JPWO2014185430A1 - Ｌ−アミノ酸の製造法 - Google Patents

Abstract

Ｌ−アミノ酸の製造法を提供する。リン酸トランスポーターの活性が増大するように改変されたＬ−アミノ酸生産能を有するコリネ型細菌を培地で培養し、該培地よりＬ−アミノ酸を採取することにより、Ｌ−アミノ酸を製造する。

Description

本発明は、コリネ型細菌を用いたＬ−アミノ酸の製造法に関する。Ｌ−アミノ酸は、動物飼料用の添加物、調味料や飲食品の成分、又はアミノ酸輸液等として、産業上有用である。

Ｌ−アミノ酸は、例えば、Ｌ−アミノ酸生産能を有する各種微生物を用いた発酵法により工業生産されている。発酵法によるＬ−アミノ酸の製造法としては、例えば、野生型微生物（野生株）を用いる方法、野生株から誘導された栄養要求株を用いる方法、野生株から種々の薬剤耐性変異株として誘導された代謝調節変異株を用いる方法、栄養要求株と代謝調節変異株の両方の性質を持った株を用いる方法が挙げられる。

また、近年は、組換えＤＮＡ技術によりＬ−アミノ酸生産能を向上させた微生物がＬ−アミノ酸の製造に利用されている。微生物のＬ−アミノ酸生産能を向上させる方法としては、例えば、Ｌ−アミノ酸生合成系酵素をコードする遺伝子の発現を増強すること（特許文献１、特許文献２）、Ｌ−アミノ酸生合成系への炭素源の流入を増強すること（特許文献３）が挙げられる。

エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）は、少なくとも２種の無機リン酸取り込み系を有する（非特許文献１）。一方は、低親和性の無機リン酸トランスポーター（low-affinity inorganic phosphate transporter；Ｐｉｔ）系であり、もう一方は、高親和性のリン酸特異的トランスポーター（high-affinity phosphate-specific transporter；Ｐｓｔ）系である。Ｐｉｔ系をコードする遺伝子としてはpitA遺伝子やpitB遺伝子が知られている。Ｐｓｔ系をコードする遺伝子としてはpstSCAB遺伝子が知られており、pstSCAB遺伝子の産物は複合体を形成してＰｓｔ系として機能する。しかしながら、これらリン酸トランスポーターの活性とＬ−アミノ酸生産との関連は知られていなかった。

米国特許第5,168,056号明細書 米国特許第5,776,736号明細書 米国特許第5,906,925号明細書

R. M. Harris et al., Journal of Bacteriology, Sept. 2001, p5008-5014

本発明は、コリネ型細菌のＬ−アミノ酸生産能を向上させる新規な技術を開発し、効率的なＬ−アミノ酸の製造法を提供することを課題とする。

本発明者は、上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、リン酸トランスポーターの活性が増大するようにコリネ型細菌を改変することによって、コリネ型細菌のＬ−アミノ酸生産能を向上させることができることを見出し、本発明を完成させた。

すなわち、本発明は以下の通り例示できる。
［１］
Ｌ−アミノ酸生産能を有するコリネ型細菌を培地で培養すること、および該培地よりＬ−アミノ酸を採取すること、を含むＬ−アミノ酸の製造法であって、
前記細菌が、リン酸トランスポーターの活性が増大するように改変されていることを特徴とする、方法。
［２］
リン酸トランスポーターをコードする遺伝子の発現を上昇させることにより、リン酸トランスポーターの活性が増大した、前記方法。
［３］
前記遺伝子がｐｉｔＡ遺伝子である、前記方法。
［４］
前記ｐｉｔＡ遺伝子が、下記（ａ）又は（ｂ）に記載のＤＮＡである、前記方法：
（ａ）配列番号５または２５に示す塩基配列を有するＤＮＡ、
（ｂ）配列番号５または２５に示す塩基配列の相補配列又は同相補配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、リン酸トランスポーター活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
［５］
前記ｐｉｔＡ遺伝子が、下記（Ａ）又は（Ｂ）に記載のタンパク質をコードするＤＮＡである、前記方法：
（Ａ）配列番号６または２６に示すアミノ酸配列を有するタンパク質、
（Ｂ）配列番号６または２６に示すアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を有し、かつ、リン酸トランスポーター活性を有するタンパク質。
［６］
前記遺伝子の発現が、該遺伝子のコピー数を高めること、及び／又は該遺伝子の発現調節配列を改変することによって上昇した、前記方法。
［７］
配列番号６の２４６位のフェニルアラニン残基に相当するアミノ酸残基がフェニルアラニン以外のアミノ酸残基に置換される変異を有するリン酸トランスポーターをコードする変異型ｐｉｔＡ遺伝子を前記細菌に保持させることにより、リン酸トランスポーターの活性が増大した、前記方法。
［８］
配列番号６の２４６位のフェニルアラニン残基に相当するアミノ酸残基が、セリン残基に置換されたことを特徴とする、前記方法。
［９］
Ｌ−アミノ酸生産能を有するコリネ型細菌を培地で培養すること、および該培地よりＬ−アミノ酸を採取すること、を含むＬ−アミノ酸の製造法であって、
前記細菌が、配列番号６の２４６位のフェニルアラニン残基に相当するアミノ酸残基がフェニルアラニン以外のアミノ酸残基に置換される変異を有するリン酸トランスポーターをコードする変異型ｐｉｔＡ遺伝子を保持していることを特徴とする、方法。
［１０］
配列番号６の２４６位のフェニルアラニン残基に相当するアミノ酸残基が、セリン残基に置換されたことを特徴とする、前記方法。
［１１］
前記細菌が、コリネバクテリウム属細菌である、前記方法。
［１２］
前記コリネ型細菌が、コリネバクテリウム・グルタミカムである、前記方法。
［１３］
前記Ｌ−アミノ酸が、Ｌ−グルタミン酸である、前記方法。
［１４］
前記Ｌ−グルタミン酸が、Ｌ−グルタミン酸アンモニウムまたはＬ−グルタミン酸ナトリウムである、前記方法。
［１５］
配列番号６の２４６位のフェニルアラニン残基に相当するアミノ酸残基がセリン残基に置換される変異を有するリン酸トランスポーターをコードするＤＮＡ。
［１６］
配列番号６の２４６位のフェニルアラニン残基に相当するアミノ酸残基がセリン残基に置換される変異を有するリン酸トランスポーターをコードする変異型ｐｉｔＡ遺伝子を保持しているコリネ型細菌。

以下、本発明を詳細に説明する。

本発明の方法は、Ｌ−アミノ酸生産能を有するコリネ型細菌を培地で培養すること、および該培地よりＬ−アミノ酸を採取すること、を含むＬ−アミノ酸の製造法であって、前記細菌が、リン酸トランスポーターの活性が増大するように改変されたことを特徴とする、方法である。同方法に用いられるコリネ型細菌を、「本発明の細菌」ともいう。

＜１＞本発明の細菌
本発明の細菌は、リン酸トランスポーターの活性が増大するように改変された、Ｌ−アミノ酸生産能を有するコリネ型細菌である。

＜１−１＞Ｌ−アミノ酸生産能を有するコリネ型細菌
本発明において、「Ｌ−アミノ酸生産能を有する細菌」とは、培地で培養したときに、目的とするＬ−アミノ酸を生成し、回収できる程度に培地中または菌体内に蓄積する能力を有する細菌をいう。Ｌ−アミノ酸生産能を有する細菌は、非改変株よりも多い量の目的とするＬ−アミノ酸を培地に蓄積することができる細菌であってよい。非改変株としては、野生株や親株が挙げられる。また、Ｌ−アミノ酸生産能を有する細菌は、好ましくは０．５ｇ／Ｌ以上、より好ましくは１．０ｇ／Ｌ以上の量の目的とするＬ−アミノ酸を培地に蓄積することができる細菌であってもよい。

Ｌ−アミノ酸としては、Ｌ−リジン、Ｌ−オルニチン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−シトルリン等の塩基性アミノ酸、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−アラニン、Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシン、グリシン等の脂肪族アミノ酸、Ｌ−スレオニン、Ｌ−セリン等のヒドロキシモノアミノカルボン酸であるアミノ酸、Ｌ−プロリン等の環式アミノ酸、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−チロシン、Ｌ−トリプトファン等の芳香族アミノ酸、Ｌ−システイン、Ｌ−シスチン、Ｌ−メチオニン等の含硫アミノ酸、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−アスパラギン酸等の酸性アミノ酸、Ｌ−グルタミン、Ｌ−アスパラギン等の側鎖にアミド基を持つアミノ酸が挙げられる。本発明の細菌は、２またはそれ以上のアミノ酸の生産能を有していてもよい。

本発明において、アミノ酸は、特記しない限り、いずれもＬ−アミノ酸である。Ｌ−アミノ酸は、フリー体、その塩、またはそれらの混合物であってよい。すなわち、本発明における「Ｌ−アミノ酸」という用語は、フリー体のＬ−アミノ酸、その塩、またはそれらの混合物を意味してよい。塩としては、例えば、硫酸塩、塩酸塩、炭酸塩、アンモニウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩が挙げられる。例えば、Ｌ−リジンは、フリー体のＬ−リジン、Ｌ−リジン硫酸塩、Ｌ−リジン塩酸塩、Ｌ−リジン炭酸塩、またはそれらの混合物であってもよい。また、例えば、Ｌ−グルタミン酸は、フリー体のＬ−グルタミン酸、Ｌ―グルタミン酸ナトリウム（ＭＳＧ）、Ｌ−グルタミン酸アンモニウム塩、またはそれらの混合物であってもよい。

コリネ型細菌としては、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属、ブレビバクテリウム（Brevibacterium）属、およびミクロバクテリウム（Microbacterium）属等の属に属する細菌が挙げられる。

コリネ型細菌としては、具体的には、下記のような種が挙げられる。
コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム（Corynebacterium acetoacidophilum）
コリネバクテリウム・アセトグルタミカム（Corynebacterium acetoglutamicum）
コリネバクテリウム・アルカノリティカム（Corynebacterium alkanolyticum）
コリネバクテリウム・カルナエ（Corynebacterium callunae）
コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）
コリネバクテリウム・リリウム（Corynebacterium lilium）
コリネバクテリウム・メラセコーラ（Corynebacterium melassecola）
コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス（コリネバクテリウム・エフィシエンス）（Corynebacterium thermoaminogenes (Corynebacterium efficiens)）
コリネバクテリウム・ハーキュリス（Corynebacterium herculis）
ブレビバクテリウム・ディバリカタム（コリネバクテリウム・グルタミカム）（Brevibacterium divaricatum (Corynebacterium glutamicum)）
ブレビバクテリウム・フラバム（コリネバクテリウム・グルタミカム）（Brevibacterium flavum (Corynebacterium glutamicum)）
ブレビバクテリウム・イマリオフィラム（Brevibacterium immariophilum）
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（コリネバクテリウム・グルタミカム）（Brevibacterium lactofermentum (Corynebacterium glutamicum)）
ブレビバクテリウム・ロゼウム（Brevibacterium roseum）
ブレビバクテリウム・サッカロリティカム（Brevibacterium saccharolyticum）
ブレビバクテリウム・チオゲニタリス（Brevibacterium thiogenitalis）
コリネバクテリウム・アンモニアゲネス（コリネバクテリウム・スタティオニス）（Corynebacterium ammoniagenes (Corynebacterium stationis)）
ブレビバクテリウム・アルバム（Brevibacterium album）
ブレビバクテリウム・セリナム（Brevibacterium cerinum）
ミクロバクテリウム・アンモニアフィラム（Microbacterium ammoniaphilum）

コリネ型細菌としては、具体的には、下記のような菌株が挙げられる。
Corynebacterium acetoacidophilum ATCC 13870
Corynebacterium acetoglutamicum ATCC 15806
Corynebacterium alkanolyticum ATCC 21511
Corynebacterium callunae ATCC 15991
Corynebacterium glutamicum ATCC 13020, ATCC 13032, ATCC 13060，ATCC 13869，FERM BP-734
Corynebacterium lilium ATCC 15990
Corynebacterium melassecola ATCC 17965
Corynebacterium efficiens (Corynebacterium thermoaminogenes) AJ12340 (FERM BP-1539)
Corynebacterium herculis ATCC 13868
Corynebacterium glutamicum (Brevibacterium divaricatum) ATCC 14020
Corynebacterium glutamicum (Brevibacterium flavum) ATCC 13826, ATCC 14067, AJ12418(FERM BP-2205)
Brevibacterium immariophilum ATCC 14068
Corynebacterium glutamicum (Brevibacterium lactofermentum) ATCC 13869
Brevibacterium roseum ATCC 13825
Brevibacterium saccharolyticum ATCC 14066
Brevibacterium thiogenitalis ATCC 19240
Corynebacterium ammoniagenes (Corynebacterium stationis) ATCC 6871, ATCC 6872
Brevibacterium album ATCC 15111
Brevibacterium cerinum ATCC 15112
Microbacterium ammoniaphilum ATCC 15354

なお、コリネバクテリウム属細菌には、従来ブレビバクテリウム属に分類されていたが、現在コリネバクテリウム属に統合された細菌（Int. J. Syst. Bacteriol., 41, 255(1991)）も含まれる。また、コリネバクテリウム・スタティオニスには、従来コリネバクテリウム・アンモニアゲネスに分類されていたが、16S rRNAの塩基配列解析等によりコリネバクテリウム・スタティオニスに再分類された細菌も含まれる（Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 60, 874-879(2010)）。

これらの菌株は、例えば、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（住所12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852 P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108, United States of America）より分譲を受けることが出来る。すなわち各菌株に対応する登録番号が付与されており、この登録番号を利用して分譲を受けることが出来る（http://www.atcc.org/参照）。各菌株に対応する登録番号は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションのカタログに記載されている。

本発明の細菌は、本来的にＬ−アミノ酸生産能を有するものであってもよく、Ｌ−アミノ酸生産能を有するように改変されたものであってもよい。Ｌ−アミノ酸生産能を有する細菌は、例えば、上記のような細菌にＬ−アミノ酸生産能を付与することにより、または、上記のような細菌のＬ−アミノ酸生産能を増強することにより、取得できる。

Ｌ−アミノ酸生産能の付与または増強は、従来、コリネ型細菌又はエシェリヒア属細菌等のアミノ酸生産菌の育種に採用されてきた方法により行うことができる（アミノ酸発酵、（株）学会出版センター、1986年5月30日初版発行、第７７〜１００頁参照）。そのような方法としては、例えば、栄養要求性変異株の取得、Ｌ−アミノ酸のアナログ耐性株の取得、代謝制御変異株の取得、Ｌ−アミノ酸の生合成系酵素の活性が増強された組換え株の創製が挙げられる。Ｌ−アミノ酸生産菌の育種において、付与される栄養要求性、アナログ耐性、代謝制御変異等の性質は、単独であってもよく、２種又は３種以上であってもよい。また、Ｌ−アミノ酸生産菌の育種において、活性が増強されるＬ−アミノ酸生合成系酵素も、単独であってもよく、２種又は３種以上であってもよい。さらに、栄養要求性、アナログ耐性、代謝制御変異等の性質の付与と、生合成系酵素の活性の増強が組み合わされてもよい。

Ｌ−アミノ酸生産能を有する栄養要求性変異株、アナログ耐性株、又は代謝制御変異株は、親株又は野生株を通常の変異処理に供し、得られた変異株の中から、栄養要求性、アナログ耐性、又は代謝制御変異を示し、且つＬ−アミノ酸生産能を有するものを選択することによって取得できる。通常の変異処理としては、Ｘ線や紫外線の照射、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＭＮＮＧ）、エチルメタンスルフォネート（ＥＭＳ）、メチルメタンスルフォネート（ＭＭＳ）等の変異剤による処理が挙げられる。

