KR101773755B1 - Ｌ-아미노산의 제조법 - Google Patents

Ｌ-아미노산의 제조법 Download PDF

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Abstract

L-아미노산의 제조법을 제공한다. 인산 트랜스포터의 활성이 증대되도록 개변된 L-아미노산 생산능을 갖는 코리네형 세균을 배지에서 배양하고, 상기 배지로부터 L-아미노산을 채취함으로써 L-아미노산을 제조한다.

Description

Ｌ-아미노산의 제조법{METHOD FOR PRODUCING L-AMINO ACID}
본 발명은, 코리네형 세균을 이용한 L-아미노산의 제조법에 관한 것이다. L-아미노산은, 동물 사료용의 첨가물, 조미료나 음식물의 성분, 또는 아미노산 수액 등으로서 산업상 유용하다.
L-아미노산은, 예를 들면, L-아미노산 생산능을 갖는 각종 미생물을 이용한 발효에 의해 공업 생산되고 있다. 발효에 의한 L-아미노산의 제조법으로서는, 예를 들면, 야생형 미생물(야생주)을 사용하는 방법, 야생주로부터 유도된 영양 요구주를 사용하는 방법, 야생주로부터 각종 약제 내성 변이주로서 유도된 대사 조절 변이주를 사용하는 방법, 영양 요구주와 대사 조절 변이주 양쪽의 성질을 갖는 균주를 사용하는 방법이 열거된다.
또한, 최근에는, 재조합 DNA 기술에 의해 L-아미노산 생산능이 향상된 미생물이 L-아미노산의 제조에 이용되고 있다. 미생물의 L-아미노산 생산능을 향상시키는 방법으로서는, 예를 들면, L-아미노산 생합성계 효소를 암호화하는 유전자의 발현을 증강시키는 것(특허문헌 1, 특허문헌 2), 및 L-아미노산 생합성계에의 탄소원의 유입을 증강시키는 것(특허문헌 3)이 열거된다.
에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)는 적어도 2종의 무기 인산 흡수계를 갖는다(비특허문헌 1). 하나는 저친화성의 무기 인산 트랜스포터(low-affinity inorganic phosphate transporter; Pit)계이고, 다른 하나는 고친화성의 인산 특이적 트랜스포터(high-affinity phosphate-specific transporter; Pst)계이다. Pit계를 암호화하는 유전자로서는 pitA 유전자나 pitB 유전자가 공지되어 있다. Pst계를 암호화하는 유전자로서는 pstSCAB 유전자가 공지되어 있고, pstSCAB 유전자의 산물은 복합체를 형성하여 Pst계로서 기능한다. 그러나, 이들 인산 트랜스포터의 활성과 L-아미노산 생산과의 관계는 알려져 있지 않았다.
특허문헌 1: 미국 특허 제5,168,056호 명세서 특허문헌 2: 미국 특허 제5,776,736호 명세서 특허문헌 3: 미국 특허 제5,906,925호 명세서
비특허문헌 1: R. M. Harris et al., Journal of Bacteriology, Sept. 2001, p5008-5014
본 발명은, 코리네형 세균의 L-아미노산 생산능을 향상시키는 신규한 기술을 개발하고, 효율적인 L-아미노산의 제조법을 제공하는 것을 과제로 한다.
본 발명자는, 상기 과제를 해결하기 위해 예의 연구를 행한 결과, 인산 트랜스포터의 활성이 증대되도록 코리네형 세균을 개변시킴으로써, 코리네형 세균의 L-아미노산 생산능이 향상될 수 있음을 발견하여, 본 발명을 완성하였다.
즉, 본 발명은 이하와 같이 예시될 수 있다.
[1]
L-아미노산 생산능을 갖는 코리네형 세균을 배지에서 배양하는 것, 및
상기 배지로부터 L-아미노산을 채취하는 것을 포함하는, L-아미노산의 제조법으로서,
상기 세균은, 인산 트랜스포터의 활성이 증대되도록 개변되어 있는 것을 특징으로 하는, 방법.
[2]
인산 트랜스포터를 암호화하는 유전자의 발현을 상승시킴으로써 인산 트랜스포터의 활성이 증대되는, 상기 방법.
[3]
상기 유전자가 pitA 유전자인, 상기 방법.
[4]
상기 pitA 유전자가, 하기 (a) 또는 (b)에 기재된 DNA인, 상기 방법:
(a) 서열번호 5 또는 서열번호 25에 나타낸 염기 서열을 갖는 DNA,
(b) 서열번호 5 또는 서열번호 25에 나타낸 염기 서열의 상보 서열 또는 상기 상보 서열로부터 조제될 수 있는 프로브와 엄격한 조건 하에 하이브리드화하고, 또한, 인산 트랜스포터 활성을 갖는 단백질을 암호화하는, DNA.
[5]
상기 pitA 유전자가, 하기 (A) 또는 (B)에 기재된 단백질을 암호화하는 DNA인, 상기 방법:
(A) 서열번호 6 또는 서열번호 26에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 단백질,
(B) 서열번호 6 또는 서열번호 26에 나타낸 아미노산 서열에 있어서, 1개 또는 수개의 아미노산 잔기의 치환, 결실, 삽입, 또는 부가를 포함하는 아미노산 서열을 갖고, 또한, 인산 트랜스포터 활성을 갖는, 단백질.
[6]
상기 유전자의 발현이, 상기 유전자의 카피 수를 증가시키고/시키거나 상기 유전자의 발현 조절 서열을 개변시킴에 의해 상승되는, 상기 방법.
[7]
서열번호 6의 위치 246의 페닐알라닌 잔기에 상당하는 아미노산 잔기가 페닐알라닌 이외의 아미노산 잔기로 치환되는 변이를 갖는 인산 트랜스포터를 암호화하는 변이형 pitA 유전자를 상기 세균이 보유함으로써, 인산 트랜스포터의 활성이 증대되는, 상기 방법.
[8]
서열번호 6의 위치 246의 페닐알라닌 잔기에 상당하는 아미노산 잔기가 세린 잔기로 치환된 것을 특징으로 하는, 상기 방법.
[9]
L-아미노산 생산능을 갖는 코리네형 세균을 배지에서 배양하는 것, 및
상기 배지로부터 L-아미노산을 채취하는 것을 포함하는, L-아미노산의 제조법으로서,
상기 세균은, 서열번호 6의 위치 246의 페닐알라닌 잔기에 상당하는 아미노산 잔기가 페닐알라닌 이외의 아미노산 잔기로 치환되는 변이를 갖는 인산 트랜스포터를 암호화하는 변이형 pitA 유전자를 보유하는 것을 특징으로 하는, 방법.
[10]
서열번호 6 내의 위치 246에서의 페닐알라닌 잔기에 상당하는 아미노산 잔기가 세린 잔기로 치환된 것을 특징으로 하는, 상기 방법.
[11]
상기 세균이 코리네박테리움(Corynebacterium) 속 세균인, 상기 방법.
[12]
상기 코리네형 세균이 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)인, 상기 방법.
[13]
상기 L-아미노산이 L-글루탐산인, 상기 방법.
[14]
상기 L-글루탐산이 L-글루탐산 암모늄 또는 L-글루탐산 나트륨인, 상기 방법.
[15]
서열번호 6의 위치 246의 페닐알라닌 잔기에 상당하는 아미노산 잔기가 세린 잔기로 치환되는 변이를 갖는 인산 트랜스포터를 암호화하는, DNA.
[16]
서열번호 6의 위치 246의 페닐알라닌 잔기에 상당하는 아미노산 잔기가 세린 잔기로 치환되는 변이를 갖는 인산 트랜스포터를 암호화하는 변이형 pitA 유전자를 보유하는, 코리네형 세균.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명의 방법은, L-아미노산 생산능을 갖는 코리네형 세균을 배지에서 배양하는 것, 및 상기 배지로부터 L-아미노산을 채취하는 것을 포함하는, L-아미노산의 제조법으로서, 상기 세균은, 인산 트랜스포터의 활성이 증대되도록 개변되어 있는 것을 특징으로 하는, 방법이다. 상기 방법에 사용되는 코리네형 세균을 「본 발명의 세균」이라고도 한다.
<1> 본 발명의 세균
본 발명의 세균은, 인산 트랜스포터의 활성이 증대되도록 개변되어 있는, L-아미노산 생산능을 갖는 코리네형 세균이다.
<1-1> L-아미노산 생산능을 갖는 코리네형 세균
본 발명에 있어서, 「L-아미노산 생산능을 갖는 세균」이란, 배지에서 배양할 때에, 목적으로 하는 L-아미노산을 생성하여, 회수할 수 있는 정도로 배지 중 또는 균체 내에 축적시키는 능력을 갖는 세균을 말한다. L-아미노산 생산능을 갖는 세균은, 비개변주보다도 많은 양의 목적으로 하는 L-아미노산을 배지에 축적시킬 수 있는 세균이어도 좋다. 비개변주로서는 야생주나 친주가 열거된다. 또한, L-아미노산 생산능을 갖는 세균은, 바람직하게는 0.5g/L 이상, 보다 바람직하게는 1.0g/L 이상의 양의 목적으로 하는 L-아미노산을 배지에 축적할 수 있는 세균이어도 좋다.
L-아미노산으로서는, L-리신, L-오르니틴, L-아르기닌, L-히스티딘, L-시트룰린 등의 염기성 아미노산, L-이소류신, L-알라닌, L-발린, L-류신, 글리신 등의 지방족 아미노산, L-트레오닌, L-세린 등의 하이드록시모노아미노카복실산인 아미노산, L-프롤린 등의 환식 아미노산; L-페닐알라닌, L-티로신, L-트립토판 등의 방향족 아미노산, L-시스테인, L-시스틴, L-메티오닌 등의 함황 아미노산, L-글루탐산, L-아스파라긴산 등의 산성 아미노산, L-글루타민, L-아스파라긴 등의 측쇄에 아미드기를 갖는 아미노산이 열거된다. 본 발명의 세균은, 2종 또는 그 이상의 아미노산의 생산능을 가져도 좋다.
본 발명에 있어서, 아미노산은, 특별히 기재하지 않는 한, 임의의 L-아미노산이다. L-아미노산은, 유리체, 이의 염, 또는 이들의 혼합물이어도 좋다. 즉, 본 발명에 있어서, 「L-아미노산」이라고 하는 용어는, 유리체의 L-아미노산, 이의 염, 또는 이들의 혼합물을 의미하여도 좋다. 염으로서는, 예를 들면, 황산염, 염산염, 탄산염, 암모늄염, 나트륨염, 칼륨염이 열거된다. 예를 들면, L-리신은, 유리체의 L-리신, L-리신 황산염, L-리신 염산염, L-리신 탄산염, 또는 이들의 혼합물이어도 좋다. 또한, 예를 들면, L-글루탐산은 유리체의 L-글루탐산, L-글루탐산 나트륨(MSG), L-글루탐산 암모늄염, 또는 이들의 혼합물이어도 좋다.
코리네형 세균으로서는, 코리네박테리움(Corynebacterium) 속, 브레비박테리움(Brevibacterium) 속, 및 마이크로박테리움(Microbacterium) 속 등의 속에 속하는 세균이 열거된다.
코리네형 세균으로서는 구체적으로는 하기와 같은 종이 열거된다.
코리네박테리움 아세토아시도필룸(Corynebacterium acetoacidophilum)
코리네박테리움 아세토글루타미쿰(Corynebacterium acetoglutamicum)
코리네박테리움 알카노리티쿰(Corynebacterium alkanolyticum)
코리네박테리움 칼루나에(Corynebacterium callunae)
코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)
코리네박테리움 릴리움(Corynebacterium lilium)
코리네박테리움 멜라세콜라(Corynebacterium melassecola)
코리네박테리움 써모아미노게네스(코리네박테리움 에피시엔스)(Corynebacterium thermoaminogenes(Corynebacterium efficiens))
코리네박테리움 헤르쿨리스(Corynebacterium herculis)
브레비박테리움 디바리카툼(코리네박테리움 글루타미쿰)(Brevibacterium divaricatum(Corynebacterium glutamicum))
브레비박테리움 플라붐(코리네박테리움 글루타미쿰)(Brevibacterium flavum(Corynebacterium glutamicum))
브레비박테리움 임마리오필룸(Brevibacterium immariophilum)
브레비박테리움 락토퍼멘툼(코리네박테리움 글루타미쿰)(Brevibacterium lactofermentum(Corynebacterium glutamicum))
브레비박테리움 로세움(Brevibacterium roseum)
브레비박테리움 사카로리티쿰(Brevibacterium saccharolyticum)
브레비박테리움 티오게니탈리스(Brevibacterium thiogenitalis)
코리네박테리움 아미노게네스(코리네박테리움 스타티오니스)(Corynebacterium ammoniagenes(Corynebacterium stationis))
브레비박테리움 알붐(Brevibacterium album)
브레비박테리움 세리눔(Brevibacterium cerinum)
마이크로박테리움 암모니아필룸(Microbacterium ammoniaphilum)
코리네형 세균으로서는 구체적으로는 하기와 같은 균주가 열거된다.
Corynebacterium acetoacidophilm ATCC 13870
Corynebacterium acetoglutamicum ATCC 15806
Corynebacterium alkanolyticum ATCC 21511
Corynebacterium callunae ATCC 15991
Corynebacterium glutamicum ATCC 13020, ATCC 13032, ATCC 13060, ATCC 13869, FERM BP-734
Corynebacterium lilium ATCC 15990
Corynebacterium melassecola ATCC 17965
Corynebacterium efficiens(Corynebacterium thermoaminogenes) AJ12340 (FERM BP-1539)
Corynebacterium herculis ATCC 13868
Corynebacterium glutamicum(Brevibacterium divaricatum) ATCC 14020
Corynebacterium glutamicum(Brevibacterium flavum) ATCC 13826, ATCC 14067, AJ12418 (FERM BP-2205)
Brevibacterium immariophilum ATCC 14068
Corynebacterium glutamicum(Brevibacterium lactofermentum) ATCC 13869
Brevibacterium roseum ATCC 13825
Brevibacterium saccharolyticum ATCC 14066
Brevibacterium thiogenitalis ATCC 19240
Corynebacterium ammoniagenes(Corynebacterium stationis) ATCC 6871, ATCC 6872
Brevibacterium album ATCC 15111
Brevibacterium cerinum ATCC 15112
Microbacterium ammoniaphilum ATCC 15354
또한, 코리네박테리움 속 세균으로는, 종래 브레비박테리움 속으로 분류되었지만, 현재 코리네박테리움 속으로 통합된 세균(Int. J. Syst. Bacteriol., 41, 255(1991))도 포함된다. 또한, 코리네박테리움 스타티오니스로는, 종래 코리네박테리움 암모니아게네스로 분류되었지만, 16S rRNA의 염기 서열 해석 등에 의해 코리네박테리움 스타티오니스로 재분류된 세균도 포함된다(Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 60, 874-879(2010)).
이러한 균주는, 예를 들면, 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(주소 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852 P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108, United States of America)로부터 분양을 받을 수 있다. 즉, 각 균주에 대응하는 등록 번호가 부여되어 있고, 이의 등록 번호를 이용하여 분양을 받을 수 있다(http://www.atcc.org/참조). 각 균주에 대응하는 등록 번호는, 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션의 카탈로그에 기재되어 있다.
본 발명의 세균은, 본래적으로 L-아미노산 생산능을 갖는 것이어도 좋고, L-아미노산 생산능을 갖도록 개변된 것이어도 좋다. L-아미노산 생산능을 갖는 세균은, 예를 들면, 상기한 바와 같은 세균에게 L-아미노산 생산능을 부여함으로써, 또는 상기한 바와 같은 세균의 L-아미노산 생산능을 증강시킴으로써, 취득될 수 있다.
L-아미노산 생산능의 부여 또는 증강은, 종래, 코리네형 세균 또는 에스케리키아 속 세균 등의 아미노산 생산균의 육종에 채용되어 온 방법에 의해 행할 수 있다(아미노산 발효, (주) 가카이 슈판 센터, 1986년 5월 30일 초판 발행, 제77~100쪽 참조). 이와 같은 방법으로서는, 예를 들면, 영양요구성 변이주의 취득, L-아미노산의 유사체 내성주의 취득, 대사 제어 변이주의 취득, L-아미노산의 생합성계 효소의 활성이 증강된 재조합주의 창제가 열거된다. L-아미노산 생산균의 육종에 있어서, 부여되는 영양요구성, 유사체 내성, 대사 제어 변이 등의 성질은 단독이어도 좋고, 2종 또는 3종 이상이어도 좋다. 또한, L-아미노산 생성균의 육종에 있어서, 활성이 증강되는 L-아미노산 생합성계 효소도 단독이어도 좋고, 2종 또는 3종 이상이어도 좋다. 또한, 영양요구성, 유사체 내성, 및 대사 제어 변이 등의 성질의 부여와 생합성계 효소의 활성의 증강이 조합되어도 좋다.
L-아미노산 생산능을 갖는 영양요구성 변이주, 유사체 내성주, 또는 대사 제어 변이주는, 친주 또는 야생주를 통상의 변이 처리에 제공하고, 얻어진 변이주 중에서 영양요구성, 유사체 내성, 또는 대사 제어 변이를 나타내고, 또한, L-아미노산 생산능을 갖는 것을 선택함으로써 취득할 수 있다. 통상의 변이 처리로서는 X선이나 자외선의 조사, N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘(MNNG), 에틸 메탄설포네이트(EMS), 메틸 메탄설포네이트(MMS) 등의 변이제에 의한 처리가 열거된다.
또한, L-아미노산 생산능의 부여 또는 증강은, 목적의 L-아미노산의 생합성에 관여하는 효소의 활성을 증강시킴으로써도 행할 수 있다. 효소 활성의 증강은, 예를 들면, 상기 효소를 암호화하는 유전자의 발현이 증강되도록 세균을 개변시킴으로써 행할 수 있다. 유전자의 발현을 증강시키는 방법은 WO00/18935호 팜플렛, 유럽 특허 출원 공개 1010755호 명세서 등에 기재되어 있다. 효소 활성을 증강시키는 상세한 방법에 대해서는 후술한다.
또한, L-아미노산 생산능의 부여 또는 증강은, 목적의 L-아미노산의 생합성 경로로부터 분기하여 목적의 L-아미노산 이외의 화합물을 생성하는 반응을 촉매하는 효소의 활성을 저하시킴으로써도 행할 수 있다. 또한, 여기에서 말하는 「목적의 L-아미노산의 생합성 경로로부터 분기하여 목적의 L-아미노산 이외의 화합물을 생성하는 반응을 촉매하는 효소」로는, 목적의 아미노산의 분해에 관여하는 효소도 포함된다. 효소 활성을 저하시키는 방법에 대해서는 후술한다.
이하, L-아미노산 생산균, 및 L-아미노산 생산능을 부여 또는 증강시키는 방법에 대해서는 구체적으로 예시한다. 또한, 이하에 예시되는 바와 같은 L-아미노산 생산균이 갖는 성질 및 L-아미노산 생산능을 부여 또는 증강시키기 위한 개변은 어느 것이라도 단독으로 이용하여도 좋고, 적당히 조합하여 이용하여도 좋다.
<L-글루탐산 생산균>
L-글루탐산 생산균 또는 이를 유도하기 위한 친주로서는, L-글루탐산 생합성계 효소로부터 선택되는 1개 또는 그 이상의 효소의 활성이 증강되는 균주가 열거된다. 이와 같은 효소로서는, 특별하게 제한되지 않지만, 글루타메이트 데하이드로게나제(ghdA), 글루타민 합성효소(glnA), 글루타메이트 합성효소(gltBD), 이소시트레이트 데하이드로게나제(icdA), 아코니테이트 수화효소(acnA, acnB), 시트르산 합성효소(gltA), 메틸시트르산 합성효소(prpC), 포스포엔올피루베이트 카복실라제(ppc), 피루베이트 데하이드로게나제(aceEF, lpdA), 피루베이트 키나제(pykA, pykF), 포스포엔올피루베이트 합성효소(ppsA), 엔올라제(eno), 포스포글리세로뮤타제(pgmA, pgmI), 포스포글리세레이트 키나제(pgk), 글리세르알데하이드-3-포스페이트 데하이드로게나제(gapA), 트리오스 포스페이트 이소머라제(tpiA), 프럭토스 비스포스페이트 알돌라제(fbp), 포스포프럭토키나제(pfkA, pfkB), 글루코스 포스페이트 이소머라제(pgi), 6-포스포글루콘산 수화효소(edd), 2-케토-3-데옥시-6-포스포글루콘산 알돌라제(eda), 트랜스하이드로게나제가 열거된다. 또한, 괄호 안은 이의 효소를 암호화하는 유전자의 약기호이다(이하의 기재에 있어서도 동일함). 이들 효소 중에서는, 예를 들면, 글루타메이트 데하이드로게나제, 시트르산 합성효소, 포스포엔올 피루베이트 카복실라제, 및 메틸시트르산 합성효소로부터 선택되는 1개 또는 그 이상의 효소의 활성을 증강시키는 것이 바람직하다.
글루탐산 합성효소 유전자(gltBD)의 발현이 증대되도록 개변시키는 코리네형 세균으로서는, WO99/07853에 개시된 것이 열거된다.
또한, L-글루탐산 생산균 및 이를 유도하기 위한 친주로서는, L-글루탐산의 생합성 경로로부터 분기하여 L-글루탐산 이외의 화합물을 생성시키는 반응을 촉매하는 효소로부터 선택되는 1종 또는 그 이상의 효소의 활성이 저하 또는 결손되어 있는 균주도 열거된다. 이러한 효소로서는, 특별히 제한되지 않지만, 이소시트레이트 분해효소(aceA), α-케토글루타레이트 데하이드로게나제(sucA, odhA), 포스포트랜스아세틸라제(pta), 아세테이트 키나제(ack), 아세토하이드록시산 합성효소(ilvG), 아세토락테이트 합성효소(ilvI), 포르메이트 아세틸트랜스퍼라제(pfl), 락테이트 데하이드로게나제(ldh), 글루타메이트 데카복실라제(gadAB), 석신산 데하이드로게나제(sdhABCD), 및 1-피롤린-5-카복실레이트 데하이드로게나제(putA)가 열거된다.
α-케토글루타르산 데하이드로게나제 활성이 저하 또는 결손된 코리네형 세균, 및 이들의 취득 방법은 WO2008/075483에 기재되어 있다. α-케토글루타레이트 데하이드로게나제 활성이 저하 또는 결손된 코리네형 세균으로서, 구체적으로는, 예를 들면, 하기의 균주가 열거된다.
Corynebacterium glutamicum(Brevibacterium lactofermentum) L30-2주 (일본 공개특허공보 특개2006-340603호 명세서)
Corynebacterium glutamicum(Brevibacterium lactofermentum) ΔS주 (국제 공개 95/34672호 팜플렛)
Corynebacterium glutamicum(Brevibacterium lactofermentum) AJ12821 (FERM BP-4172, 프랑스 특허 공보 9401748호 명세서 참조)
Corynebacterium glutamicum(Brevibacterium flavum) AJ12822 (FERM BP-4173, 프랑스 특허 공보 9401748호 명세서)
Corynebacterium glutamicum AJ12823 (FERM BP-4174, 프랑스 특허 공보 9401748호 명세서)
Corynebacterium glutamicum L30-2주(일본 공개특허공보 특개2006-340603호)
또한, L-글루탐산 생산균 또는 이를 유도하기 위한 친주로서는, α-케토글루타레이트 데하이드로게나제(sucA) 활성 및 석신산 데하이드로게나제(sdh) 활성의 양쪽이 저하 또는 결손된 균주도 열거된다(일본 공개특허공보 특개2010-041920호). 이러한 균주로서, 구체적으로는, 예를 들면, Corynebacterium glutamicum ATCC14067의 odhAsdhA 이중 결손주(Corynebacterium glutamicum 8L3GΔSDH주)가 열거된다(일본 공개특허공보 특개2010-041920호).
또한, L-글루탐산 생산균 또는 이를 유도하기 위한 친주로서는, D-크실룰로스-5-인산포스포케톨라제 및/또는 프럭토스-6-인산포스포케톨라제 활성이 증강되도록 개변된 균주도 열거된다(일본 공표특허공보 특표 2008-509661). D-크실룰로스-5-인산포스포케톨라제 활성 및 프럭토스-6-인산 포스포케톨라제 활성은 어느 하나를 증강시켜도 좋거나, 양쪽을 증강시켜도 좋다. 또한, 본 명세서에서는 D-크실룰로스-5-인산-포스포케톨라제와 프럭토스-6-인산포스포케톨라제를 총체적으로 포스포케톨라제라고 칭하기도 한다.
D-크실룰로스-5-인산포스포케톨라제 활성이란, 인산을 소비하여 크실룰로스-5-인산을 글리세르알데하이드-3-인산과 아세틸인산으로 변환시켜 1분자의 H2O를 방출하는 활성을 의미한다. 이의 활성은 Goldberg, M. 등의 문헌(Methods Enzymol., 9, 515-520 (1996)), 또는 L. Meile의 문헌(J. Bacteriol. (2001) 183; 2929-2936)에 기재되어 있는 방법에 의해 측정할 수 있다.
또한, 프럭토스-6-인산포스포케톨라제 활성이란, 인산을 소비하여 프럭토스-6-인산을 에리스로스-4-인산과 아세틸인산으로 변환시켜 1분자의 H2O를 방출하는 활성을 의미한다. 이의 활성은 Racker, E의 문헌(Methods Enzymol., 5, 276-280 (1962)), 또는 L. Meile의 문헌(J. Bacteriol. (2001) 183; 2929-2936)에 기재되어 있는 방법에 의해 측정할 수 있다.
