala Phe
610 615 620
CAG AAA GAG CTG CAC GGT ATG ACC GAA GAA GTT TAC CTC GAC GAA ATG 1920
Gin Lys G1U Leu His Gly Met Thr Glu Glu Val Tyr Leu Asp Glu Met
625 630 635 640
- 19CZ 290070 B6
GTA GGT CGT AAC GCC AAT ATG ATC CTT CCG TAC CCG CCG GGA GTT 1968
Val Gly Arg Ile Asn Ala Asn Met Ile Leu Pro Tyr Pro Pro Gly Val
645 650 655
CCT CTG GTA ATG CCG GGT GAA ATG ATC ACC GAA GAA AGC CGT CCG GTT 2016
Pro Leu Val Met Pro Gly Glu Met Ile Thr Glu Glu Ser Arg Pro Val
660 665 670
CTG GAG TTC CTG CAG ATG CTG TGT GAA ATC GGC GCT CAC TAT CCG GGC 2064
Leu Glu Phe Leu Gin Met Leu Cys Glu Ile Gly Ala His Tyr Pro Gly
675 630 685
TTT GAA ACC GAT ATT CAC GGT GCA TAC CGT CAG GCT GAT GGC CGC TAT 2112
Phe Glu Thr Asp Ile His Gly Ala Tyr Arg Gin Ala Asp Gly Arg Tyr
690 695 700
ACC GTT AAG GTA TTG AAA GAA GAA AGC AAA AAA 2145
Thr Val Lys Val Leu Lys Glu Glu Ser Lys Lys
705 710 715
(2) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 6:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 715 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 6:
Met 1 Asn Val Ile Ala Ile Leu Asn His Met Gly Val Tyr Phe Lys 15 Glu
5 10
Glu Pro Ile Arg Glu Leu His Arg Ala Leu Glu Arg Leu Asn Phe Gin
20 25 30
Ile Val Tyr Pro Asn Asp Arg Asp Asp Leu Leu Lys Leu Ile Glu Asn
35 40 45
Asn Ala Arg Leu Cys Gly Val Ile Phe Asp Trp Asp Lys Tyr Asn Leu
50 55 60
Glu Leu Cys Glu Glu Ile Ser Lys Met Asn Glu Asn Leu Pro Leu Tyr
65 70 75 80
Ala Phe Ala Asn Thr Tyr Ser Thr Leu Asp Val Ser Leu Asn Asp Leu
85 90 95
Arg Leu Gin Ile Ser Phe Phe Glu Tyr Ala Leu Gly Ala Ala Glu Asp
100 105 110
Ile Ala Asn Lys Ile Lys Gin Thr Thr Asp Glu Tyr Ile Asn Thr Ile
115 120 125
Leu Pro Pro Leu Thr Lys Ala Leu Phe Lys Tyr Val Arg Glu Gly Lys
130 135 140
Tyr Thr Phe Cys Thr Pro Gly His Met Gly Gly Thr Ala Phe Gin Lys
145 150 155 160
Ser Pro Val Gly Ser Leu Phe Tyr Asp Phe Phe Gly Pro Asn Thr Met
165 170 175
Lys Ser Asp Ile Ser Ile Ser Val Ser Glu Leu Gly Ser Leu Leu Asp
180 185 190
His Ser Gly Pro His Lys Glu Ala Glu Gin Tyr Ile Ala Arg Val Phe
195 200 205
-20CZ 290070 B6
Asn Ala 210 Asp Arg Val Gly Ser Tyr Met val Thr Asn 215 Gly Thr Ser Thr Ala Asn Ile 240
Gly 235 220 Ser
Lys 225 Ile Met Tyr Ser 230 Ala Pro Ala Thr Ile Leu
Asp Arg Asn Cys His Lys Ser Leu Thr His Leu Met Met Met Ser Asp
245 250 255
Val Thr Pro Ile Tyr Phe Arg Pro Thr Arg Asn Ala Tyr Gly Ile Leu
260 265 270
Gly Gly Ile Pro Gin Ser Glu Phe Gin His Ala Thr Ile Ala Lys Arg
275 230 285
Val Lys Glu Thr Pro Asn Ala Thr Trp Pro Val His Ala Val Ile Thr
290 295 300
Asn Ser Thr Tyr Asp Gly Leu Leu Tyr Asn Thr Asp Phe Ile Lys Lys
305 310 315 320
Thr Leu Asp Val Lys Ser Ile His Phe Asp Ser Ala Trp Val Pro Tyr
325 330 335
Thr Asn Phe Ser Pro Ile Tyr Glu Gly Lys Cys Gly Met Ser Gly Gly
340 345 350
Arg Val Glu Gly Lys Val Ile Tyr Glu Thr Gin Ser Thr His Lys Leu
355 360 365
Leu Ala Ala Phe Ser Gin Ala Ser Met Ile His Val Lys Gly Asp Val
370 375 380
Asn Glu Glu Thr Phe Asn Glu Ala Tyr Met Met His Thr Thr Thr Ser
385 390 395 400
Pro His Tyr Gly Ile Val Ala Ser Thr Glu Thr Ala Ala Ala Met Met
405 410 415
Lys Gly Asn Ala Gly Lys Arg Leu Ile Asn Gly Ser Ile Glu Arg Ala
420 425 430
Ile Lys Phe Arg Lys Glu Ile Lys Arg Leu Arg Thr Glu Ser Asp Gly
435 440 445
Trp Phe Phe Asp Val Trp Gin Pro Asp His Ile Asp Thr Thr Glu Cys
450 455 460
Trp Pro Leu Arg Ser Asp Ser Thr Trp His Gly Phe Lys Asn Ile Asp
465 470 47S 480
Asn Glu His Met Tyr Leu Asp Pro Ile Lys Val Thr Leu Leu Thr Pro
48S 490 495
Gly Met Glu Lys Asp Gly Thr Met Ser Asp Phe Gly Ile Pro Ala Ser
500 505 510
Ile Val Ala Lys Tyr Leu Asp Glu His Gly Ile Val Val Glu Lys Thr
515 520 525
Gly Pro Tyr Asn Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ile Gly Ile Asp Lys Thr
530 535 540
Lys Ala Leu Ser Leu Leu Arg Ala Leu Thr Asp Phe Lys Arg Ala Phe
545 550 555 560
Asp Leu Asn Leu Arg Val Lys Asn Met Leu Pro Ser Leu Tyr Arg Glu
565 570 575
Asp Pro Glu Phe Tyr Glu Asn Met Arg Ile Gin Glu Leu Ala Gin Asn
580 585 590
Ile His Lys Leu Ile Val His His Asn Leu Pro Asp Leu Met Tyr Arg
595 600 605
-21 CZ 290070 B6
Ala Phe Glu 610 Gin Lys Glu 625 Val Gly Arg Val Leu Ile Leu His Asn 645 Pro Thr Met Val Met Thr 615 Pro Tyr Ala Ala Phe
620 Tyr Tyr Leu Asp Glu Met 640
Gly 630 Ala Met Thr Glu Glu Val 635
Asn Met
Ile Leu 650 Pro Pro Pro Gly 655 Val
Pro Leu Val Met Pro Gly Glu Met Ile Thr Glu Glu Ser Arg Pro Val
660 665 670
Leu Glu Phe Leu Gin Met Leu Cys Glu Ile Gly Ala His Tyr Pro Gly
675 680 685
Phe Glu Thr Asp Ile His Gly Ala Tyr Arg Gin Ala Asp Gly Arg Tyr
690 695 700
Thr Val Lys Val Leu Lys Glu Glu Ser Lys Lys
705 710 715
PATENTOVÉ NÁROKY
1. Gen Idc kódující lysindekarboxylázu, která má sekvenci aminokyselin uvedenou v SEQ ID NO: 4 výpisu sekvencí.