また、Ｌ−アミノ酸生産能の付与又は増強は、目的のＬ−アミノ酸の生合成に関与する酵素の活性を増強することによっても行うことができる。酵素活性の増強は、例えば、同酵素をコードする遺伝子の発現が増強するように細菌を改変することにより行うことができる。遺伝子の発現を増強する方法は、WO00/18935号パンフレット、欧州特許出願公開1010755号明細書等に記載されている。酵素活性を増強する詳細な手法については後述する。

また、Ｌ−アミノ酸生産能の付与又は増強は、目的のＬ−アミノ酸の生合成経路から分岐して目的のＬ−アミノ酸以外の化合物を生成する反応を触媒する酵素の活性を低下させることによっても行うことができる。なお、ここでいう「目的のＬ−アミノ酸の生合成経路から分岐して目的のＬ−アミノ酸以外の化合物を生成する反応を触媒する酵素」には、目的のアミノ酸の分解に関与する酵素も含まれる。酵素活性を低下させる手法については後述する。

以下、Ｌ−アミノ酸生産菌、およびＬ−アミノ酸生産能を付与または増強する方法について具体的に例示する。なお、以下に例示するようなＬ−アミノ酸生産菌が有する性質およびＬ−アミノ酸生産能を付与または増強するための改変は、いずれも、単独で用いてもよく、適宜組み合わせて用いてもよい。

＜Ｌ−グルタミン酸生産菌＞
Ｌ−グルタミン酸生産菌又はそれを誘導するための親株としては、Ｌ−グルタミン酸生合成系酵素から選択される１またはそれ以上の酵素の活性が増強された株が挙げられる。そのような酵素としては、特に制限されないが、グルタメートデヒドロゲナーゼ（gdhA）、グルタミンシンテターゼ（glnA）、グルタメートシンテターゼ（gltBD）、イソシトレートデヒドロゲナーゼ（icdA）、アコニテートヒドラターゼ（acnA, acnB）、クエン酸シンターゼ（gltA）、メチルクエン酸シンターゼ（prpC）、ホスホエノールピルベートカルボシラーゼ（ppc）、ピルベートデヒドロゲナーゼ（aceEF, lpdA）、ピルベートキナーゼ（pykA, pykF）、ホスホエノールピルベートシンターゼ（ppsA）、エノラーゼ（eno）、ホスホグリセロムターゼ（pgmA, pgmI）、ホスホグリセレートキナーゼ（pgk）、グリセルアルデヒド-3-フォスフェートデヒドロゲナーゼ（gapA）、トリオースフォスフェートイソメラーゼ（tpiA）、フルクトースビスフォスフェートアルドラーゼ（fbp）、ホスホフルクトキナーゼ（pfkA, pfkB）、グルコースフォスフェートイソメラーゼ（pgi）、６−ホスホグルコン酸デヒドラターゼ（edd）、２−ケト−３−デオキシ−６−ホスホグルコン酸アルドラーゼ（eda）、トランスヒドロゲナーゼが挙げられる。なお、カッコ内は、その酵素をコードする遺伝子の略記号である（以下の記載においても同様）。これらの酵素の中では、例えば、グルタメートデヒドロゲナーゼ、クエン酸シンターゼ、ホスホエノールピルベートカルボキシラーゼ、及びメチルクエン酸シンターゼから選択される１またはそれ以上の酵素の活性を増強するのが好ましい。

グルタミン酸シンテターゼ遺伝子（gltBD）の発現が増大するように改変されたコリネ型細菌としては、WO99/07853に開示されたものが挙げられる。

また、Ｌ−グルタミン酸生産菌又はそれを誘導するための親株としては、Ｌ−グルタミン酸の生合成経路から分岐してＬ−グルタミン酸以外の化合物を生成する反応を触媒する酵素から選択される１またはそれ以上の酵素の活性が低下または欠損している株も挙げられる。そのような酵素としては、特に制限されないが、イソシトレートリアーゼ（aceA）、α−ケトグルタレートデヒドロゲナーゼ（sucA, odhA）、ホスホトランスアセチラーゼ（pta）、アセテートキナーゼ（ack）、アセトヒドロキシ酸シンターゼ（ilvG）、アセトラクテートシンターゼ（ilvI）、フォルメートアセチルトランスフェラーゼ（pfl）、ラクテートデヒドロゲナーゼ（ldh）、グルタメートデカルボキシラーゼ（gadAB）、コハク酸デヒドロゲナーゼ（sdhABCD）、１−ピロリン−５−カルボキシレートデヒドロゲナーゼ（putA）が挙げられる。

α−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性が低下または欠損したコリネ型細菌、及びそれらの取得方法は、WO2008/075483に記載されている。α−ケトグルタレートデヒドロゲナーゼ活性が低下または欠損したコリネ型細菌として、具体的には、例えば、下記の株が挙げられる。
Corynebacterium glutamicum (Brevibacterium lactofermentum) L30-2株 (特開2006-340603号明細書)
Corynebacterium glutamicum (Brevibacterium lactofermentum) ΔS株 (国際公開95/34672号パンフレット)
Corynebacterium glutamicum (Brevibacterium lactofermentum) AJ12821 (FERM BP-4172；フランス特許公報9401748号明細書参照)
Corynebacterium glutamicum (Brevibacterium flavum) AJ12822 (FERM BP-4173；フランス特許公報9401748号明細書)
Corynebacterium glutamicum AJ12823 (FERM BP-4174；フランス特許公報9401748号明細書)
Corynebacterium glutamicum L30-2株 (特開2006-340603号)

また、Ｌ−グルタミン酸生産菌又はそれを誘導するための親株としては、α−ケトグルタレートデヒドロゲナーゼ（sucA）活性およびコハク酸デヒドロゲナーゼ（sdh）活性の両方が低下または欠損した株も挙げられる（特開2010-041920号）。そのような株として、具体的には、例えば、Corynebacterium glutamicum ATCC14067のodhAsdhA二重欠損株（Corynebacterium glutamicum 8L3GΔSDH株）が挙げられる（特開2010-041920号）。

また、Ｌ−グルタミン酸生産菌又はそれを誘導するための親株としては、Ｄ−キシルロース−５−リン酸−ホスホケトラーゼ及び／又はフルクトース−６−リン酸ホスホケトラーゼ活性を増強するように改変された株も挙げられる（特表2008-509661）。Ｄ−キシルロース−５−リン酸−ホスホケトラーゼ活性及びフルクトース−６−リン酸ホスホケトラーゼ活性はいずれか一方を増強してもよいし、両方を増強してもよい。なお、本明細書ではＤ−キシルロース−５−リン酸−ホスホケトラーゼとフルクトース−６−リン酸ホスホケトラーゼをまとめてホスホケトラーゼと呼ぶことがある。

Ｄ−キシルロース−５−リン酸−ホスホケトラーゼ活性とは、リン酸を消費して、キシルロース−５−リン酸をグリセルアルデヒド−３−リン酸とアセチルリン酸に変換し、一分子のH₂Oを放出する活性を意味する。この活性は、Goldberg, M.らの文献 (Methods Enzymol., 9,515-520 (1966)) またはL.Meileの文献 (J.Bacteriol. (2001) 183; 2929-2936) に記載の方法によって測定することができる。

また、フルクトース−６−リン酸ホスホケトラーゼ活性とは、リン酸を消費して、フルクトース６−リン酸をエリスロース−４−リン酸とアセチルリン酸に変換し、一分子のH₂Oを放出する活性を意味する。この活性は、Racker, Eの文献 (Methods Enzymol., 5, 276-280 (1962)) またはL.Meileの文献 (J.Bacteriol. (2001) 183; 2929-2936) に記載の方法によって測定することができる。

また、コリネ型細菌について、Ｌ−グルタミン酸生産能を付与または増強する方法としては、有機酸アナログや呼吸阻害剤などへの耐性を付与する方法や細胞壁合成阻害剤に対する感受性を付与する方法も挙げられる。そのような方法としては、例えば、モノフルオロ酢酸耐性を付与する方法（特開昭50-113209）、アデニン耐性またはチミン耐性を付与する方法（特開昭57-065198）、ウレアーゼ活性を弱化させる方法（特開昭52-038088）、マロン酸耐性を付与する方法（特開昭52-038088）、ベンゾピロン耐性またはナフトキノン類への耐性を付与する方法（特開昭56-1889）、HOQNO耐性を付与する方法（特開昭56-140895）、α−ケトマロン酸耐性を付与する方法（特開昭57-2689）、グアニジン耐性を付与する方法（特開昭56-35981）、ペニシリンに対する感受性を付与する方法（特開平4-88994）が挙げられる。

このような耐性菌または感受性菌として、具体的には、例えば、下記の株が挙げられる。
Corynebacterium glutamicum (Brevibacterium flavum) AJ3949 (FERM BP-2632；特開昭50-113209参照)
Corynebacterium glutamicum AJ11628 (FERM P-5736；特開昭57-065198参照)
Corynebacterium glutamicum (Brevibacterium flavum) AJ11355 (FERM P-5007；特開昭56-1889号公報参照)
Corynebacterium glutamicum AJ11368 (FERM P-5020；特開昭56-1889号公報参照)
Corynebacterium glutamicum (Brevibacterium flavum) AJ11217 (FERM P-4318；特開昭57-2689号公報参照)
Corynebacterium glutamicum AJ11218 (FERM P-4319；特開昭57-2689号公報参照)
Corynebacterium glutamicum (Brevibacterium flavum) AJ11564 (FERM P-5472；特開昭56-140895公報参照)
Corynebacterium glutamicum (Brevibacterium flavum) AJ11439 (FERM P-5136；特開昭56-35981号公報参照)
Corynebacterium glutamicum H7684 (FERM BP-3004；特開平04-88994号公報参照)
Corynebacterium glutamicum (Brevibacterium lactofermentum) AJ11426 (FERM P-5123；特開平56-048890号公報参照)
Corynebacterium glutamicum AJ11440 (FERM P-5137；特開平56-048890号公報参照)
Corynebacterium glutamicum (Brevibacterium lactofermentum) AJ11796 (FERM P-6402；特開平58-158192号公報参照)

また、コリネ型細菌について、Ｌ−グルタミン酸生産能を付与または増強する方法としては、yggB遺伝子の発現を増強する方法やコード領域内に変異を導入した変異型yggB遺伝子を導入する方法も挙げられる（WO2006/070944）。yggB遺伝子は、メカノセンシティブチャンネル（mechanosensitive channel）をコードする遺伝子である。Corynebacterium glutamicum ATCC13032のyggB遺伝子は、ＮＣＢＩデータベースにGenbank Accession No. NC_003450で登録されているゲノム配列中、1,336,091〜1,337,692の配列の相補配列に相当し、NCgl1221とも呼ばれる。Corynebacterium glutamicum ATCC13032のyggB遺伝子にコードされるYggBタンパク質は、GenBank accession No. NP_600492として登録されている。また、Corynebacterium glutamicum 2256 (ATCC 13869)のyggB遺伝子の塩基配列、及び同遺伝子がコードするYggBタンパク質のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号２１および２２に示す。

ここで用いる変異型yggB遺伝子としては、以下のような変異を有するyggB遺伝子を挙げることができる。なお、変異型yggB遺伝子にコードされるYggBタンパク質を変異型YggBタンパク質ともいう。また、当該変異を有さないyggB遺伝子および同遺伝子にコードされるYggBタンパク質を、それぞれ野生型yggB遺伝子および野生型YggBタンパク質ともいう。野生型YggBタンパク質としては、例えば配列番号２２に示すアミノ酸配列を有するタンパク質が挙げられる。

（１）C末端側変異
C末端側変異は、配列番号２２のアミノ酸番号４１９〜５３３の配列をコードする領域の塩基配列の一部に導入された変異である。C末端側変異は、上記領域の塩基配列中の少なくとも一部に変異が導入される限り特に制限されないが、インサーションシーケンス（以下、「IS」ともいう）やトランスポゾンが挿入されたものが好ましい。C末端側変異は、アミノ酸置換を伴うもの（ミスセンス変異）や、上記IS等の挿入によってフレームシフト変異が導入されたもの、ナンセンス変異が導入されたものの何れでもよい。C末端側変異を有する変異型yggB遺伝子として、具体的には、例えば、配列番号２２の４１９位のバリン残基をコードする箇所にＩＳが挿入され、野生型YggBタンパク質（配列番号２２）よりも短い全長４２３アミノ酸残基の変異型YggBタンパク質をコードするyggB遺伝子が挙げられる（特開2007-222163）。この変異型yggB遺伝子（V419::IS）の塩基配列、及び同遺伝子がコードする変異型YggBタンパク質のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号２３および２４に示す。また、C末端側変異として、配列番号２２のアミノ酸番号４１９〜５３３の領域内に存在するプロリンを他のアミノ酸に置換する変異も挙げられる。

（２）膜貫通領域の変異
yggB遺伝子がコードするYggBタンパク質は、５個の膜貫通領域を有していると推測されている。配列番号２２の野生型YggBタンパク質のアミノ酸配列において、膜貫通領域はそれぞれ、アミノ酸番号１〜２３（第１膜貫通領域）、２５〜４７（第２膜貫通領域）、６２〜８４（第３膜貫通領域）、８６〜１０８（第４膜貫通領域）、１１０〜１３２（第５膜貫通領域）の領域に相当する。yggB遺伝子は、これら膜貫通領域をコードする領域内に変異を有していてよい。膜貫通領域の変異は、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、付加、挿入又は逆位を含む変異であって、フレームシフト変異およびナンセンス変異を伴わないものが望ましい。膜貫通領域の変異としては、配列番号２２に示されるアミノ酸配列において、１４位のロイシン残基と１５位のトリプトファン残基間に１又は数個のアミノ酸を挿入する変異、１００位のアラニン残基を他のアミノ酸残基へ置換する変異、１１１位のアラニン残基を他のアミノ酸残基へ置換する変異などが挙げられる。尚、上記「１又は数個」とは、具体的には、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個、特に好ましくは１〜３個を意味する。

なお、野生型YggBタンパク質が配列番号２２に示すアミノ酸配列以外のアミノ酸配列を有する場合、変異型yggB遺伝子は、配列番号２２における上記箇所のアミノ酸残基に相当するアミノ酸残基をコードする領域に変異を有していればよい。任意の野生型YggBタンパク質において、いずれのアミノ酸残基が「配列番号２２における上記箇所のアミノ酸残基に相当するアミノ酸残基」であるかは、当該野生型YggBタンパク質のアミノ酸配列と配列番号２２のアミノ酸配列とでアライメントを行うことにより決定できる。このような変異型yggB遺伝子や変異型YggBタンパク質のバリアントについては、後述する変異型リン酸トランスポーターやそれをコードする遺伝子のバリアントについての記載を準用できる。なお、「配列番号２２のアミノ酸番号Ｘ」とは、「配列番号２２のＸ位」と読み替えてよい。

＜Ｌ−グルタミン生産菌＞
Ｌ−グルタミン生産能を付与又は増強するための方法としては、例えば、Ｌ−グルタミン生合成系酵素から選択される１またはそれ以上の酵素の活性が増大するように細菌を改変する方法が挙げられる。そのような酵素としては、特に制限されないが、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（gdhA）やグルタミンシンセターゼ（glnA）が挙げられる。