또한, 코리네형 세균에 관해서, L-글루탐산 생산능을 부여 또는 증강시키는 방법으로서는 유기산 유사체나 호흡 저해제 등에의 내성을 부여하는 방법이나 세포벽 합성 저해제에 대한 감수성을 부여하는 방법도 열거된다. 이러한 방법으로서는, 예를 들면, 모노플루오로아세트산 내성을 부여하는 방법(일본 공개특허공보 소50-113209), 아데닌 내성 또는 티민 내성을 부여하는 방법(일본 공개특허공보 소57-065198), 우레아제 활성을 약화시키는 방법(일본 공개특허공보 소52-038088), 말론산 내성을 부여하는 방법(일본 공개특허공보 소52-038088), 벤조피론 내성 또는 나프토퀴논류에의 내성을 부여하는 방법(일본 공개특허공보 소56-1889), HOQNO 내성을 부여하는 방법(일본 공개특허공보 소56-140895), α-케토말론산 내성을 부여하는 방법(일본 공개특허공보 소57-2689), 구아니딘 내성을 부여하는 방법(일본 공개특허공보 소56-35981), 페니실린에 대한 감수성을 부여하는 방법(일본 공개특허공보 평4-88994)이 열거된다.
이러한 내성균 또는 감수성균으로서, 구체적으로는, 예를 들면, 하기의 균주가 열거된다.
Corynebacterium glutamicum(Brevibacterium flavum) AJ3949 (FERM BP-2632; 일본 공개특허공보 소50-113209 참조)
Corynebacterium glutamicum AJ11628 (FERM P-5736; 일본 공개특허공보 소57-065198 참조)
Corynebacterium glutamicum(Brevibacterium flavum) AJ11355 (FERM P-5007; 일본 공개특허공보 소56-1889호 참조)
Corynebacterium glutamicum AJ11368 (FERM P-5020; 일본 공개특허공보 소56-1889호 참조)
Corynebacterium glutamicum(Brevibacterium flavum) AJ11217 (FERM P-4318; 일본 공개특허공보 소57-2869호 참조)
Corynebacterium glutamicum AJ11218 (FERM P-4319; 일본 공개특허공보 소57-2869호 참조)
Corynebacterium glutamicum(Brevibacterium flavum) AJ11564 (FERM P-5472; 일본 공개특허공보 소56-140895 참조)
Corynebacterium glutamicum(Brevibacterium flavum) AJ11439 (FERM P-5136; 일본 공개특허공보 소56-35981호 참조)
Corynebacterium glutamicum H7684 (FERM BP-3004; 일본 공개특허공보 평04-88994호 참조)
Corynebacterium glutamicum(Brevibacterium lactofermentum) AJ11426 (FERM P-5123; 일본 공개특허공보 평56-048890호 참조)
Corynebacterium glutamicum AJ11440 (FERM P-5137; 일본 공개특허공보 평56-048890호 참조)
Corynebacterium glutamicum(Brevibacterium lactofermentum) AJ11796 (FERM P-6402; 일본 공개특허공보 평58-158192호 참조)
또한, 코리네형 세균에 관해서, L-글루탐산 생산능을 부여 또는 증강시키는 방법으로서는 yggB 유전자의 발현을 증강시키는 방법이나 암호화 영역 내에 변이를 도입한 변이형 yggB 유전자를 도입하는 방법도 열거된다(WO2006/070944). yggB 유전자는, 메카노센시티브 채널(mechanosensitive channel)을 암호화하는 유전자이다. Corynebacterium glutamicum ATCC13032의 yggB 유전자는, NCBI 데이터베이스에 Genbank Accession No. NC_003450으로 등록되어 있는 게놈 서열 중 1,336,091 내지 1,337,692의 서열의 상보 서열에 상당하고, NCgl1221이라고도 칭한다. Corynebacterium glutamicum ATCC13032의 yggB 유전자로 암호화되는 YggB 단백질은, GenBank accession No. NP_600492호로서 등록되어 있다. 또한, Corynebacterium glutamicum 2256(ATCC 13869)의 yggB 유전자의 염기 서열, 및 상기 유전자가 암호화된 yggB 단백질의 아미노산 서열을 각각 서열번호 21 및 서열번호 22에 나타낸다.
여기서 사용된 변이형 yggB 유전자로서는, 이하와 같은 변이를 갖는 yggB 유전자를 열거할 수 있다. 또한, 변이형 yggB 유전자로 암호화된 YggB 단백질을 변이형 YggB 단백질이라고 한다. 또한, 당해 변이를 갖지 않는 yggB 유전자 및 상기 유전자로 암호화된 YggB 단백질은 각각 야생형 yggB 유전자 및 야생형 YggB 단백질이라고 한다. 야생형 YggB 단백질로서는, 예를 들면, 서열번호 22에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 단백질이 열거된다.
(1) C 말단측 변이
C 말단측 변이는, 서열번호 22의 아미노산 번호 419 내지 533의 서열을 암호화하는 영역의 염기 서열의 일부에 도입되는 변이이다. C 말단측 변이는, 상기 영역의 염기 서열 중의 적어도 일부에 변이가 도입되는 한 특별하게 제한되는 것은 아니지만, 삽입 서열(이하, 「IS」라고도 함)이나 트랜스포손이 삽입되는 것이 바람직하다. C 말단측 변이는, 아미노산 치환을 따른 것(미스센스 변이)나 상기 IS 등의 삽입에 의해 프레임 시프트 변이가 도입된 것, 논센스 변이가 도입된 것 중 어느 것이어도 좋다. C 말단측 변이를 갖는 변이형 yggB 유전자로서, 구체적으로는, 예를 들면, 서열번호 22의 위치 419의 발린 잔기를 암호화하는 개소에 IS가 삽입된, 야생형 YggB 단백질(서열번호 22)보다도 짧은 전장 423 아미노산 잔기의 변이형 YggB 단백질을 암호화하는 yggB 유전자가 열거된다(일본 공개특허공보 특개2007-222163). 이러한 변이형 yggE 유전자(V419::IS)의 염기 서열, 및 상기 유전자가 암호화된 변이형 YggB 단백질의 아미노산 서열을, 각각 서열번호 23 및 서열번호 24에 나타낸다. 또한, C 말단측 변이로서, 서열번호 22의 아미노산 번호 419 내지 533의 영역에 존재하는 프롤린을 다른 아미노산으로 치환하는 변이도 열거된다.
(2) 막관통 영역의 변이
yggB 유전자가 암호화된 YggB 단백질은, 5개의 막관통 영역들을 갖는 것으로 추측된다. 서열번호 22의 야생형 YggB 단백질의 아미노산 서열에 있어서, 막관통 영역은 각각 아미노산 번호 1 내지 23(제1 막관통 영역), 25 내지 47(제2 막관통 영역), 62 내지 84(제3 막관통 영역), 86 내지 108(제4 막관통 영역), 110 내지 132(제5 막관통 영역)의 영역에 상당한다. yggB 유전자는, 이들 막관통 영역을 암호화하는 영역 내에 변이를 가져도 좋다. 막관통 영역의 변이는, 1개 또는 수개의 아미노산의 치환, 결실, 부가, 삽입, 또는 역위를 포함하는 변이에 있어서, 프레임 시프트 변이 및 논센스 변이를 동반하지 않는 것이 바람직하다. 막관통 영역의 변이로서는, 서열번호 22에 나타낸 아미노산 서열에 있어서, 위치 14의 류신 잔기와 위치 15의 트립토판 잔기 사이에 1개 또는 수개의 아미노산을 삽입하는 변이, 위치 100의 알라닌 잔기를 다른 아미노산 잔기로 치환하는 변이, 및 위치 111의 알라닌 잔기를 다른 아미노산 잔기로 치환하는 변이 등이 열거된다. 또한, 상기 「1개 또는 수개」란, 구체적으로는, 바람직하게는 1 내지 20개이고, 보다 바람직하게는 1 내지 10개이고, 더욱 바람직하게는 1 내지 5개이고, 특히 바람직하게는 1 내지 3개를 의미한다.
또한, 야생형 YggB 단백질이 서열번호 22에 나타낸 아미노산 서열 이외의 아미노산 서열을 갖는 경우, 변이형 yggB 유전자는, 서열번호 22에 있어서의 상기 개소의 아미노산 잔기에 상당하는 아미노산 잔기를 암호화하는 영역에 변이를 가져도 좋다. 임의의 야생형 YggB 단백질에 있어서, 임의의 아미노산 잔기가 「서열번호 22에 있어서의 상기 개소의 아미노산 잔기에 상당하는 아미노산 잔기」인지는, 당해 야생형 YggB 단백질의 아미노산 서열과 서열번호 22의 아미노산 서열 사이의 정렬을 행함으로써 결정될 수 있다. 이러한 변이형 yggB 유전자나 변이형 YggB 단백질의 변이체에 대해서는, 후술되는 변이형 인산 트랜스포터나 이를 암호화하는 유전자의 변이체에 대한 기재를 준용할 수 있다. 또한, 「서열번호 22의 아미노산 번호 X」란 「서열번호 22의 위치 X」로서 바꾸어 읽어도 좋다.
<L-글루타민 생산균>
L-글루타민 생산능을 부여 또는 증강시키기 위한 방법으로서는, 예를 들면, L-글루타민 생합성계 효소로부터 선택되는 1종 또는 그 이상의 효소의 활성이 증대되도록 세균을 개변시키는 방법이 열거된다. 이러한 효소로서는 특별하게 제한되지 않지만, 글루탐산 데하이드로게나제(gdhA)나 글루타민 합성효소(glnA)가 열거된다.
또한, L-글루타민 생산능을 부여 또는 증강시키는 방법으로서는, 예를 들면, L-글루타민의 생합성 경로로부터 분기하여 L-글루타민 이외의 화합물을 생성하는 반응을 촉매하는 효소로부터 선택되는 1종 또는 그 이상의 효소의 활성이 저하되도록 세균을 개변시키는 방법도 열거된다. 이러한 효소로서는, 특별하게 제한되지 않지만, 글루타미나제가 열거된다.
L-글루타민 생산균 또는 이를 유도하기 위한 친주로서는, 글루탐산 데하이드로게나제(gdhA) 및/또는 글루타민 합성효소(glnA)의 활성을 증강시킨 코리네형 세균(EP1229121, EP1424398)이나 글루타미나제 활성이 저하된 코리네형 세균(일본 공개특허공보 특개2004-187684)이 열거된다. 글루타민 합성효소의 활성 증강은 글루타민 아데닐릴트랜스퍼라제 유전자(glnE)의 파괴, PII 제어 단백질 유전자(glnB)의 파괴에 의해서도 달성될 수 있다(EP1229121).
또한, 코리네형 세균에 관해서, L-글루타민 생산능을 부여 또는 증강시키는 방법으로서는 6-디아조-5-옥소-노르류신 내성을 부여하는 방법(일본 공개특허공보 평3-232497), 퓨린 유사체 내성 및 메티오닌 설폭사이드 내성을 부여하는 방법(일본 공개특허공보 소61-202694), α-케토말레인산 내성을 부여하는 방법(일본 공개특허공보 소56-151495)이 열거된다. L-글루타민 생산능을 갖는 코리네형 세균으로서, 구체적으로는, 예를 들면, 이하의 균주가 열거된다.
Corynebacterium glutamicum(Brevibacterium flavum) AJ11573 (FERM P-5492, 일본 공개특허공보 소56-161495)
Corynebacterium glutamicum(Brevibacterium flavum) AJ11576 (FERM BP-10381, 일본 공개특허공보 소56-161495)
Corynebacterium glutamicum(Brevibacterium flavum) AJ12212 (FERM P-8123, 일본 공개특허공보 소61-202694)
<L-프롤린 생산균>
L-프롤린 생산균 또는 이를 유도하기 위한 친주로서는, L-프롤린 생합성계 효소로부터 선택되는 1종 또는 그 이상의 효소의 활성이 증강되는 균주가 열거된다. L-프롤린 생합성에 관여하는 효소로서는 글루탐산 5-키나제, γ-글루타밀-인산 환원효소, 피롤린-5-카복실레이트 환원효소가 열거된다. 효소 활성의 증강으로는, 예를 들면, L-프롤린에 의한 피드백 저해가 해제된 글루타메이트 키나제를 암호화하는 proB 유전자(독일 특허 제3127361호)가 바람직하게 이용될 수 있다.
또한, L-프롤린 생산균 및 이를 유도하기 위한 친주로서는, L-프롤린 분해에 관여하는 효소의 활성이 저하되는 균주도 열거된다. 이러한 효소로서는 프롤린 데하이드로게나제나 오르니틴 아미노트랜스퍼라제가 열거된다.
<L-트레오닌 생산균>
L-트레오닌 생산균 또는 이를 유도하기 위한 친주로서는, L-트레오닌 생합성계 효소로부터 선택되는 1종 또는 그 이상의 효소의 활성이 증강되는 균주가 열거된다. 이러한 효소로서는 특별하게 제한되지 않지만, 아스파르토키나제 III(lysC), 아스파라긴산 세미알데하이드 데하이드로게나제(asd), 아스파르토키나제 I(thrA), 호모세린 키나제(homoserine kinase)(thrB), 트레오닌 합성효소(threonine synthase)(thrC), 아스파라긴산 아미노트랜스퍼라제(아스파라긴산 트랜스아미나제)(aspC)가 열거된다. 이러한 효소 중에는, 아스파르토키나제 III, 아스파라긴산 세미알데하이드 데하이드로게나제, 아스파르토키나제 I, 호모세린 키나제, 아스파라긴산 아미노트랜스퍼라제, 및 트레오닌 합성효소로부터 선택되는 1종 또는 그 이상의 효소의 활성을 증강시키는 것이 바람직하다. L-트레오닌 생합성계 유전자는, 트레오닌 분해가 제어되는 균주에 도입되어도 좋다.
L-트레오닌 생합성계 효소의 활성은, 최종 산물인 L-트레오닌에 의해 저해된다. 따라서, L-트레오닌 생산균을 구축하기 위해서는, L-트레오닌에 의한 피드백 저해를 받아들이지 않도록 L-트레오닌 생합성계 유전자를 개변시키는 것이 바람직하다. 상기 thrA, thrB, thrC 유전자는 트레오닌 오페론을 구성하고, 트레오닌 오페론은 어테뉴에이터 구조를 형성하고 있다. 트레오닌 오페론의 발현은 배양액 중의 이소류신, 트레오닌으로 저해를 받고, 어테뉴에이터에 의해 억제된다. 트레오닌 오페론의 발현의 증강은, 어테뉴에이터 영역의 리더 서열에 있어서는 어테뉴에이터를 제거함으로써 달성될 수 있다(Lynn, S. P., Burton, W. S., Donohue, T. J., Gould, R. M., Gumport, R. I., and Gardner, J. F., J. Mol. Biol. 194:59-69 (1987); WO02/26993; WO2005/049808; WO2005/049808; WO2003/097839 참조).
트레오닌 오페론의 상류에는 고유의 프로모터가 존재하지만, 상기 프로모터를 비천연의 프로모터로 치환해도 좋다(WO98/04715호 팜플렛 참조). 또한, 트레오닌 생합성 관여 유전자가 람다 파지의 리프레서 및 프로모터의 제어 하에 발현되도록 트레오닌 오페론을 구축해도 좋다(유럽 특허 제0593792호 명세서 참조). 또한, L-트레오닌에 의한 피드백 저해를 받지 않도록 개변된 세균은, L-트레오닌 유사체인 α-amino-β-hydroxyvaleric acid(AHV)에 내성인 균주를 선택함으로써도 취득될 수 있다.
이와 같은 L-트레오닌에 의한 피드백 저해를 받지 않도록 개변된 트레오닌 오페론은, 카피수의 상승에 의해, 또는 강력한 프로모터에 연결됨으로써 숙주 내에서의 발현량이 향상되는 것이 바람직하다. 카피수의 상승은, 트레오닌 오페론을 포함하는 플라스미드를 숙주에 도입함으로써 달성될 수 있다. 또한, 카피수의 상승은, 트랜스포손, Mu 파지 등을 이용하여, 숙주의 게놈 상에 트레오닌 오페론을 전이시킴으로써도 달성될 수 있다.
E. coli의 아스파르토키나제 호모세린 데하이드로게나제 I을 암호화하는 thrA 유전자는 밝혀져 있다(뉴클레오타이드 번호 337 내지 2799, GenBank accession NC_000913.2, gi: 49175990). thrA 유전자는, E. coli K12의 염색체에 있어서, thrL 유전자와 thrB 유전자와의 사이에 위치한다. Escherichia coli의 호모세린 키나제를 암호화하는 thrB 유전자는 밝혀져 있다(뉴클레오타이드 번호 2801 내지 3733, GenBank accession NC_000913.2, gi: 49175990). thrB 유전자는, E. coli K-12의 염색체에 있어서, thrA 유전자와 thrC와의 사이에 위치한다. E. coli의 트레오닌 합성효소를 암호화하는 thrC 유전자가 밝혀져 있다(뉴클레오타이드 번호 3734 내지 5020, GenBank accession NC_000913.2, gi: 49175990). thrC 유전자는, E. coli K-12의 염색체에 있어서, thrB 유전자와 yaaX 오픈 리딩 프레임과의 사이에 위치한다. 또한, 트레오닌에 의한 피드백 저해에 내성인 아스파르토키나제 호모세린 데하이드로게나제 I를 암호화하는 변이형 thrA 유전자와 야생형 thrBC 유전자를 포함하는 thrA*BC 오페론은, 트레오닌 생산주 E. coli VKPM B-3996에 존재하는, 주지의 플라스미드 pVIC40(미국 특허 제5,705,371호)로부터 취득될 수 있다.
E. coli의 rhtA 유전자는, 글루타민 수송계의 요소를 암호화하는 glnHPQ 오페론에 가까운 E. coli 염색체의 18분에 존재한다. rhtA 유전자는, ORF1(ybiF 유전자, 뉴클레오타이드 번호 764 내지 1651, GenBank accession number AAA218541, gi: 440181)과 동일하고, pexB 유전자와 ompX 유전자와의 사이에 위치한다. ORF1에 의해 암호화된 단백질을 발현하는 단위는, rhtA 유전자라고 칭한다(rht: resistant to homoserine and threonine(호모세린 및 트레오닌에 내성)). 또한, 고농도의 트레오닌 또는 호모세린에의 내성을 부여하는 rhtA23 변이가, ATG 개시 코돈에 대하여 위치 1의 G→A 치환임이 판명되어 있다(ABSTRACTS of the 17th International Congress of Biochemistry and Molecular Biology in conjugation with Annual Meeting of the American Society for Biochemistry and Molecular Biology, San Francisco, California August 24-29, 1997, abstract No. 457, EP 1013765 A).
E. coli의 asd 유전자는 이미 밝혀져 있고(뉴클레오타이드 번호 3572511 내지 3571408, GenBank accession NC_000913.1, gi:16131307), 이의 유전자의 염기 서열에 근거하여 작제된 프라이머를 사용하는 PCR에 의해 취득될 수 있다[White, T.J. et al., Trends Genet., 5, 185 (1989) 참조]. 다른 미생물의 asd 유전자도 동일하게 수득될 수 있다.
또한, E. coli의 aspC 유전자도 이미 설명되어 있고(뉴클레오타이드 번호 983742 내지 984932, GenBank accession NC_000913.1, gi: 16128895), 이의 유전자의 염기 서열에 근거하여 작제된 프라이머를 사용하는 PCR에 의해 수득될 수 있다. 다른 미생물의 aspC 유전자도 동일하게 수득될 수 있다.
또한, L-트레오닌 생산능을 갖는 코리네형 세균으로서는, 예를 들면, Corynebacterium acetoacidophilum AJ12318(FERM BP-1172)(미국 특허 제5,188,949호 참조)이 열거된다.
<L-리신 생산균>
L-리신 생산균 또는 이를 유도하기 위한 친주로서는, L-리신 생합성계 효소로부터 선택되는 1종 또는 그 이상의 효소의 활성이 증강되는 균주가 열거된다. 이러한 효소로서는, 특별하게 제한되지 않지만, 디하이드로디피콜린산 합성효소(dihydrodipicolinate synthase)(dapA), 아스파르토키나제 III(aspartokinase III)(lysC), 디하이드로디피콜산 환원효소(dihydrodipicolinate reductase)(dapB), 디아미노피멜린산 디카복실라제(diaminopimelate decarboxylase)(lysA), 디아미노피멜린산 데하이드로게나제(diaminopimelate dehydrogenase)(ddh)[미국 특허 제6,040,160호], 포스포엔올피루브산 카복실라제(phosphoenolpyrvate carboxylase)(ppc), 아스파라긴산 세미알데하이드 데하이드로게나제(aspartate semialdehyde dehydrogenease)(asd), 아스파라긴산 아미노트랜스퍼라제(aspartate aminotransferase)(아스파라긴산 트랜스아미나제(aspartate transaminase))(aspC), 디아미노피멜린산 에피머라제(diaminopimelate epimerase)(dapF), 테트라하이드로디피콜린산 석시닐라제(tetrahydrodipicolinate succinylase)(dapD), 석시닐디아미노피멜린산 데아실라제(succinyl-diaminopimelate deacylase)(dapE), 및 아스파타제(aspartase)(aspA)[EP 1253195 A]가 열거된다. 이러한 효소 중에서는, 예를 들면, 디하이드로디피콜린산 환원효소, 디아미노피멜린산 데카복실라제, 디아미노피멜린산 데하이드로게나제, 포스포엔올피루브산 카복실라제, 아스파라긴산 아미노트랜스퍼라제, 디아미노피멜린산 에피머라제, 아스파라긴산 세미알데하이드 데하이드로게나제, 테트라하이드로디피콜린산 석시닐라제, 및 석시닐 디아미노피멜린산 데아실라제로부터 선택되는 1종 또는 그 이상의 효소의 활성을 증강시키는 것이 바람직하다. 또한, L-리신 생산균 또는 이를 유도하기 위한 친주로는, 에너지 효율에 관여하는 유전자(cyo)(EP 1170376 A), 니코틴아미드 뉴클레오타이드 트랜스하이드로게나제(nicotinamide nucleotide transhydrogenase)를 암호화하는 유전자(pntAB)(미국 특허 제5,830,716호), ybjE 유전자(WO2005/073390), 또는 이들의 조합의 발현 수준이 증대되어도 좋다. 아스파르토키나제 III(lysC)은 L-리신에 의한 피드백 저해를 받으므로, 상기 효소의 활성을 증강시키기 위해서는 L-리신에 의한 피드백 저해가 해제된 아스파르토키나제 III을 암호화하는 변이형 lysC 유전자를 이용하여도 좋다(미국 특허 제5,932,453호 명세서). 또한, 디하이드로디피콜린산 합성효소(dapA)는 L-리신에 의한 피드백 저해를 받으므로, 상기 효소의 활성을 증강시키기 위해서는 L-리신에 의한 피드백 저해가 해제된 디하이드로디피콜린산 합성효소를 암호화하는 변이형 dapA 유전자를 이용해도 좋다.
또한, L-리신 생산균 또는 이를 유도하기 위한 친주로서는, L-리신의 생합성 경로로부터 분기하여 L-리신 이외의 화합물을 생성시키는 반응을 촉매하는 효소로부터 선택되는 1종 또는 그 이상의 효소의 활성이 저하 또는 결손된 균주도 열거된다. 이러한 효소로서는, 특별하게 제한되지 않지만, 호모세린 데하이드로게나제(homoserine dehydrogenase), 리신 데카복실라제(lysine decarboxylase)(미국 특허 제5,827,698호), 및 말산 효소(malic enzyme)(WO2005/010175)가 열거된다.
또한, L-리신 생산균 또는 이를 유도하기 위한 친주로서는, L-리신 유사체에 내성을 갖는 변이주도 열거된다. L-리신 유사체는 장내 세균과의 세균이나 코리네형 세균 등의 세균의 생육을 저해하지만, 이의 저해는, L-리신이 배지에 공존하는 경우에는 완전히 또는 부분적으로 해제된다. L-리신 유사체로서는, 특별하게 제한되지 않지만, 옥사리신, 리신 하이드록사메이트, S-(2-아미노에틸)-L-시스테인(AEC), γ-메틸리신, α-클로로카프로락탐이 열거된다. 이들 리신 유사체에 대해서 내성을 갖는 변이주는, 세균을 통상의 인공 변이 처리시킴으로써 수득될 수 있다.
또한, L-리신 생산능을 갖는 코리네형 세균으로서, 구체적으로는, 예를 들면, AEC 내성 변이주(Corynebacterium glutamicum(Brevibacterium lactofermentum) AJ11082(NRRL B-11470)주 등; 일본 특허공보 소56-1914호 공보, 일본 특허공보 소56-1915호 공보, 일본 특허공보 소57-14157호 공보, 일본 특허공보 소57-14158호 공보, 일본 특허공보 소57-30474호 공보, 일본 특허공보 소58-10075호 공보, 일본 특허공보 소59-4993호 공보, 일본 특허공보 소61-35840호 공보, 일본 특허공보 소62-24074호 공보, 일본 특허공보 소62-36673호 공보, 일본 특허공보 평5-11958호 공보, 일본 특허공보 평7-112437호 공보, 일본 특허공보 평7-112438호 공보 참조); 이의 생육에 L-호모세린 등의 아미노산을 필요로 하는 변이주(일본 특허공보 소48-28078호 공보, 일본 특허공보 소56-6499호 공보 참조); AEC에 내성을 나타내고, 또한, L-류신, L-호모세린, L-프롤린, L-세린, L-아르기닌, L-알라닌, L-발린 등의 아미노산을 요구하는 변이주(미국 특허 제3708395호 및 제3825472호 명세서 참조); DL-α-아미노-ε-카프로락탐, α-아미노-라우릴락탐, 아스파르트산 유사체, 설파제, 퀴노이드, 및 N-라우로일류신에 내성을 나타내는 변이주; 옥살로아세트산 데카복실라제 저해제 또는 호흡계 효소 저해제에 대한 내성을 나타내는 변이주(일본 공개특허공보 소50-53588호 공보, 일본 공개특허공보 소50-31093호 공보, 일본 공개특허공보 소52-102498호 공보, 일본 공개특허공보 소53-9394호 공보, 일본 공개특허공보 소53-86089호 공보, 일본 공개특허공보 소55-9783호 공보, 일본 공개특허공보 소55-9759호 공보, 일본 공개특허공보 소56-32995호 공보, 일본 공개특허공보 소56-39778호 공보, 일본 특허공보 소53-43591호 공보, 일본 특허공보 소53-1833호 공보); 이노시톨 또는 아세트산을 요구하는 변이주(일본 공개특허공보 소55-9784호 공보, 일본 공개특허공보 소56-8692호 공보); 플루오로피루브산 또는 34℃ 이상의 온도에 대해서 감수성을 나타내는 변이주(일본 공개특허공보 소55-9783호 공보, 일본 공개특허공보 소53-86090호 공보); 에틸렌 글리콜에 내성을 나타내는 변이주(미국 특허 제4411997호 명세서)가 열거된다.