Claims (10)

1. Gen Idc kódující lysindekarboxylázu, která má sekvenci aminokyselin uvedenou v SEQ ID NO: 4 výpisu sekvencí.
2. Gen Idc podle nároku 1, kde uvedený gen má sekvenci nukleotidů od kodonu 1005 do 3143, uvedenou v SEQ ID NO: 3 výpisu sekvencí.
3. Gen Idc podle nároku 1, kde uvedená sekvence aminokyselin obsahuje substituci, deleci nebo inzerci jednoho nebo více zbytků aminokyselin, přičemž nedojde k podstatnému snížení lysindekarboxylázové aktivity.
4. Mikroorganismus rodu Escherichia produkující L-lysin se sníženou nebo chybějící lysindekarboxylázovou aktivitou v buňkách, přičemž lysindekarboxylázová aktivita v buňkách je snížena nebo chybí omezením exprese genu Idc podle některého z nároku 1 až 3.
5. Mikroorganismus podle nároku 4, kterým je Escherichia coli.
6. Mikroorganismus podle nároku 4, který má dále omezenou expresi genu cadA.
7. Mikroorganismus podle nároku 4, kde exprese genu Idc je snížena dosažením nefunkčnosti genu Idc.
8. Mikroorganismus podle nároku 4, kde nefunkčnost genu Idc je dosažena substitucí, deleci, inzercí, adicí nebo inverzí jednoho nebo více nukleotidů v sekvenci nukleotidů.
9. Způsob výroby L-lysinu, vyznačující se tím, že se kultivuje mikroorganismus podle některého z nároků 4 až 8 v kapalném médiu, přičemž se dosáhne produkce a akumulace L-lysinu v kultivačním médiu, a L-lysin se izoluje.
10. Způsob podle nároku 9, vyznačující se tím, že se kultivuje mikroorganismus podle nároku 6.
CZ19971746A 1994-12-09 1995-12-05 Gen ldc kódující lysindekarboxylázu, mikroorganismus a způsob výroby L-lysinu CZ290070B6 (cs)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP30638694 1994-12-09
PCT/JP1995/002481 WO1996017930A1 (fr) 1994-12-09 1995-12-05 Nouveau gene de decarboxylase de lysine et procede de production de lysine l