また、Ｌ−グルタミン生産能を付与又は増強するための方法としては、例えば、Ｌ−グルタミンの生合成経路から分岐してＬ−グルタミン以外の化合物を生成する反応を触媒する酵素から選択される１またはそれ以上の酵素の活性が低下するように細菌を改変する方法も挙げられる。そのような酵素としては、特に制限されないが、グルタミナーゼが挙げられる。

Ｌ−グルタミン生産菌又はそれを誘導するための親株としては、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（gdhA）および／またはグルタミンシンセターゼ（glnA）の活性を増強したコリネ型細菌（EP1229121, EP1424398）やグルタミナーゼ活性が低下したコリネ型細菌（特開2004-187684）が挙げられる。グルタミンシンセターゼの活性増強は、グルタミンアデニリルトランスフェラーゼ遺伝子（glnE）の破壊、PII制御タンパク質遺伝子（glnB）の破壊によっても達成できる（EP1229121）。

また、コリネ型細菌について、Ｌ−グルタミン生産能を付与または増強する方法としては、6-ジアゾ-5-オキソ-ノルロイシン耐性を付与する方法 (特開平3-232497)、プリンアナログ耐性及びメチオニンスルホキシド耐性を付与する方法 (特開昭61-202694)、α-ケトマレイン酸耐性を付与する方法 (特開昭56-151495)が挙げられる。Ｌ−グルタミン生産能を有するコリネ型細菌として、具体的には、例えば、以下の株が挙げられる。
Corynebacterium glutamicum (Brevibacterium flavum) AJ11573 (FERM P-5492、特開昭56-161495)
Corynebacterium glutamicum (Brevibacterium flavum) AJ11576 (FERM BP-10381、特開昭56-161495)
Corynebacterium glutamicum (Brevibacterium flavum) AJ12212 (FERM P-8123、特開昭61-202694)

＜Ｌ−プロリン生産菌＞
Ｌ−プロリン生産菌又はそれを誘導するための親株としては、Ｌ−プロリン生合成系酵素から選択される１またはそれ以上の酵素の活性が増強された株が挙げられる。Ｌ−プロリン生合成に関与する酵素としては、グルタミン酸５−キナーゼ、γ‐グルタミル−リン酸レダクターゼ、ピロリン−５−カルボキシレートレダクターゼが挙げられる。酵素活性の増強には、例えば、Ｌ−プロリンによるフィードバック阻害が解除されたグルタメートキナーゼをコードするproB遺伝子(ドイツ特許第3127361号)が好適に利用できる。

また、Ｌ−プロリン生産菌又はそれを誘導するための親株としては、Ｌ−プロリン分解に関与する酵素の活性が低下した株も挙げられる。そのような酵素としては、プロリンデヒドロゲナーゼやオルニチンアミノトランスフェラーゼが挙げられる。

＜Ｌ−スレオニン生産菌＞
Ｌ−スレオニン生産菌又はそれを誘導するための親株としては、Ｌ−スレオニン生合成系酵素から選択される１またはそれ以上の酵素の活性が増強された株が挙げられる。そのような酵素としては、特に制限されないが、アスパルトキナーゼIII（lysC）、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（asd）、アスパルトキナーゼI（thrA）、ホモセリンキナーゼ（homoserine kinase）（thrB）、スレオニンシンターゼ（threonine synthase）（thrC）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（アスパラギン酸トランスアミナーゼ）（aspC）が挙げられる。これらの酵素の中では、アスパルトキナーゼIII、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、アスパルトキナーゼI、ホモセリンキナーゼ、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、及びスレオニンシンターゼから選択される１またはそれ以上の酵素の活性を増強するのが好ましい。Ｌ−スレオニン生合成系遺伝子は、スレオニン分解が抑制された株に導入してもよい。

Ｌ−スレオニン生合成系酵素の活性は、最終産物のＬ−スレオニンによって阻害される。従って、Ｌ−スレオニン生産菌を構築するためには、Ｌ−スレオニンによるフィードバック阻害を受けないようにＬ−スレオニン生合成系遺伝子を改変するのが好ましい。上記thrA、thrB、thrC遺伝子は、スレオニンオペロンを構成しており、スレオニンオペロンは、アテニュエーター構造を形成している。スレオニンオペロンの発現は、培養液中のイソロイシン、スレオニンに阻害を受け、アテニュエーションにより抑制される。スレオニンオペロンの発現の増強は、アテニュエーション領域のリーダー配列あるいはアテニュエーターを除去することにより達成できる（Lynn, S. P., Burton, W. S., Donohue, T. J., Gould, R. M., Gumport, R. I., and Gardner, J. F. J. Mol. Biol. 194:59-69 (1987); WO02/26993; WO2005/049808; WO2005/049808; WO2003/097839参照）。

スレオニンオペロンの上流には固有のプロモーターが存在するが、同プロモーターを非天然のプロモーターに置換してもよい（WO98/04715号パンフレット参照）。また、スレオニン生合成関与遺伝子がラムダファ−ジのリプレッサーおよびプロモーターの制御下で発現するようにスレオニンオペロンを構築してもよい（欧州特許第0593792号明細書参照）。また、Ｌ−スレオニンによるフィードバック阻害を受けないように改変された細菌は、Ｌ−スレオニンアナログであるα-amino-β-hydroxyvaleric acid（AHV）に耐性な菌株を選抜することによっても取得できる。

このようにＬ−スレオニンによるフィードバック阻害を受けないように改変されたスレオニンオペロンは、コピー数の上昇により、あるいは強力なプロモーターに連結されることにより、宿主内での発現量が向上しているのが好ましい。コピー数の上昇は、スレオニンオペロンを含むプラスミドを宿主に導入することにより達成できる。また、コピー数の上昇は、トランスポゾン、Muファ−ジ等を利用して、宿主のゲノム上にスレオニンオペロンを転移させることによっても達成できる。

E. coliのアスパルトキナーゼホモセリンデヒドロゲナーゼＩをコードするthrA遺伝子は明らかにされている(ヌクレオチド番号337〜2799, GenBank accession NC_000913.2, gi: 49175990)。thrA遺伝子は、E. coli K-12の染色体において、thrL遺伝子とthrB遺伝子との間に位置する。Escherichia coliのホモセリンキナーゼをコードするthrB遺伝子は明らかにされている(ヌクレオチド番号2801〜3733, GenBank accession NC_000913.2, gi: 49175990)。thrB遺伝子は、E. coli K-12の染色体において、thrA遺伝子とthrC遺伝子との間に位置する。E. coliのスレオニンシンターゼをコードするthrC遺伝子は明らかにされている(ヌクレオチド番号3734〜5020, GenBank accession NC_000913.2, gi: 49175990)。thrC遺伝子は、E. coli K-12の染色体において、thrB遺伝子とyaaXオープンリーディングフレームとの間に位置する。また、スレオニンによるフィードバック阻害に耐性のアスパルトキナーゼホモセリンデヒドロゲナーゼＩをコードする変異型thrA遺伝子と野生型thrBC遺伝子を含むthrA*BCオペロンは、スレオニン生産株E. coli VKPM B-3996に存在する周知のプラスミドpVIC40（米国特許第5,705,371号）から取得できる。

E. coliのrhtA遺伝子は、グルタミン輸送系の要素をコードするglnHPQ オペロンに近いE. coli染色体の18分に存在する。rhtA遺伝子は、ORF1 (ybiF遺伝子, ヌクレオチド番号764〜1651, GenBank accession number AAA218541, gi:440181)と同一であり、pexB遺伝子とompX遺伝子との間に位置する。ORF1によりコードされるタンパク質を発現するユニットは、rhtA遺伝子と呼ばれている(rht: resistant to homoserine and threonine（ホモセリン及びスレオニンに耐性）)。また、高濃度のスレオニン又はホモセリンへの耐性を付与するrhtA23変異が、ATG開始コドンに対して-1位のG→A置換であることが判明している(ABSTRACTS of the 17th International Congress of Biochemistry and Molecular Biology in conjugation with Annual Meeting of the American Society for Biochemistry and Molecular Biology, San Francisco, California August 24-29, 1997, abstract No. 457, EP 1013765 A)。

E. coliのasd遺伝子は既に明らかにされており(ヌクレオチド番号3572511〜3571408, GenBank accession NC_000913.1, gi:16131307)、その遺伝子の塩基配列に基づいて作製されたプライマーを用いるPCRにより取得できる(White, T.J. et al., Trends Genet., 5, 185 (1989)参照)。他の微生物のasd遺伝子も同様に得ることができる。

また、E. coliのaspC遺伝子も既に明らかにされており(ヌクレオチド番号983742〜984932, GenBank accession NC_000913.1, gi:16128895)、その遺伝子の塩基配列に基づいて作製されたプライマーを用いるPCRにより得ることができる。他の微生物のaspC遺伝子も同様に得ることができる。

また、Ｌ−スレオニン生産能を有するコリネ型細菌としては、例えば、Corynebacterium acetoacidophilum AJ12318 (FERM BP-1172) (米国特許第5,188,949号参照) が挙げられる。

＜Ｌ−リジン生産菌＞
Ｌ−リジン生産菌又はそれを誘導するための親株としては、Ｌ−リジン生合成系酵素から選択される１またはそれ以上の酵素の活性が増強された株が挙げられる。そのような酵素としては、特に制限されないが、ジヒドロジピコリン酸シンターゼ（dihydrodipicolinate synthase）（dapA）、アスパルトキナーゼIII（aspartokinase III）（lysC）、ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ（dihydrodipicolinate reductase）（dapB）、ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼ（diaminopimelate decarboxylase）（lysA）、ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ（diaminopimelate dehydrogenase）（ddh）（米国特許第6,040,160号）、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ（phosphoenolpyrvate carboxylase）（ppc）、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（aspartate semialdehyde dehydrogenease）（asd）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（aspartate aminotransferase）（アスパラギン酸トランスアミナーゼ（aspartate transaminase））（aspC）、ジアミノピメリン酸エピメラーゼ（diaminopimelate epimerase）（dapF）、テトラヒドロジピコリン酸スクシニラーゼ（tetrahydrodipicolinate succinylase）（dapD）、スクシニルジアミノピメリン酸デアシラーゼ（succinyl-diaminopimelate deacylase）（dapE）、及びアスパルターゼ（aspartase）（aspA）（EP 1253195 A）が挙げられる。これらの酵素の中では、例えば、ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ、ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼ、ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、ジアミノピメリン酸エピメラーゼ、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、テトラヒドロジピコリン酸スクシニラーゼ、及びスクシニルジアミノピメリン酸デアシラーゼから選択される１またはそれ以上の酵素の活性を増強するのが好ましい。また、Ｌ−リジン生産菌又はそれを誘導するための親株では、エネルギー効率に関与する遺伝子（cyo）（EP 1170376 A）、ニコチンアミドヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼ（nicotinamide nucleotide transhydrogenase）をコードする遺伝子（pntAB）（米国特許第5,830,716号）、ybjE遺伝子（WO2005/073390）、またはこれらの組み合わせの発現レベルが増大していてもよい。アスパルトキナーゼIII（lysC）はＬ−リジンによるフィードバック阻害を受けるので、同酵素の活性を増強するには、Ｌ−リジンによるフィードバック阻害が解除されたアスパルトキナーゼIIIをコードする変異型lysC遺伝子を利用してもよい（米国特許5,932,453号明細書）。また、ジヒドロジピコリン酸合成酵素（dapA）Ｌ−リジンによるフィードバック阻害を受けるので、同酵素の活性を増強するには、Ｌ−リジンによるフィードバック阻害が解除されたジヒドロジピコリン酸合成酵素をコードする変異型dapA遺伝子を利用してもよい。

また、Ｌ−リジン生産菌又はそれを誘導するための親株としては、Ｌ−リジンの生合成経路から分岐してＬ−リジン以外の化合物を生成する反応を触媒する酵素から選択される１またはそれ以上の酵素の活性が低下または欠損している株も挙げられる。そのような酵素としては、特に制限されないが、ホモセリンデヒドロゲナーゼ（homoserine dehydrogenase）、リジンデカルボキシラーゼ（lysine decarboxylase）（米国特許第5,827,698号）、及びリンゴ酸酵素（malic enzyme）（WO2005/010175）が挙げられる。

また、Ｌ−リジン生産菌又はそれを誘導するための親株としては、Ｌ−リジンアナログに耐性を有する変異株も挙げられる。Ｌ−リジンアナログは腸内細菌科の細菌やコリネ型細菌等の細菌の生育を阻害するが、この阻害は、Ｌ−リジンが培地に共存するときには完全にまたは部分的に解除される。Ｌ−リジンアナログとしては、特に制限されないが、オキサリジン、リジンヒドロキサメート、Ｓ−（２−アミノエチル）−Ｌ−システイン（AEC）、γ−メチルリジン、α−クロロカプロラクタムが挙げられる。これらのリジンアナログに対して耐性を有する変異株は、細菌を通常の人工変異処理に付すことによって得ることができる。

また、Ｌ−リジン生産能を有するコリネ型細菌として、具体的には、例えば、AEC耐性変異株（Corynebacterium glutamicum (Brevibacterium lactofermentum) AJ11082（NRRL B-11470）株など；特公昭56-1914号公報、特公昭56-1915号公報、特公昭57-14157号公報、特公昭57-14158号公報、特公昭57-30474号公報、特公昭58-10075号公報、特公昭59-4993号公報、特公昭61-35840号公報、特公昭62-24074号公報、特公昭62-36673号公報、特公平5-11958号公報、特公平7-112437号公報、特公平7-112438号公報参照）；その生育にＬ−ホモセリン等のアミノ酸を必要とする変異株（特公昭48-28078号公報、特公昭56-6499号公報参照）；AECに耐性を示し、更にＬ−ロイシン、Ｌ−ホモセリン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−アラニン、Ｌ−バリン等のアミノ酸を要求する変異株（米国特許第3708395号及び第3825472号明細書参照）；ＤＬ−α−アミノ−ε−カプロラクタム、α−アミノ−ラウリルラクタム、アスパラギン酸アナログ、スルファ剤、キノイド、Ｎ−ラウロイルロイシンに耐性を示す変異株；オキザロ酢酸デカルボキシラーゼ阻害剤または呼吸系酵素阻害剤に対する耐性を示す変異株（特開昭50-53588号公報、特開昭50-31093号公報、特開昭52-102498号公報、特開昭53-9394号公報、特開昭53-86089号公報、特開昭55-9783号公報、特開昭55-9759号公報、特開昭56-32995号公報、特開昭56-39778号公報、特公昭53-43591号公報、特公昭53-1833号公報）；イノシトールまたは酢酸を要求する変異株（特開昭55-9784号公報、特開昭56-8692号公報）；フルオロピルビン酸または34℃以上の温度に対して感受性を示す変異株（特開昭55-9783号公報、特開昭53-86090号公報）；エチレングリコールに耐性を示す変異株（米国特許第4411997号明細書）が挙げられる。

＜Ｌ−アルギニン生産菌＞
Ｌ−アルギニン生産菌又はそれを誘導するための親株としては、Ｌ−アルギニン生合成系酵素から選択される１またはそれ以上の酵素の活性が増強された株が挙げられる。そのような酵素としては、特に制限されないが、Ｎ−アセチルグルタミン酸シンターゼ（argA）、Ｎ−アセチルグルタミルフォスフェートレダクターゼ（argC）、オルニチンアセチルトランスフェラーゼ（argJ）、Ｎ−アセチルグルタメートキナーゼ（argB）、アセチルオルニチントランスアミナーゼ（argD）、オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ（argF）、アルギノコハク酸シンテターゼ（argG）、アルギノコハク酸リアーゼ（argH）、カルバモイルフォスフェートシンテターゼ（carAB）が挙げられる。Ｎ−アセチルグルタミン酸シンターゼ（argA）遺伝子としては、例えば、野生型の１５位〜１９位に相当するアミノ酸残基が置換され、Ｌ−アルギニンによるフィードバック阻害が解除された変異型Ｎ−アセチルグルタミン酸シンターゼをコードする遺伝子を用いると好適である（欧州出願公開1170361号明細書）。