<L-아르기닌 생산균>
L-아르기닌 생산균 또는 이를 유도하기 위한 친주로서는, L-아르기닌 생합성계 효소로부터 선택되는 1종 또는 그 이상의 효소의 활성이 증강되는 균주가 열거된다. 이러한 효소로서는, 특별하게 제한되지 않지만, N-아세틸글루탐산 합성효소(argA), N-아세틸글루타밀 포스페이트 환원효소(argC), 오르니틴 아세틸 트랜스퍼라제(argJ), N-아세틸글루타메이트 키나제(argB), 아세틸오르니틴 트랜스아미나제(argD), 오르니틴 카르바모일 트랜스퍼라제(argF), 아르기노석신산 합성효소(argG), 아르기노석신산 분해효소(argH), 카르바모일 포스페이트 합성효소(carAB)가 열거된다. N-아세틸글루탐산 합성효소(argA) 유전자로서는, 예를 들면, 야생형의 위치 15 내지 위치 19에 상당하는 아미노산 잔기가 치환된 L-아르기닌에 의한 피드백 저해가 해제된 변이형 N-아세틸글루탐산 합성효소를 암호화하는 유전자를 이용하는 것이 바람직하다(유럽 출원 공개 1170361호 명세서).
또한, L-아르기닌 생산균 또는 이를 유도하기 위한 친주로서는, 아미노산 유사체 등에의 내성을 갖는 균주도 열거된다. 이러한 균주로서는, 예를 들면, 2-티아졸알라닌 내성에 추가하여 L-히스티딘, L-프롤린, L-트레오닌, L-이소류신, L-메티오닌, 또는 L-트립토판 요구성을 갖는 코리네형 세균주(일본 공개특허공보 소54-44096호 공보); 케토말론산, 플루오로말론산, 또는 모노플루오로아세트산에 내성을 갖는 코리네형 세균주(일본 공개특허공보 소57-18989호 공보); 아르기니놀에 내성을 갖는 코리네형 세균주(일본 특허공보 소62-24075호 공보); X-구아니딘(X는 지방산 또는 지방쇄의 유도체)에 내성을 갖는 코리네형 세균주(일본 공개특허공보 평2-186995호 공보); 아르기닌 하이드록사메이트 및 6-아자우라실에 내성을 갖는 코리네형 세균주(일본 공개특허공보 소57-150381호 공보)가 열거된다. L-아르기닌 생산능을 갖는 코리네형 세균의 구체예로서는 하기와 같은 균주가 열거된다.
Corynebacterium glutamicum(Brevibacterium flavum) AJ11169(FERM BP-6892)
Corynebacterium glutamicum(Brevibacterium lactofermentum) AJ12092(FERM BP-6906)
Corynebacterium glutamicum(Brevibacterium flavum) AJ11336(FERM BP-6893)
Corynebacterium glutamicum(Brevibacterium flavum) AJ11345(FERM BP-6894)
Corynebacterium glutamicum(Brevibacterium lactofermentum) AJ12430(FERM BP-2228)
<L-시트룰린 생산균 및 L-오르니틴 생산균>
L-시트룰린 및 L-오르니틴은, L-아르기닌과 생합성 경로가 공통되어 있다. 따라서, N-아세틸글루탐산 합성효소(argA), N-아세틸글루타밀인산 환원효소(argC), 오르니틴 아세틸트랜스퍼라제(argJ), N-아세틸글루탐산 키나제(argB), 아세틸오르니틴 트랜스아미나제(argD), 및/또는 아세틸오르니틴 데아세틸라제(argE)의 효소 활성을 상승시킴으로써 L-시트룰린 및/또는 L-오르니틴의 생산능을 부여 또는 증강시킬 수 있다(국제 공개 2006/35831호 팜플렛).
<L-히스티딘 생산균>
L-히스티딘 생산균 또는 이를 유도하기 위한 친주로서는, L-히스티딘 생합성계 효소로부터 선택되는 1종 또는 그 이상의 효소의 활성이 증강된 균주가 열거된다. 이러한 효소로서는, 특별하게 제한되지 않지만, ATP 포스포리보실트랜스퍼라제(hisG), 포스포리보실-AMP 사이클로하이드롤라제(hisI), 포스포리보실-ATP 피로포스포하이드롤라제(hisI), 포스포리보실포르미미노-5-아미노이미다졸 카복사미드 리보타이드 이소머라제(hisA), 아미노트랜스퍼라제(hisH), 히스티디놀 포스페이트 아미노트랜스퍼라제(hisC), 히스티디놀 포스파타제(hisB), 히스티디놀 데하이드로게나제(hisD)가 열거된다.
이들 중에서, hisG 및 hisBHAFI로 암호화되는 L-히스티딘 생합성계 효소는, L-히스티딘에 의해 저해되는 것으로 공지되어 있다. 따라서, L-히스티딘 생산능은, 예를 들면, ATP 포스포리보실트랜스퍼라제 유전자(hisG)에, 피드백 저해에의 내성을 부여하는 변이를 도입함으로써 부여 또는 증강될 수 있다(러시아 특허 제2003677호 및 제2119536호).
<L-시스테인 생산균>
L-시스테인 생산균 또는 이를 유도하기 위한 친주로서는, L-시스테인 생합성계 효소로부터 선택되는 1종 또는 그 이상의 효소의 활성이 증강된 균주가 열거된다. 이러한 효소로서는, 특별하게 제한되지 않지만, 세린 아세틸트랜스퍼라제나 3-포스포글리세레이트 데하이드로게나제가 열거된다. 세린 아세틸트랜스퍼라제 활성은, 예를 들면, 시스테인에 의한 피드백 저해에 내성인 변이형 세린 아세틸트랜스퍼라제를 암호화하는 변이형 cysE 유전자를 세균에 도입함으로써 증강될 수 있다. 변이형 세린 아세틸트랜스퍼라제는, 예를 들면, 일본 공개특허공보 평11-155571호나 미국 특허 공개 제20050112731에 개시되어 있다. 또한, 3-포스포글리세레이트 데하이드로게나제 활성은, 예를 들면, 세린에 의한 피드백 저해에 내성인 변이형 3-포스포글리세레이트 데하이드로게나제를 암호화하는 변이형 serA 유전자를 세균에 도입함으로써 증강될 수 있다. 변이형 3-포스포글리세레이트 데하이드로게나제는, 예를 들면, 미국 특허 제6,180,373호에 개시되어 있다.
또한, L-시스테인 생산균 및 이를 유도하기 위한 친주로서는, L-시스테인의 생합성 경로로부터 분기하여 L-시스테인 이외의 화합물을 생성하는 반응을 촉매하는 효소로부터 선택되는 1종 또는 그 이상의 효소의 활성이 저하 또는 결손되어 있는 균주도 열거된다. 이러한 효소로서는, 예를 들면, L-시스테인의 분해에 관여하는 효소가 열거된다. L-시스테인의 분해에 관여하는 효소로서는, 특별하게 제한되지 않지만, 시스테인 탈황화수소효소(aceD)(일본 공개특허공보 특개2002-233384)가 열거된다.
또한, L-시스테인 생산균 또는 이를 유도하기 위한 친주로서는, L-시스테인 배출계가 증강된 균주나 황산염/티오황산염 수송계가 증강된 균주도 열거된다. L-시스테인 배출계의 단백질로서는, ydeD 유전자에 의해 암호화된 단백질(일본 공개특허공보 특개2002-233384), yfiK 유전자로 암호화된 단백질(일본 공개특허공보 특개2004-49237), emrAB, emrKY, yojIH, acrEF, bcr, 및 cusA의 각 유전자로 암호화된 각 단백질(일본 공개특허공보 특개2005-287333), yeaS 유전자로 암호화된 단백질(일본 공개특허공보 특개2010-187552)이 열거된다. 황산염/티오황산염 수송계의 단백질로서는 cysPTWAM 유전자 클러스터로 암호화된 단백질이 열거된다.
또한, L-시스테인 생산능을 갖는 코리네형 세균으로서는, L-시스테인에 의한 피드백 저해가 저감된 세린 아세틸트랜스퍼라제를 보유함으로써 세포 내의 세린 아세틸트랜스퍼라제 활성이 상승된 코리네형 세균(일본 공개특허공보 특개2002-233384)이 열거된다.
<L-메티오닌 생산균>
L-메티오닌 생산균 또는 이를 유도하기 위한 친주로서는, L-트레오닌 요구주나 노르류신에 대해 내성을 갖는 변이주가 열거된다(일본 공개특허공보 특개2000-139471). 또한, L-메티오닌 생산균 또는 이를 유도하기 위한 친주로서는 L-메티오닌에 의한 피드백 저해에 대해 내성을 갖는 변이주 호모세린 트랜스석시닐라제를 보유하는 균주도 열거된다(일본 공개특허공보 특개2000-139471, US20090029424). 또한, L-메티오닌은 L-시스테인을 중간체로 해서 생합성되므로, L-시스테인 생산능의 향상에 의해 L-메티오닌의 생산능도 향상시킬 수 있다(일본 공개특허공보 특개2000-139471, US20080311632).
<L-류신 생산균>
L-류신 생산균 또는 이를 유도하기 위한 친주로서는, L-류신 생합성계 효소로부터 선택되는 1종 또는 그 이상의 효소의 활성이 증강된 균주가 열거된다. 이러한 효소로서는, 특별하게 제한되지 않지만, leuABCD 오페론의 유전자로 암호화된 효소가 열거된다. 또한, 효소 활성의 증강에는, 예를 들면, L-류신에 의한 피드백 저해가 해제된 이소프로필 말레에이트 합성효소를 암호화하는 변이 leuA 유전자(미국 특허 제6,403,342호)가 바람직하게 이용될 수 있다.
L-류신 생산능을 갖는 코리네형 세균으로서는, 예를 들면, 2-티아졸 알라닌 및 β-하이드록시류신에 내성이고, 또한, 이소류신 및 메티오닌에 요구성인 Corynebacterium glutamicum(Brevibacterium lactofermentum) AJ3718 (FERM P-2516)이 열거된다.
<L-이소류신 생산균>
L-이소류신 생산능을 부여 또는 증강시키기 위한 방법으로서는, 예를 들면, L-이소류신 생합성계 효소로부터 선택되는 1종 또는 그 이상의 효소의 활성이 증대되도록 세균을 개변시키는 방법이 열거된다. 이러한 효소로서는, 특별하게 제한되지 않지만, 트레오닌 데아미나제나 아세토하이드록시산 합성효소가 열거된다(일본 공개특허공보 평2-458호, FR 0356739, 및 미국 특허 제5,998,178호).
L-이소류신 생산능을 갖는 코리네형 세균으로서는, 분기쇄 아미노산 배출 단백질을 암호화하는 brnE 유전자를 증폭시킨 코리네형 세균(일본 공개특허공보 특개2001-169788), L-리신 생산균과의 프로토플라스미드 융합에 의해 L-이소류신 생산능을 부여한 코리네형 세균(일본 공개특허공보 소62-74293), 호모세린 데하이드로게나제를 강화시킨 코리네형 세균(일본 공개특허공보 소62-91193), 트레오닌 하이드록사메이트 내성주(일본 공개특허공보 소62-195293), α-케토말론 내성주(일본 공개특허공보 소61-15695), 메틸리신 내성주(일본 공개특허공보 소61-15696), Corynebacterium glutamicum(Brevibacterium flavum) AJ12149 (FERM BP-759)(미국 특허 제4,656,135호)이 열거된다.
<L-발린 생산균>
L-발린 생산균 및 이를 유도하기 위한 친주로서는, L-발린 생합성 효소로부터 선택되는 1종 또는 그 이상의 효소의 활성이 증강된 균주가 열거된다. 이러한 효소로서는, 특별하게 제한되지 않지만, ilvGMEDA 오페론이나 ilvBNC 오페론의 유전자로 암호화된 효소가 열거된다. ilvBN은 아세토하이드록시산 합성효소를, ilvC는 이소메로 환원효소(국제 공개00/50624호)를 각각 암호화한다. 또한, ilvGMEDA 오페론 및 ilvBNC 오페론은 L-발린, L-이소류신, 및/또는 L-류신에 의한 발현 억제(어테뉴에이션)를 받는다. 따라서, 효소 활성의 증강을 위해서는, 어테뉴에이션에 필요한 영역을 제거 또는 개변시켜 생성되는 L-발린에 의한 발현 제어를 해제하는 것이 바람직하다. 또한, ilvA 유전자가 암호화된 트레오닌 데아미나제는, L-이소류신 생합성계의 율속 단계인 L-트레오닌으로부터 2-케토부티르산에의 탈아민화 반응을 촉매하는 효소이다. 따라서, L-발린 생산을 위해서는, ilvA 유전자가 파괴되는 등으로 트레오닌 데아미나제 활성이 감소되는 것이 바람직하다.
또한, L-발린 생산균 및 이를 유도하기 위한 친주로서는, L-발린의 생합성 경로로부터 분기하여 L-발린 이외의 화합물을 생성하는 반응을 촉매하는 효소로부터 선택되는 1종 또는 그 이상의 효소의 활성이 저하된 균주도 열거된다. 이러한 효소로서는, 특별하게 제한되지 않지만, L-류신 합성에 관여하는 트레오닌 데하이드라타제나 D-판토텐산 합성에 관여하는 효소가 열거된다(국제 공개 00/50624호).
또한, L-발린 생산균 또는 이를 유도하기 위한 친주로서는, 아미노산 유사체 등에의 내성을 갖는 균주도 열거된다. 이러한 균주로서는, 예를 들면, L-이소류신 및 L-메티오닌 요구성, 및 D-리보스, 퓨린 리보뉴클레오사이드, 또는 피리미딘 리보뉴클레오사이드에 내성을 갖고, 또한, L-발린 생산능을 갖는, 코리네형 세균주(FERM P-1841, FERM P-29, 일본 특허공보 소53-025034), 폴리케타이드류에 내성을 갖는 코리네형 세균주(FERM P-1763, FERM P-1764, 일본 특허공보 평06-065314), 아세트산을 유일의 탄소원으로 하는 배지에서 L-발린 내성을 나타내고, 또한, 글루코스를 유일의 탄소원으로 하는 배지에서 피루브산 유사체(플루오로피루브산 등)에 감수성을 갖는 코리네형 세균주(FERM BP-3006, FERM BP-3007, 일본 특허 3006929호)가 열거된다.
<L-알라닌 생산균>
L-알라닌 생산균 또는 이를 유도하기 위한 친주로서는, H+-ATPase를 결실시킨 코리네형 세균(Appl Microbiol Biotechnol. 2001 Nov;57(4):534-40)이나 아스파라긴산 β-데카복실라제 활성이 증강된 코리네형 세균(일본 공개특허공보 평07-163383)이 열거된다.
<L-트립토판 생산균, L-페닐알라닌 생산균, L-티로신 생산균>
L-트립토판 생산능, L-페닐알라닌 생산능, 및/또는 L-티로신 생산능을 부여 또는 증강시키는 방법으로서는, 예를 들면, L-트립토판, L-페닐알라닌, 및/또는 L-티로신의 생합성계 효소로부터 선택되는 1종 또는 그 이상의 효소의 활성이 증대되도록 세균을 개변시키는 방법이 열거된다.
이러한 방향족 아미노산에 공통인 생합성계 효소로서는, 특별하게 제한되지 않지만, 3-데옥시-D-아라비노헵실론산-7-인산 합성효소(aroG), 3-데하이드로퀴네이트 합성효소(aroB), 시킴산 데하이드로게나제(aroE), 시킴산 키나제(aroL), 5-엔올산피루빌시킴산-3-인산 합성효소(aroA), 코리스미산 합성효소(aroC)가 열거된다(유럽 특허 763127호). 이들 효소를 암호화하는 유전자의 발현은 티로신 리프레서(tyrR)에 의해 제어되어 있고, tyrR 유전자를 결실시킴으로써 이러한 효소의 활성을 증강시켜도 좋다(유럽 특허 763127호).
L-트립토판 생합성계 효소로서는, 특별하게 제한되지 않지만, 안트라닐산 합성효소(trpE), 트립토판 합성효소(trpAB), 및 포스포글리세린산 데하이드로게나제(serA)가 열거된다. 예를 들면, 트립토판 오페론을 포함하는 DNA를 도입함으로써, L-트립토판 생산능을 부여 또는 증강시킬 수 있다. 트립토판 합성효소는, 각각 trpA 및 trpB 유전자에 의해 암호화된 α 및 β 서브유닛으로 이루어진다. 안트라닐산 합성효소는 L-트립토판에 의한 피드백 저해를 받으므로, 상기 효소의 활성을 증강시키기 위해서는 피드백 저해를 해제하는 변이를 도입한 상기 효소를 암호화하는 유전자를 이용해도 좋다. 포스포글리세린산 데하이드로게나제는 L-세린에 의한 피드백 저해를 받으므로, 상기 효소의 활성을 증강시키기 위해서는 피드백 저해를 해제하는 변이를 도입한 상기 효소를 암호화하는 유전자를 이용해도 좋다. 또한, 말레에이트 합성효소(aceB), 이소시트르산 분해효소(aceA), 및 이소시트르산 데하이드로게나제 키나제/포스파타제(aceK)로 이루어진 오페론(ace 오페론)의 발현을 증대시킴으로써 L-트립토판 생산능을 부여 또는 증강시켜도 좋다(WO2005/103275).
L-페닐알라닌 생합성계 효소로서는, 특별하게 제한되지 않지만, 코리스미산 뮤타제 및 프레펜산 데하이드라타제가 열거된다. 코리스미산 뮤타제 및 프레펜산 데하이드라타제는 2기능 효소로서 pheA 유전자에 의해 암호화된다. 코리스미산 뮤타제-프레펜산 데하이드라타제는 L-페닐알라닌에 의한 피드백 저해를 받으므로, 상기 효소의 활성을 증강시키기 위해서는, 피드백 저해를 해제하는 변이를 도입한 상기 효소를 암호화하는 유전자를 이용해도 좋다.
L-티로신 생합성계 효소로서는, 특별하게 제한되지 않지만, 코리스미산 뮤타제 및 프레펜산 데하이드로게나제가 열거된다. 코리스미산 뮤타제 및 프레펜산 데하이드로게나제는 2기능 효소로서 tyrA 유전자에 의해 암호화된다. 코리스미산 뮤타제-프레펜산 데하이드로게나제는 L-티로신에 의한 피드백 저해를 받으므로, 상기 효소의 활성을 증강시키기 위해서는 피드백 저해를 해제하는 변이를 도입한 상기 효소를 암호화하는 유전자를 이용해도 좋다.
L-트립토판, L-페닐알라닌, 및/또는 L-티로신 생산균은, 목적의 방향족 아미노산 이외의 방향족 아미노산의 생합성이 저하되도록 개변되어도 좋다. 또한, L-트립토판, L-페닐알라닌, 및/또는 L-티로신 생산균은, 부생물의 흡수계가 증강되도록 개변되어도 좋다. 부생물로서는, 목적의 방향족 아미노산 이외의 방향족 아미노산이 열거된다. 부생물 흡수계를 암호화하는 유전자로서는, 예를 들면, L-트립토판의 흡수계를 암호화하는 유전자인 tnaB나 mtr, L-페닐알라닌의 흡수계를 암호화하는 유전자인 pheP, L-티로신 흡수계를 암호화하는 유전자인 tyrP가 열거된다(EP1484410).
L-트립토판 생산능을 갖는 코리네형 세균으로서는, 설파구아니딘에 내성인 Corynebacterium glutamicum AJ12118(FERM BP-478 일본 특허 01681002호), 트립토판 오페론이 도입된 균주(일본 공개특허공보 소63-240794호 공보), 코리네형 세균 유래의 시킴산 키나제를 암호화하는 유전자가 도입된 균주(일본 공개특허공보 특개01994749호 공보)가 열거된다.
L-페닐알라닌 생산능을 갖는 코리네형 세균으로서는, 예를 들면, 포스포엔올피루브산 카복실라제 또는 피루브산 키나제 활성이 저하된, Corynebacterium glutamicum BPS-13주(FERM BP-1777), Corynebacterium glutamicum K77(FERM BP-2062), Corynebacterium glutamicum K78(FERM BP-2063)(유럽 특허 공개 공보 331145호, 일본 공개특허공보 평02-303495호), 티로신 요구성 균주(일본 공개특허공보 평05-049489)가 열거된다.
L-티로신 생산능을 갖는 코리네형 세균으로서는, 예를 들면, Corynebacterium glutamicum AJ11655(FERM P-5836)(일본 특허공보 평2-6517), Corynebacterium glutamicum(Brevibacterium lactofermentum) AJ12081(FERM P-7249)(일본 공개특허공보 소60-70093)이 열거된다.
또한, L-아미노산 생산능을 부여 또는 증강시키는 방법으로서는, 예를 들면, 세균의 세포로부터 L-아미노산을 배출하는 활성이 증대되도록 세균을 개변시키는 방법이 열거된다. L-아미노산을 배출하는 활성은, 예를 들면, L-아미노산을 배출하는 단백질을 암호화하는 유전자의 발현을 상승시킴으로써 증대될 수 있다. 각종 아미노산을 배출하는 단백질을 암호화하는 유전자로서는, 예를 들면, b2682 유전자(ygaZ), b2683 유전자(ygaH), b1242 유전자(ychE) 및 b3434 유전자(yhgN)가 열거된다(일본 공개특허공보 특개2002-300874호).
또한, L-아미노산 생산능을 부여 또는 증강시키는 방법으로서는, 예를 들면, 당대사에 관여하는 단백질이나 에너지 대사에 관여하는 단백질의 활성이 증대되도록 세균을 개변시키는 방법이 열거된다.
당대사에 관여하는 단백질로서는, 당의 흡수에 관여하는 단백질이나 해당계 효소가 열거된다. 당대사에 관여하는 단백질을 암호화하는 유전자로서는, 글루코스6-인산 이소머라제 유전자(pgi; 국제 공개 제01/02542호 팜플렛), 포스포엔올피루브산 합성효소 유전자(pps; 유럽 출원 공개 877090호 명세서), 포스포엔올피루브산 카복실라제 유전자(ppc; 국제 공개 95/06114호 팜플렛), 피루브산 카복실라제 유전자(pyc; 국제 공개 99/18228호 팜플렛, 유럽 출원 공개 1092776호 명세서), 포스포글루코뮤타제 유전자(pgm; 국제 공개 03/04598호 팜플렛), 프럭토스 2인산 알돌라제 유전자(pfkB, fbp; 국제 공개 03/04664호 팜플렛), 피루브산 키나제 유전자(pykF; 국제 공개 03/008609호 팜플렛), 트랜스알돌라제 유전자(talB; 국제 공개 03/008611호 팜플렛), 푸마라제 유전자(fum; 국제 공개 01/02545호 팜플렛), 비-PTS 슈크로스 흡수 유전자 유전자(csc; 유럽 출원 공개 149911호 팜플렛), 슈크로스 자화성 유전자(scrAB 오페론; 국제 공개 제90/04636호 팜플렛)가 열거된다.
에너지 대사에 관여하는 단백질을 암호화하는 유전자로서는, 트랜스하이드로게나제 유전자(pntAB; 미국 특허 5,830,716호 명세서), 사이토크롬 bo형 옥시다제(cytochromoe bo type oxidase) 유전자(cyoB; 유럽 특허 출원 공개 1070376호 명세서)가 열거된다.
또한, 상기의 L-아미노산 생산균의 육종에 사용되는 유전자는, 암호화된 단백질의 기능이 손상되지 않는 한, 상기 예시된 유전자나 공지의 염기 서열을 갖는 유전자에 한정되지 않고, 이의 변이체이어도 좋다. 예를 들면, L-아미노산 생산균의 육종에 사용되는 유전자는, 공지의 단백질의 아미노산 서열에 있어서, 1개 또는 수개의 위치에서의 1개 또는 수개의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 단백질을 암호화하는 유전자이어도 좋다. 유전자나 단백질의 변이체에 관해서는, 후술되는 인산 트랜스포터 유전자 및 인산 트랜스포터의 변이체에 관한 기재를 준용할 수 있다.