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ174697A3 CZ174697A3 (en) 1997-11-12
CZ290070B6 true CZ290070B6 (cs) 2002-05-15

Family

ID=17956402

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ19971746A CZ290070B6 (cs) 1994-12-09 1995-12-05 Gen ldc kódující lysindekarboxylázu, mikroorganismus a způsob výroby L-lysinu

Country Status (21)

Country Link
US (1) US5827698A (cs)
EP (1) EP0796912B9 (cs)
JP (1) JP3692538B2 (cs)
KR (1) KR100420743B1 (cs)
CN (2) CN100357431C (cs)
AU (1) AU703308B2 (cs)
BR (1) BR9509896A (cs)
CA (1) CA2207271C (cs)
CZ (1) CZ290070B6 (cs)
DE (1) DE69534801T3 (cs)
DK (1) DK0796912T4 (cs)
ES (1) ES2256850T5 (cs)
HU (1) HU223706B1 (cs)
MX (1) MX9704236A (cs)
MY (1) MY113738A (cs)
PE (1) PE59996A1 (cs)
PL (1) PL182903B1 (cs)
RU (1) RU2188235C2 (cs)
SK (1) SK283478B6 (cs)
WO (1) WO1996017930A1 (cs)
ZA (1) ZA9510442B (cs)

Families Citing this family (124)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0796912B9 (en) * 1994-12-09 2013-08-28 Ajinomoto Co., Inc. Novel lysine decarboxylase gene and process for producing l-lysine
ES2313878T3 (es) * 2000-01-21 2009-03-16 Ajinomoto Co., Inc. Procedimiento para la produccion de l-lisina.
US7329514B2 (en) * 2002-02-28 2008-02-12 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Process for producing n-acetylneuraminic acid
BR0304860A (pt) * 2002-11-11 2004-08-31 Ajinomoto Kk Método para produzir uma substância alvo pela utilização de uma-bactéria pertencente ao gênero escherichia
DE60335774D1 (de) 2002-11-26 2011-03-03 Ajinomoto Kk Methode für die Produktion von L-Glutamin und L-Glutamin-produzierendes Bakterium
CN101691577A (zh) * 2002-12-20 2010-04-07 梅坦诺米克斯有限公司 制备氨基酸的方法
JP2004254544A (ja) * 2003-02-25 2004-09-16 Ajinomoto Co Inc 新規リジンデカルボキシラーゼ遺伝子及びｌ−リジンの製造法
CA2813540C (en) 2004-10-07 2018-06-05 Ajinomoto Co., Inc. Method for producing basic substance
RU2004137719A (ru) * 2004-12-23 2006-06-10 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) (RU) Способ получения l-аминокислот с использованием бактерий семейства enterobacteriaceae
WO2006078039A1 (en) * 2005-01-18 2006-07-27 Ajinomoto Co., Inc. L-amino acid producing microorganism and a method for producing l-amino acid
JP2007185184A (ja) * 2005-12-16 2007-07-26 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸生産菌及びｌ−アミノ酸の製造法
WO2007086618A1 (en) 2006-01-30 2007-08-02 Ajinomoto Co., Inc. L-amino acid producing bacterium and method of producing l-amino acid
JP2009095237A (ja) * 2006-02-02 2009-05-07 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸の製造法
JP2009118740A (ja) * 2006-03-03 2009-06-04 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸の製造法
EP2004803A2 (en) 2006-03-23 2008-12-24 Ajinomoto Co., Inc. A method for producing an l-amino acid using bacterium of theenterobacteriaceae family with attenuated expression of a gene coding for small rna
JP2009060791A (ja) 2006-03-30 2009-03-26 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸生産菌及びｌ−アミノ酸の製造法
WO2007119890A1 (en) 2006-04-18 2007-10-25 Ajinomoto Co., Inc. A METHOD FOR PRODUCING AN L-AMINO ACID USING A BACTERIUM OF THE ENTEROBACTERIACEAE FAMILY WITH ATTENUATED EXPRESSION OF THE sfmACDFH-fimZ CLUSTER OR THE fimZ GENE
JP2009165355A (ja) * 2006-04-28 2009-07-30 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸を生産する微生物及びｌ−アミノ酸の製造法
WO2007136133A1 (en) 2006-05-23 2007-11-29 Ajinomoto Co., Inc. A method for producing an l-amino acid using a bacterium of the enterobacteriaceae family
CN103215319A (zh) * 2006-07-19 2013-07-24 味之素株式会社 使用肠杆菌科细菌产生l-氨基酸的方法
JP2010017081A (ja) * 2006-10-10 2010-01-28 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸の製造法
WO2008073333A2 (en) * 2006-12-08 2008-06-19 The Board Of Rengents Of The University Of Oklahoma Vaccine for periodontitis and methods of use