また、Ｌ−アルギニン生産菌又はそれを誘導するための親株としては、アミノ酸アナログなどへの耐性を有する株も挙げられる。そのような株としては、例えば、２−チアゾールアラニン耐性に加えて、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−プロリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−メチオニン、またはＬ−トリプトファン要求性を有するコリネ型細菌株（特開昭54-44096号公報）；ケトマロン酸、フルオロマロン酸、又はモノフルオロ酢酸に耐性を有するコリネ型細菌株（特開昭57-18989号公報）；アルギニノールに耐性を有するコリネ型細菌株（特公昭62-24075号公報）；Ｘ−グアニジン（Ｘは脂肪酸又は脂肪鎖の誘導体）に耐性を有するコリネ型細菌株（特開平2-186995号公報）；アルギニンヒドロキサメート及び６−アザウラシルに耐性を有するコリネ型細菌株（特開昭57-150381号公報）が挙げられる。Ｌ−アルギニン生産能を有するコリネ型細菌の具体例としては、下記のような菌株が挙げられる。
Corynebacterium glutamicum (Brevibacterium flavum) AJ11169（FERM BP-6892）
Corynebacterium glutamicum (Brevibacterium lactofermentum) AJ12092（FERM BP-6906）
Corynebacterium glutamicum (Brevibacterium flavum) AJ11336（FERM BP-6893）
Corynebacterium glutamicum (Brevibacterium flavum) AJ11345（FERM BP-6894）
Corynebacterium glutamicum (Brevibacterium lactofermentum) AJ12430（FERM BP-2228）

＜Ｌ−シトルリン生産菌およびＬ−オルニチン生産菌＞
Ｌ−シトルリンおよびＬ−オルニチンは、Ｌ−アルギニンと生合成経路が共通している。よって、Ｎ−アセチルグルタミン酸シンターゼ（argA）、Ｎ−アセチルグルタミルリン酸レダクターゼ（argC）、オルニチンアセチルトランスフェラーゼ（argJ）、N-アセチルグルタミン酸キナーゼ（argB）、アセチルオルニチントランスアミナーゼ（argD）、および／またはアセチルオルニチンデアセチラーゼ（argE）の酵素活性を上昇させることによって、Ｌ−シトルリンおよび／またはＬ−オルニチンの生産能を付与または増強することができる（国際公開2006-35831号パンフレット）。

＜Ｌ−ヒスチジン生産菌＞
Ｌ−ヒスチジン生産菌又はそれを誘導するための親株としては、Ｌ−ヒスチジン生合成系酵素から選択される１またはそれ以上の酵素の活性が増強された株が挙げられる。そのような酵素としては、特に制限されないが、ＡＴＰホスホリボシルトランスフェラーゼ（hisG）、ホスホリボシル−ＡＭＰサイクロヒドロラーゼ（hisI）、ホスホリボシル−ＡＴＰピロホスホヒドロラーゼ（hisI）、ホスホリボシルフォルミミノ−５−アミノイミダゾールカルボキサミドリボタイドイソメラーゼ（hisA）、アミドトランスフェラーゼ（hisH）、ヒスチジノールフォスフェイトアミノトランスフェラーゼ（hisC）、ヒスチジノールフォスファターゼ（hisB）、ヒスチジノールデヒドロゲナーゼ（hisD）が挙げられる。

これらの内、hisG及びhisBHAFIにコードされるＬ−ヒスチジン生合成系酵素は、Ｌ−ヒスチジンにより阻害されることが知られている。従って、Ｌ−ヒスチジン生産能は、例えば、ＡＴＰホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子（hisG）にフィードバック阻害への耐性を付与する変異を導入することにより、付与または増強させることができる(ロシア特許第2003677号及び第2119536号)。

＜Ｌ−システイン生産菌＞
Ｌ−システイン生産菌又はそれを誘導するための親株としては、Ｌ−システイン生合成系酵素から選択される１またはそれ以上の酵素の活性が増強された株が挙げられる。そのような酵素としては、特に制限されないが、セリンアセチルトランスフェラーゼや３−ホスホグリセレートデヒドロゲナーゼが挙げられる。セリンアセチルトランスフェラーゼ活性は、例えば、システインによるフィードバック阻害に耐性の変異型セリンアセチルトランスフェラーゼをコードする変異型cysE遺伝子を細菌に導入することにより増強できる。変異型セリンアセチルトランスフェラーゼは、例えば、特開平11-155571や米国特許公開第20050112731に開示されている。また、３−ホスホグリセレートデヒドロゲナーゼ活性は、例えば、セリンによるフィードバック阻害に耐性の変異型３−ホスホグリセレートデヒドロゲナーゼをコードする変異型serA遺伝子を細菌に導入することにより増強できる。変異型３−ホスホグリセレートデヒドロゲナーゼは、例えば、米国特許第6,180,373号に開示されている。

また、Ｌ−システイン生産菌又はそれを誘導するための親株としては、Ｌ−システインの生合成経路から分岐してＬ−システイン以外の化合物を生成する反応を触媒する酵素から選択される１またはそれ以上の酵素の活性が低下または欠損している株も挙げられる。そのような酵素としては、例えば、Ｌ−システインの分解に関与する酵素が挙げられる。Ｌ−システインの分解に関与する酵素としては、特に制限されないが、システインデスルフヒドラーゼ（aecD）（特開2002-233384）が挙げられる。

また、Ｌ−システイン生産菌又はそれを誘導するための親株としては、Ｌ−システイン排出系が増強された株や硫酸塩／チオ硫酸塩輸送系が増強された株も挙げられる。Ｌ−システイン排出系のタンパク質としては、ydeD遺伝子にコードされるタンパク質（特開2002-233384）、yfiK遺伝子にコードされるタンパク質（特開2004-49237）、emrAB、emrKY、yojIH、acrEF、bcr、およびcusAの各遺伝子にコードされる各タンパク質（特開2005-287333）、yeaS遺伝子にコードされるタンパク質（特開2010-187552）が挙げられる。硫酸塩／チオ硫酸塩輸送系のタンパク質としては、cysPTWAM遺伝子クラスターにコードされるタンパク質が挙げられる。

また、Ｌ−システイン生産能を有するコリネ型細菌としては、Ｌ−システインによるフィードバック阻害が低減されたセリンアセチルトランスフェラーゼを保持することにより、細胞内のセリンアセチルトランスフェラーゼ活性が上昇したコリネ型細菌（特開2002-233384）が挙げられる。

＜Ｌ−メチオニン生産菌＞
Ｌ−メチオニン生産菌又はそれを誘導するための親株としては、Ｌ−スレオニン要求株や、ノルロイシンに耐性を有する変異株が挙げられる(特開2000-139471)。また、Ｌ−メチオニン生産菌又はそれを誘導するための親株としては、Ｌ−メチオニンによるフィードバック阻害に対して耐性をもつ変異型ホモセリントランスサクシニラーゼを保持する株も挙げられる（特開2000-139471、US20090029424）。なお、Ｌ−メチオニンはＬ−システインを中間体として生合成されるため、Ｌ−システインの生産能の向上によりＬ−メチオニンの生産能も向上させることができる（特開2000-139471、US20080311632）。

＜Ｌ−ロイシン生産菌＞
Ｌ−ロイシン生産菌又はそれを誘導するための親株としては、Ｌ−ロイシン生合成系酵素から選択される１またはそれ以上の酵素の活性が増強された株が挙げられる。そのような酵素としては、特に制限されないが、leuABCDオペロンの遺伝子にコードされる酵素が挙げられる。また、酵素活性の増強には、例えば、Ｌ−ロイシンによるフィードバック阻害が解除されたイソプロピルマレートシンターゼをコードする変異leuA遺伝子(米国特許第6,403,342号)が好適に利用できる。

Ｌ−ロイシン生産能を有するコリネ型細菌としては、例えば、２−チアゾールアラニン及びβ−ハイドロキシロイシンに耐性で、且つイソロイシン及びメチオニン要求性である、Corynebacterium glutamicum (Brevibacterium lactofermentum) AJ3718（FERM P-2516）が挙げられる。

＜Ｌ−イソロイシン生産菌＞
Ｌ−イソロイシン生産能を付与又は増強するための方法としては、例えば、Ｌ−イソロイシン生合成系酵素から選択される１またはそれ以上の酵素の活性が増大するように細菌を改変する方法が挙げられる。そのような酵素としては、特に制限されないが、スレオニンデアミナーゼやアセトヒドロキシ酸シンターゼが挙げられる（特開平2-458号, FR 0356739, 及び米国特許第5,998,178号）。

Ｌ−イソロイシン生産能を有するコリネ型細菌としては、分岐鎖アミノ酸排出タンパク質をコードするbrnE遺伝子を増幅したコリネ型細菌（特開2001-169788）、Ｌ−リジン生産菌とのプロトプラスト融合によりＬ−イソロイシン生産能を付与したコリネ型細菌（特開昭62-74293）、ホモセリンデヒドロゲナーゼを強化したコリネ型細菌（特開昭62-91193）、スレオニンハイドロキサメート耐性株（特開昭62-195293）、α-ケトマロン耐性株（特開昭61-15695）、メチルリジン耐性株（特開昭61-15696）、Corynebacterium glutamicum (Brevibacterium flavum) AJ12149（FERM BP-759）（米国特許第4,656,135号）が挙げられる。

＜Ｌ−バリン生産菌＞
Ｌ−バリン生産菌又はそれを誘導するための親株としては、Ｌ−バリン生合成系酵素から選択される１またはそれ以上の酵素の活性が増強された株が挙げられる。そのような酵素としては、特に制限されないが、ilvGMEDAオペロンやilvBNCオペロンの遺伝子にコードされる酵素が挙げられる。ilvBNはアセトヒドロキシ酸シンターゼを、ilvCはイソメロリダクターゼ（国際公開00/50624号）を、それぞれコードする。なお、ilvGMEDAオペロンおよびilvBNCオペロンは、Ｌ−バリン、Ｌ−イソロイシン、および／またはＬ−ロイシンによる発現抑制（アテニュエーション）を受ける。よって、酵素活性の増強のためには、アテニュエーションに必要な領域を除去または改変し、生成するＬ−バリンによる発現抑制を解除するのが好ましい。また、ilvA遺伝子がコードするスレオニンデアミナーゼは、Ｌ−イソロイシン生合成系の律速段階であるＬ−スレオニンから２−ケト酪酸への脱アミノ化反応を触媒する酵素である。よって、Ｌ−バリン生産のためには、ilvA遺伝子が破壊等され、スレオニンデアミナーゼ活性が減少しているのが好ましい。

また、Ｌ−バリン生産菌又はそれを誘導するための親株としては、Ｌ−バリンの生合成経路から分岐してＬ−バリン以外の化合物を生成する反応を触媒する酵素から選択される１またはそれ以上の酵素の活性が低下した株も挙げられる。そのような酵素としては、特に制限されないが、Ｌ−ロイシン合成に関与するスレオニンデヒドラターゼやＤ−パントテン酸合成に関与する酵素が挙げられる（国際公開00/50624号）。

また、Ｌ−バリン生産菌又はそれを誘導するための親株としては、アミノ酸アナログなどへの耐性を有する株も挙げられる。そのような株としては、例えば、Ｌ−イソロイシンおよびＬ−メチオニン要求性、ならびにＤ−リボース、プリンリボヌクレオシド、またはピリミジンリボヌクレオシドに耐性を有し、且つＬ−バリン生産能を有するコリネ型細菌株（FERM P-1841、FERM P-29、特公昭53-025034）、ポリケトイド類に耐性を有するコリネ型細菌株（FERM P-1763、FERM P-1764、特公平06-065314）、酢酸を唯一の炭素源とする培地でＬ−バリン耐性を示し、且つグルコースを唯一の炭素源とする培地でピルビン酸アナログ(フルオロピルビン酸等)に感受性を有するコリネ型細菌株（FERM BP-3006、FERM BP-3007、特許3006929号）が挙げられる。

＜Ｌ−アラニン生産菌＞
Ｌ−アラニン生産菌又はそれを誘導するための親株としては、H⁺-ATPaseを欠失しているコリネ型細菌（Appl Microbiol Biotechnol. 2001 Nov;57(4):534-40）やアスパラギン酸β−デカルボキシラーゼ活性が増強されたコリネ型細菌（特開平07-163383）が挙げられる。

＜Ｌ−トリプトファン生産菌、Ｌ−フェニルアラニン生産菌、Ｌ−チロシン生産菌＞
Ｌ−トリプトファン生産能、Ｌ−フェニルアラニン生産能、および／またはＬ−チロシン生産能を付与又は増強するための方法としては、例えば、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−フェニルアラニン、および／またはＬ−チロシンの生合成系酵素から選択される１またはそれ以上の酵素の活性が増大するように細菌を改変する方法が挙げられる。

これらの芳香族アミノ酸に共通する生合成系酵素としては、特に制限されないが、３−デオキシ−Ｄ−アラビノヘプツロン酸−７−リン酸シンターゼ（aroG）、３−デヒドロキネートシンターゼ（aroB）、シキミ酸デヒドロゲナーゼ（aroE）、シキミ酸キナーゼ（aroL）、５−エノール酸ピルビルシキミ酸３−リン酸シンターゼ（aroA）、コリスミ酸シンターゼ（aroC）が挙げられる（欧州特許763127号）。これらの酵素をコードする遺伝子の発現はチロシンリプレッサー（tyrR）によって制御されており、tyrR遺伝子を欠損させることによって、これらの酵素の活性を増強してもよい（欧州特許763127号）。

Ｌ−トリプトファン生合成系酵素としては、特に制限されないが、アントラニル酸シンターゼ（trpE）、トリプトファンシンターゼ（trpAB）、及びホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ（serA）が挙げられる。例えば、トリプトファンオペロンを含むＤＮＡを導入することにより、Ｌ−トリプトファン生産能を付与又は増強できる。トリプトファンシンターゼは、それぞれtrpA及びtrpB遺伝子によりコードされるα及びβサブユニットからなる。アントラニル酸シンターゼはＬ−トリプトファンによるフィードバック阻害を受けるので、同酵素の活性を増強するには、フィードバック阻害を解除する変異を導入した同酵素をコードする遺伝子を利用してもよい。ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼはＬ−セリンによるフィードバック阻害を受けるので、同酵素の活性を増強するには、フィードバック阻害を解除する変異を導入した同酵素をコードする遺伝子を利用してもよい。さらに、マレートシンターゼ（aceB）、イソクエン酸リアーゼ（aceA）、およびイソクエン酸デヒドロゲナーゼキナーゼ／フォスファターゼ（aceK）からなるオペロン（aceオペロン）の発現を増大させることによりＬ−トリプトファン生産能を付与または増強してもよい(WO2005/103275)。

Ｌ−フェニルアラニン生合成系酵素としては、特に制限されないが、コリスミ酸ムターゼ及びプレフェン酸デヒドラターゼが挙げられる。コリスミ酸ムターゼ及びプレフェン酸デヒドラターゼは、２機能酵素としてpheA遺伝子によってコードされている。コリスミ酸ムターゼ−プレフェン酸デヒドラターゼはＬ−フェニルアラニンによるフィードバック阻害を受けるので、同酵素の活性を増強するには、フィードバック阻害を解除する変異を導入した同酵素をコードする遺伝子を利用してもよい。