<1-2> 인산 트랜스포터 활성의 증강
본 발명의 세균은, 인산 트랜스포터 활성이 증대되도록 개변되어 있다. 본 발명의 세균은, L-아미노산 생산능을 갖는 코리네형 세균을 인산 트랜스포터 활성이 증대되도록 개변시킴으로써 취득될 수 있다. 또한, 본 발명의 세균은, 인산 트랜스포터 활성이 증대되도록 코리네형 세균을 개변시킨 후에, L-아미노산 생산능을 부여 또는 증강시킴으로써도 수득될 수 있다. 또한, 본 발명의 세균은, 인산 트랜스포터 활성이 증대되도록 개변시킴으로써 L-아미노산 생산능을 획득한 세균이어도 좋다. 본 발명의 세균을 구축하기 위한 개변은 임의의 순번으로 행할 수 있다.
이하에, 인산 트랜스포터 및 이를 암호화하는 유전자에 관해서 설명한다.
본 발명에 있어서, 「인산 트랜스포터」란, 인산 트랜스포터 활성을 갖는 단백질을 말한다. 본 발명에 있어서, 「인산 트랜스포터 활성」이란, 무기 인산(Pi)을 세포 외부로부터 세포 내로 흡수하는 활성을 말한다.
인산 트랜스포터로서는 저 친화성의 무기 인산 트랜스포터(low-affinity inorganic phosphate transporter; Pit)계나 고 친화성의 인산 특이적 트랜스포터(high-affinity phosphate-specific transporter; Pst)계가 열거된다. 인산 트랜스포터를 암호화하는 유전자(「인산 트랜스포터 유전자」라고도 함)로서는, Pit계를 암호화하는 pitA 유전자나 pitB 유전자, Pst계를 암호화하는 pstSCAB 유전자가 열거된다(비특허문헌 1). 또한, Pst계는 4개의 단백질(pstSCAB 유전자 산물)의 복합체로서 기능한다.
본 발명에 있어서는, Pit계와 Pst계 중 어느 하나의 활성을 증대시켜도 좋다. 본 발명에 있어서는, Pit계의 활성을 증대시키는 것이 바람직하고, pitA 유전자 산물인 PitA 단백질의 활성을 증대시키는 것이 보다 바람직하다.
에스케리키아 콜라이 K12 MG1655 균주의 pitA 유전자는, NCBI 데이터베이스에 GenBank accession NC_000913(VERSION NC_000913.2 GI: 49175990)으로서 등록되어 있는 게놈 서열 중 위치 3635665 내지 3637164의 서열에 상당한다. 에스케리키아 콜라이 K12 MG1655 균주의 pitA 유전자는 ECK3478, JW3460과 동일하다. 또한, 에스케리키아 콜라이 K12 MG1655 균주의 PitA 단백질은 GenBank accession NP_417950(version NP_417950.1 GI:16131365, locus_tag="b3493")으로서 등록되어 있다. MG1655 균주의 pitA 유전자의 염기 서열 및 이러한 유전자가 암호화된 PitA 단백질의 아미노산 서열을 각각 서열번호 1 및 서열번호 2에 나타낸다.
Pantoea ananatis LMG20103 균주의 pitA 유전자는, NCBI 데이터베이스에 GenBank accession NC_013956(VERSION NC_013956.2 GI:332139403)으로서 등록되어 있는 게놈 서열 중 위치 1397898 내지 1399514의 서열의 상보 서열에 상당한다. 또한, Pantoea ananatis LMG20103 균주의 PitA 단백질은 GenBank accession YP_003519531(version YP_003519531.1 GI: 291616789, locus_tag="PANA_1236")로서 등록되어 있다. Pantoea ananatis LMG20103 균주의 pitA 유전자의 염기 서열, 및 이러한 유전자가 암호화된 PitA 단백질의 아미노산 서열을 각각 서열번호 3 및 서열번호 4에 나타낸다.
Corynebacterium glutamicum ATCC13032의 pitA 유전자는 NCBI 데이터베이스에 GenBank accession NC_003450(VERSION NC_003450.3 GI: 58036263)으로서 등록되어 있는 게놈 서열 중 위치 481391 내지 482776의 서열의 상보 서열에 상당한다. Corynebacterium glutamicum ATCC13032의 pitA 유전자는 Cgl0460과 동일하다. 또한, Corynebacterium glutamicum ATCC13032의 PitA 단백질은 GenBank accession NP_599707(version NP_599707.1 GI: 19551705, locus_tag="NCgl0445")로서 등록되어 있다. Corynebacterium glutamicum ATCC13032의 pitA 유전자의 염기 서열, 및 이러한 유전자가 암호화된 PitA 단백질의 아미노산 서열을 각각 서열번호 25 및 서열번호 26에 나타낸다. 또한, Corynebacterium glutamicum 2256(ATCC 13869)의 pitA 유전자의 염기 서열, 및 이러한 유전자가 암호화된 PitA 단백질의 아미노산 서열을 각각 서열번호 5 및 서열번호 6에 나타낸다.
인산 트랜스포터는, 인산 트랜스포터 활성을 갖는 한, 상기 인산 트랜스포터, 예를 들면, 각종 PitA 단백질의 변이체이어도 좋다. 또한, 이러한 변이체를 「보존적 변이체」라고 하는 경우도 있다. 보존적 변이체로서는, 예를 들면, 상기 인산 트랜스포터, 예를 들면, 각종 PitA 단백질의 동족체나 인위적 개변체가 열거된다.
상기 PitA 단백질의 동족체를 암호화하는 유전자는, 예를 들면, 상기 pitA 유전자의 염기 서열(서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 5 또는 서열번호 25)를 문의 서열로서 사용한 BLAST 검색이나 FASTA 검색에 의해 공개 데이터베이스로부터 용이하게 취득할 수 있다. 또한, 상기 PitA 단백질의 동족체를 암호화하는 유전자는, 예를 들면, 세균이나 효모의 염색체를 주형으로 해서 이러한 공지의 유전자 서열에 근거하여 작제한 올리고뉴클레오타이드를 프라이머로서 이용하는 PCR에 의해 취득될 수 있다.
인산 트랜스포터의 보존적 변이체를 암호화하는 유전자는, 예를 들면, 이하와 같은 유전자이어도 좋다. 즉, 인산 트랜스포터 유전자는, 인산 트랜스포터 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 한에 있어서, 상기 아미노산 서열에 있어서 1개 또는 수개의 위치에서의 1개 또는 수개의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 단백질을 암호화하는 유전자이어도 좋다. 이러한 경우, 인산 트랜스포터 활성은, 1개 또는 수개의 아미노산이 치환, 결실, 삽입, 또는 부가되기 전의 단백질에 비하여, 통상 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상이 유지될 수 있다. 또한, 상기 「1개 또는 수개」란, 아미노산 잔기의 단백질의 입체 구조에 있어서의 위치나 아미노산 잔기의 종류에 따라 상이하지만, 구체적으로는 바람직하게는 1개 내지 20개, 보다 바람직하게는 1개 내지 10개, 더욱 바람직하게는 1개 내지 5개, 특히 바람직하게는 1개 내지 3개를 의미한다.
상기의 1개 또는 수개의 아미노산의 치환, 결실, 삽입, 또는 부가는, 단백질의 기능이 정상으로 유지되는 보존적 변이이다. 보존적 변이의 대표적인 것으로는 보존적 치환이 있다. 보존적 치환이란, 치환 부위가 방향족 아미노산인 경우에는, Phe, Trp, Tyr 사이에서; 치환 부위가 소수성 아미노산인 경우에는, Leu, Ile, Val 사이에서; 극성 아미노산인 경우에는, Gln, Asn 사이에서; 염기성 아미노산인 경우에는, Lys, Arg, His 사이에서; 산성 아미노산인 경우에는, Asp, Glu 사이에서; 하이드록실기를 갖는 아미노산인 경우에는, Ser, Thr 사이에서 상호 치환되는 변이이다. 보존적 치환으로 간주되는 치환으로서는, 구체적으로는, Ala로부터 Ser 또는 Thr으로의 치환, Arg으로부터 Gln, His, 또는 Lys으로의 치환, Asn으로부터 Glu, Gln, Lys, His, 또는 Asp로의 치환, Asp로부터 Asn, Glu, 또는 Gln으로의 치환, Cys으로부터 Ser 또는 Ala으로의 치환, Gln으로부터 Asn, Glu, Lys, His, Asp, 또는 Arg으로의 치환, Glu로부터 Gly, Asn, Gln, Lys, 또는 Asp으로의 치환, Gly로부터 Pro으로의 치환, His으로부터 Asn, Lys, Gln, Arg, 또는 Tyr으로의 치환, Ile으로부터 Leu, Met, Val, 또는 Phe로의 치환, Leu으로부터 Ile, Met, Val, 또는 Phe로의 치환, Lys으로부터 Asn, Glu, Gln, His, 또는 Arg으로의 치환, Met으로부터 Ile, Leu, Val, 또는 Phe로의 치환, Phe로부터 Trp, Tyr, Met, Ile, 또는 Leu으로의 치환, Ser으로부터 Thr 또는 Ala으로의 치환, Thr으로부터 Ser 또는 Ala으로의 치환, Trp으로부터 Phe 또는 Tyr으로의 치환, Tyr으로부터 His, Phe, 또는 Trp으로의 치환, 및 Val으로부터 Met, Ile, 또는 Leu으로의 치환이 열거된다. 또한, 상기와 같은 아미노산의 치환, 결실, 삽입, 부가, 또는 역위 등에는, 유전자가 유래하는 생물의 개체 차, 종의 차이에 근거한 경우 등의 천연 발생 변이(mutant 또는 variant)에 의해 발생하는 것도 포함된다.
또한, 상기한 바와 같은 보존적 변이를 갖는 유전자는, 상기 아미노산 서열 전체에 대해 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 보다 바람직하게는 95% 이상, 더욱 바람직하게는 97% 이상, 특히 바람직하게는 99% 이상의 상동성을 갖고, 또한, 인산 트랜스포터 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 유전자이어도 좋다. 또한, 본 명세서에 있어서, 「상동성」(homology)은 「동일성」(identity)을 의미한다.
또한, 인산 트랜스포터 유전자는, 공지의 유전자 서열로부터 조제될 수 있는 프로브, 예를 들면, 상기 염기 서열의 전체 또는 일부에 대한 상보 서열과 엄격한 조건 하에 하이드리드화하여, 인산 트랜스포터 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 DNA이어도 좋다. 「엄격한 조건」이란, 소위 특이적인 하이브리드가 형성되고, 비특이적 하이브리드가 형성되지 않는 조건을 말한다. 일례를 나타내면, 상동성이 높은 DNA끼리, 예를 들면, 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 보다 바람직하게는 95% 이상, 더욱 바람직하게는 97% 이상, 특히 바람직하게는 99% 이상의 상동성을 갖는 DNA끼리 하이브리드화하고, 그보다 상동성이 낮은 DNA끼리 하이브리드화하지 않는 조건, 또는 통상의 써던 하이브리드화의 세척 조건인 60℃, 1×SSC, 0.1% SDS, 바람직하게는 60℃, 0.1×SSC, 0.1% SDS, 보다 바람직하게는 68℃, 0.1×SSC, 0.1% SDS에 상당하는 염 농도 및 온도에서, 1회, 바람직하게는 2회 내지 3회 세정하는 조건을 열거할 수 있다.
상술한 바와 같이, 상기 하이브리드화에 사용된 프로브는, 유전자의 상보 서열의 일부이어도 좋다. 이러한 프로브는, 공지의 유전자 서열에 근거하여 작제된 올리고뉴클레오타이드를 프라이머로 하여, 이러한 염기 서열을 포함하는 DNA 단편을 주형으로 하는 PCR에 의해 작제될 수 있다. 예를 들면, 프로브로서는, 300bp 정도 길이의 DNA 단편을 사용할 수 있다. 보다 구체적으로는, 프로브로서, 300bp 정도 길이의 DNA 단편을 사용하는 경우에는, 하이브리드화의 세척 조건으로서는, 50℃, 2×SSC 및 0.1% SDS가 열거된다.
또한, 인산 트랜스포터 유전자는, 인산 트랜스포터 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 한, 임의의 코돈이 이와 등가의 코돈으로 치환되는 것이어도 좋다. 예를 들면, 인산 트랜스포터 유전자는, 사용하는 숙주의 코돈 사용 빈도에 따라서 최적인 코돈을 갖도록 개변되어 있는 것이어도 좋다.
2개의 서열 사이의 서열 동일성의 백분율은, 예를 들면, 수학적 알고리듬을 이용하여 결정할 수 있다. 이러한 수학적 알고리듬의 한정되지 않는 예로서는, 문헌[Myers 및 Miller (1988) CABIOS 4:11-17]의 알고리듬, 문헌[Smith et al (1981) Adv. Appl. Math. 2:482]의 국소 상동성 알고리듬, 문헌[Needleman 및 Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443-453]의 상동성 정렬 알고리듬, 문헌[Pearson 및 Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85:2444-2448]의 유사성을 검색하는 방법, 문헌[Karlin 및 Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877]에 기재되어 있는 바와 같이 개량된 문헌[Karlin 및 Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 872264]의 알고리듬이 열거된다.
이러한 수학적 알고리듬에 근거한 프로그램을 이용하여, 서열 동일성을 결정하기 위한 서열 비교(정렬)를 행할 수 있다. 프로그램은 적당하게 컴퓨터에 의해 실행할 수 있다. 이러한 프로그램으로서는, 특별하게 한정되지 않지만, PC/Gene 프로그램의 CLUSTAL(Intelligenetics, Mountain View, Calif.로부터 입수가능), ALIGN 프로그램(Version 2.0), 및 Wisconsin Genetics Software Package, Version 8(Genetics Computer Group (GCG), 575 Science Drive, Madison, Wis., USA로부터 입수가능)의 GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA, 및 TFASTA가 열거된다. 이러한 프로그램을 이용한 정렬은, 예를 들면, 초기 파라미터들을 이용하여 행할 수 있다. CLUSTAL 프로그램에 관해서는 문헌[Higgins et al. (1988) Gene 73:237-244 (1988), Higgins et al. (1989) CABIOS 5:151-153, Corpet et al. (1988) Nucleic Acids Res. 16:10881-90, Huang et al. (1992) CABIOS 8:155-65, 및 Pearson et al. (1994) Meth. Mol. Biol. 24:307-331]에 잘 기재되어 있다.
대상의 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열과 상동성인 뉴클레오타이드 서열을 수득하기 위해서, 구체적으로는, 예를 들면, BLAST 뉴클레오타이드 검색을, BLASTN 프로그램, 스코어=100, 워드 길이=12로서 행할 수 있다. 대상의 단백질과 상동성인 아미노산 서열을 수득하기 위해서, 구체적으로는, 예를 들면, BLAST 단백질 검색을, BLASTX 프로그램, 스코어=50, 워드 길이=3으로서 행할 수 있다. BLAST 뉴클레오타이드 검색이나 BLAST 단백질 검색에 관해서는 http://www.ncbi.nlm.nih.gov를 참조한다. 또한, 비교를 목적으로 해서, 갭을 가한 정렬을 수득하기 위해서, Gapped BLAST(BLAST 2.0)를 이용할 수 있다. 또한, PSI-BLAST(BLAST 2.0)를, 서열 사이의 먼 관계를 검출하는 반복 검색을 행하기 위해 이용할 수 있다. Gapped BLAST 및 PSI-BLAST에 관해서는 문헌[Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389]을 참조한다. BLAST, Gapped BLAST, 또는 PSI-BLAST를 이용하는 경우, 예를 들면, 각 프로그램(예를 들면, 뉴클레오타이드 서열에 대해서 BLASTN, 아미노산 서열에 대해서 BLASTX)의 초기 파라미터가 사용될 수 있다. 정렬은 수동으로 행하여도 좋다.
2개의 서열 사이의 서열 동일성은, 2개의 서열을 최대 일치하도록 정렬하는 경우에 2개의 서열 사이에서 일치하는 잔기의 비율로서 산출된다.
또한, 상기의 유전자나 단백질의 변이체에 관한 기재는, L-아미노산 생합성계 효소 등의 임의의 단백질, 및 이를 암호화하는 유전자에도 준용될 수 있다.
<1-3> 단백질의 활성을 증대시키는 방법
이하에, 단백질을 활성을 증대시키는 방법에 관해서 설명한다.
「단백질의 활성이 증대되는」이란, 상기 단백질의 세포당 활성이 야생주나 친주 등의 비개변주에 비해서 증대되는 것을 의미한다. 또한, 「단백질의 활성이 증대되는」 것을, 「단백질의 활성이 증강되는」이라고도 한다. 「단백질의 활성이 증대되는」이란, 구체적으로는 비개변주와 비교해서 상기 단백질의 세포당 분자수가 증가되는 것, 및/또는 상기 단백질의 분자당 기능이 증대되는 것을 말한다. 즉, 「단백질의 활성이 증대된다」고 하는 경우의 「활성」이란, 단백질의 촉매 활성에 한정되지 않고 단백질을 암호화하는 유전자의 전사량(mRNA의 양), 또는 번역량(단백질의 양)을 의미하여도 좋다. 단백질의 활성은, 비개변주와 비교하여 증대되는 것이면 특별하게 제한되지 않지만, 예를 들면, 비개변주와 비교하여 1.5배 이상, 2배 이상, 또는 3배 이상으로 상승되어도 좋다. 또한, 「단백질의 활성이 증대되는」이란, 원래 표적의 단백질의 활성을 갖는 균주에 있어서 상기 단백질의 활성을 증대시키는 것뿐만 아니라, 원래 표적의 단백질의 활성이 존재하지 않는 균주에 상기 단백질의 활성을 부여하는 것도 포함한다. 또한, 결과로서 단백질의 활성이 증대되는 한, 숙주가 본래 갖는 표적의 단백질의 활성을 약화 및/또는 결손시킨 후, 바람직한 상기 단백질을 도입하여도 좋다.
단백질의 활성이 증대되도록 하는 개변은, 예를 들면, 상기 단백질을 암호화하는 유전자의 발현을 상승시킴으로써 달성된다. 또한, 「유전자의 발현이 상승되는」 것을, 「유전자의 발현이 증강되는」 것이라고 한다. 유전자의 발현은, 예를 들면, 비개변주와 비교하여 1.5배 이상, 2배 이상, 또는 3배 이상으로 상승되어도 좋다. 또한, 「유전자의 발현이 상승되는」이란, 원래 표적의 유전자가 발현되는 균주에 있어서 상기 유전자의 발현량을 상승시키는 것뿐만 아니라, 원래 표적의 유전자가 발현되지 않는 균주에 있어서 상기 유전자를 발현시키는 것을 포함한다. 즉, 「유전자의 발현이 상승되는」이란, 예를 들면, 표적 유전자를 보유하지 않는 균주에 상기 유전자를 도입하여 상기 유전자를 발현시키는 것을 포함한다.
유전자의 발현의 상승은, 예를 들면, 유전자의 카피 수를 증가시킴으로써 달성될 수 있다.
유전자의 카피 수의 증가는, 숙주의 염색체에 상기 유전자를 도입시킴으로써 달성될 수 있다. 염색체에의 유전자의 도입은, 예를 들면, 상동 재조합을 이용함으로써 행할 수 있다((MillerI, J. H., Experiments in Molecular Genetics, 1972, Cold Spring Harbor Laboratory). 유전자는, 1개의 카피만을 도입하여도 좋고, 2개의 카피 또는 그 이상을 도입하여도 좋다. 예를 들면, 염색체 상에 다수의 카피가 존재하는 서열을 표적으로 하여 상동 재조합을 행함으로써, 염색체에 유전자의 다수의 카피를 도입할 수 있다. 염색체 상에 다수의 카피가 존재하는 서열로서는, 반복 DNA 서열(repetitive DNA), 트랜스포손의 양단에 존재하는 인버테이트 리피트가 열거된다. 또한, L-아미노산 생산에 불필요한 유전자 등의 염색체 상의 적당한 서열을 표적으로 하여 상동 재조합을 행하여도 좋다. 상동 재조합은, 예를 들면, Red 드리븐 인테그레이션(Ref-driven integration)법(Datsenko, K. A., and Wanner, B. L. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 97:6640-6645 (2000)) 등의 직쇄상 DNA를 사용하는 방법, 온도 감수성 복제 기점을 포함하는 플라스미드를 사용하는 방법, 접합 전달가능한 플라스미드를 사용하는 방법, 숙주 내에서 기능하는 복제 기점을 갖지 않는 자살 벡터를 사용하는 방법, 또는 파지를 사용한 transduction법에 의해 행할 수 있다. 또한, 유전자는, 트랜스포손이나 Mini-Mu를 이용하여 염색체 상에 랜덤하게 도입될 수 있다(일본 공개특허공보 평2-109985호 공보, US5,882,888호, EP805867B1).
염색체 상에 표적 유전자가 도입된 것의 확인은, 상기 유전자의 전부 또는 일부와 상보적인 서열을 갖는 프로브를 이용한 써던 하이브리드화, 또는 상기 유전자의 서열에 근거하여 작성된 프라이머를 이용한 PCR 등에 의해 확인할 수 있다.
또한, 유전자의 카피 수의 증가는, 표적 유전자를 포함하는 벡터를 숙주에 도입함으로써도 달성될 수 있다. 예를 들면, 표적 유전자를 포함하는 DNA 단편을, 숙주에서 기능하는 벡터와 연결해서 상기 유전자의 발현 벡터를 구축하여, 당해 발현 벡터로 숙주를 형질전환시킴으로써, 상기 유전자의 카피 수를 증가시킬 수 있다. 표적 유전자를 포함하는 DNA 단편은, 예를 들면, 표적 유전자를 갖는 미생물의 게놈 DNA를 주형으로 하는 PCR에 의해 취득할 수 있다. 벡터로서는, 숙주의 세포 내에 있어서 자율 복제가능한 벡터를 사용할 수 있다. 벡터는, 멀티카피 벡터인 것이 바람직하다. 또한, 형질전환체를 선택하기 위해서, 벡터는 항생물질 내성 유전자 등의 마커를 갖는 것이 바람직하다. 벡터는, 예를 들면, 세균 플라스미드 유래의 벡터, 효모 플라스미드 유래의 벡터, 박테리오파지 유래의 벡터, 코스미드, 또는 파지미드 등이어도 좋다. 코리네형 세균에서 자율 복제가능한 벡터로서, 구체적으로는, 예를 들면, pHM1519(Agric, Biol. Chem., 48, 2901-2903 (1984)); pAM330(Agric. Biol. Chem., 48, 2901-2903 (1984)); 이를 개량한 약제 내성 유전자를 갖는 플라스미드; 일본 공개특허공보 평3-210184호 공보에 기재되어 있는 플라스미드 pCRY30; 일본 공개특허공보 평2-72876호 공보 및 미국 특허 5,185,262호 명세서 공보에 기재되어 있는 플라스미드 pCRY21, pCRY2KE, pCRY2KX, pCRY31, pCRY3KE, 및 pCRY3KX; 일본 공개특허공보 평1-191686호 공보에 기재되어 있는 플라스미드 pCRY2 및 pCRY3; 일본 공개특허공보 소58-192900호 공보에 기재되어 있는 pAJ655, pAJ611, 및 pAJ1844; 일본 공개특허공보 소57-134500호 공보에 기재되어 있는 pCG1; 일본 공개특허공보 소58-35197호 공보에 기재되어 있는 pCG2; 일본 공개특허공보 소57-183799호 공보에 기재되어 있는 pCG4 및 pCG11이 열거된다.
유전자를 도입하는 경우, 유전자는 발현 가능하게 본 발명의 세균에 보유되어 있으면 좋다. 구체적으로는, 유전자는, 본 발명의 세균에서 기능하는 프로모터 서열에 의한 제어를 받아 발현되도록 도입되는 것이면 좋다. 프로모터는, 숙주 유래의 프로모터이어도 좋고, 이종 유래의 프로모터이어도 좋다. 프로모터는, 도입하는 유전자의 고유의 프로모터이어도 좋고, 다른 유전자의 프로모터이어도 좋다. 프로모터로서는, 예를 들면, 후술되는 바와 같은 보다 강력한 프로모터를 이용하여도 좋다.
또한, 2종 또는 그 이상의 유전자를 도입하는 경우, 각 유전자가 발현 가능하게 본 발명의 세균에 보유되어 있으면 좋다. 예를 들면, 각 유전자는 전체가 단일 발현 벡터 상에 유지되어 있어도 좋고, 전체가 염색체 상에 유지되어 있어도 좋다. 또한, 각 유전자는, 복수의 발현 벡터 상에 별도로 유지되어 있어도 좋고, 단일 또는 복수의 발현 벡터 상과 염색체 상에 별도로 유지되어 있어도 좋다. 또한, 2개 또는 그 이상의 유전자로 오페론을 구성하여 도입하여도 좋다.
도입되는 유전자는, 숙주에서 기능하는 단백질을 암호화하는 것이면 특별하게 제한되지 않는다. 도입되는 유전자는, 숙주 유래의 유전자이어도 좋고, 이종 유래의 유전자이어도 좋다.
또한, 유전자 발현의 상승은, 유전자의 전사 효율을 향상시킴으로써 달성될 수 있다. 유전자의 전사 효율의 향상은, 예를 들면, 염색체 상의 유전자의 프로모터를 보다 강력한 프로모터로 치환함으로써 달성될 수 있다. 「보다 강력한 프로모터」란, 유전자의 전사가 원래 존재하는 야생형 프로모터보다도 향상된 프로모터를 의미한다. 또한, 코리네형 세균에서 이용할 수 있는 보다 강력한 프로모터로서는, 인위적으로 설계 변경된 P54-6 프로모터(Appl.Microbiol.Biotechnolo., 53, 674-679 (2000)), 코리네형 세균 내에서 아세트산, 에탄올, 피루브산 등으로 유도할 수 있는 pta, aceA, aceB, adh, amyE 프로모터, 코리네형 세균 내에서 발현량이 많은 강력한 프로모터인 cspB, SOD, tuf 프로모터(Journal of Biotechnology, 104 (2003) 311-323, Appl Environ Microbiol. 2005 Dec; 71(12):8587-96.), lac 프로모터, tac 프로모터, trc 프로모터가 열거된다. 또한, 보다 강력한 프로모터로서는, 각종 리포터 유전자를 이용함으로써 재래의 프로모터의 고 활성형인 것이 취득하여도 좋다. 예를 들면, 프로모터 영역 내의 -35, -10 영역을 컨센서스 서열에 보다 가깝게 함으로써, 프로모터의 활성을 높일 수 있다(국제 공개 제00/18935호). 프로모터의 강도의 평가법 및 강력한 프로모터의 예는 Goldstein 등의 문헌(Prokaryotic Promoters in biotechnology. Biotechnol. Annu. Rev., 1, 105-128 (1995)) 등에 기재되어 있다.