EP2094858B1 (en) * 2006-12-11 2015-02-18 Ajinomoto Co., Inc. Method for producing an l-amino acid
RU2006143864A (ru) 2006-12-12 2008-06-20 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) (RU) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АМИНОКИСЛОТ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ СЕМЕЙСТВА ENTEROBACTERIACEAE, В КОТОРОЙ ОСЛАБЛЕНА ЭКСПРЕССИЯ ГЕНОВ cynT, cynS, cynX, ИЛИ cynR, ИЛИ ИХ КОМБИНАЦИИ
JP2010041920A (ja) 2006-12-19 2010-02-25 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸の製造法
RU2006145712A (ru) * 2006-12-22 2008-06-27 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) (RU) Способ получения l-аминокислот методом ферментации с использованием бактерий, обладающих повышенной способностью к утилизации глицерина
BRPI0703692B1 (pt) 2006-12-25 2016-12-27 Ajinomoto Kk método para se obter os cristais de um hidrocloreto de aminoácido básico compreendendo gerar um aminoácido básico usando células microbianas por fermentação em um caldo de fermentação ou por um método enzimático em uma solução de reação de enzima usando as células como catalisadores
BRPI0806790B1 (pt) 2007-01-22 2017-02-14 Ajinomoto Kk microorganismo, e, método para produzir um l-aminoácido
DE102007005072A1 (de) 2007-02-01 2008-08-07 Evonik Degussa Gmbh Verfahren zur fermentativen Herstellung von Cadaverin
JP2010088301A (ja) 2007-02-01 2010-04-22 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸の製造法
JP2010110217A (ja) 2007-02-22 2010-05-20 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸生産菌及びｌ−アミノ酸の製造法
JP2010263790A (ja) * 2007-09-04 2010-11-25 Ajinomoto Co Inc アミノ酸生産微生物及びアミノ酸の製造法
RU2395579C2 (ru) * 2007-12-21 2010-07-27 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АМИНОКИСЛОТЫ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ, ПРИНАДЛЕЖАЩЕЙ К РОДУ Escherichia
EP2192170B1 (en) 2007-09-04 2017-02-15 Ajinomoto Co., Inc. Amino acid-producing microorganism and method of producing amino acid
WO2009076226A1 (en) * 2007-12-07 2009-06-18 The Board Of Regents Of The University Of Oklahoma Mutants of lysine decarboxylase, vaccines for periodontitis, and methods of use
JP2011067095A (ja) 2008-01-10 2011-04-07 Ajinomoto Co Inc 発酵法による目的物質の製造法
JP5526785B2 (ja) 2008-01-23 2014-06-18 味の素株式会社 Ｌ−アミノ酸の製造法
RU2008105793A (ru) 2008-02-19 2009-08-27 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) (RU) Способ конструирования оперонов, содержащих трансляционно сопряженные гены, бактерия, содержащая такой оперон, способ продукции полезного метаболита и способ мониторинга экспрессии гена
US8268597B2 (en) 2008-03-03 2012-09-18 Global Bio-Chem Technology Group Company Limited Recombinant microorganism and method for producing L-lysine
JP5598329B2 (ja) 2008-09-08 2014-10-01 味の素株式会社 Ｌ−アミノ酸を生産する微生物及びｌ−アミノ酸の製造法
JP2012029565A (ja) 2008-11-27 2012-02-16 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸の製造法
JP2010142200A (ja) 2008-12-22 2010-07-01 Ajinomoto Co Inc Ｌ−リジンの製造法
BRPI1007069A2 (pt) 2009-01-23 2015-08-25 Ajinomoto Kk Método para produzir um l-aminoácido.
JP5521347B2 (ja) * 2009-02-16 2014-06-11 味の素株式会社 Ｌ−アミノ酸生産菌及びｌ−アミノ酸の製造法
DE102009030342A1 (de) 2009-06-25 2010-12-30 Evonik Degussa Gmbh Verfahren zur fermentativen Herstellung von organisch chemischen Verbindungen
CN102471790B (zh) 2009-07-29 2014-10-29 味之素株式会社 产生l-氨基酸的方法
JP2012196144A (ja) 2009-08-03 2012-10-18 Ajinomoto Co Inc ビブリオ属細菌を用いたｌ−リジンの製造法
JP2012223092A (ja) 2009-08-28 2012-11-15 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸の製造法
JP2013013329A (ja) 2009-11-06 2013-01-24 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸の製造法
RU2460793C2 (ru) 2010-01-15 2012-09-10 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт "Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) Способ получения l-аминокислот с использованием бактерий семейства enterobacteriaceae