Ｌ−チロシン生合成系酵素としては、特に制限されないが、コリスミ酸ムターゼ及びプレフェン酸デヒドロゲナーゼが挙げられる。コリスミ酸ムターゼ及びプレフェン酸デヒドロゲナーゼは、２機能酵素としてtyrA遺伝子によってコードされている。コリスミ酸ムターゼ−プレフェン酸デヒドロゲナーゼはＬ−チロシンによるフィードバック阻害を受けるので、同酵素の活性を増強するには、フィードバック阻害を解除する変異を導入した同酵素をコードする遺伝子を利用してもよい。

Ｌ−トリプトファン、Ｌ−フェニルアラニン、および／またはＬ−チロシンの生産菌は、目的の芳香族アミノ酸以外の芳香族アミノ酸の生合成が低下するように改変されていてもよい。また、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−フェニルアラニン、および／またはＬ−チロシンの生産菌は、副生物の取り込み系が増強されるように改変されていてもよい。副生物としては、目的の芳香族アミノ酸以外の芳香族アミノ酸が挙げられる。副生物の取り込み系をコードする遺伝子としては、例えば、Ｌ−トリプトファンの取り込み系をコードする遺伝子であるtnaBやmtr、Ｌ−フェニルアラニンの取り込み系をコードする遺伝子であるpheP、Ｌ−チロシンの取り込み系をコードする遺伝子であるtyrPが挙げられる（EP1484410）。

Ｌ−トリプトファン生産能を有するコリネ型細菌としては、サルファグアニジンに耐性のCorynebacterium glutamicum AJ12118（FERM BP-478 特許01681002号）、トリプトファンオペロンが導入された株（特開昭63240794号公報）、コリネ型細菌由来のシキミ酸キナーゼをコードする遺伝子が導入された株（特開01994749号公報）が挙げられる。

Ｌ−フェニルアラニン生産能を有するコリネ型細菌としては、例えば、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼまたはピルビン酸キナーゼ活性が低下したCorynebacterium glutamicum BPS-13株 (FERM BP-1777)、Corynebacterium glutamicum K77 (FERM BP-2062)、Corynebacterium glutamicum K78 (FERM BP-2063)（欧州特許公開公報331145号、特開平 02-303495号）、チロシン要求性株（特開平05-049489）が挙げられる。

Ｌ−チロシン生産能を有するコリネ型細菌としては、例えば、Corynebacterium glutamicum AJ11655 (FERM P-5836)（特公平2-6517）、Corynebacterium glutamicum (Brevibacterium lactofermentum) AJ12081 (FERM P-7249)（特開昭60-70093）が挙げられる。

また、Ｌ−アミノ酸生産能を付与または増強する方法としては、例えば、細菌の細胞からＬ−アミノ酸を排出する活性が増大するように細菌を改変する方法が挙げられる。Ｌ−アミノ酸を排出する活性は、例えば、Ｌ−アミノ酸を排出するタンパク質をコードする遺伝子の発現を上昇させることにより、増大させることができる。各種アミノ酸を排出するタンパク質をコードする遺伝子としては、例えば、b2682遺伝子（ygaZ）、b2683遺伝子（ygaH）、b1242遺伝子（ychE）、b3434遺伝子（yhgN）が挙げられる（特開2002-300874号公報）。

また、Ｌ−アミノ酸生産能を付与または増強する方法としては、例えば、糖代謝に関与するタンパク質やエネルギー代謝に関与するタンパク質の活性が増大するように細菌を改変する方法が挙げられる。

糖代謝に関与するタンパク質としては、糖の取り込みに関与するタンパク質や解糖系酵素が挙げられる。糖代謝に関与するタンパク質をコードする遺伝子としては、グルコース６−リン酸イソメラーゼ遺伝子（pgi；国際公開第01/02542号パンフレット）、ホスホエノールピルビン酸シンターゼ遺伝子（pps；欧州出願公開877090号明細書）、ホスホエノ−ルピルビン酸カルボキシラ−ゼ遺伝子（ppc；国際公開95/06114号パンフレット)、ピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子（pyc；国際公開99/18228号パンフレット、欧州出願公開1092776号明細書）、ホスホグルコムターゼ遺伝子（pgm；国際公開03/04598号パンフレット）、フルクトース二リン酸アルドラーゼ遺伝子（pfkB, fbp；国際公開03/04664号パンフレット）、ピルビン酸キナーゼ遺伝子（pykF；国際公開03/008609号パンフレット）、トランスアルドラーゼ遺伝子（talB；国際公開03/008611号パンフレット）、フマラーゼ遺伝子（fum；国際公開01/02545号パンフレット）、non-PTSスクロース取り込み遺伝子遺伝子（csc；欧州出願公開149911号パンフレット）、スクロース資化性遺伝子（scrABオペロン；国際公開第90/04636号パンフレット）が挙げられる。

エネルギー代謝に関与するタンパク質をコードする遺伝子としては、トランスヒドロゲナーゼ遺伝子（pntAB；米国特許 5,830,716号明細書）、チトクロムbo型オキシダーゼ（cytochromoe bo type oxidase）遺伝子(cyoB；欧州特許出願公開1070376号明細書)が挙げられる。

なお、上記のＬ−アミノ酸生産菌の育種に使用される遺伝子は、コードされるタンパク質の機能が損なわれない限り、上記例示した遺伝子や公知の塩基配列を有する遺伝子に限られず、そのバリアントであってもよい。例えば、Ｌ−アミノ酸生産菌の育種に使用される遺伝子は、公知のタンパク質のアミノ酸配列において、１若しくは数個の位置での１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子であってもよい。遺伝子やタンパク質のバリアントについては、後述するリン酸トランスポーター遺伝子およびリン酸トランスポーターのバリアントに関する記載を準用できる。

＜１−２＞リン酸トランスポーター活性の増強
本発明の細菌は、リン酸トランスポーター活性が増大するように改変されている。本発明の細菌は、Ｌ−アミノ酸生産能を有するコリネ型細菌を、リン酸トランスポーター活性が増大するように改変することにより取得できる。また、本発明の細菌は、リン酸トランスポーター活性が増大するようにコリネ型細菌を改変した後に、Ｌ−アミノ酸生産能を付与または増強することによっても得ることができる。なお、本発明の細菌は、リン酸トランスポーター活性が増大するように改変されたことにより、Ｌ−アミノ酸生産能を獲得したものであってもよい。本発明の細菌を構築するための改変は、任意の順番で行うことができる。

以下に、リン酸トランスポーターおよびそれをコードする遺伝子について説明する。

本発明において、「リン酸トランスポーター」とは、リン酸トランスポーター活性を有するタンパク質をいう。本発明において、「リン酸トランスポーター活性」とは、無機リン酸（Ｐｉ）を細胞外から細胞内に取り込む活性をいう。

リン酸トランスポーターとしては、低親和性の無機リン酸トランスポーター（low-affinity inorganic phosphate transporter；Ｐｉｔ）系や高親和性のリン酸特異的トランスポーター（high-affinity phosphate-specific transporter；Ｐｓｔ）系が挙げられる。リン酸トランスポーターをコードする遺伝子（「リン酸トランスポーター遺伝子」ともいう）としては、Ｐｉｔ系をコードするpitA遺伝子やpitB遺伝子、Ｐｓｔ系をコードするpstSCAB遺伝子が挙げられる（非特許文献１）。なお、Ｐｓｔ系は、４つのタンパク質（pstSCAB遺伝子の産物）の複合体として機能する。

本発明においては、Ｐｉｔ系とＰｓｔ系のいずれの活性を増大させてもよい。本発明においては、Ｐｉｔ系の活性を増大させるのが好ましく、pitA遺伝子産物であるPitAタンパク質の活性を増大させるのがより好ましい。

エシェリヒア・コリK12 MG1655株のpitA遺伝子は、ＮＣＢＩデータベースに、GenBank accession NC_000913 (VERSION NC_000913.2 GI:49175990)として登録されているゲノム配列中、3635665〜3637164位の配列に相当する。エシェリヒア・コリK12 MG1655株のpitA遺伝子は、ECK3478、JW3460と同義である。また、エシェリヒア・コリK12 MG1655株のPitAタンパク質は、GenBank accession NP_417950 (version NP_417950.1 GI:16131365、locus_tag="b3493")として登録されている。MG1655株のpitA遺伝子の塩基配列、及び同遺伝子がコードするPitAタンパク質のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号１および２に示す。

Pantoea ananatis LMG20103株のpitA遺伝子は、ＮＣＢＩデータベースに、GenBank accession NC_013956 (VERSION NC_013956.2 GI:332139403)として登録されているゲノム配列中、1397898〜1399514位の配列の相補配列に相当する。また、Pantoea ananatis LMG20103株のPitAタンパク質は、GenBank accession YP_003519531 (version YP_003519531.1 GI:291616789、locus_tag="PANA_1236")として登録されている。Pantoea ananatis LMG20103株のpitA遺伝子の塩基配列、及び同遺伝子がコードするPitAタンパク質のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号３および４に示す。

Corynebacterium glutamicum ATCC13032のpitA遺伝子は、ＮＣＢＩデータベースに、GenBank accession NC_003450 (VERSION NC_003450.3 GI:58036263)として登録されているゲノム配列中、481391〜482776位の配列の相補配列に相当する。Corynebacterium glutamicum ATCC13032のpitA遺伝子は、Cgl0460と同義である。また、Corynebacterium glutamicum ATCC13032のPitAタンパク質は、GenBank accession NP_599707 (version NP_599707.1 GI:19551705、locus_tag="NCgl0445")として登録されている。Corynebacterium glutamicum ATCC13032のpitA遺伝子の塩基配列、及び同遺伝子がコードするPitAタンパク質のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号２５および２６に示す。また、Corynebacterium glutamicum 2256 (ATCC 13869)のpitA遺伝子の塩基配列、及び同遺伝子がコードするPitAタンパク質のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号５および６に示す。

リン酸トランスポーターは、リン酸トランスポーター活性を有する限り、上記リン酸トランスポーター、例えば各種PitAタンパク質、のバリアントであってもよい。なお、そのようなバリアントを「保存的バリアント」という場合がある。保存的バリアントとしては、例えば、上記リン酸トランスポーター、例えば各種PitAタンパク質、のホモログや人為的な改変体が挙げられる。

上記PitAタンパク質のホモログをコードする遺伝子は、例えば、上記pitA遺伝子の塩基配列（配列番号１、３、５、または２５）を問い合わせ配列として用いたBLAST検索やFASTA検索によって公開データベースから容易に取得することができる。また、上記PitAタンパク質のホモログをコードする遺伝子は、例えば、細菌や酵母の染色体を鋳型にして、これら公知の遺伝子配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いたＰＣＲにより取得することができる。

リン酸トランスポーターの保存的バリアントをコードする遺伝子は、例えば、以下のような遺伝子であってよい。すなわち、リン酸トランスポーター遺伝子は、リン酸トランスポーター活性を有するタンパク質をコードする限りにおいて、上記アミノ酸配列において、１若しくは数個の位置での１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、又は付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子であってもよい。この場合、リン酸トランスポーター活性は、１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、又は付加される前のタンパク質に対して、通常70%以上、好ましくは80%以上、より好ましくは90%以上が維持され得る。なお上記「１又は数個」とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置やアミノ酸残基の種類によっても異なるが、具体的には、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個、特に好ましくは１〜３個を意味する。

上記の１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、または付加は、タンパク質の機能が正常に維持される保存的変異である。保存的変異の代表的なものは、保存的置換である。保存的置換とは、置換部位が芳香族アミノ酸である場合には、Phe、Trp、Tyr間で、置換部位が疎水性アミノ酸である場合には、Leu、Ile、Val間で、極性アミノ酸である場合には、Gln、Asn間で、塩基性アミノ酸である場合には、Lys、Arg、His間で、酸性アミノ酸である場合には、Asp、Glu間で、ヒドロキシル基を持つアミノ酸である場合には、Ser、Thr間でお互いに置換する変異である。保存的置換とみなされる置換としては、具体的には、AlaからSer又はThrへの置換、ArgからGln、His又はLysへの置換、AsnからGlu、Gln、Lys、His又はAspへの置換、AspからAsn、Glu又はGlnへの置換、CysからSer又はAlaへの置換、GlnからAsn、Glu、Lys、His、Asp又はArgへの置換、GluからGly、Asn、Gln、Lys又はAspへの置換、GlyからProへの置換、HisからAsn、Lys、Gln、Arg又はTyrへの置換、IleからLeu、Met、Val又はPheへの置換、LeuからIle、Met、Val又はPheへの置換、LysからAsn、Glu、Gln、His又はArgへの置換、MetからIle、Leu、Val又はPheへの置換、PheからTrp、Tyr、Met、Ile又はLeuへの置換、SerからThr又はAlaへの置換、ThrからSer又はAlaへの置換、TrpからPhe又はTyrへの置換、TyrからHis、Phe又はTrpへの置換、及び、ValからMet、Ile又はLeuへの置換が挙げられる。また、上記のようなアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、または逆位等には、遺伝子が由来する生物の個体差、種の違いに基づく場合などの天然に生じる変異（mutant又はvariant）によって生じるものも含まれる。

さらに、上記のような保存的変異を有する遺伝子は、上記アミノ酸配列全体に対して、80%以上、好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、さらに好ましくは97%以上、特に好ましくは99%以上の相同性を有し、かつ、リン酸トランスポーター活性を有するタンパク質をコードする遺伝子であってもよい。尚、本明細書において、「相同性」（homology）は、「同一性」（identity）を意味する。

また、リン酸トランスポーター遺伝子は、公知の遺伝子配列から調製され得るプローブ、例えば上記塩基配列の全体または一部に対する相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、リン酸トランスポーター活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡであってもよい。「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。一例を示せば、相同性が高いＤＮＡ同士、例えば80%以上、好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、より好ましくは97%以上、特に好ましくは99%以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いＤＮＡ同士がハイブリダイズしない条件、あるいは通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である60℃、1×SSC、0.1% SDS、好ましくは60℃、0.1×SSC、0.1% SDS、より好ましくは、68℃、0.1×SSC、0.1% SDSに相当する塩濃度および温度で、１回、好ましくは２〜３回洗浄する条件を挙げることができる。

上述の通り、上記ハイブリダイゼーションに用いるプローブは、遺伝子の相補配列の一部であってもよい。そのようなプローブは、公知の遺伝子配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプライマーとし、これらの塩基配列を含むDNA断片を鋳型とするPCRによって作製することができる。例えば、プローブとしては、300 bp程度の長さのDNA断片を用いることができる。より具体的には、プローブとして、300 bp程度の長さのDNA断片を用いる場合には、ハイブリダイゼーションの洗いの条件としては、50℃、2×SSC、0.1% SDSが挙げられる。

また、リン酸トランスポーター遺伝子は、リン酸トランスポーター活性を有するタンパク質をコードする限り、任意のコドンがそれと等価のコドンに置換されたものであってもよい。例えば、リン酸トランスポーター遺伝子は、使用する宿主のコドン使用頻度に応じて最適なコドンを有するように改変されたものであってもよい。

２つの配列間の配列同一性のパーセンテージは、例えば、数学的アルゴリズムを用いて決定できる。このような数学的アルゴリズムの限定されない例としては、Myers 及び Miller (1988) CABIOS 4:11 17のアルゴリズム、Smith et al (1981) Adv. Appl. Ｍath. 2:482の局所ホモロジーアルゴリズム、Needleman及びWunsch (1970) J. Ｍol. Biol. 48:443 453のホモロジーアライメントアルゴリズム、Pearson及びLipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85:2444 2448の類似性を検索する方法、Karlin 及びAltschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873 5877に記載されているような、改良された、Karlin及びAltschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 872264のアルゴリズムが挙げられる。