또한, 유전자의 발현의 상승은, 유전자의 번역 효율을 향상시킴으로써 달성될 수 있다. 유전자의 번역 효율의 향상은, 예를 들면, 염색체 상의 유전자의 샤인 달가노(SD) 서열(리보솜 결합 부위(RBS)라고도 함)을 보다 강력한 SD 서열로 치환함으로써 달성될 수 있다. 「보다 강력한 SD 서열」이란, mRNA의 번역이 원래 존재하고 있는 야생형 SD 서열보다도 향상된 SD 서열을 의미한다. 보다 강력한 SD 서열로서는, 예를 들면, 파지 T7 유래의 유전자 10의 RBS가 열거된다(Olins P. O. et al, Gene, 1988, 73, 227-235). 또한, RBS와 개시 코돈 사이의 스페이서 영역, 특히, 개시 코돈의 인접 상류의 서열(5'-UTR)에서의 수개의 뉴클레오타이드의 치환, 또는 삽입, 또는 결실이 mRNA의 안정성 및 번역 효율에 매우 영향을 미친다는 것이 알려져 있고, 이를 개변시킴으로써도 유전자의 번역 효율을 향상시킬 수 있다.
본 발명에 있어서는, 프로모터, SD 서열, 및 RBS와 개시 코돈과의 사이의 스페이서 영역 등의 유전자의 발현에 영향을 미치는 부위를 총칭하여 「발현 조절 영역」이라고 한다. 발현 조절 영역은, 프로모터 검색 벡터나 GENETYX 등의 유전자 해석 소프트웨어를 이용하여 결정할 수 있다. 이러한 발현 조절 영역의 개변은, 예를 들면, 온도 감수성 벡터를 이용하는 방법이나 Red 드리븐 인테그레이션법(WO2005/010175)에 의해 행할 수 있다.
유전자의 번역 효율의 향상은, 예를 들면, 코돈을 개변시킴으로써도 달성될 수 있다. 예를 들면, 유전자의 이종 발현을 행하는 경우 등에는, 유전자 중에 존재하는 레어 코돈을 보다 고빈도로 이용하는 동의 코돈으로 치환함으로써, 유전자의 번역 효율을 향상시킬 수 있다. 코돈의 치환은, 예를 들면, DNA의 목적하는 부위에 목적하는 변이를 도입하는 부위 특이적 변이법에 의해 행할 수 있다. 또한, 코돈이 치환된 유전자 단편을 전체적으로 합성하여도 좋다. 각종 생물에서의 코돈의 사용 빈도는, 「코돈 사용 데이터베이스」(http://www.kazusa.or.jp/codon; Nakamura, Y. et al, Nucl. Acids Res., 28, 292 (2000))에 개시되어 있다.
또한, 유전자의 발현의 상승은, 유전자의 발현을 상승시키도록 하는 조절인자를 증폭시킴, 또는 유전자의 발현을 저하시키도록 하는 조절인자를 결실 또는 약화시킴에 의해서도 달성될 수 있다.
상기한 바와 같은 유전자의 발현을 상승시키는 방법은, 단독으로 이용하여도 좋고, 임의의 조합으로 사용하여도 좋다.
또한, 효소 활성이 증대되도록 하는 개변은, 예를 들면, 효소의 비활성을 증강시킴에 의해서도 달성될 수 있다. 비활성이 증강된 효소는, 예를 들면, 각종 생물을 탐색하여 취득할 수 있다. 또한, 재래의 효소에 변이를 도입함으로써 높은 활성형의 것을 취득하여도 좋다. 비활성의 증강은, 독립적으로 이용하여도 좋고, 상기와 같은 유전자의 발현을 증강시키는 방법과 임의로 조합하여 이용하여도 좋다.
인산 트랜스포터의 활성은, 예를 들면, 「특정의 변이」를 갖는 인산 트랜스포터를 암호화하는 인산 트랜스포터 유전자를 숙주가 보유함으로써도 증대될 수 있다. 본 발명에 있어서는, 당해 「특정의 변이」를 갖는 인산 트랜스포터를 변이형 인산 트랜스포터, 이를 암호화하는 유전자를 변이형 인산 트랜스포터 유전자라고도 한다. 또한, 본 발명에 있어서는, 당해 「특정의 변이」를 갖지 않는 인산 트랜스포터를 야생형 인산 트랜스포터, 이를 암호화하는 유전자를 야생형 인산 트랜스포터 유전자라고도 한다. 당해 「특정의 변이」를 갖는 변이형 인산 트랜스포터는, 야생형 인산 트랜스포터와 비교하여 높은 비활성을 갖는 것이어도 좋다.
야생형 인산 트랜스포터로서는, 「특정의 변이」를 갖지 않는 PitA 단백질(야생형 PitA 단백질)이 열거된다. 변이형 인산 트랜스포터로서는 「특정의 변이」를 갖는 PitA 단백질(변이형 PitA 단백질)이 열거된다. 야생형 PitA 단백질을 암호화하는 유전자를 야생형 pitA 유전자, 변이형 PitA 단백질을 암호화하는 유전자를 변이형 pitA 유전자라고 한다. 야생형 PitA 단백질로서는, 상기 예시한 각종 PitA 단백질이나, 이의 보존적 변이체에 있어서 「특정의 변이」를 갖지 않는 것이 열거된다. 즉, 변이형 인산 트랜스포터는, 「특정의 변이」를 갖는 것 이외는, 예를 들면, 상기 예시한 각종 PitA 단백질 및 이의 보존적 변이체로부터 선택되는 하나의 단백질과 동일하여도 좋다.
구체적으로는, 예를 들면, 변이형 인산 트랜스포터는, 「특정의 변이」를 갖는 것 이외는, 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 6, 또는 서열번호 26에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 단백질이어도 좋다. 또한, 구체적으로는, 예를 들면, 변이형 인산 트랜스포터는 「특정의 변이」를 갖는 것 이외는, 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 6, 또는 서열번호 26에 나타낸 아미노산 서열에 있어서, 1개 또는 수개의 아미노산의 치환, 결실, 삽입, 또는 부가를 포함하는 아미노산 서열을 갖는 단백질이어도 좋다. 또한, 구체적으로는, 예를 들면, 변이형 인산 트랜스포터는, 「특정의 변이」를 갖는 것 이외는, 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 6, 또는 서열번호 26에 나타낸 아미노산 서열에 대하여 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 보다 바람직하게는 95% 이상, 더욱 바람직하게는 97% 이상, 특히 바람직하게는 99% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 단백질이어도 좋다. 또한, 본 발명에 있어서, 「상동성」이란 「동일성」을 의미한다.
또한, 달리 말하면, 변이형 인산 트랜스포터는, 상기 예시한 각종 PitA 단백질에 있어서 「특정의 변이」를 갖고, 또한, 당해 「특정의 변이」 이외의 개소에 추가로 보존적 변이를 포함하는 변이체이어도 좋다.
구체적으로는, 예를 들면, 변이형 인산 트랜스포터는, 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 6, 또는 서열번호 26에 나타낸 아미노산 서열에 있어서 「특정의 변이」를 갖고, 또한, 당해 「특정의 변이」 이외의 개소에 추가로 1개 또는 수개의 아미노산의 치환, 결실, 삽입, 또는 부가를 포함하는 아미노산 서열을 갖는 단백질이어도 좋다.
또한, 상기 「1개 또는 수개」란, 구체적으로는, 바람직하게는 1개 내지 20개, 보다 바람직하게는 1개 내지 10개, 더욱 바람직하게는 1개 내지 5개, 특히 바람직하게는 1개 내지 3개를 의미한다. 상기의 1개 또는 수개의 아미노산의 치환, 결실, 삽입, 또는 부가는, 단백질의 기능이 정상으로 유지되는 보존적 변이이다. 보존적 변이의 대표적인 것은 보존적 치환이다. 보존적 치환이란, 치환 부위가 방향족 아미노산인 경우에는 Phe, Trp, Tyr 사이에서, 치환 부위가 소수성 아미노산인 경우에는 Leu, Ile, Val 사이에서, 극성 아미노산인 경우에는 Gln, Asn 사이에서, 염기성 아미노산인 경우에는 Lys, Arg, His 사이에서, 산성 아미노산인 경우에는 Asp, Glu 사이에서, 하이드록실기를 갖는 아미노산인 경우에는 Ser, Thr 사이에서 상호 치환되는 변이이다. 보존적 치환으로 간주되는 치환으로서는, 구체적으로는, Ala으로부터 Ser 또는 Thr으로의 치환, Arg으로부터 Gln, His, 또는 Lys으로의 치환, Asn으로부터 Glu, Gln, Lys, His, 또는 Asp으로의 치환, Asp으로부터 Asn, Glu, 또는 Gln으로의 치환, Cys으로부터 Ser 또는 Ala으로의 치환, Gln으로부터 Asn, Glu, Lys, His, Asp, 또는 Arg으로의 치환, Glu으로부터 Gly, Asn, Gln, Lys, 또는 Asp으로의 치환, Gly으로부터 Pro으로의 치환, His으로부터 Asn, Lys, Gln, Arg, 또는 Tyr으로의 치환, Ile으로부터 Leu, Met, Val, 또는 Phe로의 치환, Leu으로부터 Ile, Met, Val, 또는 Phe로의 치환, Lys으로부터 Asn, Glu, Gln, His, 또는 Arg으로의 치환, Met으로부터 Ile, Leu, Val, 또는 Phe로의 치환, Phe로부터 Trp, Tyr, Met, Ile, 또는 Leu으로의 치환, Ser으로부터 Thr 또는 Ala으로의 치환, Thr으로부터 Ser 또는 Ala으로의 치환, Trp으로부터 Phe 또는 Tyr으로의 치환, Tyr으로부터 His, Phe, 또는 Trp으로의 치환, 및 Val으로부터 Met, Ile, 또는 Leu으로의 치환이 열거된다. 또한, 상기와 같은 아미노산의 치환, 결실, 삽입, 부가, 또는 역위 등에는, 유전자가 유래하는 생물의 개체 차, 종의 차이에 근거한 경우 등의 천연 발생 변이(mutant 또는 variant)에 의해 발생하는 것도 포함된다.
「특정의 변이」로서는, 예를 들면, 서열번호 6의 위치 246에서의 페닐알라닌 잔기에 상당하는 아미노산 잔기가 페닐알라닌 이외의 아미노산 잔기로 치환되는 변이가 열거된다. 치환 후의 아미노산 잔기는 페닐알리닌 이외의 아미노산으로 천연형 아미노산이면 임의의 아미노산이어도 좋고, 리신, 글루탐산, 티로신, 발린, 이소류신, 세린, 아스파르트산, 아스파라긴, 글루타민, 아르기닌, 시스테인, 메티오닌, 트립토판, 글리신, 알라닌, 히스티딘으로부터 선택되지만, 특히 세린인 것이 바람직하다.
아미노산 서열에 있어서의 「위치 X」란, 상기 아미노산 서열의 N 말단으로부터 계산하여 X번째 위치를 의미하고, N 말단의 아미노산 잔기가 위치 1의 아미노산 잔기이다. 또한, 아미노산 잔기의 위치는 상대적인 위치를 나타내는 것으로서, 아미노산의 결실, 삽입, 부가 등에 의해 이의 절대적인 위치는 전후하는 경우가 있다. 즉, 「서열번호 6의 위치 246의 페닐알라닌 잔기에 상당하는 아미노산 잔기」란, 서열번호 6에 있어서 위치 246보다도 N 말단측의 1개의 아미노산 잔기가 결실되어 있는 경우는, N 말단으로부터 계산하여 245번째의 아미노산 잔기를 의미한다. 또한, 「서열번호 6의 위치 246의 페닐알라닌 잔기에 상당하는 아미노산 잔기」란, 서열번호 6에 있어서 위치 246보다도 N 말단측에 1개의 아미노산 잔기가 삽입되어 있는 경우는, N 말단으로부터 계산하여 247번째의 아미노산 잔기를 의미한다.
임의의 아미노산 서열에 있어서, 임의의 아미노산 잔기가 「서열번호 6의 위치 246의 페닐알라닌 잔기에 상당하는 아미노산 잔기」인지는, 당해 임의의 아미노산 서열과 서열번호 6의 아미노산 서열의 정렬을 행하는 것에 의해 결정될 수 있다. 정렬은, 예를 들면, 공지의 유전자 해석 소프트웨어를 이용하여 행할 수 있다. 구체적인 소프트웨어로서는, 히타치 솔루션 제조의 DNASIS나, 제네틱스 제조의 GENETYX 등이 열거된다(Elizabeth C. Tyler et al., Computers and Biomedical Research, 24(1), 72-96, 1991; Barton GJ et al., Journal of molecular biology, 198(2), 327-37, 1987).
또한, 본 발명에 있어서, 야생형 인산 트랜스포터가, 서열번호 6에 나타낸 아미노산 서열 이외의 아미노산 서열을 갖는 경우에는, 「서열번호 6의 위치 246의 페닐알라닌 잔기에 상당하는 아미노산 잔기」는 페닐알라닌 잔기가 아닌 경우일 수 있다. 즉, 예를 들면, 「서열번호 6의 위치 246의 페닐알라닌 잔기에 상당하는 아미노산 잔기가 세린 잔기로 치환된 변이」로는, 야생형 산성 인산 트랜스포터에 있어서 서열번호 6에 나타낸 아미노산 서열에 있어서의 위치 246의 페닐알라닌 잔기에 상당하는 아미노산 잔기가 페닐알라닌 잔기인 경우에, 당해 페닐알라닌 잔기를 세린 잔기로 치환하는 변이에 한정되지 않고, 야생형 산성 인산 트랜스포터에 있어서 서열번호 6에 나타낸 아미노산 서열에 있어서의 위치 246의 페닐알라닌 잔기에 상당하는 아미노산 잔기가 페닐알라닌 잔기 및 세린 잔기 이외의 임의의 아미노산 잔기인 경우에, 당해 아미노산 잔기를 세린 잔기로 치환하는 변이도 포함된다.
변이형 인산 트랜스포터 유전자는, 야생형 인산 트랜스포터 유전자를, 암호화된 인산 트랜스포터가 「특정의 변이」를 갖도록 개변시킴으로써 취득될 수 있다. 야생형 인산 트랜스포터 유전자는, 변이형 인산 트랜스포터 유전자를 도입하는 숙주 유래의 유전자이어도 좋고, 이종 유래의 유전자이어도 좋다. DNA의 개변은 공지의 방법에 의해 행할 수 있다. 구체적으로는, 예를 들면, DNA의 목적 부위에 목적의 변이를 도입하는 부위 특이적 변이법으로서는, PCR을 이용하는 방법(Higuchi, R., 61, in PCR Technology, Erlich, H. A. Eds., Stockton press (1989); Carter P., Meth. in Enzymol., 154, 382, (1987))이나, 파지를 이용하는 방법(Kramer, W. and Frits, H. J., Meth. in Enzymol., 154, 350, (1987); Kunkel, T. A. et al., Meth. in Enzymol., 154, 367, (1987))이 열거된다. 또한, 변이형 인산 트랜스포터 유전자는 화학적 합성에 의해서도 취득될 수 있다.
변이형 인산 트랜스포터 유전자를 코리네형 세균에 도입함으로써, 코리네형 세균이 변이형 인산 트랜스포터 유전자를 보유할 수 있다. 변이형 인산 트랜스포터 유전자를 코리네형 세균에 도입하는 방법은 특별하게 제한되지 않고, 종래 공지되어 있는 방법을 사용할 수 있다. 예를 들면, 상술한 유전자의 카피 수를 증가시키는 방법과 동일하게 하여, 변이형 인산 트랜스포터 유전자를 코리네형 세균에 도입할 수 있다. 또한, 자연 변이나 변이원 처리에 의해, 코리네형 세균이 갖는 야생형 인산 트랜스포터 유전자를, 암호화된 인산 트랜스포터가 「특정의 변이」를 갖도록 개변되어도 좋다. 본 발명의 세균이 변이형 인산 트랜스포터 유전자를 보유하는 경우, 본 발명의 세균은 야생형 인산 트랜스포터 유전자를 가져도 좋고, 갖지 않아도 좋다. 본 발명의 세균은 1개 또는 그 이상의 카피수의 변이형 인산 트랜스포터 유전자를 가져도 좋다.
형질전환의 방법은 특별하게 한정되지 않고, 종래 공지되어 있는 방법을 사용할 수 있다. 예를 들면, 에스케리키아 콜라이 K-12에 관해서 보고되어 있는 바와 같은 수용균 세포를 염화 칼슘으로 처리하여 DNA의 투과성을 증가시키는 방법(Mandel, M. and Higa, A., J. Mol. Biol. 1970, 53, 159-162)이나, 바실러스 서브틸리스로 보고되어 있는 바와 같은 증식 단계의 세포로부터 컴피턴트 세포를 조제하여 DNA를 도입하는 방법(Duncan, C. H., Wilson, G. A. and Young, F. E., 1997. Gene 1: 153-167)을 사용할 수 있다. 또는, 바실러스 서브틸리스, 방선균류, 및 효모에 관해서 공지되어 있는 바와 같이, DNA 수용균의 세포를, 재조합 DNA를 용이하게 흡수하는 프로토플라스트 또는 스페로플라스트의 상태로 하여 재조합 DNA를 DNA 수용균에 도입하는 방법(Chang, S. and Choen, S.N., 1979. Mol. Gen. Genet., 168: 111-115; Bibb, M. J., Ward, J. M. and Hopwood, O. A., 1978. Nature, 274: 398-400; Hinnen, A., Hicks, J. B. and Fink, G. R., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75: 1929-1933)도 응용할 수 있다. 또한, 코리네형 세균에 관해서 보고되어 있는 전기 펄스법(일본 공개특허공보 평2-207791)를 이용할 수 있다.
단백질 활성이 증대된 것은, 상기 단백질의 활성을 측정함으로써 확인할 수 있다. 인산 트랜스포터 활성은, 예를 들면, 공지의 방법에 의해 무기 인산의 흡수를 측정함으로써 측정될 수 있다(R. M. Harris et al., Journal of Bacteriology, Sept. 2001, p5008-5014).
단백질 활성이 증대된 것은, 상기 단백질을 암호화하는 유전자의 발현이 상승되었음을 확인함으로써도 확인될 수 있다. 유전자의 발현이 상승되었다는 것은, 상기 유전자의 전사량이 상승되었음을 확인하는 것이나, 상기 유전자로부터 발현된 단백질의 양이 상승되었음을 확인함으로써 확인될 수 있다.
유전자의 전사량이 상승된 것의 확인은, 상기 유전자로부터 전사된 mRNA의 양을 야생주 또는 친주 등의 비개변주와 비교함으로써 행할 수 있다. mRNA의 양을 평가하는 방법으로서는, 노던 하이브리드화, RT-PCR 등이 열거된다(Sambrook, J., et al., Molecular Cloning A Laboratory Manual/Third Edition, Cold spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (USA), 2001). mRNA의 양은, 비개변주와 비교하여, 예를 들면, 1.5배 이상, 2배 이상, 또는 3배 이상으로 상승되어도 좋다.
단백질의 양이 상승한 것의 확인은, 항체를 이용한 웨스턴 블롯에 의해 행할 수 있다(Molecular Cloning(Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (USA), 2001)). 단백질의 양은, 비개변주와 비교하여, 예를 들면, 1.5배 이상, 2배 이상, 또는 3배 이상으로 상승되어도 좋다.
상기한 단백질의 활성을 증대시키는 방법은, 인산 트랜스포터의 활성 증강에 추가하여, 임의의 단백질, 예를 들면, L-아미노산 생합성 효소의 활성 증강이나, 임의의 유전자, 예를 들면, 이러한 임의의 단백질을 암호화하는 유전자의 발현 증강에 이용될 수 있다.
<1-4> 단백질의 활성을 저하시키는 방법
이하에, 단백질의 활성을 저하시키는 방법에 관해서 설명한다.
「단백질의 활성이 저하된다」란, 상기 단백질의 세포당의 활성이 야생주나 친주 등의 비개변주와 비교하여 감소된다는 것을 의미하고, 활성이 완전히 소실되어 있는 경우도 포함한다. 「단백질의 활성이 저하된다」란, 구체적으로는, 비개변주와 비교하여, 상기 단백질의 세포당의 분자 수가 저하된다는 것 및/또는 상기 단백질의 각 분자당의 기능이 저하된다는 것을 말한다. 즉, 「단백질의 활성이 저하된다」고 하는 경우의 「활성」이란, 단백질의 촉매 활성에 한정되지 않고, 단백질을 암호화하는 유전자의 전사량(mRNA의 양) 또는 번역량(단백질의 양)을 의미하여도 좋다. 또한, 「단백질의 세포당의 분자 수가 저하되어 있다」는 것은, 상기 단백질이 완전하게 존재하지 않는 경우가 포함된다. 또한, 「단백질의 분자당의 기능이 저하되어 있다」는 것은, 상기 단백질의 분자당의 기능이 완전하게 소실되어 있는 경우가 포함된다. 단백질의 활성은, 비개변주와 비교하여 저하되어 있는 것이면 특별하게 제한되지 않지만, 예를 들면, 비개변주와 비교하여 50% 이하, 20% 이하, 10% 이하, 5% 이하, 또는 0%로 저하되어도 좋다.
단백질의 활성이 저하되도록 하는 개변은, 예를 들면, 상기 단백질을 암호화하는 유전자의 발현을 저하시킴으로써 달성된다. 「유전자의 발현이 저하되는」 것에는, 상기 유전자가 전혀 발현되지 않는 경우가 포함된다. 또한, 「유전자의 발현이 저하되는」 것을, 「유전자의 발현이 약화되는」 것이라고도 한다. 유전자의 발현은, 예를 들면, 비개변주와 비교하여, 50% 이하, 20% 이하, 10% 이하, 5% 이하, 또는 0%로 저하되어도 좋다.
유전자의 발현의 저하는, 예를 들면, 전사 효율의 저하에 의한 것이어도 좋고, 번역 효율의 저하에 의한 것이어도 좋고, 이들의 조합에 의한 것이어도 좋다. 유전자의 발현의 저하는, 예를 들면, 유전자의 프로모터나 샤인 달가노(SD) 서열 등의 발현 조절 서열을 개변시킴으로써 달성될 수 있다. 발현 조절 서열을 개변하는 경우에는, 발현 조절 서열은, 바람직하게는 1개의 염기 이상, 보다 바람직하게는 2개의 염기 이상, 특히 바람직하게는 3개의 염기 이상이 개변된다. 또한, 발현 조절 서열의 일부 또는 전부를 결실시켜도 좋다. 또한, 유전자의 발현의 저하는, 예를 들면, 발현 제어에 관여하는 인자를 조작함으로써도 달성될 수 있다. 발현 제어에 관여하는 인자로서는, 전사나 번역 제어에 관여하는 저분자(유도 물질, 저해 물질 등), 단백질(전사 인자 등), 및 핵산(siRNA 등) 등이 열거된다.
또한, 단백질의 활성이 저하되도록 하는 개변은, 예를 들면, 상기 단백질을 암호화하는 유전자를 파괴함으로써 달성될 수 있다. 유전자의 파괴는, 예를 들면, 염색체 상의 유전자의 암호화 영역의 일부 또는 전부를 결실시킴으로써 달성될 수 있다. 또한, 염색체 상의 유전자의 전후의 서열을 포함하여 유전자 전체를 결실시켜도 좋다. 단백질의 활성의 저하가 달성될 수 있는 한, 결실되는 영역은, N 말단 영역, 내부 영역, C 말단 영역 중 임의의 영역이어도 좋다. 통상, 결실되는 영역은 긴 쪽이 확실히 유전자를 불활성화시킬 수 있다. 또한, 결실되는 영역의 전후의 서열은, 리딩 프레임이 일치하지 않는 것이 바람직하다.
또한, 유전자의 파괴는, 예를 들면, 염색체 상의 유전자의 암호화 영역에 아미노산 치환(미스센스 변이)을 도입하는 것, 정지 코돈을 도입하는 것(논센스 변이), 또는 1개 내지 2개의 염기를 부가 또는 결실시키는 프레임 시프트 변이를 도입하는 것 등에 의해서도 달성될 수 있다(Journal of Biological Chemistry, 272:8611-8617 (1997) Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 95 5511-5515 (1998), Journal of Biological Chemistry 26 116, 20833-20839 (1991)).
또한, 유전자의 파괴는, 예를 들면, 염색체 상의 유전자의 암호화 영역에 다른 서열을 삽입함으로써도 달성될 수 있다. 삽입 부위는 유전자의 임의의 영역이어도 좋지만, 삽입되는 서열은 긴 쪽이 확실하게 유전자를 불활성화시킬 수 있다. 또한, 삽입 부위의 전후의 서열은, 리딩 프레임이 일치하지 않는 것이 바람직하다. 다른 서열로서는, 암호화된 단백질의 활성을 저하 또는 소실시키는 것이면 특별하게 제한되지 않지만, 예를 들면, 항생 물질 내성 유전자 등의 마커 유전자나, L-아미노산의 생산에 유용한 유전자가 열거된다.