RU2010101135A (ru) 2010-01-15 2011-07-20 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт "Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) (RU) Бактерия семейства enterobacteriaceae - продуцент l-аспартата или метаболитов, производных l-аспартата, и способ получения l-аспартата или метаболитов, производных l-аспартата
JP2013074795A (ja) 2010-02-08 2013-04-25 Ajinomoto Co Inc 変異型ｒｐｓＡ遺伝子及びＬ−アミノ酸の製造法
RU2471868C2 (ru) 2010-02-18 2013-01-10 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт "Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) Мутантная аденилатциклаза, днк, кодирующая ее, бактерия семейства enterobacteriaceae, содержащая указанную днк, и способ получения l-аминокислот
JPWO2011129293A1 (ja) * 2010-04-12 2013-07-18 東レ株式会社 １，５−ペンタンジアミンの製造方法
DE102010019059A1 (de) 2010-05-03 2011-11-03 Forschungszentrum Jülich GmbH Sensoren zur intrazellulären Metabolit-Detektion
RU2471870C2 (ru) 2010-06-03 2013-01-10 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт "Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АРГИНИНА И L-ЦИТРУЛЛИНА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ СЕМЕЙСТВА ENTEROBACTERIACEAE, В КОТОРОЙ ОСЛАБЛЕНА ЭКСПРЕССИЯ ГЕНА pepA
RU2010122646A (ru) 2010-06-03 2011-12-10 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт "Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) (RU) Способ получения l-аминокислоты с использованием бактерии семейства enterobacteriaceae, в которой ослаблена экспрессия генов, кодирующих транспортер лизина/аргинина/орнитина
RU2501858C2 (ru) 2010-07-21 2013-12-20 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт "Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АМИНОКИСЛОТЫ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ СЕМЕЙСТВА Enterobacteriaceae
RU2482188C2 (ru) 2010-07-21 2013-05-20 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт "Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АРГИНИНА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИЙ РОДА Escherichia, В КОТОРОЙ ИНАКТИВИРОВАН ОПЕРОН astCADBE
JP2014036576A (ja) 2010-12-10 2014-02-27 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸の製造法
EP2678421B1 (en) * 2011-02-22 2018-04-11 Basf Se Processes and recombinant microorganisms for the production of cadaverine
DE102011006716A1 (de) 2011-04-04 2012-10-04 Evonik Degussa Gmbh Mikroorganismus und Verfahren zur fermentativen Herstellung einer organisch-chemischen Verbindung
JPWO2012157699A1 (ja) 2011-05-18 2014-07-31 味の素株式会社 動物用免疫賦活剤、それを含む飼料及びその製造方法
DE102011118019A1 (de) 2011-06-28 2013-01-03 Evonik Degussa Gmbh Varianten des Promotors des für die Glyzerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase kodierenden gap-Gens
RU2011134436A (ru) 2011-08-18 2013-10-27 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО "АГРИ") Способ получения l-аминокислоты с использованием бактерии семейства enterobacteriaceae, обладающей повышенной экспрессией генов каскада образования флагелл и клеточной подвижности
JP2015013812A (ja) 2011-11-01 2015-01-22 味の素株式会社 植物ウイルスの感染抑制剤およびそれを用いた植物ウイルス感染抑制方法
KR101483344B1 (ko) * 2011-12-21 2015-01-15 씨제이제일제당 (주) Ｌ-라이신 생산능을 갖는 미생물을 이용하여 ｌ-라이신을 생산하는 방법
BR112014021439B1 (pt) 2012-04-27 2021-12-21 Evonik Technochemie Gmbh Polipeptídeo de isopropilmalato sintase e a sequência de nucleotídeos que o codifica, vetor, microrganismo do gênero corynebacterium e uso do mesmo, bem como processo fermentativo para a produção de kic ou l-leucina