これらの数学的アルゴリズムに基づくプログラムを利用して、配列同一性を決定するための配列比較（アラインメント）を行うことができる。プログラムは、適宜、コンピュータにより実行することができる。このようなプログラムとしては、特に限定されないが、ＰＣ／ＧｅｎｅプログラムのＣＬＵＳＴＡＬ（Intelligenetics, Mountain View, Calif.から入手可能）、ＡＬＩＧＮプログラム（Version 2.0）、並びにWisconsin Genetics Software Package, Version 8（Genetics Computer Group (GCG), 575 Science Drive, Madison, Wis., USAから入手可能）のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、及びＴＦＡＳＴＡが挙げられる。これらのプログラムを用いたアライメントは、例えば、初期パラメーターを用いて行うことができる。ＣＬＵＳＴＡＬプログラムについては、Higgins et al. (1988) Gene 73:237 244 (1988)、Higgins et al. (1989) CABIOS 5:151 153、Corpet et al. (1988) Nucleic Acids Res. 16:10881 90、Huang et al. (1992) CABIOS 8:155 65、及びPearson et al. (1994) Meth. Mol. Biol. 24:307 331によく記載されている。

対象のタンパク質をコードするヌクレオチド配列と相同性があるヌクレオチド配列を得るために、具体的には、例えば、ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索を、ＢＬＡＳＴＮプログラム、スコア＝１００、ワード長＝１２にて行うことができる。対象のタンパク質と相同性があるアミノ酸配列を得るために、具体的には、例えば、ＢＬＡＳＴタンパク質検索を、ＢＬＡＳＴＸプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３にて行うことができる。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索やＢＬＡＳＴタンパク質検索については、http://www.ncbi.nlm.nih.govを参照されたい。また、比較を目的としてギャップを加えたアライメントを得るために、Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ（BLAST 2.0）を利用できる。また、ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ (BLAST 2.0)を、配列間の離間した関係を検出する反復検索を行うのに利用できる。Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴおよびＰＳＩ−ＢＬＡＳＴについては、Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389を参照されたい。ＢＬＡＳＴ、Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ、またはＰＳＩ−ＢＬＡＳＴを利用する場合、例えば、各プログラム（例えば、ヌクレオチド配列に対してＢＬＡＳＴＮ、アミノ酸配列に対してＢＬＡＳＴＸ）の初期パラメーターが用いられ得る。アライメントは、手動にて行われてもよい。

２つの配列間の配列同一性は、２つの配列を最大一致となるように整列したときに２つの配列間で一致する残基の比率として算出される。

なお、上記の遺伝子やタンパク質のバリアントに関する記載は、Ｌ−アミノ酸生合成系酵素等の任意のタンパク質、およびそれらをコードする遺伝子にも準用できる。

＜１−３＞タンパク質の活性を増大させる手法
以下に、タンパク質の活性を増大させる手法について説明する。

「タンパク質の活性が増大する」とは、同タンパク質の細胞当たりの活性が野生株や親株等の非改変株に対して増大していることを意味する。なお、「タンパク質の活性が増大する」ことを、「タンパク質の活性が増強される」ともいう。「タンパク質の活性が増大する」とは、具体的には、非改変株と比較して、同タンパク質の細胞当たりの分子数が増加していること、および／または、同タンパク質の分子当たりの機能が増大していることをいう。すなわち、「タンパク質の活性が増大する」という場合の「活性」とは、タンパク質の触媒活性に限られず、タンパク質をコードする遺伝子の転写量（ｍＲＮＡ量）または翻訳量（タンパク質の量）を意味してもよい。タンパク質の活性は、非改変株と比較して増大していれば特に制限されないが、例えば、非改変株と比較して、１．５倍以上、２倍以上、または３倍以上に上昇してよい。また、「タンパク質の活性が増大する」とは、もともと標的のタンパク質の活性を有する菌株において同タンパク質の活性を増大させることだけでなく、もともと標的のタンパク質の活性が存在しない菌株に同タンパク質の活性を付与することを含む。また、結果としてタンパク質の活性が増大する限り、宿主が本来有する標的のタンパク質の活性を弱化および／または欠損させた上で、好適な同タンパク質を導入してもよい。

タンパク質の活性が増大するような改変は、例えば、同タンパク質をコードする遺伝子の発現を上昇させることによって達成される。なお、「遺伝子の発現が上昇する」ことを、「遺伝子の発現が増強される」ともいう。遺伝子の発現は、例えば、非改変株と比較して、１．５倍以上、２倍以上、または３倍以上に上昇してよい。また、「遺伝子の発現が上昇する」とは、もともと標的の遺伝子が発現している菌株において同遺伝子の発現量を上昇させることだけでなく、もともと標的の遺伝子が発現していない菌株において、同遺伝子を発現させることを含む。すなわち、「遺伝子の発現が上昇する」とは、例えば、標的の遺伝子を保持しない菌株に同遺伝子を導入し、同遺伝子を発現させることを含む。

遺伝子の発現の上昇は、例えば、遺伝子のコピー数を増加させることにより達成できる。

遺伝子のコピー数の増加は、宿主の染色体へ同遺伝子を導入することにより達成できる。染色体への遺伝子の導入は、例えば、相同組み換えを利用して行うことができる（MillerI, J. H. Experiments in Molecular Genetics, 1972, Cold Spring Harbor Laboratory）。遺伝子は、１コピーのみ導入されてもよく、２コピーまたはそれ以上導入されてもよい。例えば、染色体上に多数のコピーが存在する配列を標的として相同組み換えを行うことで、染色体へ遺伝子の多数のコピーを導入することができる。染色体上に多数のコピーが存在する配列としては、反復DNA配列（repetitive DNA）、トランスポゾンの両端に存在するインバーテッド・リピートが挙げられる。また、Ｌ−アミノ酸生産に不要な遺伝子等の染色体上の適当な配列を標的として相同組み換えを行ってもよい。相同組み換えは、例えば、Redドリブンインテグレーション(Red-driven integration)法（Datsenko, K. A, and Wanner, B. L. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 97:6640-6645 (2000)）等の直鎖状ＤＮＡを用いる方法、温度感受性複製起点を含むプラスミドを用いる方法、接合伝達可能なプラスミドを用いる方法、宿主内で機能する複製起点を持たないスイサイドベクターを用いる方法、またはファージを用いたtransduction法により行うことができる。また、遺伝子は、トランスポゾンやMini-Muを用いて染色体上にランダムに導入することもできる（特開平2-109985号公報、US5,882,888、EP805867B1）。

染色体上に標的遺伝子が導入されたことの確認は、同遺伝子の全部又は一部と相補的な配列を持つプローブを用いたサザンハイブリダイゼーション、又は同遺伝子の配列に基づいて作成したプライマーを用いたPCR等によって確認できる。

また、遺伝子のコピー数の増加は、標的遺伝子を含むベクターを宿主に導入することによっても達成できる。例えば、標的遺伝子を含むＤＮＡ断片を、宿主で機能するベクターと連結して同遺伝子の発現ベクターを構築し、当該発現ベクターで宿主を形質転換することにより、同遺伝子のコピー数を増加させることができる。標的遺伝子を含むＤＮＡ断片は、例えば、標的遺伝子を有する微生物のゲノムＤＮＡを鋳型とするＰＣＲにより取得できる。ベクターとしては、宿主の細胞内において自律複製可能なベクターを用いることができる。ベクターは、マルチコピーベクターであるのが好ましい。また、形質転換体を選択するために、ベクターは抗生物質耐性遺伝子などのマーカーを有することが好ましい。ベクターは、例えば、細菌プラスミド由来のベクター、酵母プラスミド由来のベクター、バクテリオファージ由来のベクター、コスミド、またはファージミド等であってよい。コリネ型細菌で自律複製可能なベクターとして、具体的には、例えば、pHM1519(Agric, Biol. Chem., 48, 2901-2903(1984))；pAM330（Agric. Biol. Chem., 48, 2901-2903(1984)）；これらを改良した薬剤耐性遺伝子を有するプラスミド；特開平3-210184号公報に記載のプラスミドpCRY30；特開平2-72876号公報及び米国特許5,185,262号明細書公報に記載のプラスミドpCRY21、pCRY2KE、pCRY2KX、pCRY31、pCRY3KE及びpCRY3KX；特開平1-191686号公報に記載のプラスミドpCRY2およびpCRY3；特開昭58-192900号公報に記載のpAJ655、pAJ611及びpAJ1844；特開昭57-134500号公報に記載のpCG1；特開昭58-35197号公報に記載のpCG2；特開昭５7-183799号公報に記載のpCG4およびpCG11が挙げられる。

遺伝子を導入する場合、遺伝子は、発現可能に本発明の細菌に保持されていればよい。具体的には、遺伝子は、本発明の細菌で機能するプロモーター配列による制御を受けて発現するように導入されていればよい。プロモーターは、宿主由来のプロモーターであってもよく、異種由来のプロモーターであってもよい。プロモーターは、導入する遺伝子の固有のプロモーターであってもよく、他の遺伝子のプロモーターであってもよい。プロモーターとしては、例えば、後述するような、より強力なプロモーターを利用してもよい。

また、２またはそれ以上の遺伝子を導入する場合、各遺伝子が、発現可能に本発明の細菌に保持されていればよい。例えば、各遺伝子は、全てが単一の発現ベクター上に保持されていてもよく、全てが染色体上に保持されていてもよい。また、各遺伝子は、複数の発現ベクター上に別々に保持されていてもよく、単一または複数の発現ベクター上と染色体上とに別々に保持されていてもよい。また、２またはそれ以上の遺伝子でオペロンを構成して導入してもよい。

導入される遺伝子は、宿主で機能するタンパク質をコードするものであれば特に制限されない。導入される遺伝子は、宿主由来の遺伝子であってもよく、異種由来の遺伝子であってもよい。

また、遺伝子の発現の上昇は、遺伝子の転写効率を向上させることにより達成できる。遺伝子の転写効率の向上は、例えば、染色体上の遺伝子のプロモーターをより強力なプロモーターに置換することにより達成できる。「より強力なプロモーター」とは、遺伝子の転写が、もともと存在している野生型のプロモーターよりも向上するプロモーターを意味する。また、コリネ型細菌で利用できるより強力なプロモーターとしては、人為的に設計変更されたP54-6プロモーター（Appl.Microbiol.Biotechnolo., 53, 674-679(2000)）、コリネ型細菌内で酢酸、エタノール、ピルビン酸等で誘導できるpta、aceA、aceB、adh、amyEプロモーター、コリネ型細菌内で発現量が多い強力なプロモーターであるcspB、SOD、tufプロモーター（Journal of Biotechnology 104 (2003) 311-323, Appl Environ Microbiol. 2005 Dec;71(12):8587-96.）、lacプロモーター、tacプロモーター、trcプロモーターが挙げられる。また、より強力なプロモーターとしては、各種レポーター遺伝子を用いることにより、在来のプロモーターの高活性型のものを取得してもよい。例えば、プロモーター領域内の-35、-10領域をコンセンサス配列に近づけることにより、プロモーターの活性を高めることができる（国際公開第00/18935号）。プロモーターの強度の評価法および強力なプロモーターの例は、Goldsteinらの論文（Prokaryotic promoters in biotechnology. Biotechnol. Annu. Rev., 1, 105-128 (1995)）等に記載されている。

また、遺伝子の発現の上昇は、遺伝子の翻訳効率を向上させることにより達成できる。遺伝子の翻訳効率の向上は、例えば、染色体上の遺伝子のシャインダルガノ（ＳＤ）配列（リボソーム結合部位（ＲＢＳ）ともいう）をより強力なＳＤ配列に置換することにより達成できる。「より強力なＳＤ配列」とは、ｍＲＮＡの翻訳が、もともと存在している野生型のＳＤ配列よりも向上するＳＤ配列を意味する。より強力なＳＤ配列としては、例えば、ファージＴ７由来の遺伝子１０のＲＢＳが挙げられる(Olins P. O. et al, Gene, 1988, 73, 227-235)。さらに、ＲＢＳと開始コドンとの間のスペーサー領域、特に開始コドンのすぐ上流の配列(5'-UTR)における数個のヌクレオチドの置換、あるいは挿入、あるいは欠失がｍＲＮＡの安定性および翻訳効率に非常に影響を及ぼすことが知られており、これらを改変することによっても遺伝子の翻訳効率を向上させることができる。

本発明においては、プロモーター、ＳＤ配列、およびＲＢＳと開始コドンとの間のスペーサー領域等の遺伝子の発現に影響する部位を総称して「発現調節領域」ともいう。発現調節領域は、プロモーター検索ベクターやＧＥＮＥＴＹＸ等の遺伝子解析ソフトを用いて決定することができる。これら発現調節領域の改変は、例えば、温度感受性ベクターを用いた方法や、Ｒｅｄドリブンインテグレーション法（WO2005/010175）により行うことができる。

遺伝子の翻訳効率の向上は、例えば、コドンの改変によっても達成できる。例えば、遺伝子の異種発現を行う場合等には、遺伝子中に存在するレアコドンを、より高頻度で利用される同義コドンに置き換えることにより、遺伝子の翻訳効率を向上させることができる。コドンの置換は、例えば、ＤＮＡの目的の部位に目的の変異を導入する部位特異的変異法により行うことができる。また、コドンが置換された遺伝子断片を全合成してもよい。種々の生物におけるコドンの使用頻度は、「コドン使用データベース」（http://www.kazusa.or.jp/codon; Nakamura, Y. et al, Nucl. Acids Res., 28, 292 (2000)）に開示されている。

また、遺伝子の発現の上昇は、遺伝子の発現を上昇させるようなレギュレーターを増幅すること、または、遺伝子の発現を低下させるようなレギュレーターを欠失または弱化させることによっても達成できる。

上記のような遺伝子の発現を上昇させる手法は、単独で用いてもよく、任意の組み合わせで用いてもよい。

また、酵素活性が増大するような改変は、例えば、酵素の比活性を増強することによっても達成できる。比活性が増強された酵素は、例えば、種々の生物を探索し取得することができる。また、在来の酵素に変異を導入することで高活性型のものを取得してもよい。比活性の増強は、単独で用いてもよく、上記のような遺伝子の発現を増強させる手法と任意に組み合わせて用いてもよい。

リン酸トランスポーターの活性は、例えば、「特定の変異」を有するリン酸トランスポーターをコードするリン酸トランスポーター遺伝子を宿主に保持させることによっても増大させることができる。本発明においては、当該「特定の変異」を有するリン酸トランスポーターを変異型リン酸トランスポーター、それをコードする遺伝子を変異型リン酸トランスポーター遺伝子ともいう。また、本発明においては、当該「特定の変異」を有さないリン酸トランスポーターを野生型リン酸トランスポーター、それをコードする遺伝子を野生型リン酸トランスポーター遺伝子ともいう。当該「特定の変異」を有する変異型リン酸トランスポーターは、野生型リン酸トランスポーターと比較して、高い比活性を有するものであってよい。

野生型リン酸トランスポーターとしては、「特定の変異」を有さないPitAタンパク質（野生型PitAタンパク質）が挙げられる。変異型リン酸トランスポーターとしては、「特定の変異」を有するPitAタンパク質（変異型PitAタンパク質）が挙げられる。野生型PitAタンパク質をコードする遺伝子を野生型pitA遺伝子、変異型PitAタンパク質をコードする遺伝子を変異型pitA遺伝子ともいう。野生型PitAタンパク質としては、上記例示した各種PitAタンパク質や、その保存的バリアントであって「特定の変異」を有さないものが挙げられる。すなわち、変異型リン酸トランスポーターは、「特定の変異」を有する以外は、例えば上記例示した各種PitAタンパク質およびその保存的バリアントから選択されるいずれかのタンパク質と同一であってよい。