염색체 상의 유전자를 상기한 바와 같이 개변시키는 것은, 예를 들면, 유전자의 부분 서열을 결실시켜, 정상으로 기능하는 단백질을 생산하지 않도록 개변시킨 결실형 유전자를 작제하고, 상기 결실형 유전자를 포함한 재조합 DNA로 숙주를 형질전환시켜, 결실형 유전자와 염색체 상의 야생형 유전자 사이의 상동 재조합을 야기함으로써, 염색체 상의 야생형 유전자를 결실형 유전자로 치환함으로써 달성될 수 있다. 이 때, 재조합 DNA에는, 숙주의 영양요구성 등의 형질에 따른 마커 유전자를 포함시켜 두면 조작이 용이하다. 결실형 유전자에 의해 암호화된 단백질은, 생성되는 경우에도, 야생형 단백질과는 다른 입체 구조를 가져, 기능이 저하 또는 소실된다. 이와 같은 상동 재조합을 이용한 유전자 치환에 의한 유전자 파괴는 이미 확립되어 있고, 「Red 드리븐 인테그레이션(Red-driven integration)」이라고 칭하는 방법(Datsenko, K. A, and Wanner, B. L. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A, 97:6640-6645 (2000)), Red 드리븐 인테그레이션법과 λ 파지 유래의 절제 시스템(Cho, E. H., Gumport, R. I., Gardner, J. F. J. Bacteriol. 184:5200-5203 (2002))을 조합한 방법(WO2005/010175호 참조) 등의 직쇄상 DNA를 이용하는 방법이나, 온도 감수성 복제 기원을 포함하는 플라스미드를 이용하는 방법, 접합 전달가능한 플라스미드를 이용하는 방법, 숙주 내에서 기능하는 복제 기원을 갖지 않는 자살 벡터를 이용하는 방법 등이 있다(미국 특허 제6303383호, 일본 공개특허공보 평05-007491호).
또한, 단백질의 활성이 저하되도록 하는 개변은, 예를 들면, 돌연변이 처리에 의해 행하여도 좋다. 돌연변이 처리로서는, X선 또는 자외선의 조사, 또는 N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘(MNNG), 에틸메탄설포네이트(EMS), 메틸 메탄설포네이트(MMS) 등의 변이제에 의한 통상의 변이 처리가 열거된다.
단백질 활성이 저하된다는 것은, 상기 단백질의 활성을 측정함으로써 확인될 수 있다.
유전자의 발현이 저하된다는 것은, 상기 유전자의 전사량이 저하된다는 것을 확인하는 것이나, 상기 유전자로부터 발현되는 단백질의 양이 저하된다는 것을 확인함으로써 확인될 수 있다.
유전자의 전사량이 저하된다는 것의 확인은, 상기 유전자로부터 전사된 mRNA의 양을 비개변주와 비교함으로써 행할 수 있다. mRNA의 양을 평가하는 방법으로서는 노던 하이브리드화, RT-PCR 등이 열거된다(Molecular cloning (Cold spring Harbor Laboratory Press, Cold spring Harbor (USA), 2001)). mRAN의 양은, 비개변주와 비교하여, 예를 들면, 50% 이하, 20% 이하, 10% 이하, 5% 이하, 또는 0%로 저하되어도 좋다.
단백질의 양이 저하된다는 것의 확인은, 항체를 이용한 웨스턴 블롯에 의해 행할 수 있다(Molecular cloning (Cold spring Harbor Laboratory Press, Cold spring Harbor (USA) 2001)). 단백질의 양은, 비개변주와 비교하여, 예를 들면, 50% 이하, 20% 이하, 10% 이하, 5% 이하, 또는 0%로 저하되어도 좋다.
유전자가 파괴된다는 것은, 파괴에 이용한 수단에 따라서, 상기 유전자의 일부 또는 전부의 염기 서열, 제한 효소 지도, 또는 전장 등을 결정함으로써 확인할 수 있다.
상기한 단백질의 활성을 저하시키는 방법은, 임의의 단백질, 예를 들면, 목적의 L-아미노산의 생합성 경로로부터 분기하여 목적의 L-아미노산 이외의 화합물을 생성하는 반응을 촉매하는 효소의 활성 저하나, 임의의 유전자, 예를 들면, 임의의 단백질을 암호화하는 유전자 발현 저하에 이용될 수 있다.
<2> 본 발명의 L-아미노산의 제조 방법
본 발명의 방법은, 본 발명의 세균을 배지에서 배양하는 것, 및 상기 배지로부터 L-아미노산을 채취하는 것을 포함하는, L-아미노산의 제조법이다.
사용되는 배지는, 본 발명의 세균이 증식할 수 있고, 목적의 L-아미노산이 생산될 수 있는 한 특별하게 제한되지 않는다. 배지로서는, 예를 들면, 코리네형 세균 등의 세균의 배양에 사용되는 통상의 배지를 사용할 수 있다. 배지로서는, 예를 들면, 탄소원, 질소원, 인산원, 유황원, 그 이외의 각종 유기 성분이나 무기 성분으로부터 선택되는 성분을 필요에 따라 함유하는 배지를 사용할 수 있다. 배지 성분의 종류나 농도는, 사용되는 세균의 종류나 제조하는 아미노산의 종류 등의 각종 조건에 따라 적당하게 설정하여도 좋다.
탄소원으로서, 구체적으로는, 예를 들면, 글루코스, 프럭토스, 슈크로스, 락토스, 갈락토스, 크실로스, 아라비노스, 폐 당밀, 전분 가수분해물, 바이오매스의 가수분해물 등의 당류, 아세트산, 푸마르산, 시트르산, 석신산 등의 유기산류, 글리세롤, 조 글리세롤, 에탄올 등의 알콜류, 지방산이 열거된다. 탄소원으로서는, 1종의 탄소원을 사용하여도 좋고, 2종 또는 그 이상의 탄소원을 조합하여 사용하여도 좋다.
질소원으로서, 구체적으로는, 예를 들면, 황산 암모늄, 염화 암모늄, 인산 암모늄 등의 암모늄염, 펩톤, 효모 추출물, 육류 추출물, 대두 단백질 분해물 등의 유기 질소원, 암모니아, 우레아가 열거된다. pH 조정에 사용되는 암모니아 가스나 암모니아수를 질소원으로서 이용하여도 좋다. 질소원으로서는, 1종의 질소원을 사용하여도 좋고, 2종 또는 그 이상의 질소원을 조합하여 사용하여도 좋다.
인산원으로서, 구체적으로는, 예를 들면, 인산 2수소 칼륨, 인산 수소 2칼륨 등의 인산염, 피로인산 등의 인산 폴리머가 열거된다. 인산원으로서는, 1종의 인산원을 사용하여도 좋고, 2종 또는 그 이상의 인산원을 조합하여 사용하여도 좋다.
유황원으로서, 구체적으로는, 예를 들면, 황산염, 티오황산염, 아황산염 등의 무기 유황 화합물, 시스테인, 시스틴, 글루타티온 등의 함황 아미노산이 열거된다. 유황원으로서는, 1종의 유황원을 사용하여도 좋고, 2종 또는 그 이상의 유황원을 조합하여 사용하여도 좋다.
그 이외의 각종 유기 성분이나 무기 성분으로서, 구체적으로는, 예를 들면, 염화 나트륨, 염화 칼륨 등의 무기염류; 철, 망간, 마그네슘, 칼슘 등의 미량 금속류; 비타민 B1, 비타민 B2, 비타민 B6, 니코틴산, 니코틴산 아미드, 비타민 B12 등의 비타민류; 아미노산류; 핵산류; 이들을 함유하는 펩톤, 카사미노산, 효모 추출물, 대두 단백질 분해물 등의 유기 성분이 열거된다. 그 이외의 각종 유기 성분이나 무기 성분으로서는, 1종의 성분을 사용하여도 좋고, 2종 또는 그 이상의 성분을 조합하여 사용하여도 좋다.
또한, 생육에 아미노산 등을 요구하는 영양요구성 변이주를 사용하는 경우에는, 배지에 요구되는 영양소를 보충하는 것이 바람직하다. 예를 들면, L-리신 생산균은, L-리신 생합성 경로가 강화되고, L-리신 분해능이 약화되는 경우가 많다. 따라서, 이러한 L-리신 생산균을 배양하는 경우에는, 예를 들면, L-트레오닌, L-호모세린, L-이소류신, 및 L-메티오닌으로부터 선택되는 1종 또는 그 이상의 아미노산을 배지에 보충하는 것이 바람직하다.
또한, 예를 들면, 코리네형 세균에 의해 L-글루탐산을 제조하는 경우는, 배지 중의 비오틴 양을 제한하는 것이나, 배지에 계면활성제 또는 페니실린을 첨가하는 것이 바람직하다.
배양 조건은, 본 발명의 세균이 증식할 수 있고 목적의 L-아미노산이 생산되는 한 특별하게 제한되지 않는다. 배양은, 예를 들면, 코리네형 세균 등의 세균의 배양에 사용되는 통상의 조건으로 행할 수 있다. 배양 조건은, 사용되는 세균의 종류나 제조되는 아미노산의 종류 등의 각종 조건에 따라 적당하게 설정되어도 좋다.
배양은, 액체 배지를 이용하여 호기적으로 행할 수 있다. 배양은, 구체적으로는, 통기 배양 또는 진탕 배양으로 행할 수 있다. 배양 온도는, 예를 들면, 20 내지 40℃, 바람직하게는 25℃ 내지 37℃이어도 좋다. 배지의 pH는, 예를 들면, 5 내지 8로 조정되어도 좋다. pH 조정에는, 무기 또는 유기의 산성 또는 알칼리성 물질, 또는 암모니아 가스 등을 사용할 수 있다. 배양 기간은, 예를 들면, 15시간 내지 90시간이어도 좋다. 배양은 회분 배양(batch culture), 유가 배양(Fed-batch culture), 연속 배양(continuous culture), 또는 이들의 조합에 의해 실시할 수 있다. 또한, 배양은, 종 배양과 본 배양으로 나누어 행하여도 좋다. 이 경우, 종 배양과 본 배양의 배양 조건은 동일하여도 좋고, 그렇지 않아도 좋다. 예를 들면, 종 배양과 본 배양을 공동으로 회분 배양으로 행하여도 좋다. 또한, 예를 들면, 종 배양을 회분 배양으로 행하고, 본 배양을 유가 배양 또는 연속 배양으로 행하여도 좋다. 이러한 조건 하에 본 발명의 세균을 배양함으로써, 배지 중에 L-아미노산이 축적된다.
또한, L-글루탐산을 제조하는 경우, L-글루탐산이 석출되는 조건으로 조정된 액체 배지를 이용하여, 배지 중에 L-글루탐산을 석출시키면서 배양을 행할 수 있다. L-글루탐산이 석출되는 조건으로서는, 예를 들면, pH 5.0 내지 4.0, 바람직하게는 pH 4.5 내지 4.0, 보다 바람직하게는 pH 4.3 내지 4.0, 특히 바람직하게는 pH 4.0의 조건이 열거된다(유럽 특허 출원 공개 제1078989호 명세서).
또한, L-인산 등의 염기성 아미노산을 제조하는 경우, 중탄산 이온 및/또는 탄산 이온을 염기성 아미노산의 주요 카운터 이온으로서 이용하여 염기성 아미노산을 발효 생산하는 방법을 이용하여도 좋다(일본 공개특허공보 특개2002-65287, US2002-0025564A, EP1813677A). 이러한 방법에 의하면, 염기성 아미노산의 카운터 이온으로서 종래 이용되었던 황산 이온 및/또는 염화물 이온의 사용량을 삭감시키면서 염기성 아미노산을 제조할 수 있다.
발효액으로부터의 L-아미노산의 회수는, 통상, 이온 교환 수지법(Nagai, H. et al., Separation Science and Technology, 39(16), 3691-3710), 침전법, 막 분리법(일본 공개특허공보 평9-164323호, 일본 공개특허공보 평9-173792호), 정석(晶析)법(WO2008/078448, WO2008/078646), 그 이외의 공지의 방법을 조합함으로써 실시할 수 있다. 또한, 균체 내에 L-아미노산이 축적되는 경우에는, 예를 들면, 균체를 초음파 등에 의해 파쇄하고, 원심분리에 의해 균체를 제거하여 얻어진 상청으로부터 이온 교환 수지법 등에 의해 L-아미노산을 회수할 수 있다. 회수되는 L-아미노산은 유리체, 이의 염, 또는 이들의 혼합물이어도 좋다. 염으로서는, 예를 들면, 황산염, 염산염, 탄산염, 암모늄염, 나트륨염, 칼륨염이 열거된다. 예를 들면, L-글루탐산의 경우, 발효액 중의 L-글루탐산 암모늄을 산을 첨가하여 정석시켜, 결정으로 등몰의 수산화 나트륨을 첨가함으로써 L-글루탐산 나트륨(MSG)이 얻어진다. 또한, 정석 전후에 활성탄을 가하여 탈색시켜도 좋다(글루탐산 나트륨의 공업 정석 일본 해수 학회지 56권 5호 테츠야 카와키타 참조).
또한, L-아미노산이 배지에 석출되는 경우는, 원심분리 또는 여과 등에 의해 회수할 수 있다. 또한, 배지 중에 석출된 L-아미노산은, 배지 중에 용해되어 있는 L-아미노산을 정석시킨 후에 함께 단리하여도 좋다.
또한, 회수된 L-아미노산은, L-아미노산 이외에 세균 균체, 배지 성분, 수분, 및 세균의 대사 부산물을 함유하여도 좋다. 회수된 L-아미노산의 순도는, 예를 들면, 50% 이상, 바람직하게는 85% 이상, 특히 바람직하게는 95% 이상이어도 좋다(JP1214636B, USP5,431,933, USP4,956,471, USP4,777,051, USP4,946,654, USP5,840,358, USP6,238,714, US2005/0025878).
L-아미노산이 L-글루탐산인 경우, 예를 들면, L-글루탐산 나트륨 결정을 우마미 조미료로서 사용할 수 있다. L-글루탐산 나트륨 결정은, 동일하게 우마미를 갖는 5'-GMP 이나트륨염이나 5'-IMP 이나트륨염 등의 핵산과 혼합하여 조미료로서 사용하여도 좋다.
또한, 본 발명의 방법의 한 실시형태는, L-아미노산 생산능을 갖는 코리네형 세균을 배지에서 배양하는 것, 및 상기 배지로부터 L-아미노산을 채취하는 것을 포함하는, L-아미노산의 제조 방법으로서, 상기 세균이 서열번호 6의 위치 246의 페닐알라닌 잔기에 상당하는 아미노산 잔기가 페닐알라닌 이외의 아미노산 잔기로 치환되는 변이를 갖는 인산 트랜스포터를 암호화하는 변이형 pitA 유전자를 보유하는 것을 특징으로 하는 방법이다.
본 발명의 방법의 당해 실시형태에 관해서는, 상술한 본 발명의 세균이나 본 발명의 방법에 관한 기재를 준용할 수 있다. 예를 들면, 당해 실시형태에 있어서는, 서열번호 6의 위치 246의 페닐알라닌 잔기에 상당하는 아미노산 잔기가 세린 잔기로 치환되는 것이 바람직하다. 또한, 당해 실시형태에 있어서는, 코리네형 세균이 코리네박테리움 글루타미쿰인 것이 바람직하다. 또한, 당해 실시형태에 있어서는, 제조되는 L-아미노산은 임의의 아미노산이어도 좋지만, L-글루탐산인 것이 바람직하다.
실시예
본 발명은 이하의 실시예에 의해서 보다 구체적으로 설명되지만, 이들은 어떠한 의미로도 본 발명을 한정하는 의도로 해석되어서는 안된다.
실시예 1: pitA 강화주를 이용한 Glu 생산 배양
본 실시예에서는, pitA 유전자의 발현이 증강된 C. glutamicum의 Glu 생산주를 이용하여 Glu 생산을 행하여, pitA 유전자의 발현 증강이 Glu 생산에 관여하는 영향에 관하여 평가하였다.
사용 균주는 이하와 같았다.
C. glutamicum 2256ΔldhAΔsucA yggB*/pVK9
C. glutamicum 2256ΔldhAΔsucA yggB*/pVK9-Plac-pitA
(1) 균주 구축 방법
C. glutamicum 2256주(ATCC 13869)를 친주로 이용하여, 이하의 방법으로, 모델 Glu 생산주로서 2256ΔldhAΔsucA yggB*주를 구축하였다. 사용된 프라이머를 표 1에 나타낸다.
Figure 112015069792586-pct00001
우선, 2256주의 염색체 DNA를 주형으로 하여 프라이머 1과 2의 쌍, 및 프라이머 3과 4의 쌍을 각각 이용하여, ldhA 유전자 결손용의 DNA 단편을 증폭시켰다. 이어서, 증폭된 2개의 단편을 등량 혼합한 것을 주형으로 하여 프라이머 5와 6을 이용하여 PCR을 행하여, 2개의 단편이 결합된 DNA 단편을 얻었다. 얻어진 DNA 단편을 SalI로 처리하고, pBS4S(WO2005/113745)의 SalI 부위에 도입함으로써 ldhA 결손용 플라스미드를 구축하였다. 이의 ldhA 결손용 플라스미드를 2256주의 염색체에 삽입한 후, 탈락시킴으로써 ldhA 유전자를 결손시켰다.
이어서, 2256주의 염색체 DNA를 주형으로 하여 프라이머 7과 8의 쌍, 및 프라이머 9와 10의 쌍을 각각 이용하여 sucA 유전자 결손용 DNA 단편을 증폭시켰다. 이어서, 증폭된 2개의 단편을 등량 혼합한 것을 주형으로 하여 프라이머 11과 12를 이용하여 PCR을 행하여, 2개의 단편이 결합된 DNA 단편을 얻었다. 얻어진 DNA 단편을 BamHI로 처리하고, pBS3(WO2006/070944)의 BamHI 부위에 도입함으로써 sucA 결손용 플라스미드를 구축하였다. 이의 sucA 결손용 플라스미드를 2256ΔldhA주의 염색체에 삽입한 후, 탈락시킴으로써 sucA 유전자를 결실시켰다. 얻어진 sucA 결손주의 몇몇의 변이체를 비오틴 충분 조건에서 배양하여, Glu 생산능을 갖는 균주를 선발한 결과, yggB 유전자에 IS 변이(V419::IS)가 포함된 Glu 생산주를 취득하였다. IS 변이(V419::IS)가 포함된 yggB 유전자의 염기 서열, 및 상기 유전자가 암호화된 YggB 단백질의 아미노산 서열을, 각각 서열번호 23 및 서열번호 24로 나타낸다. 얻어진 Glu 생산주를 2256ΔldhAΔsucA yggB*주라고 하였다.
pitA 발현 플라스미드(pVK9-Plac-pitA)를 이하의 방법으로 구축하였다. 우선, 2256주의 염색체 DNA를 주형으로 하여 프라이머 13과 14를 이용하여 pitA 유전자 단편을 증폭시켰다. 이어서, 증폭된 단편을 bamHI와 pstI로 처리한 pVK9 플라스미드(US2006-0141588)에 in-fusion(TaKaRa INC.)을 이용하여 연결하여, pitA 발현 플라스미드를 구축하였다. 구축된 pitA 발현 플라스미드를 pVK9-Plac-pitA라고 하였다.
구축된 pVK9-Plac-pitA와 벡터 대조군으로서 pVK9를 각각 Glu 생산균 2256ΔldhAΔsucA yggB*주에 도입하여, 2256ΔldhAΔsucA yggB*/pVK9-Plac-pitA 균주 및 2256ΔldhAΔsucA yggB*/pVK9 균주를 구축하였다.
(2) Glu 생산 배양
2256ΔldhAΔsucA yggB*/pVK9-Plac-pitA 균주 및 2256ΔldhAΔsucA yggB*/pVK9 균주를 이용하여, Glu 생산 배양을 행하였다. 사용된 배지의 조성을 표 2에 나타낸다.
Figure 112015069792586-pct00002
KOH로 pH 8.0으로 조정된 상기 조성의 배지를 작제하고, 오토클레이브(115℃, 15min)에 의해 멸균하여 배양에 제공하였다.
<배양 방법>
배양(전 배양 및 본 배양)은, 사카구치 플라스크에 배지를 20mL 넣고, CaCO3를 50g/L가 되도록 첨가하여, 31.5℃의 박스 쉐이커에서 진탕시킴으로써 행하였다. 최초로, 전 배양으로서, 배지 1을 이용하여 상기의 균주의 각각을 24시간 동안 배양하였다. 이어서, 얻어진 전배양액 2mL를 배지 2에 식균하고, 식균으로부터 2시간 후에 Tween40(최종 농도 4g/L)을 첨가하여 본 배양을 행하였다. 샘플링은, 식균으로부터 17시간 후에 행하였다. 잔존 당 및 글루탐산은, AS-310(아사히 카세이)을 이용하여 정량하였다.
<결과와 고찰>
결과는 표 3에 나타낸다. 표 3 중, 「RS」는 잔존 당량을, 「Glu」는 글루탐산 양을 나타낸다. 본 실시예에 의해, C. glutamicum에 있어서 pitA 유전자의 발현을 상승시킴으로써, C. glutamicum의 생육과 Glu 생산성이 향상되는 것이 밝혀졌다. 따라서, pitA 유전자가 암호화하는 인산 트랜스포터의 활성을 증대시키는 것은, 글루탐산 등의 아미노산 생산에 유효한 것으로 고찰되었다.
Figure 112015069792586-pct00003
실시예 2: pitA 변이주를 이용한 Glu 생산 배양
본 실시예에서는, pitA 유전자에 변이가 도입된 C. glutamicum의 Glu 생산주를 이용하여 Glu 생산을 행하고, pitA 유전자의 변이가 Glu 생산에 관여하는 영향에 관해서 평가하였다.
사용 균주는 이하와 같았다.
C. glutamicum 2256ΔldhAΔsucA yggB*
C. glutamicum 2256ΔldhAΔsucA yggB* pitAmut
(1) 균주 구축 방법
실시예 1에서 구축된 모델 Glu 생산주인 C. glutamicum 2256ΔldhAΔsucA yggB*를 친주로 하여, pitA 유전자에 변이가 도입된 2256ΔldhAΔsucA yggB* pitAmut 균주를 구축하였다. 사용된 프라이머들을 표 4에 나타낸다.
Figure 112015069792586-pct00004
pitA 변이 도입용 플라스미드 pBS4S-pitAmut를 이하의 방법으로 구축하였다. pitA 유전자의 암호화 영역 내에 PitA 단백질의 위치 246의 페닐알라닌 잔기가 세린 잔기로 치환되는 변이(Phe246Ser ttc→tcc)가 포함된 Glu 생산균 B3주의 염색체 DNA를 주형으로 하여, 프라이머 15와 16을 이용하여 PCR을 행하여, 상기 변이를 갖는 pitA 유전자 단편을 증폭시켰다. 이어서, 증폭된 단편을 BamHI와 PstI 처리된 pBS4S 플라스미드에 in-fusion(TaKaRa INC.)을 이용하여 연결하여, pitA 변이 도입용 플라스미드를 구축하였다. 구축된 pitA 변이 도입용 플라스미드를 pBS4S-pitAmut라고 하였다.
구축된 pBS4S-pitAmut를 Glu 생산균 2256ΔldhAΔsucA yggB* 균주의 염색체에 삽입한 후, 탈락시킴으로써, pitA 유전자에 변이가 도입된 2256ΔldhAΔsucA yggB* pitAmut 균주를 구축하였다.
또한, 상기 pitA 변이주 2256ΔldhAΔsucA yggB* pitAmut 균주는, Glu산 생산균 B3주의 염색체 DNA를 주형으로 하여 구축한 변이 도입용 플라스미드를 이용하여 구축하지만, 타카라 바이오 제작의 PrimeSTAR(등록 상표) Mutagenesis Basal Kit에 의해서 작제된 변이 도입용 플라스미드를 이용하여도 구축가능하다. 예를 들면, C. glutamicum 2256주(ATCC 13869) 등의 야생주의 염색체 DNA를 주형으로 하여, 프라이머 15와 16을 이용하여 PCR을 행하여, 변이를 갖지 않는 pitA 유전자 단편을 증폭시켰다. 이어서, 증폭된 단편을 BamHI와 PstI 처리한 pBS4S 플라스미드에 in-fusion(TaKaRa INC.)을 이용하여 연결시켜, 야생형 pitA 유전자의 서열을 포함하는 플라스미드를 구축하였다. 또한, 본 플라스미드를 주형으로 하여 PrimeSTAR(등록 상표) Mutagenesis Basal Kit의 사용 설명서에 따라 pitA 유전자의 위치 737의 T가 C로 개변되도록 하는 적절한 프라이머를 이용하여 PCR을 행하여, pitA 변이 도입용 플라스미드 pBS4S-pitAmut가 구축될 수 있다. 이를 이용하여 동일한 pitA 변이주의 구축이 가능해진다.
(2) Glu 생산 배양
2256ΔldhAΔsucA yggB* 균주 및 2256ΔldhAΔsucA yggB* pitAmut 균주를 이용하여 Glu 생산 배양을 행하였다. 사용된 배지의 조성을 표 5에 나타낸다.
Figure 112015069792586-pct00005
KOH로 pH 8.0으로 조정된 상기 조성의 배지를 작제하고, 오토클레이브(115℃, 15min)에 의해 멸균하여 배양에 제공하였다.