DE102012024435A1 (de) 2012-12-14 2014-07-10 Forschungszentrum Jülich GmbH Verfahren zur Identifizierung einer Zelle mit gegenüber ihrem Wildtyp erhöhten intrazellulären Konzentration eines bestimmten Metaboliten, wobei die Veränderung der Zelle durch Rekombi-neering erreicht wird, sowie ein Verfahren zur Herstellung einer gegenüber ihrem Wildtyp genetisch veränderten Produktionszelle mit optimierter Produktion eines bestimmten Metaboliten, ein Verfahren zur Herstellung dieses Metaboliten, sowie dafür geeignete Nukleinsäuren
EP2762571A1 (de) 2013-01-30 2014-08-06 Evonik Industries AG Mikroorganismus und Verfahren zur fermentativen Herstellung von Aminosäuren
RU2013118637A (ru) 2013-04-23 2014-10-27 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО "АГРИ") СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АМИНОКИСЛОТ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ СЕМЕЙСТВА ENTEROBACTERIACEAE, В КОТОРОЙ РАЗРЕГУЛИРОВАН ГЕН yjjK
BR112015007916B1 (pt) 2013-05-13 2023-04-04 Ajinomoto Co., Inc Método para produzir l-aminoácido
HUE032752T2 (en) 2013-06-03 2017-10-30 Evonik Degussa Gmbh A method for the preparation of L-valine using recombinant corynebacteria containing propionate-inducible ilvBN operon
RU2013140115A (ru) 2013-08-30 2015-03-10 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО "АГРИ") СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АМИНОКИСЛОТ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ СЕМЕЙСТВА Enterobacteriaceae, В КОТОРОЙ НАРУШЕНА ЭКСПРЕССИЯ КЛАСТЕРА ГЕНОВ znuACB
JP2016192903A (ja) 2013-09-17 2016-11-17 味の素株式会社 海藻由来バイオマスからのｌ−アミノ酸の製造方法
PL3053999T3 (pl) 2013-10-02 2020-03-31 Ajinomoto Co., Inc. Przyrząd do regulowania poziomu amoniaku i sposób regulowania poziomu amoniaku
RU2013144250A (ru) 2013-10-02 2015-04-10 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО "АГРИ") СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АМИНОКИСЛОТ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ СЕМЕЙСТВА Enterobacteriaceae, В КОТОРОЙ ОСЛАБЛЕНА ЭКСПРЕССИЯ ГЕНА, КОДИРУЮЩЕГО ФОСФАТНЫЙ ТРАНСПОРТЕР
JP6459962B2 (ja) 2013-10-21 2019-01-30 味の素株式会社 Ｌ−アミノ酸の製造法
BR112016008830B1 (pt) 2013-10-23 2023-02-23 Ajinomoto Co., Inc Método para produzir uma substância alvo
RU2014105547A (ru) 2014-02-14 2015-08-20 Адзиномото Ко., Инк. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АМИНОКИСЛОТ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ СЕМЕЙСТВА ENTEROBACTERIACEAE, ИМЕЮЩЕЙ СВЕРХЭКСПРЕССИРУЕМЫЙ ГЕН yajL
RU2015120052A (ru) 2015-05-28 2016-12-20 Аджиномото Ко., Инк. Способ получения L-аминокислоты с использованием бактерии семейства Enterobacteriaceae, в которой ослаблена экспрессия гена gshA
KR101791837B1 (ko) * 2015-08-06 2017-10-31 서울대학교산학협력단 라이신 디카르복실라아제의 변이주 개발 방법 및 그의 응용
WO2017100376A2 (en) 2015-12-07 2017-06-15 Zymergen, Inc. Promoters from corynebacterium glutamicum
US11208649B2 (en) 2015-12-07 2021-12-28 Zymergen Inc. HTP genomic engineering platform
US9988624B2 (en) 2015-12-07 2018-06-05 Zymergen Inc. Microbial strain improvement by a HTP genomic engineering platform
CN109121422B (zh) 2016-02-25 2021-12-21 味之素株式会社 使用过表达编码铁输出蛋白基因的肠杆菌科的细菌生产l-氨基酸的方法
US10544390B2 (en) 2016-06-30 2020-01-28 Zymergen Inc. Methods for generating a bacterial hemoglobin library and uses thereof
KR102345898B1 (ko) 2016-06-30 2022-01-03 지머젠 인코포레이티드 글루코오스 투과 효소 라이브러리를 생성하는 방법 및 이의 용도
CN106222231A (zh) * 2016-07-12 2016-12-14 南京工业大学 一种快速生产高光学纯度d‑赖氨酸的方法
JP2019165635A (ja) * 2016-08-10 2019-10-03 味の素株式会社 Ｌ−アミノ酸の製造法
EP3562938A4 (en) * 2016-12-30 2020-11-11 Cathay Biotech Inc. LYSINE DECARBOXYLASES WITH CHANGES IN THE LEVELS OF TITRABLE AMINO ACIDS
EP3562837A4 (en) * 2016-12-30 2020-12-30 Cathay Biotech Inc. MODIFIED LYSIN DECARBOXYLASE ENZYMES
WO2018126266A1 (en) 2016-12-30 2018-07-05 Quidel Coroporation Phage-mediated immunoassay and methods for determining susceptibility of bacteria to antibiotic or probiotic agents
JP7066977B2 (ja) 2017-04-03 2022-05-16 味の素株式会社 Ｌ－アミノ酸の製造法