具体的には、例えば、変異型リン酸トランスポーターは、「特定の変異」を有する以外は、配列番号２、４、６、または２６に示すアミノ酸配列を有するタンパク質であってよい。また、具体的には、例えば、変異型リン酸トランスポーターは、「特定の変異」を有する以外は、配列番号２、４、６、または２６に示すアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、又は付加を含むアミノ酸配列を有するタンパク質であってよい。また、具体的には、例えば、変異型リン酸トランスポーターは、「特定の変異」を有する以外は、配列番号２、４、６、または２６に示すアミノ酸配列に対して、８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９７％以上、特に好ましくは９９％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質であってよい。尚、本明細書において、「相同性」とは、「同一性」を意味する。

また、言い換えると、変異型リン酸トランスポーターは、上記例示した各種PitAタンパク質において、「特定の変異」を有し、且つ、当該「特定の変異」以外の箇所にさらに保存的変異を含むバリアントであってよい。

具体的には、例えば、変異型リン酸トランスポーターは、配列番号２、４、６、または２６に示すアミノ酸配列において、「特定の変異」を有し、且つ、当該「特定の変異」以外の箇所にさらに１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、又は付加を含むアミノ酸配列を有するタンパク質であってよい。

なお上記「１又は数個」とは、具体的には、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個、特に好ましくは１〜３個を意味する。上記の１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、または付加は、タンパク質の機能が正常に維持される保存的変異である。保存的変異の代表的なものは、保存的置換である。保存的置換とは、置換部位が芳香族アミノ酸である場合には、Phe、Trp、Tyr間で、置換部位が疎水性アミノ酸である場合には、Leu、Ile、Val間で、極性アミノ酸である場合には、Gln、Asn間で、塩基性アミノ酸である場合には、Lys、Arg、His間で、酸性アミノ酸である場合には、Asp、Glu間で、ヒドロキシル基を持つアミノ酸である場合には、Ser、Thr間でお互いに置換する変異である。保存的置換とみなされる置換としては、具体的には、AlaからSer又はThrへの置換、ArgからGln、His又はLysへの置換、AsnからGlu、Gln、Lys、His又はAspへの置換、AspからAsn、Glu又はGlnへの置換、CysからSer又はAlaへの置換、GlnからAsn、Glu、Lys、His、Asp又はArgへの置換、GluからGly、Asn、Gln、Lys又はAspへの置換、GlyからProへの置換、HisからAsn、Lys、Gln、Arg又はTyrへの置換、IleからLeu、Met、Val又はPheへの置換、LeuからIle、Met、Val又はPheへの置換、LysからAsn、Glu、Gln、His又はArgへの置換、MetからIle、Leu、Val又はPheへの置換、PheからTrp、Tyr、Met、Ile又はLeuへの置換、SerからThr又はAlaへの置換、ThrからSer又はAlaへの置換、TrpからPhe又はTyrへの置換、TyrからHis、Phe又はTrpへの置換、及び、ValからMet、Ile又はLeuへの置換が挙げられる。また、上記のようなアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、または逆位等には、遺伝子が由来する生物の個体差、種の違いに基づく場合などの天然に生じる変異（mutant又はvariant）によって生じるものも含まれる。

「特定の変異」としては、例えば、配列番号６の２４６位のフェニルアラニン残基に相当するアミノ酸残基がフェニルアラニン以外のアミノ酸残基に置換される変異が挙げられる。置換後のアミノ酸残基はフェニルアラニン以外のアミノ酸で天然型アミノ酸であればいずれのアミノ酸でもよく、リジン、グルタミン酸、チロシン、バリン、イソロイシン、セリン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン、アルギニン、システイン、メチオニン、トリプトファン、グリシン、アラニン、ヒスチジンから選択されるが、特にセリンが好ましい。

アミノ酸配列における「Ｘ位」とは、同アミノ酸配列のＮ末端から数えてＸ番目の位置を意味し、Ｎ末端のアミノ酸残基が１位のアミノ酸残基である。なお、アミノ酸残基の位置は相対的な位置を示すものであって、アミノ酸の欠失、挿入、付加などによってその絶対的な位置は前後することがある。すなわち、「配列番号６の２４６位のフェニルアラニン残基に相当するアミノ酸残基」とは、配列番号６において２４６位よりもＮ末端側の１アミノ酸残基が欠失している場合は、Ｎ末端から数えて２４５番目のアミノ酸残基を意味する。また、「配列番号６の２４６位のフェニルアラニン残基に相当するアミノ酸残基」とは、配列番号６において２４６位よりもＮ末端側に１アミノ酸残基挿入されている場合は、Ｎ末端から数えて２４７番目のアミノ酸残基を意味する。

任意のアミノ酸配列において、いずれのアミノ酸残基が「配列番号６の２４６位のフェニルアラニン残基に相当するアミノ酸残基」であるかは、当該任意のアミノ酸配列と配列番号６のアミノ酸配列とでアライメントを行うことにより決定できる。アライメントは、例えば、公知の遺伝子解析ソフトウェアを利用して行うことができる。具体的なソフトウェアとしては、日立ソリューションズ製のDNASISや、ゼネティックス製のGENETYXなどが挙げられる（Elizabeth C. Tyler et al., Computers and Biomedical Research, 24(1), 72-96, 1991；Barton GJ et al., Journal of molecular biology, 198(2), 327-37. 1987）。

なお、本発明において、野生型リン酸トランスポーターが配列番号６に示すアミノ酸配列以外のアミノ酸配列を有する場合には、「配列番号６の２４６位のフェニルアラニン残基に相当するアミノ酸残基」はフェニルアラニン残基でないことがあり得る。すなわち、例えば、「配列番号６の２４６位のフェニルアラニン残基に相当するアミノ酸残基がセリン残基に置換される変異」には、野生型酸性リン酸トランスポーターにおいて配列番号６に示すアミノ酸配列における２４６位のフェニルアラニン残基に相当するアミノ酸残基がフェニルアラニン残基である場合に、当該フェニルアラニン残基をセリン残基に置換する変異に限られず、野生型酸性リン酸トランスポーターにおいて配列番号６に示すアミノ酸配列における２４６位のフェニルアラニン残基に相当するアミノ酸残基がフェニルアラニン残基およびセリン残基以外のいずれかのアミノ酸残基である場合に、当該アミノ酸残基をセリン残基に置換する変異も含まれる。

変異型リン酸トランスポーター遺伝子は、野生型リン酸トランスポーター遺伝子を、コードされるリン酸トランスポーターが「特定の変異」を有するよう改変することにより取得できる。野生型リン酸トランスポーター遺伝子は、変異型リン酸トランスポーター遺伝子を導入する宿主由来の遺伝子であってもよく、異種由来の遺伝子であってもよい。ＤＮＡの改変は公知の手法により行うことができる。具体的には、例えば、ＤＮＡの目的部位に目的の変異を導入する部位特異的変異法としては、PCRを用いる方法（Higuchi, R., 61, in PCR technology, Erlich, H. A. Eds., Stockton press (1989)；Carter, P., Meth. in Enzymol., 154, 382 (1987)）や、ファージを用いる方法（Kramer,W. and Frits, H. J., Meth. in Enzymol., 154, 350 (1987)；Kunkel, T. A. et al., Meth. in Enzymol., 154, 367 (1987)）が挙げられる。また、変異型リン酸トランスポーター遺伝子は、化学合成によっても取得できる。

変異型リン酸トランスポーター遺伝子をコリネ型細菌に導入することにより、コリネ型細菌に変異型リン酸トランスポーター遺伝子を保持させることができる。変異型リン酸トランスポーター遺伝子をコリネ型細菌に導入する手法は特に制限されず、従来知られた方法を用いることができる。例えば、上述した遺伝子のコピー数を増加させる手法と同様にして、変異型リン酸トランスポーター遺伝子をコリネ型細菌に導入することができる。また、自然変異や変異原処理により、コリネ型細菌が有する野生型リン酸トランスポーター遺伝子を、コードされるリン酸トランスポーターが「特定の変異」を有するよう改変してもよい。本発明の細菌が変異型リン酸トランスポーター遺伝子を保持する場合、本発明の細菌は、野生型リン酸トランスポーター遺伝子を有していてもよく、有していなくともよい。本発明の細菌は、１またはそれ以上のコピーの変異型リン酸トランスポーター遺伝子を有していてよい。

形質転換の方法は特に限定されず、従来知られた方法を用いることができる。例えば、エシェリヒア・コリ K-12について報告されているような、受容菌細胞を塩化カルシウムで処理してDNAの透過性を増す方法（Mandel, M. and Higa, A.,J. Mol. Biol. 1970, 53, 159-162）や、バチルス・ズブチリスについて報告されているような、増殖段階の細胞からコンピテントセルを調製してDNAを導入する方法（Duncan, C. H., Wilson, G. A. and Young, F. E.., 1997. Gene 1: 153-167）を用いることができる。あるいは、バチルス・ズブチリス、放線菌類、及び酵母について知られているような、DNA受容菌の細胞を、組換えDNAを容易に取り込むプロトプラストまたはスフェロプラストの状態にして組換えDNAをDNA受容菌に導入する方法（Chang, S.and Choen, S.N., 1979.Mol. Gen. Genet. 168: 111-115; Bibb, M. J., Ward, J. M. and Hopwood, O. A. 1978.Nature 274: 398-400; Hinnen, A., Hicks, J. B. and Fink, G. R. 1978. Proc. Natl.Acad. Sci. USA 75: 1929-1933）も応用できる。さらに、コリネ型細菌について報告されている電気パルス法（特開平2-207791）を利用することができる。

タンパク質の活性が増大したことは、同タンパク質の活性を測定することで確認できる。リン酸トランスポーター活性は、例えば、公知の手法により無機リン酸の取り込みを測定することにより測定できる（R. M. Harris et al., Journal of Bacteriology, Sept. 2001, p5008-5014）。

タンパク質の活性が増大したことは、同タンパク質をコードする遺伝子の発現が上昇したことを確認することによっても、確認できる。遺伝子の発現が上昇したことは、同遺伝子の転写量が上昇したことを確認することや、同遺伝子から発現するタンパク質の量が上昇したことを確認することにより確認できる。

遺伝子の転写量が上昇したことの確認は、同遺伝子から転写されるmRNAの量を野生株または親株等の非改変株と比較することによって行うことができる。mRNAの量を評価する方法としてはノーザンハイブリダイゼーション、RT-PCR等が挙げられる(Sambrook, J., et al., Molecular Cloning A Laboratory Manual/Third Edition, Cold spring Harbor Laboratory Press, Cold spring Harbor (USA), 2001）。mRNAの量は、非改変株と比較して、例えば、１．５倍以上、２倍以上、または３倍以上に上昇してよい。

タンパク質の量が上昇したことの確認は、抗体を用いてウェスタンブロットによって行うことができる（Molecular cloning(Cold spring Harbor Laboratory Press, Cold spring Harbor (USA), 2001)）。タンパク質の量は、非改変株と比較して、例えば、１．５倍以上、２倍以上、または３倍以上に上昇してよい。

上記したタンパク質の活性を増大させる手法は、リン酸トランスポーターの活性増強に加えて、任意のタンパク質、例えばＬ−アミノ酸生合成系酵素、の活性増強や、任意の遺伝子、例えばそれら任意のタンパク質をコードする遺伝子、の発現増強に利用できる。

＜１−４＞タンパク質の活性を低下させる手法
以下に、タンパク質の活性を低下させる手法について説明する。

「タンパク質の活性が低下する」とは、同タンパク質の細胞当たりの活性が野性株や親株等の非改変株と比較して減少していることを意味し、活性が完全に消失している場合を含む。「タンパク質の活性が低下する」とは、具体的には、非改変株と比較して、同タンパク質の細胞当たりの分子数が低下していること、および／または、同タンパク質の分子当たりの機能が低下していることをいう。すなわち、「タンパク質の活性が低下する」という場合の「活性」とは、タンパク質の触媒活性に限られず、タンパク質をコードする遺伝子の転写量（ｍＲＮＡ量）または翻訳量（タンパク質の量）を意味してもよい。なお、「タンパク質の細胞当たりの分子数が低下している」ことには、同タンパク質が全く存在していない場合が含まれる。また、「タンパク質の分子当たりの機能が低下している」ことには、同タンパク質の分子当たりの機能が完全に消失している場合が含まれる。タンパク質の活性は、非改変株と比較して低下していれば特に制限されないが、例えば、非改変株と比較して、５０％以下、２０％以下、１０％以下、５％以下、または０％に低下してよい。

タンパク質の活性が低下するような改変は、例えば、同タンパク質をコードする遺伝子の発現を低下させることにより達成される。「遺伝子の発現が低下する」ことには、同遺伝子が全く発現していない場合が含まれる。なお、「遺伝子の発現が低下する」ことを、「遺伝子の発現が弱化される」ともいう。遺伝子の発現は、例えば、非改変株と比較して、５０％以下、２０％以下、１０％以下、５％以下、または０％に低下してよい。

遺伝子の発現の低下は、例えば、転写効率の低下によるものであってもよく、翻訳効率の低下によるものであってもよく、それらの組み合わせによるものであってもよい。遺伝子の発現の低下は、例えば、遺伝子のプロモーターやシャインダルガノ（ＳＤ）配列等の発現調節配列を改変することにより達成できる。発現調節配列を改変する場合には、発現調節配列は、好ましくは１塩基以上、より好ましくは２塩基以上、特に好ましくは３塩基以上が改変される。また、発現調節配列の一部または全部を欠失させてもよい。また、遺伝子の発現の低下は、例えば、発現制御に関わる因子を操作することによっても達成できる。発現制御に関わる因子としては、転写や翻訳制御に関わる低分子（誘導物質、阻害物質など）、タンパク質（転写因子など）、核酸（siRNAなど）等が挙げられる。

また、タンパク質の活性が低下するような改変は、例えば、同タンパク質をコードする遺伝子を破壊することにより達成できる。遺伝子の破壊は、例えば、染色体上の遺伝子のコード領域の一部又は全部を欠損させることにより達成できる。さらには、染色体上の遺伝子の前後の配列を含めて、遺伝子全体を欠失させてもよい。タンパク質の活性の低下が達成できる限り、欠失させる領域は、Ｎ末端領域、内部領域、Ｃ末端領域等のいずれの領域であってもよい。通常、欠失させる領域は長い方が確実に遺伝子を不活化することができる。また、欠失させる領域の前後の配列は、リーディングフレームが一致しないことが好ましい。

また、遺伝子の破壊は、例えば、染色体上の遺伝子のコード領域にアミノ酸置換（ミスセンス変異）を導入すること、終止コドンを導入すること（ナンセンス変異）、あるいは１〜２塩基を付加または欠失するフレームシフト変異を導入すること等によっても達成できる（Journal of Biological Chemistry 272:8611-8617（1997） Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 95 5511-5515(1998), Journal of Biological Chemistry 26 116, 20833-20839(1991)）。

また、遺伝子の破壊は、例えば、染色体上の遺伝子のコード領域に他の配列を挿入することによっても達成できる。挿入部位は遺伝子のいずれの領域であってもよいが、挿入する配列は長い方が確実に遺伝子を不活化することができる。また、挿入部位の前後の配列は、リーディングフレームが一致しないことが好ましい。他の配列としては、コードされるタンパク質の活性を低下又は消失させるものであれば特に制限されないが、例えば、抗生物質耐性遺伝子等のマーカー遺伝子やＬ−アミノ酸生産に有用な遺伝子が挙げられる。