<배양 방법>
배양(전 배양 및 본 배양)은, 사카구치 플라스크에 배지를 20mL 넣고, CaCO3를 50g/L가 되도록 첨가하여, 31.5℃의 박스 쉐이커에서 진탕시킴으로써 행하였다. 최초로, 전배양으로서, 배지 3을 이용하여 상기의 균주의 각각을 24시간 배양하였다. 이어서, 얻어진 전배양액 2mL를 배지 3에 식균하고, 식균으로부터 2시간 후에 Tween40(최종 농도 4g/L)을 첨가하여 본 배양을 행하였다. 샘플링은, 식균으로부터 21.5시간 후에 행하였다. 잔존 당 및 글루탐산은, AS-310(아사히 카세이)을 이용하여 정량하였다.
<결과와 고찰>
결과는 표 6에 나타낸다. 표 6 중, 「RS」는 잔존 당량을, 「Glu」는 글루탐산 양을 나타낸다. 본 실시예에 의해, C. glutamicum에 있어서 pitA 유전자에 변이(Phe246Ser)를 도입함으로써, C. glutamicum의 생육과 Glu 생산성이 향상된다는 것이 밝혀졌다. 따라서, 본 pitA 변이(Phe246Ser)는 글루탐산 등의 아미노산 생산에 유효한 것으로 고찰되었다.
Figure 112015069792586-pct00006
산업 상의 이용 가능성
본 발명에 의하면, 코리네형 세균의 L-아미노산 생산능을 향상시킬 수 있고, L-아미노산을 효율적으로 제조할 수 있다.
[서열표의 설명]
서열번호 1: E. coli MG1655의 pitA 유전자의 염기 서열
서열번호 2: E. coli MG1655의 PitA 단백질의 아미노산 서열
서열번호 3: Pantoea ananatis LMG20103의 pitA 유전자의 염기 서열
서열번호 4: Pantoea ananatis LMG20103의 PitA 단백질의 아미노산 서열
서열번호 5: Corynebacterium glutamicum 2256(ATCC 13869)의 pitA 유전자의 염기 서열
서열번호 6: Corynebacterium glutamicum 2256(ATCC 13869)의 PitA 단백질의 아미노산 서열
서열번호 7 내지 서열번호 20: 프라이머
서열번호 21: Corynebacterium glutamicum 2256(ATCC 13869)의 yggB 유전자의 염기 서열
서열번호 22: Corynebacterium glutamicum 2256(ATCC 13869)의 YggB 단백질의 아미노산 서열
서열번호 23: Corynebacterium glutamicum 2256(ATCC 13869)의 yggB 유전자(V419::IS)의 염기 서열
서열번호 24: Corynebacterium glutamicum 2256(ATCC 13869)의 YggB 단백질(V419::IS)의 아미노산 서열
서열번호 25: Corynebacterium glutamicum ATCC 13032의 pitA 유전자의 염기 서열
서열번호 26: Corynebacterium glutamicum ATCC 13032의 PitA 단백질의 아미노산 서열
서열번호 27, 서열번호 28: 프라이머
SEQUENCE LISTING <110> AJINOMOTO CO., INC. <120> METHOD FOR MANUFACTURING L-AMINO ACID <130> D563-14092 <150> JP2013-101589 <151> 2013-05-13 <150> JP2013-219274 <151> 2013-10-22 <160> 28 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1500 <212> DNA <213> Escherichia coli MG1655 <220> <221> CDS <222> (1)..(1500) <400> 1 atg cta cat ttg ttt gct ggc ctg gat ttg cat acc ggg ctg tta tta 48 Met Leu His Leu Phe Ala Gly Leu Asp Leu His Thr Gly Leu Leu Leu 1 5 10 15 ttg ctt gca ctg gct ttt gtg ctg ttc tac gaa gcc atc aat ggt ttc 96 Leu Leu Ala Leu Ala Phe Val Leu Phe Tyr Glu Ala Ile Asn Gly Phe 20 25 30 cat gac aca gcc aac gcc gtg gca acc gtt atc tat acc cgc gcg atg 144 His Asp Thr Ala Asn Ala Val Ala Thr Val Ile Tyr Thr Arg Ala Met 35 40 45 cgt tct cag ctc gcc gtg gtt atg gcg gcg gta ttc aac ttt ttg ggt 192 Arg Ser Gln Leu Ala Val Val Met Ala Ala Val Phe Asn Phe Leu Gly 50 55 60 gtt ttg ctg ggt ggt ctg agt gtt gcc tat gcc att gtg cat atg ctg 240 Val Leu Leu Gly Gly Leu Ser Val Ala Tyr Ala Ile Val His Met Leu 65 70 75 80 ccg acg gat ctg ctg ctt aat atg gga tcg tct cat ggc ctt gcc atg 288 Pro Thr Asp Leu Leu Leu Asn Met Gly Ser Ser His Gly Leu Ala Met 85 90 95 gtg ttc tct atg ttg ctg gcg gcg att atc tgg aac ctg ggt acc tgg 336 Val Phe Ser Met Leu Leu Ala Ala Ile Ile Trp Asn Leu Gly Thr Trp 100 105 110 tac ttt ggt tta cct gca tcc agc tct cat acg ctg att ggc gcg atc 384 Tyr Phe Gly Leu Pro Ala Ser Ser Ser His Thr Leu Ile Gly Ala Ile 115 120 125 atc ggg att ggt tta acc aat gcg ttg atg acc ggg acg tca gtg gtg 432 Ile Gly Ile Gly Leu Thr Asn Ala Leu Met Thr Gly Thr Ser Val Val 130 135 140 gat gca ctc aat atc ccg aaa gta tta agt att ttc ggt tct ctg atc 480 Asp Ala Leu Asn Ile Pro Lys Val Leu Ser Ile Phe Gly Ser Leu Ile 145 150 155 160 gtt tcc cct att gtc ggc ctg gtg ttt gct ggc ggt ctg att ttc ttg 528 Val Ser Pro Ile Val Gly Leu Val Phe Ala Gly Gly Leu Ile Phe Leu 165 170 175 ctg cgt cgc tac tgg agc ggc acc aag aaa cgc gcc cgt atc cac ctg 576 Leu Arg Arg Tyr Trp Ser Gly Thr Lys Lys Arg Ala Arg Ile His Leu 180 185 190 acc cca gcg gag cgt gaa aag aaa gac ggc aag aaa aag ccg ccg ttc 624 Thr Pro Ala Glu Arg Glu Lys Lys Asp Gly Lys Lys Lys Pro Pro Phe 195 200 205 tgg acg cgt att gcg ctg atc ctt tcc gct atc ggc gtg gcg ttt tcg 672 Trp Thr Arg Ile Ala Leu Ile Leu Ser Ala Ile Gly Val Ala Phe Ser 210 215 220 cac ggc gcg aac gat ggt cag aaa ggc att ggt ctg gtt atg ttg gta 720 His Gly Ala Asn Asp Gly Gln Lys Gly Ile Gly Leu Val Met Leu Val 225 230 235 240 ttg att ggc gtc gcg cca gca ggc ttc gtg gtg aac atg aat gcc act 768 Leu Ile Gly Val Ala Pro Ala Gly Phe Val Val Asn Met Asn Ala Thr 245 250 255 ggc tac gaa atc acc cgt acc cgt gat gcc atc aac aac gtc gaa gct 816 Gly Tyr Glu Ile Thr Arg Thr Arg Asp Ala Ile Asn Asn Val Glu Ala 260 265 270 tac ttt gag cag cat cct gcg ctg ctc aaa cag gct acc ggt gct gat 864 Tyr Phe Glu Gln His Pro Ala Leu Leu Lys Gln Ala Thr Gly Ala Asp 275 280 285 cag tta gta ccg gct ccg gaa gct ggc gca acg caa cct gcg gag ttc 912 Gln Leu Val Pro Ala Pro Glu Ala Gly Ala Thr Gln Pro Ala Glu Phe 290 295 300 cac tgc cat ccg tcg aat acc att aac gcg ctc aac cgc ctg aaa ggt 960 His Cys His Pro Ser Asn Thr Ile Asn Ala Leu Asn Arg Leu Lys Gly 305 310 315 320 atg ttg acc acc gat gtg gaa agc tac gac aag ctg tcg ctt gat caa 1008 Met Leu Thr Thr Asp Val Glu Ser Tyr Asp Lys Leu Ser Leu Asp Gln 325 330 335 cgt agc cag atg cgc cgc att atg ctg tgc gtt tct gac act atc gac 1056 Arg Ser Gln Met Arg Arg Ile Met Leu Cys Val Ser Asp Thr Ile Asp 340 345 350 aaa gtg gtg aag atg cct ggc gtg agt gct gac gat cag cgc ctg ttg 1104 Lys Val Val Lys Met Pro Gly Val Ser Ala Asp Asp Gln Arg Leu Leu 355 360 365 aag aaa ctg aag tcc gac atg ctt agc acc atc gag tat gca ccg gtg 1152 Lys Lys Leu Lys Ser Asp Met Leu Ser Thr Ile Glu Tyr Ala Pro Val 370 375 380 tgg atc atc atg gcg gtc gcg ctg gcg tta ggt atc ggt acg atg att 1200 Trp Ile Ile Met Ala Val Ala Leu Ala Leu Gly Ile Gly Thr Met Ile 385 390 395 400 ggc tgg cgc cgt gtg gca acg act atc ggt gag aaa atc ggt aag aaa 1248 Gly Trp Arg Arg Val Ala Thr Thr Ile Gly Glu Lys Ile Gly Lys Lys 405 410 415 ggc atg acc tac gct cag ggg atg tct gcc cag atg acg gcg gca gtg 1296 Gly Met Thr Tyr Ala Gln Gly Met Ser Ala Gln Met Thr Ala Ala Val 420 425 430 tct atc ggc ctg gcg agt tat acc ggg atg ccg gtt tcc act act cac 1344 Ser Ile Gly Leu Ala Ser Tyr Thr Gly Met Pro Val Ser Thr Thr His 435 440 445 gta ctc tcc tct tct gtc gcg ggg acg atg gtg gta gat ggt ggc ggc 1392 Val Leu Ser Ser Ser Val Ala Gly Thr Met Val Val Asp Gly Gly Gly 450 455 460 tta cag cgt aaa acc gtg acc agc att ctg atg gcc tgg gtg ttt acc 1440 Leu Gln Arg Lys Thr Val Thr Ser Ile Leu Met Ala Trp Val Phe Thr 465 470 475 480 ctt ccg gct gcg gta ctg ctt tcc ggc ggg ctg tac tgg ctc tcc ttg 1488 Leu Pro Ala Ala Val Leu Leu Ser Gly Gly Leu Tyr Trp Leu Ser Leu 485 490 495 cag ttc ctg taa 1500 Gln Phe Leu <210> 2 <211> 499 <212> PRT <213> Escherichia coli MG1655 <400> 2 Met Leu His Leu Phe Ala Gly Leu Asp Leu His Thr Gly Leu Leu Leu 1 5 10 15 Leu Leu Ala Leu Ala Phe Val Leu Phe Tyr Glu Ala Ile Asn Gly Phe 20 25 30 His Asp Thr Ala Asn Ala Val Ala Thr Val Ile Tyr Thr Arg Ala Met 35 40 45 Arg Ser Gln Leu Ala Val Val Met Ala Ala Val Phe Asn Phe Leu Gly 50 55 60 Val Leu Leu Gly Gly Leu Ser Val Ala Tyr Ala Ile Val His Met Leu 65 70 75 80 Pro Thr Asp Leu Leu Leu Asn Met Gly Ser Ser His Gly Leu Ala Met 85 90 95 Val Phe Ser Met Leu Leu Ala Ala Ile Ile Trp Asn Leu Gly Thr Trp 100 105 110 Tyr Phe Gly Leu Pro Ala Ser Ser Ser His Thr Leu Ile Gly Ala Ile 115 120 125 Ile Gly Ile Gly Leu Thr Asn Ala Leu Met Thr Gly Thr Ser Val Val 130 135 140 Asp Ala Leu Asn Ile Pro Lys Val Leu Ser Ile Phe Gly Ser Leu Ile 145 150 155 160 Val Ser Pro Ile Val Gly Leu Val Phe Ala Gly Gly Leu Ile Phe Leu 165 170 175 Leu Arg Arg Tyr Trp Ser Gly Thr Lys Lys Arg Ala Arg Ile His Leu 180 185 190 Thr Pro Ala Glu Arg Glu Lys Lys Asp Gly Lys Lys Lys Pro Pro Phe 195 200 205 Trp Thr Arg Ile Ala Leu Ile Leu Ser Ala Ile Gly Val Ala Phe Ser 210 215 220 His Gly Ala Asn Asp Gly Gln Lys Gly Ile Gly Leu Val Met 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gta tca tcg aca 912 Pro Pro Lys Leu Pro Thr Pro Glu Glu Val Ala Pro Val Ser Ser Thr 290 295 300 gag ttt cat tgc gac agt gct cgt gcg ctg cag gcc gtg caa cgt gct 960 Glu Phe His Cys Asp Ser Ala Arg Ala Leu Gln Ala Val Gln Arg Ala 305 310 315 320 cag ttg ctg ctg aac aac ctg caa agc tac agc gat ctg tcc gtc gag 1008 Gln Leu Leu Leu Asn Asn Leu Gln Ser Tyr Ser Asp Leu Ser Val Glu 325 330 335 cag cgt agt cag atg cgt cgc ctg ctg ctg tgt att tcc gac acc gcc 1056 Gln Arg Ser Gln Met Arg Arg Leu Leu Leu Cys Ile Ser Asp Thr Ala 340 345 350 gat aaa gcg gcg aag ctg ccg gaa acc tct cca gac gat aaa cgt ttc 1104 Asp Lys Ala Ala Lys Leu Pro Glu Thr Ser Pro Asp Asp Lys Arg Phe 355 360 365 ctg ggc aag ctc aaa ggc gat ctg ttg aac acc att gag tac gcg ccg 1152 Leu Gly Lys Leu Lys Gly Asp Leu Leu Asn Thr Ile Glu Tyr Ala Pro 370 375 380 gta tgg atc atc atg gcg gtt gcg ctg gca tta ggc gtc ggc acc atg 1200 Val Trp Ile Ile Met Ala Val Ala Leu Ala Leu Gly Val Gly Thr Met 385 390 395 400 atc ggc tgg cgt cgc gtg gcc 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Leu Gly Gly Trp Arg Val Ile Arg Thr Leu 275 280 285 ggc aaa ggc ttg gtt gag att gat tcc cct cag ggc atg gca gca gaa 912 Gly Lys Gly Leu Val Glu Ile Asp Ser Pro Gln Gly Met Ala Ala Glu 290 295 300 act tct tct gca gca atc att ttg act tct tcc cac ttc ggt atg gca 960 Thr Ser Ser Ala Ala Ile Ile Leu Thr Ser Ser His Phe Gly Met Ala 305 310 315 320 ctg tcc acc act cac gtt gct act ggc tcc atc atg ggt acc ggc att 1008 Leu Ser Thr Thr His Val Ala Thr Gly Ser Ile Met Gly Thr Gly Ile 325 330 335 gga cgt aaa ggt gcg aag gtt cgt tgg tcc gtc gca gga cgc atg gca 1056 Gly Arg Lys Gly Ala Lys Val Arg Trp Ser Val Ala Gly Arg Met Ala 340 345 350 atg gcc tgg gtt atc acc ctc cct gcc tcc gcg atc gtt ggc gtt ttc 1104 Met Ala Trp Val Ile Thr Leu Pro Ala Ser Ala Ile Val Gly Val Phe 355 360 365 tgc tgg tgg gta gct cac gga att ggt ctt atc agc tca gac ctc ctc 1152 Cys Trp Trp Val Ala His Gly Ile Gly Leu Ile Ser Ser Asp Leu Leu 370 375 380 gga gtc ctc gtt gca ttc gcc att ctg gtc att ctg tct ggc tac att 1200 Gly Val 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cactgcacgg ccctgcgaac 20 <210> 8 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 cgccaactag gcgccaaaaa ttcctgattt ccctaaccgg ac 42 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 tgtgggcctt cggcgaggac 20 <210> 10 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 gtccggttag ggaaatcagg aatttttggc gcctagttgg cg 42 <210> 11 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 11 gagtcgaccg caccccattt ttcata 26 <210> 12 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 12 tggtcgacgt gaatgctcgg cgggatcc 28 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 13 ccaggcactc gtcctcggtt 20 <210> 14 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 14 aggctagtgc aggactataa agaccagttc tcctaaaaat aacgtgtc 48 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 15 tccatcgtgg ccaccgatcc 20 <210> 16 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 16 gacacgttat ttttaggaga actggtcttt atagtcctgc actagcct 48 <210> 17 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 17 cgggatcccc accggcgtac tcgtg 25 <210> 18 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 18 gggagctcac ctttgtggag gaatagag 28 <210> 19 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 19 agcttgcatg cctgcagagg aggattataa tggtcacccc aatca 45 <210> 20 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 20 cggtacccgg ggatcctgcc cacgagggtg acctca 36 <210> 21 <211> 3481 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum 2256 (ATCC 13869) <220> <221> CDS <222> (1437)..(3035) <400> 21 gatcttgccg atttcggcag gatcaatgtc ggcgtgaatg atcttggcat caggtgcgaa 60 agtgtcaacg tcaccggtga cgcggtcatc aaagcgggag ccgatagcaa tcagcaggtc 120 gctgcgctgc agtgcaccaa cagcggacac agtgccatgc atgcctggca tacccatgtg 180 cagctcgtgg gactctggga aggttcccag cgccatcaat gtggtgacaa ctggaatgcc 240 ggtgtgctca gcgaacgcac gaagctcttc gtgggcatca gccttgataa cgccgccgcc 300 aacgtaaagg acaggcttct tagactcacc gatcagtttg acagcctgct caatctgtcg 360 agcatgcggt gttgaaactg ggcggtagcc tggcaggtcg atctttggtg gccagacgaa 420 atccaattca gcgttctgaa catccttggg gatatccact agaacaggac cagggcgacc 480 agtaatcgcg aggtggaatg cctcagccaa tgcctgtgga atgtcgttgg ggttggtgac 540 catgaagttg tgcttggtca ctggcatggt gatgccgcgg atatcggctt cctggaaagc 600 atcggtaccc agcaggctac ttccgacctg gccggtgatg gcaaccatgg gaacggagtc 660 caagtttgca tcagcgattg gggtaaccaa gttggttgcg cctgggccag aggttgcaat 720 gcagacgcca acgcgtccag taacctgcgc gtagccggtt gctgcgtggc ctgcgccctg 780 ctcgtggcgc actaggacgt ggcgcacctt tgtggaggaa tagagcgggt catacaccgg 840 tagcaccgca ccaccaggaa taccgaacac gatgtcggcg ttaagctcct cgagcgatcg 900 aacaattgcc tgtgcacctg tcatccgctc aggggcggcg gatcgaccac ggcttgcaac 960 cgtggcggga gtgggctgtt gagaagctgc cacattcacg actttctggc tcctttacta 1020 aataaggatt ttcacaggac ccgtccaagc caagccgatt tcaactcagc ctaaagacaa 1080 agccctcatt taaaattgtt ccgacgcgga tgcgtgtgca cgcagtgcga cagatgtctg 1140 ttgcaaagtt ggctacttgg gtcataacca acaagaaagc cctcgttcca acactgtggt 1200 gagtgttgtc gagggcgctt gacgagacga cttggaaggc cgttacggca ggcgccgcgc 1260 ggttactact acaagtcgaa taatggtcat ggtgtgtcat gctacacaca tcgagtttcc 1320 aattccacaa cgcacgaaaa ttcccacccc caaaactccc ccacttcggt taaggaatca 1380 ggattctcac aaagttcagg caggctcccg ctacttttca gcgctaatct tggctc atg 1439 Met 1 att tta ggc gta ccc att caa tat ttg ctc tat tca ttg tgg aat tgg 1487 Ile Leu Gly Val Pro Ile Gln Tyr Leu Leu Tyr Ser Leu Trp Asn Trp 5 10 15 att gtc gat acc ggt ttt gat gta gca att atc ctg gtc ttg gcg ttt 1535 Ile Val Asp Thr Gly Phe Asp Val Ala Ile Ile Leu Val Leu Ala Phe 20 25 30 ttg att cca cgt atc ggc cga ctg gcc atg cgt att atc aag cag cga 1583 Leu Ile Pro Arg Ile Gly Arg Leu Ala Met Arg Ile Ile Lys Gln Arg 35 40 45 gtg gag tct gca gcc gat gcg gac acc act aag aac cag ctc gcg ttc 1631 Val Glu Ser Ala Ala Asp Ala Asp Thr Thr Lys Asn Gln Leu Ala Phe 50 55 60 65 gct ggc gtt ggc gtt tat atc gcg caa att gtg gcg ttt ttc atg ctt 1679 Ala Gly Val Gly Val Tyr Ile Ala Gln Ile Val Ala Phe Phe Met Leu 70 75 80 gcc gtc tcc gcg atg cag gct ttt ggt ttc tct ctc gcg ggc gct gcg 1727 Ala Val Ser Ala Met Gln Ala Phe Gly Phe Ser Leu Ala Gly Ala Ala 85 90 95 att ccg gca acc att gcg tca gct gcc att ggt ctt ggt gcg cag tcg 1775 Ile Pro Ala Thr Ile Ala Ser Ala Ala Ile Gly Leu Gly Ala Gln Ser 100 105 110 att gtt gcg gac ttc ttg gcc gga ttt ttc atc ctg acg gaa aag caa 1823 Ile Val Ala Asp Phe Leu Ala Gly Phe Phe Ile Leu Thr Glu Lys Gln 115 120 125 ttc ggc gtg ggt gac tgg gtg cgc ttt gag ggc aac ggc atc gtt gtt 1871 Phe Gly Val Gly Asp Trp Val Arg Phe Glu Gly Asn Gly Ile Val Val 130 135 140 145 gaa ggc acc gtc att gag atc acc atg cgc gcg acc aaa att cgc acg 1919 Glu Gly Thr Val Ile Glu Ile Thr Met Arg Ala Thr Lys Ile Arg Thr 150 155 160 att gca caa gag acc gtg atc atc ccg aac tcc acg gcg aaa gtg tgc 1967 Ile Ala Gln Glu Thr Val Ile Ile Pro Asn Ser Thr Ala Lys Val 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Trp Gln Lys Ile Leu Ser Phe Gly Gly Arg Val Arg 390 395 400 atg agc act tcc ctg ttg ttg ggt gcg ctg ctc ttg ctg tca cta ttt 2687 Met Ser Thr Ser Leu Leu Leu Gly Ala Leu Leu Leu Leu Ser Leu Phe 405 410 415 aag gtc atg act gtg gaa cca agt gag aat tgg caa aac tcc agt gga 2735 Lys Val Met Thr Val Glu Pro Ser Glu Asn Trp Gln Asn Ser Ser Gly 420 425 430 tgg ctg tca cca agc act gcc acc tca act gcg gtg acc acc tcc gaa 2783 Trp Leu Ser Pro Ser Thr Ala Thr Ser Thr Ala Val Thr Thr Ser Glu 435 440 445 act tcc gcg cca gca agc acg cct tcg atg aca gtg ccc act acg gtg 2831 Thr Ser Ala Pro Ala Ser Thr Pro Ser Met Thr Val Pro Thr Thr Val 450 455 460 465 gag gag acc cca acg atg gaa tct agc gtc gaa acg cag cag gaa acc 2879 Glu Glu Thr Pro Thr Met Glu Ser Ser Val Glu Thr Gln Gln Glu Thr 470 475 480 tca acc cct gca acc gca acg ccc cag cga gcc gac acc atc gaa ccg 2927 Ser Thr Pro Ala Thr Ala Thr Pro Gln Arg Ala Asp Thr Ile Glu Pro 485 490 495 acc gag gaa gcc acg tcg cag gag gaa acg act gca tcg cag acg cag 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tggcaggtcg atctttggtg gccagacgaa 420 atccaattca gcgttctgaa catccttggg gatatccact agaacaggac cagggcgacc 480 agtaatcgcg aggtggaatg cctcagccaa tgcctgtgga atgtcgttgg ggttggtgac 540 catgaagttg tgcttggtca ctggcatggt gatgccgcgg atatcggctt cctggaaagc 600 atcggtaccc agcaggctac ttccgacctg gccggtgatg gcaaccatgg gaacggagtc 660 caagtttgca tcagcgattg gggtaaccaa gttggttgcg cctgggccag aggttgcaat 720 gcagacgcca acgcgtccag taacctgcgc gtagccggtt gctgcgtggc ctgcgccctg 780 ctcgtggcgc actaggacgt ggcgcacctt tgtggaggaa tagagcgggt catacaccgg 840 tagcaccgca ccaccaggaa taccgaacac gatgtcggcg ttaagctcct cgagcgatcg 900 aacaattgcc tgtgcacctg tcatccgctc aggggcggcg gatcgaccac ggcttgcaac 960 cgtggcggga gtgggctgtt gagaagctgc cacattcacg actttctggc tcctttacta 1020 aataaggatt ttcacaggac ccgtccaagc caagccgatt tcaactcagc ctaaagacaa 1080 agccctcatt taaaattgtt ccgacgcgga tgcgtgtgca cgcagtgcga cagatgtctg 1140 ttgcaaagtt ggctacttgg gtcataacca acaagaaagc cctcgttcca