CN108795912B (zh) * 2017-05-05 2022-08-02 上海凯赛生物技术股份有限公司 赖氨酸脱羧酶突变体及其应用
DE102017004566A1 (de) 2017-05-11 2018-11-15 Forschungszentrum Jülich GmbH Pyruvatcarboxylase und für die Pyruvatcarboxylase kodierende DNA, Plasmid enthaltend die DNA, sowie Mikroorganismus zur Produktion und Verfahren zur Herstellung von Produkten, deren Biosynthese Oxalacetat als Vorstufe beinhaltet, Chromosom und Screeningverfahren
CN111748549B (zh) * 2017-05-16 2022-09-23 中国科学院天津工业生物技术研究所 新的赖氨酸脱羧酶突变体及其应用
DE102017004751A1 (de) 2017-05-18 2018-11-22 Forschungszentrum Jülich GmbH Pyruvatcarboxylase und für die Pyruvatcarboxylase kodierende DNA, Plasmid enthaltend die DNA, sowie Mikroorganismus zur Produktion und verfahren zur Herstellung von Produkten, deren Bioynthese Oxalacetat als Vorstufe beeinhaltet und Chromosom
DE102017004750A1 (de) 2017-05-18 2018-11-22 Forschungszentrum Jülich GmbH Pyruvvatcarboxylase und für die Pyrovatcarboxylase kodierende DNA, Plasmid enthaltend die DNA, sowie Mikroorganismen zur Produktion und Verfahren zur Herstellung von Produkten, deren Biosynthese Oxalacetat als Vorstufe beeinhaltet und Chromsom
KR20200026881A (ko) 2017-06-07 2020-03-11 지머젠 인코포레이티드 코리네박테리움 글루타미컴으로부터의 프로모터 및 보조 유전자 발현을 조절하는 데 이의 용도
US20190100811A1 (en) 2017-10-02 2019-04-04 Quidel Corporation Phage-based detection method for antimicrobial susceptibility testing and identification of bacterial species
EP3861109A1 (en) 2018-10-05 2021-08-11 Ajinomoto Co., Inc. Method for producing target substance by bacterial fermentation
WO2020081958A2 (en) * 2018-10-18 2020-04-23 The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate Compositions and methods for identifying mutations of genes of multi-gene systems having improved function
JP7491312B2 (ja) 2018-12-27 2024-05-28 味の素株式会社 腸内細菌科の細菌の発酵による塩基性ｌ－アミノ酸またはその塩の製造方法
JP7491314B2 (ja) 2019-02-22 2024-05-28 味の素株式会社 ｙｄｉＪ遺伝子を過剰発現する腸内細菌科に属する細菌を用いたＬ－アミノ酸の製造方法
WO2020204179A1 (en) 2019-04-05 2020-10-08 Ajinomoto Co., Inc. Method of producing l-amino acids
WO2021060438A1 (en) 2019-09-25 2021-04-01 Ajinomoto Co., Inc. Method for producing l-amino acids by bacterial fermentation
CN111117940B (zh) * 2019-12-04 2022-06-28 天津大学 一种高产戊二胺的大肠杆菌工程菌与方法
TWI748408B (zh) * 2020-04-14 2021-12-01 中國石油化學工業開發股份有限公司 用於生產1,5-戊二胺之重組微生物及方法
CN117737102A (zh) * 2020-07-02 2024-03-22 中国科学院过程工程研究所 一种用于合成戊二胺的赖氨酸脱羧酶及其应用
EP4182450A1 (en) 2020-07-15 2023-05-24 Evonik Operations GmbH Polynucleotide encoding an amino acid sequence, encoding an oxidoreductase
JP7696228B2 (ja) * 2021-04-30 2025-06-20 旭化成株式会社 組換え微生物及び化合物の製造方法
US20240336948A1 (en) 2021-08-09 2024-10-10 Evonik Operations Gmbh Method for producing a recombinant bacterial collagen-like protein (clp)
CN117813315A (zh) 2021-08-09 2024-04-02 赢创运营有限公司 用于生产重组细菌胶原样蛋白(clp)的方法
EP4384539A1 (en) 2021-08-09 2024-06-19 Evonik Operations GmbH Polynucleotide encoding a bacterial collagen-like protein
CN117999103A (zh) 2021-09-20 2024-05-07 赢创运营有限公司 非粘附性胶原蛋白样水凝胶
WO2023161038A1 (en) 2022-02-25 2023-08-31 Evonik Operations Gmbh Sponges based on collagen-like proteins
CN118974074A (zh) 2022-03-01 2024-11-15 赢创运营有限公司 通过重组微生物生物技术生产胶原蛋白和细菌胶原蛋白样蛋白
CN119012914A (zh) 2022-04-04 2024-11-22 味之素株式会社 防治寄生植物的方法
CN115089733B (zh) * 2022-06-28 2024-05-24 滨州医学院 用于治疗高赖氨酸血症的组合物及应用
CN114990043B (zh) * 2022-06-28 2024-04-30 滨州医学院 代谢赖氨酸的工程菌及其构建方法与应用
WO2024251576A1 (en) 2023-06-06 2024-12-12 Evonik Operations Gmbh Hydrogel patch made from a collagen-like protein (clp)
WO2025016819A1 (en) 2023-07-20 2025-01-23 Evonik Operations Gmbh Sponge comprising a recombinant collagen-like peptide (clp) and bioactive glass
WO2025186007A1 (en) 2024-03-08 2025-09-12 Evonik Operations Gmbh Collagen-like protein coated medical devices and coating method thereof