acactgtggt 1200 gagtgttgtc gagggcgctt gacgagacga cttggaaggc cgttacggca ggcgccgcgc 1260 ggttactact acaagtcgaa taatggtcat ggtgtgtcat gctacacaca tcgagtttcc 1320 aattccacaa cgcacgaaaa ttcccacccc caaaactccc ccacttcggt taaggaatca 1380 ggattctcac aaagttcagg caggctcccg ctacttttca gcgctaatct tggctc atg 1439 Met 1 att tta ggc gta ccc att caa tat ttg ctc tat tca ttg tgg aat tgg 1487 Ile Leu Gly Val Pro Ile Gln Tyr Leu Leu Tyr Ser Leu Trp Asn Trp 5 10 15 att gtc gat acc ggt ttt gat gta gca att atc ctg gtc ttg gcg ttt 1535 Ile Val Asp Thr Gly Phe Asp Val Ala Ile Ile Leu Val Leu Ala Phe 20 25 30 ttg att cca cgt atc ggc cga ctg gcc atg cgt att atc aag cag cga 1583 Leu Ile Pro Arg Ile Gly Arg Leu Ala Met Arg Ile Ile Lys Gln Arg 35 40 45 gtg gag tct gca gcc gat gcg gac acc act aag aac cag ctc gcg ttc 1631 Val Glu Ser Ala Ala Asp Ala Asp Thr Thr Lys Asn Gln Leu Ala Phe 50 55 60 65 gct ggc gtt ggc gtt tat atc gcg caa att gtg gcg ttt ttc atg ctt 1679 Ala Gly Val Gly Val Tyr Ile Ala Gln Ile Val Ala Phe Phe Met Leu 70 75 80 gcc gtc tcc gcg atg cag gct ttt ggt ttc 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aac atc aca gat gtc atc gcg cgc tct gaa 2063 Pro Met Leu Gly Ser Glu Asn Ile Thr Asp Val Ile Ala Arg Ser Glu 195 200 205 gct gcg act cgt cgc gca ctt ggc cag gag aaa atc gca ccg gaa atc 2111 Ala Ala Thr Arg Arg Ala Leu Gly Gln Glu Lys Ile Ala Pro Glu Ile 210 215 220 225 ctc ggt gaa ctc gat gtg cac cca gcc acg gaa gtc aca ccg cca acg 2159 Leu Gly Glu Leu Asp Val His Pro Ala Thr Glu Val Thr Pro Pro Thr 230 235 240 gtg gtc ggc atg ccg tgg atg gtc acc atg cgt ttc ctc gtg caa gtc 2207 Val Val Gly Met Pro Trp Met Val Thr Met Arg Phe Leu Val Gln Val 245 250 255 acc gcc ggc aat caa tgg ctg gtc gaa cgc gcc atc cgc aca gaa atc 2255 Thr Ala Gly Asn Gln Trp Leu Val Glu Arg Ala Ile Arg Thr Glu Ile 260 265 270 atc aac gaa ttc tgg gaa gaa tac ggc agc gca acc act aca tcg gga 2303 Ile Asn Glu Phe Trp Glu Glu Tyr Gly Ser Ala Thr Thr Thr Ser Gly 275 280 285 acc ctc att gat tcc tta cac gtt gag cat gaa gag cca aag acc tcg 2351 Thr Leu Ile Asp Ser Leu His Val Glu His Glu Glu Pro Lys Thr Ser 290 295 300 305 ctt atc gac gcc tcc ccc cag gct ctt aag gaa ccg aag ccg gag gct 2399 Leu Ile Asp Ala Ser Pro Gln Ala Leu Lys Glu Pro Lys Pro Glu Ala 310 315 320 gcg gcg acg gtt gca tcg cta gct gca tcg tct aac gac gat gca gac 2447 Ala Ala Thr Val Ala Ser Leu Ala Ala Ser Ser Asn Asp Asp Ala Asp 325 330 335 aat gca gac gcc tcg gcg atc aat gca ggc aat cca gag aag gaa ctt 2495 Asn Ala Asp Ala Ser Ala Ile Asn Ala Gly Asn Pro Glu Lys Glu Leu 340 345 350 gat tcc gat gtg ctg gaa caa gaa ctc tcc agc gaa gaa ccg gaa gaa 2543 Asp Ser Asp Val Leu Glu Gln Glu Leu Ser Ser Glu Glu Pro Glu Glu 355 360 365 aca gca aaa cca gat cac tct ctc cga ggc ttc ttc cgc act gat tac 2591 Thr Ala Lys Pro Asp His Ser Leu Arg Gly Phe Phe Arg Thr Asp Tyr 370 375 380 385 tac cca aat cgg tgg cag aag atc ctg tcg ttt ggc gga cgt gtc cgc 2639 Tyr Pro Asn Arg Trp Gln Lys Ile Leu Ser Phe Gly Gly Arg Val Arg 390 395 400 atg agc act tcc ctg ttg ttg ggt gcg ctg ctc ttg ctg tca cta ttt 2687 Met Ser Thr Ser Leu Leu Leu Gly Ala Leu Leu Leu Leu Ser Leu Phe 405 410 415 aag ggg ctc ttc ctg ttt tagagtgcat tgatcttatg gaccaactgc 2735 Lys Gly Leu Phe Leu Phe 420 cctgaatgga taaggcaccg cagaatgtag tggttcaaat tacggaaacc tagagcaatc 2795 ccacgcaaat gctccaaccg tccgttgatc gcttcgaccg gaccgttgga gacaccaaca 2855 tcgaaatacg ccaacacatc accaagtcgt ttaaacaaac tacgacccaa ctgcgcgagt 2915 tccttattcg gccccttcaa cacccgaagc tgatcaataa tggtccgcat tttcttcttc 2975 gcttcacgct tattacccat ctgataacaa tcaataatcg cctgatacgc aagccacgca 3035 agctttaaca ccccgtagtc tttgtcatac gcccacaact gctccaagct ttcttgctga 3095 cgaggactca accacttgtg cgtggtcaac aaggtcttcc ggtttttata caacggatcc 3155 tggcttaaac cacgacgctg gtatttctcc cgctggaggc gttgccggca ggcggtgagc 3215 ttgtcaccag caagccgcac aacatggaat ggatccatca cgcgacgagc agaaggaatg 3275 agttctttac ttgctgtggc gtagccttgg aacccatcca tggacacgat ccgtatctga 3335 ttgcggaact gttcaccgcg ggaaccaagc caggaccgta aagcatcagc actacgacct 3395 gggacgacat ctaataaccg ggcaggacac cgtgagtcat accgatgccc ggtcatatcg 3455 acaatcacgg tgacaaaccc atcaccatgc ttagccctat tatgtgacca cttatgctca 3515 tccaccccaa tgacatacac tccatcaaga tggtgaggat cgttatagac cagctcacgg 3575 cacatatcga gggctagttg gcaggttaaa tcccacccta gcccaagtgc tttcgcggtt 3635 gcgtgaacac tcatccggtc aatagcaagg cgttgcaaaa tccagcgggt gacccggtgg 3695 gtgacctttt taccgtggtc agcgcagctt agttctgctt ggaaatactt ttgcttacat 3755 gtcgggttgg tgcagcggta gcgaggtaga cggataaaca gtttggtggg aaacccgacg 3815 atgggtaaat caatgagcat ccggtgggtg tgatgacgaa acaccccagg ttgggagcat 3875 tctgggcagg tggaggtata gtcgagtgcg tctgcttcga tcagggtgta atcacctgca 3935 tcggaagcgc cggtgatggt gagtcctagt tccgcagtgc ggcagatggt gtcagcgatg 3995 atgttgccgg tagacttcat gggtagagcc ttttgttggt gtttggttag cttagatacc 4055 taaaccttaa ccctgacaaa aggctcgttt attttcgggt ctacaccgct agcccaggtt 4115 ctgtgatgta ccccaaaacc ggaagggcca tttaaggtca tgactgtgga accaagtgag 4175 aattggcaaa actccagtgg atggctgtca ccaagcactg ccacctcaac tgcggtgacc 4235 acctccgaaa cttccgcgcc agcaagcacg ccttcgatga cagtgcccac tacggtggag 4295 gagaccccaa cgatggaatc tagcgtcgaa acgcagcagg aaacctcaac ccctgcaacc 4355 gcaacgcccc agcgagccga caccatcgaa ccgaccgagg aagccacgtc gcaggaggaa 4415 acgactgcat cgcagacgca gtctccagca gtggaagcac caaccgcggt ccaagaaaca 4475 gttgcgccga cgtccacccc ttaggacgct gattacagac gtgtcccatt tctttactac 4535 tattggaaat tatgagttca gacgcagaaa aggcatccgt ggagctttcc gaaaaatttc 4595 acccagaacg cacccatatt ttgggcgccg ttgtttttgg cctgatctca ttattagtca 4655 tcggcgcagc ccctcagtac ctgttttggc tgctcgcgct ccctgtcatc ttcggttact 4715 gggttctaaa atcatccacg atcgttgatg aacagggcat caccgcaaac tacgccttca 4775 agggcaaaaa ggttgtggcc tgggaagacc tcgcaggaat cggattcaag ggtgcccgca 4835 ctttcgctcg caccacctcc gatgcagaag tcaccctccc cggcgtcacc ttcaactccc 4895 ttccccgcct tgaagctgct tcccacggcc gcatccccga tgcgatc 4942 <210> 24 <211> 423 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum 2256 (ATCC 13869) <400> 24 Met Ile Leu Gly Val Pro Ile Gln Tyr Leu Leu Tyr Ser Leu Trp Asn 1 5 10 15 Trp Ile Val Asp Thr Gly Phe Asp Val Ala Ile Ile Leu Val Leu Ala 20 25 30 Phe Leu Ile Pro Arg Ile Gly Arg Leu Ala Met Arg Ile Ile Lys Gln 35 40 45 Arg Val Glu Ser Ala Ala Asp Ala Asp Thr Thr Lys Asn Gln Leu Ala 50 55 60 Phe Ala Gly Val Gly Val Tyr Ile Ala Gln Ile Val Ala Phe Phe Met 65 70 75 80 Leu Ala Val Ser Ala Met Gln Ala Phe Gly Phe Ser Leu Ala Gly Ala 85 90 95 Ala Ile Pro Ala Thr Ile Ala Ser Ala Ala Ile Gly Leu Gly Ala Gln 100 105 110 Ser Ile Val Ala Asp Phe Leu Ala Gly Phe Phe Ile Leu Thr Glu Lys 115 120 125 Gln Phe Gly Val Gly Asp Trp Val Arg Phe Glu Gly Asn Gly Ile Val 130 135 140 Val Glu Gly Thr Val Ile Glu Ile Thr Met Arg Ala Thr Lys Ile Arg 145 150 155 160 Thr Ile Ala Gln Glu Thr Val Ile Ile Pro Asn Ser Thr Ala Lys Val 165 170 175 Cys Ile Asn Asn Ser Asn Asn Trp Ser Arg Ala Val Val Val Ile Pro 180 185 190 Ile Pro Met Leu Gly Ser Glu Asn Ile Thr Asp Val Ile Ala Arg Ser 195 200 205 Glu Ala Ala Thr Arg Arg Ala Leu Gly Gln Glu Lys Ile Ala Pro Glu 210 215 220 Ile Leu Gly Glu Leu Asp Val His Pro Ala Thr Glu Val Thr Pro Pro 225 230 235 240 Thr Val Val Gly Met Pro Trp Met Val Thr Met Arg Phe Leu Val Gln 245 250 255 Val Thr Ala Gly Asn Gln Trp Leu Val Glu Arg Ala Ile Arg Thr Glu 260 265 270 Ile Ile Asn Glu Phe Trp Glu Glu Tyr Gly Ser Ala Thr Thr Thr Ser 275 280 285 Gly Thr Leu Ile Asp Ser Leu His Val Glu His Glu Glu Pro Lys Thr 290 295 300 Ser Leu Ile Asp Ala Ser Pro Gln Ala Leu Lys Glu Pro Lys Pro Glu 305 310 315 320 Ala Ala Ala Thr Val Ala Ser Leu Ala Ala Ser Ser Asn Asp Asp Ala 325 330 335 Asp Asn Ala Asp Ala Ser Ala Ile Asn Ala Gly Asn Pro Glu Lys Glu 340 345 350 Leu Asp Ser Asp Val Leu Glu Gln Glu Leu Ser Ser Glu Glu Pro Glu 355 360 365 Glu Thr Ala Lys Pro Asp His Ser Leu Arg Gly Phe Phe Arg Thr Asp 370 375 380 Tyr Tyr Pro Asn Arg Trp Gln Lys Ile Leu Ser Phe Gly Gly Arg Val 385 390 395 400 Arg Met Ser Thr Ser Leu Leu Leu Gly Ala Leu Leu Leu Leu Ser Leu 405 410 415 Phe Lys Gly Leu Phe Leu Phe 420 <210> 25 <211> 1386 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum ATCC13032 <220> <221> CDS <222> (1)..(1386) <400> 25 atg gtc acc cca atc atg ggg aat tcg aac tct atc ctg ggc att tac 48 Met Val Thr Pro Ile Met Gly Asn Ser Asn Ser Ile Leu Gly Ile Tyr 1 5 10 15 cgt cag aaa atc caa aat cga cat ttg gtt tct acg ctt ttt agg gca 96 Arg Gln Lys Ile Gln Asn Arg His Leu Val Ser Thr Leu Phe Arg Ala 20 25 30 tac ttc cca atc gtg acc gag ctg att att tta ttg att gtt atc gtg 144 Tyr Phe Pro Ile Val Thr Glu Leu Ile Ile Leu Leu Ile Val Ile Val 35 40 45 acg gcg ctc gcc ttc gat ttc aca aac gga ttc cac gac acc ggc aat 192 Thr Ala Leu Ala Phe Asp Phe Thr Asn Gly Phe His Asp Thr Gly Asn 50 55 60 gcg atg gcc aca tcc att gcc aca ggc gct cta aaa cct aaa gtc gcc 240 Ala Met Ala Thr Ser Ile Ala Thr Gly Ala Leu Lys Pro Lys Val Ala 65 70 75 80 gtg gca cta tcc gcc tca ctg aac ctt gtt ggc gca ttc ctc tct gta 288 Val Ala Leu Ser Ala Ser Leu Asn Leu Val Gly Ala Phe Leu Ser Val 85 90 95 gaa gtt gcg aca act gtt gcc aaa ggc gtt gtt gac ctc gac caa ttc 336 Glu Val Ala Thr Thr Val Ala Lys Gly Val Val Asp Leu Asp Gln Phe 100 105 110 gac cta agc aat gcc tgg gat tcc cac cag ctc ctg ctt gtc gtc ttc 384 Asp Leu Ser Asn Ala Trp Asp Ser His Gln Leu Leu Leu Val Val Phe 115 120 125 gcc ggc ctc att ggc gcc atc gtc tgg aac ctt ctg acc tgg ctg cta 432 Ala Gly Leu Ile Gly Ala Ile Val Trp Asn Leu Leu Thr Trp Leu Leu 130 135 140 ggc att cct tcc agc tcc tct cac gca ctt ttc ggt ggc ctc att ggc 480 Gly Ile Pro Ser Ser Ser Ser His Ala Leu Phe Gly Gly Leu Ile Gly 145 150 155 160 gcc gca att gct tca ctc ggt ttc ggc gga gtg gtg tgg gaa ggt gtc 528 Ala Ala Ile Ala Ser Leu Gly Phe Gly Gly Val Val Trp Glu Gly Val 165 170 175 ttg tcc aag atg atc atc cca gca ttg gct gca cca gtt gtt gca ggt 576 Leu Ser Lys Met Ile Ile Pro Ala Leu Ala Ala Pro Val Val Ala Gly 180 185 190 ctc gtg gcc gcc atc ggc act ttc gcc gtg tac agc atc aca aag gca 624 Leu Val Ala Ala Ile Gly Thr Phe Ala Val Tyr Ser Ile Thr Lys Ala 195 200 205 gtt gga gac aac gag aag aac cgt tac ttc cgc tgg ggt cag atc ggc 672 Val Gly Asp Asn Glu Lys Asn Arg Tyr Phe Arg Trp Gly Gln Ile Gly 210 215 220 tcc gct tcc ttg gtt tcc ctg gca cac ggc acc aac gat gcc cag aag 720 Ser Ala Ser Leu Val Ser Leu Ala His Gly Thr Asn Asp Ala Gln Lys 225 230 235 240 acc atg ggc gtt atc ttc ctt tcc ctg gtt gcc acc ggt cac ctg gga 768 Thr Met Gly Val Ile Phe Leu Ser Leu Val Ala Thr Gly His Leu Gly 245 250 255 act gac gct gac atc cca ttc tgg gtc aag gct aca tgt gca ttg gca 816 Thr Asp Ala Asp Ile Pro Phe Trp Val Lys Ala Thr Cys Ala Leu Ala 260 265 270 atc gca atc ggt acc tac ttg ggt ggt tgg cgc gtt atc cgc aca ctg 864 Ile Ala Ile Gly Thr Tyr Leu Gly Gly Trp Arg Val Ile Arg Thr Leu 275 280 285 ggc aaa ggc ttg gtt gag att gat tcc cct cag ggc atg gca gca gaa 912 Gly Lys Gly Leu Val Glu Ile Asp Ser Pro Gln Gly Met Ala Ala Glu 290 295 300 act tct tct gca gca atc att ttg act tct tcc cac ttc ggt atg gca 960 Thr Ser Ser Ala Ala Ile Ile Leu Thr Ser Ser His Phe Gly Met Ala 305 310 315 320 ctg tcc acc act cac gtt gct act ggc tcc atc atg ggt acc ggc att 1008 Leu Ser Thr Thr His Val Ala Thr Gly Ser Ile Met Gly Thr Gly Ile 325 330 335 gga cgt aaa ggg gcg aag gtt cgt tgg tcc gtc gca gga cgc atg gca 1056 Gly Arg Lys Gly Ala Lys Val Arg Trp Ser Val Ala Gly Arg Met Ala 340 345 350 atg gcc tgg gtt atc acc ctc cct gcc tcc gcg atc gtt ggc gtt ttc 1104 Met Ala Trp Val Ile Thr Leu Pro Ala Ser Ala Ile Val Gly Val Phe 355 360 365 tgc tgg tgg gta gct cac gga att ggt ctt atc agc tca gac ctc ctc 1152 Cys Trp Trp Val Ala His Gly Ile Gly Leu Ile Ser Ser Asp Leu Leu 370 375 380 gga gtc ctc gtt gca ttc gcc att ctg gtc att ctg tct ggc tac att 1200 Gly Val Leu Val Ala Phe Ala Ile Leu Val Ile Leu Ser Gly Tyr Ile 385 390 395 400 tac gcc cgt tcc cgt cgc gtg cct gtt gat cca agc aac gtc aac gct 1248 Tyr Ala Arg Ser Arg Arg Val Pro Val Asp Pro Ser Asn Val Asn Ala 405 410 415 gac tgg aat gaa gaa tca aac agc gtg gaa cct gca aca cct tcc gcc 1296 Asp Trp Asn Glu Glu Ser Asn Ser Val Glu Pro Ala Thr Pro Ser Ala 420 425 430 ccg gct gct tct gag att aca gaa gct cct gcc gct cca gcc gct caa 1344 Pro Ala Ala Ser Glu Ile Thr Glu Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Gln 435 440 445 gcc gtt caa gat ctc aac aac gag aat gag gta acc aag taa 1386 Ala Val Gln Asp Leu Asn Asn Glu Asn Glu Val Thr Lys 450 455 460 <210> 26 <211> 461 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum ATCC13032 <400> 26 Met Val Thr Pro Ile Met Gly Asn Ser Asn Ser Ile Leu Gly Ile Tyr 1 5 10 15 Arg Gln Lys Ile Gln Asn Arg His Leu Val Ser Thr Leu Phe Arg Ala 20 25 30 Tyr Phe Pro Ile Val Thr Glu Leu Ile Ile Leu Leu Ile Val Ile Val 35 40 45 Thr Ala Leu Ala Phe Asp Phe Thr Asn Gly Phe His Asp Thr Gly Asn 50 55 60 Ala Met Ala Thr Ser Ile Ala Thr Gly Ala Leu Lys Pro Lys Val Ala 65 70 75 80 Val Ala Leu Ser Ala Ser Leu Asn Leu Val Gly Ala Phe Leu Ser Val 85 90 95 Glu Val Ala Thr Thr Val Ala Lys Gly Val Val Asp Leu Asp Gln Phe 100 105 110 Asp Leu Ser Asn Ala Trp Asp Ser His Gln Leu Leu Leu Val Val Phe 115 120 125 Ala Gly Leu Ile Gly Ala Ile Val Trp Asn Leu Leu Thr Trp Leu Leu 130 135 140 Gly Ile Pro Ser Ser Ser Ser His Ala Leu Phe Gly Gly Leu Ile Gly 145 150 155 160 Ala Ala Ile Ala Ser Leu Gly Phe Gly Gly Val Val Trp Glu Gly Val 165 170 175 Leu Ser Lys Met Ile Ile Pro Ala Leu Ala Ala Pro Val Val Ala Gly 180 185 190 Leu Val Ala Ala Ile Gly Thr Phe Ala Val Tyr Ser Ile Thr Lys Ala 195 200 205 Val Gly Asp Asn Glu Lys Asn Arg Tyr Phe Arg Trp Gly Gln Ile Gly 210 215 220 Ser Ala Ser Leu Val Ser Leu Ala His Gly Thr Asn Asp Ala Gln Lys 225 230 235 240 Thr Met Gly Val Ile Phe Leu Ser Leu Val Ala Thr Gly His Leu Gly 245 250 255 Thr Asp Ala Asp Ile Pro Phe Trp Val Lys Ala Thr Cys Ala Leu Ala 260 265 270 Ile Ala Ile Gly Thr Tyr Leu Gly Gly Trp Arg Val Ile Arg Thr Leu 275 280 285 Gly Lys Gly Leu Val Glu Ile Asp Ser Pro Gln Gly Met Ala Ala Glu 290 295 300 Thr Ser Ser Ala Ala Ile Ile Leu Thr Ser Ser His Phe Gly Met Ala 305 310 315 320 Leu Ser Thr Thr His Val Ala Thr Gly Ser Ile Met Gly Thr Gly Ile 325 330 335 Gly Arg Lys Gly Ala Lys Val Arg Trp Ser Val Ala Gly Arg Met Ala 340 345 350 Met Ala Trp Val Ile Thr Leu Pro Ala Ser Ala Ile Val Gly Val Phe 355 360 365 Cys Trp Trp Val Ala His Gly Ile Gly Leu Ile Ser Ser Asp Leu Leu 370 375 380 Gly Val Leu Val Ala Phe Ala Ile Leu Val Ile Leu Ser Gly Tyr Ile 385 390 395 400 Tyr Ala Arg Ser Arg Arg Val Pro Val Asp Pro Ser Asn Val Asn Ala 405 410 415 Asp Trp Asn Glu Glu Ser Asn Ser Val Glu Pro Ala Thr Pro Ser Ala 420 425 430 Pro Ala Ala Ser Glu Ile Thr Glu Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Gln 435 440 445 Ala Val Gln Asp Leu Asn Asn Glu Asn Glu Val Thr Lys 450 455 460 <210> 27 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 27 gagctcggta cccggggatc catggtcacc ccaatcatgg g 41 <210> 28 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 28 gccaagcttg catgcctgca gttacttggt tacctcattc t 41

Claims (16)

  1. L-글루탐산 생산능을 갖는 코리네형 세균을 배지에서 배양하는 것, 및 상기 배지로부터 L-글루탐산을 채취하는 것을 포함하는, L-글루탐산의 제조법으로서,
    상기 세균은, pitA 유전자에 의해 암호화되는 인산 트랜스포터의 활성이 증대되도록 개변되어 있고,
    상기 인산 트랜스포터의 활성은, 상기 pitA 유전자의 발현을 상승시키고/시키거나, 서열번호 6의 위치 246의 페닐알라닌 잔기에 상당하는 아미노산 잔기가 세린 잔기로 치환되는 변이를 갖는 인산 트랜스포터를 암호화하는 변이형 pitA 유전자를 상기 세균이 보유하도록 함에 의해 증대됨을 특징으로 하는, 방법.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 제1항에 있어서, 상기 pitA 유전자가 서열번호 5 또는 서열번호 25에 나타낸 염기 서열로 이루어진 DNA인, 방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 pitA 유전자가, 서열번호 6 또는 서열번호 26에 나타낸 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 암호화하는 DNA인, 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 유전자의 발현이, 상기 유전자의 카피 수를 증가시키고/시키거나 상기 유전자의 발현 조절 서열을 개변시킴에 의해 상승되는, 방법.
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. L-글루탐산 생산능을 갖는 코리네형 세균을 배지에서 배양하는 것, 및 상기 배지로부터 L-글루탐산을 채취하는 것을 포함하는, L-글루탐산의 제조법으로서,
    상기 세균은, 서열번호 6의 위치 246의 페닐알라닌 잔기에 상당하는 아미노산 잔기가 세린 잔기로 치환되는 변이를 갖는 인산 트랜스포터를 암호화하는 변이형 pitA 유전자를 보유함을 특징으로 하는, 방법.
  10. 삭제
  11. 제1항, 제4항 내지 제6항 및 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 코리네형 세균이 코리네박테리움(Corynebacterium) 속 세균인, 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 코리네형 세균이 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)인, 방법.
  13. 삭제
  14. 제1항, 제4항 내지 제6항 및 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 L-글루탐산이 L-글루탐산 암모늄 또는 L-글루탐산 나트륨인, 방법.
  15. 서열번호 6의 위치 246의 페닐알라닌 잔기에 상당하는 아미노산 잔기가 세린 잔기로 치환되는 변이를 갖는 인산 트랜스포터를 암호화하는, DNA.
  16. 서열번호 6의 위치 246의 페닐알라닌 잔기에 상당하는 아미노산 잔기가 세린 잔기로 치환되는 변이를 갖는 인산 트랜스포터를 암호화하는 변이형 pitA 유전자를 보유하는, 코리네형 세균.
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