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB820268A (en) * 1955-12-09 1959-09-16 Pfizer & Co C Preparation of lysine
JPS519393B2 (cs) * 1973-09-22 1976-03-26
SU1433981A1 (ru) * 1986-11-04 1988-10-30 Научно-производственное объединение "Фермент" Способ получени ферментного препарата L-лизиндекарбоксилазы
GB8725333D0 (en) * 1987-10-29 1987-12-02 Monsanto Europe Sa Immobilised enzymes
RU2081108C1 (ru) * 1991-10-16 1997-06-10 Циба-Гейги АГ Аддитивные соли кислот с основанием и фармацевтическая композиция, обладающая противоопухолевой активностью
EP0796912B9 (en) * 1994-12-09 2013-08-28 Ajinomoto Co., Inc. Novel lysine decarboxylase gene and process for producing l-lysine

Also Published As

Publication number Publication date
MY113738A (en) 2002-05-31
AU703308B2 (en) 1999-03-25
DE69534801T2 (de) 2006-10-05
CN100357431C (zh) 2007-12-26
CN101220366A (zh) 2008-07-16
SK283478B6 (sk) 2003-08-05
PL320645A1 (en) 1997-10-13
DK0796912T3 (da) 2006-04-10
ES2256850T3 (es) 2006-07-16
HU223706B1 (hu) 2004-12-28
PE59996A1 (es) 1996-12-26
CZ174697A3 (en) 1997-11-12
AU3994895A (en) 1996-06-26
ZA9510442B (en) 1996-06-19
EP0796912A1 (en) 1997-09-24
JP3692538B2 (ja) 2005-09-07
EP0796912B2 (en) 2012-12-12
EP0796912A4 (en) 2001-03-21
CA2207271C (en) 2010-09-21
DE69534801D1 (de) 2006-04-27
MX9704236A (es) 1998-01-31
CN1175280A (zh) 1998-03-04
KR100420743B1 (ko) 2004-05-24
DE69534801T3 (de) 2013-05-08
SK70297A3 (en) 1998-01-14
ES2256850T5 (es) 2013-04-15
EP0796912B9 (en) 2013-08-28
HUT77752A (hu) 1998-07-28
DE69534801T8 (de) 2008-09-04
PL182903B1 (pl) 2002-03-29
DK0796912T4 (da) 2013-03-25
RU2188235C2 (ru) 2002-08-27
CN101220366B (zh) 2011-10-05
EP0796912B1 (en) 2006-02-22
AU703308C (en) 1996-06-26
CA2207271A1 (en) 1996-06-13
WO1996017930A1 (fr) 1996-06-13
BR9509896A (pt) 1997-12-30
US5827698A (en) 1998-10-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CZ290070B6 (cs) Gen ldc kódující lysindekarboxylázu, mikroorganismus a způsob výroby L-lysinu
KR101208480B1 (ko) 말산 효소 활성이 감쇠된 에스케리키아 세균을 사용하는ｌ-라이신 또는 ｌ-트레오닌의 생산방법
JP3331472B2 (ja) 発酵法によるｌ−スレオニンの製造法
EP0811682B2 (en) Method of producing L-lysine
US10526586B2 (en) Pyruvate dehydrogenase variants, a microorganism comprising the same and a method for producing L-amino acid using the same
US8486670B2 (en) Method of producing L-threonine using Escherichia coli strain with phosphoenolpyruvate carboxylase promoter replaced with cysteine synthase promoter
JPH10113183A (ja) 発酵法によるｌ−アミノ酸の製造法
JP2000139471A (ja) 発酵法によるｌ−メチオニンの製造法
JP2001046067A (ja) 好熱性バチルス属細菌由来のｌ−リジン生合成系遺伝子
US20040229311A1 (en) Novel lysine decarboxylase gene and method for producing L-lysine
BR112018000074B1 (pt) Micro-organismo que produz l-lisina e método para produzir l-lisina com o uso do mesmo
CN112725254A (zh) 一种l-高丝氨酸的生产菌株及其构建方法和应用
DK2430152T3 (en) A microorganism with increased L-lysine productivity and method for producing L-lysine using the same
JP4495788B2 (ja) 温度感受性ｄｔｓＲ遺伝子
US20230040524A1 (en) Novel modified polypeptide with attenuated activity of citrate synthase and method for producing l-amino acid using the same
JP3767066B2 (ja) 新規遺伝子
CN116555136A (zh) 一种修饰的棒状杆菌属微生物及其构建方法与应用
CN116555135A (zh) 高产苏氨酸基因工程菌的构建方法
CN116622599A (zh) 高产苏氨酸菌株的构建方法
MXPA97010044A (en) Method to produce l-lysine by means of fermentation
JP2007135602A (ja) Ｌ−グルタミン酸の製造法
JP2004242564A (ja) メチロフィラス属細菌のベクター

Legal Events

Date Code Title Description
PD00 Pending as of 2000-06-30 in czech republic
MK4A Patent expired

Effective date: 20151205