染色体上の遺伝子を上記のように改変することは、例えば、遺伝子の部分配列を欠失し、正常に機能するタンパク質を産生しないように改変した欠失型遺伝子を作製し、該欠失型遺伝子を含む組換えＤＮＡで宿主を形質転換して、欠失型遺伝子と染色体上の野生型遺伝子とで相同組換えを起こさせることにより、染色体上の野生型遺伝子を欠失型遺伝子に置換することによって達成できる。その際、組換えＤＮＡには、宿主の栄養要求性等の形質にしたがって、マーカー遺伝子を含ませておくと操作がしやすい。欠失型遺伝子によってコードされるタンパク質は、生成したとしても、野生型タンパク質とは異なる立体構造を有し、機能が低下又は消失する。このような相同組換えを利用した遺伝子置換による遺伝子破壊は既に確立しており、「Redドリブンインテグレーション(Red-driven integration)」と呼ばれる方法（Datsenko, K. A, and Wanner, B. L. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 97:6640-6645 (2000)）、Redドリブンインテグレーション法とλファージ由来の切り出しシステム（Cho, E. H., Gumport, R. I., Gardner, J. F. J. Bacteriol. 184: 5200-5203 (2002)）とを組み合わせた方法（WO2005/010175号参照）等の直鎖状ＤＮＡを用いる方法や、温度感受性複製起点を含むプラスミドを用いる方法、接合伝達可能なプラスミドを用いる方法、宿主内で機能する複製起点を持たないスイサイドベクターを用いる方法などがある（米国特許第6303383号、特開平05-007491号）。

また、タンパク質の活性が低下するような改変は、例えば、突然変異処理により行ってもよい。突然変異処理としては、Ｘ線もしくは紫外線の照射、またはＮ−メチル−Ｎ'−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＭＮＮＧ）、エチルメタンスルフォネート（ＥＭＳ）、メチルメタンスルフォネート（ＭＭＳ）等の変異剤による通常の変異処理が挙げられる。

タンパク質の活性が低下したことは、同タンパク質の活性を測定することで確認できる。

遺伝子の発現が低下したことは、同遺伝子の転写量が低下したことを確認することや、同遺伝子から発現するタンパク質の量が低下したことを確認することにより確認できる。

遺伝子の転写量が低下したことの確認は、同遺伝子から転写されるmRNAの量を非改変株と比較することによって行うことが出来る。mRNAの量を評価する方法としては、ノーザンハイブリダイゼーション、RT−PCR等が挙げられる（Molecular cloning（Cold spring Harbor Laboratory Press, Cold spring Harbor (USA), 2001））。mRNAの量は、非改変株と比較して、例えば、５０％以下、２０％以下、１０％以下、５％以下、または０％に低下してよい。

タンパク質の量が低下したことの確認は、抗体を用いてウェスタンブロットによって行うことが出来る（Molecular cloning（Cold spring Harbor Laboratory Press, Cold spring Harbor (USA), 2001））。タンパク質の量は、非改変株と比較して、例えば、５０％以下、２０％以下、１０％以下、５％以下、または０％に低下してよい。

遺伝子が破壊されたことは、破壊に用いた手段に応じて、同遺伝子の一部または全部の塩基配列、制限酵素地図、または全長等を決定することで確認できる。

上記したタンパク質の活性を低下させる手法は、任意のタンパク質、例えば目的のＬ−アミノ酸の生合成経路から分岐して目的のＬ−アミノ酸以外の化合物を生成する反応を触媒する酵素、の活性低下や、任意の遺伝子、例えばそれら任意のタンパク質をコードする遺伝子、の発現低下に利用できる。

＜２＞本発明のＬ−アミノ酸の製造方法
本発明の方法は、本発明の細菌を培地で培養すること、および該培地よりＬ−アミノ酸を採取すること、を含むＬ−アミノ酸の製造法である。

使用する培地は、本発明の細菌が増殖でき、目的のＬ−アミノ酸が生産される限り、特に制限されない。培地としては、例えば、コリネ型細菌等の細菌の培養に用いられる通常の培地を用いることができる。培地としては、例えば、炭素源、窒素源、リン酸源、硫黄源、その他の各種有機成分や無機成分から選択される成分を必要に応じて含有する培地を用いることができる。培地成分の種類や濃度は、使用する細菌の種類や製造するアミノ酸の種類等の諸条件に応じて適宜設定してよい。

炭素源として、具体的には、例えば、グルコース、フルクトース、スクロース、ラクトース、ガラクトース、キシロース、アラビノース、廃糖蜜、澱粉加水分解物、バイオマスの加水分解物等の糖類、酢酸、フマル酸、クエン酸、コハク酸等の有機酸類、グリセロール、粗グリセロール、エタノール等のアルコール類、脂肪酸類が挙げられる。炭素源としては、１種の炭素源を用いてもよく、２種またはそれ以上の炭素源を組み合わせて用いてもよい。

窒素源として、具体的には、例えば、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム等のアンモニウム塩、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、大豆タンパク質分解物等の有機窒素源、アンモニア、ウレアが挙げられる。pH調整に用いられるアンモニアガスやアンモニア水を窒素源として利用してもよい。窒素源としては、１種の窒素源を用いてもよく、２種またはそれ以上の窒素源を組み合わせて用いてもよい。

リン酸源として、具体的には、例えば、リン酸２水素カリウム、リン酸水素２カリウム等のリン酸塩、ピロリン酸等のリン酸ポリマーが挙げられる。リン酸源としては、１種のリン酸源を用いてもよく、２種またはそれ以上のリン酸源を組み合わせて用いてもよい。

硫黄源として、具体的には、例えば、硫酸塩、チオ硫酸塩、亜硫酸塩等の無機硫黄化合物、システイン、シスチン、グルタチオン等の含硫アミノ酸が挙げられる。硫黄源としては、１種の硫黄源を用いてもよく、２種またはそれ以上の硫黄源を組み合わせて用いてもよい。

その他の各種有機成分や無機成分として、具体的には、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム等の無機塩類；鉄、マンガン、マグネシウム、カルシウム等の微量金属類；ビタミンB1、ビタミンB2、ビタミンB6、ニコチン酸、ニコチン酸アミド、ビタミンB12等のビタミン類；アミノ酸類；核酸類；これらを含有するペプトン、カザミノ酸、酵母エキス、大豆タンパク質分解物等の有機成分が挙げられる。その他の各種有機成分や無機成分としては、１種の成分を用いてもよく、２種またはそれ以上の成分を組み合わせて用いてもよい。

また、生育にアミノ酸などを要求する栄養要求性変異株を使用する場合には、培地に要求される栄養素を補添することが好ましい。例えば、Ｌ−リジン生産菌は、Ｌ−リジン生合成経路が強化され、Ｌ−リジン分解能が弱化されている場合が多い。よって、そのようなＬ−リジン生産菌を培養する場合には、例えば、Ｌ−スレオニン、Ｌ−ホモセリン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−メチオニンから選ばれる１またはそれ以上のアミノ酸を培地に補添するのが好ましい。

また、例えば、コリネ型細菌によりＬ−グルタミン酸を製造する場合は、培地中のビオチン量を制限することや、培地に界面活性剤またはペニシリンを添加することが好ましい。

培養条件は、本発明の細菌が増殖でき、目的のＬ−アミノ酸が生産される限り、特に制限されない。培養は、例えば、コリネ型細菌等の細菌の培養に用いられる通常の条件で行うことができる。培養条件は、使用する細菌の種類や製造するアミノ酸の種類等の諸条件に応じて適宜設定してよい。

培養は、液体培地を用いて好気的に行うことができる。培養は、具体的には、通気培養または振盪培養で行うことができる。培養温度は、例えば、２０〜４０℃、好ましくは２５℃〜３７℃であってよい。培地のｐＨは、例えば、５〜８に調整されてよい。ｐＨ調整には、無機あるいは有機の酸性あるいはアルカリ性物質、またはアンモニアガス等を使用することができる。培養期間は、例えば、１５時間〜９０時間であってよい。培養は、回分培養（batch culture）、流加培養（Fed-batch culture）、連続培養（continuous culture）、またはそれらの組み合わせにより実施することができる。また、培養は、種培養と本培養とに分けて行われてもよい。その場合、種培養と本培養の培養条件は、同一であってもよく、そうでなくてもよい。例えば、種培養と本培養を、共に回分培養で行ってもよい。また、例えば、種培養を回分培養で行い、本培養を流加培養または連続培養で行ってもよい。このような条件下で本発明の細菌を培養することにより、培地中にＬ−アミノ酸が蓄積する。

また、Ｌ−グルタミン酸を製造する場合、Ｌ−グルタミン酸が析出する条件に調整された液体培地を用いて、培地中にＬ−グルタミン酸を析出させながら培養を行うことも出来る。Ｌ−グルタミン酸が析出する条件としては、例えば、ｐＨ５．０〜４．０、好ましくはｐＨ４．５〜４．０、さらに好ましくはｐＨ４．３〜４．０、特に好ましくはｐＨ４．０の条件が挙げられる（欧州特許出願公開第1078989号明細書）。

また、Ｌ−リジン等の塩基性アミノ酸を製造する場合、重炭酸イオン及び／又は炭酸イオンを塩基性アミノ酸の主なカウンタイオンとして利用して塩基性アミノ酸を発酵生産する方法を利用してもよい（特開2002-65287、US2002-0025564A、EP1813677A）。これらの方法によれば、塩基性アミノ酸のカウンタイオンとして従来利用されていた硫酸イオン及び／又は塩化物イオンの使用量を削減しつつ、塩基性アミノ酸を製造することができる。

発酵液からのＬ−アミノ酸の回収は、通常、イオン交換樹脂法（Nagai, H. et al., Separation Science and Technology, 39(16), 3691-3710）、沈殿法、膜分離法（特開平9-164323号、特開平9-173792号）、晶析法(WO2008/078448、WO2008/078646）、その他の公知の方法を組み合わせることにより実施できる。なお、菌体内にＬ−アミノ酸が蓄積する場合には、例えば、菌体を超音波などにより破砕し、遠心分離によって菌体を除去して得られる上清から、イオン交換樹脂法などによってＬ−アミノ酸を回収することができる。回収されるＬ−アミノ酸は、フリー体、その塩、またはそれらの混合物であってよい。塩としては、例えば、硫酸塩、塩酸塩、炭酸塩、アンモニウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩が挙げられる。例えば、Ｌ−グルタミン酸の場合、発酵液中のＬ−グルタミン酸アンモニウムを酸を加えて晶析させ、結晶に等モルの水酸化ナトリウムを添加することでＬ−グルタミン酸ナトリウム（ＭＳＧ）が得られる。なお、晶析前後に活性炭を加えて脱色してもよい（グルタミン酸ナトリウムの工業晶析 日本海水学会誌 56巻 5号 川喜田哲哉参照）。

また、Ｌ−アミノ酸が培地中に析出する場合は、遠心分離又は濾過等により回収することができる。また、培地中に析出したＬ−アミノ酸は、培地中に溶解しているＬ−アミノ酸を晶析した後に、併せて単離してもよい。

尚、回収されるＬ−アミノ酸は、Ｌ−アミノ酸以外に、細菌菌体、培地成分、水分、及び細菌の代謝副産物を含んでいてもよい。回収されたＬ−アミノ酸の純度は、例えば50％以上、好ましくは85％以上、特に好ましくは95%以上であってよい (JP1214636B, USP5,431,933, USP4,956,471, USP4,777,051, USP4,946,654, USP5,840,358, USP6,238,714, US2005/0025878))。

Ｌ−アミノ酸がＬ−グルタミン酸である場合、例えば、Ｌ−グルタミン酸ナトリウム結晶をうま味調味料として用いることができる。Ｌ−グルタミン酸ナトリウム結晶は、同様にうま味を有するグアニル酸ナトリウムやイノシン酸ナトリウム等の核酸と混合して調味料として用いてもよい。

なお、本発明の方法の一態様は、Ｌ−アミノ酸生産能を有するコリネ型細菌を培地で培養すること、および該培地よりＬ−アミノ酸を採取すること、を含むＬ−アミノ酸の製造法であって、前記細菌が、配列番号６の２４６位のフェニルアラニン残基に相当するアミノ酸残基がフェニルアラニン以外のアミノ酸残基に置換される変異を有するリン酸トランスポーターをコードする変異型ｐｉｔＡ遺伝子を保持していることを特徴とする方法である。

本発明の方法の当該態様については、上述した本発明の細菌や本発明の方法に関する記載を準用できる。例えば、当該態様においては、配列番号６の２４６位のフェニルアラニン残基に相当するアミノ酸残基が、セリン残基に置換されていることが好ましい。また、当該態様においては、コリネ型細菌が、コリネバクテリウム・グルタミカムであることが好ましい。また、当該態様においては、製造されるＬ−アミノ酸はいずれのアミノ酸でもよいが、Ｌ−グルタミン酸であることが好ましい。

本発明は以下の実施例によって、更に具体的に説明されるが、これらはいかなる意味でも本発明を限定する意図と解してはならない。

実施例１：pitA強化株を用いたGlu生産培養
本実施例では、pitA遺伝子の発現が増強されたC. glutamicumのGlu生産株を用いてGlu生産を行い、pitA遺伝子の発現増強がGlu生産に与える影響について評価した。

使用菌株は以下の通りである。
C. glutamicum 2256ΔldhAΔsucA yggB^*/pVK9
C. glutamicum 2256ΔldhAΔsucA yggB^*/pVK9-Plac-pitA

（１）菌株構築方法
C. glutamicum 2256株（ATCC 13869）を親株に用いて、以下の方法で、モデルGlu生産株として2256ΔldhAΔsucA yggB^*株を構築した。使用したプライマーを表１に示す。

まず、2256株の染色体DNAを鋳型としてプライマー1と2のペア、およびプライマー3と4のペアをそれぞれ用いて、ldhA遺伝子欠損用のDNA断片を増幅した。次に、増幅された2断片を等量混合したものを鋳型としてプライマー5と6を用いてPCRを行い、2断片の結合したDNA断片を得た。得られたDNA断片をSalIで処理して、pBS4S（WO2005/113745）のSalI部位に導入することでldhA欠損用プラスミドを構築した。このldhA欠損用プラスミドを2256株の染色体に挿入した後、脱落させることでldhA遺伝子を欠損させた。

次に、2256株の染色体DNAを鋳型としてプライマー7と8のペア、およびプライマー9と10のペアをそれぞれ用いてsucA遺伝子欠損用のDNA断片を増幅した。次に、増幅された2断片を等量混合したものを鋳型としてプライマー11と12を用いてPCRを行い、2断片の結合したDNA断片を得た。得られたDNA断片をBamHIで処理して、pBS3（WO2006/070944）のBamHI部位に導入することでsucA欠損用プラスミドを構築した。このsucA欠損用プラスミドを2256ΔldhA株の染色体に挿入した後、脱落させることでsucA遺伝子を欠損させた。得られたsucA欠損株のいくつかのバリアントをビオチン十分条件において培養し、Glu生産能を有する株を選抜した結果、yggB遺伝子にIS変異（V419::IS）の入ったGlu生産株を取得した。IS変異（V419::IS）が入ったyggB遺伝子の塩基配列、及び同遺伝子がコードするYggBタンパク質のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号２３および２４に示す。得られたGlu生産株を2256ΔldhAΔsucA yggB^*株とした。

pitA発現プラスミド(pVK9-Plac-pitA)を以下の方法で構築した。まず、2256株の染色体DNAを鋳型としてプライマー13と14を用いてpitA遺伝子断片を増幅した。次いで、増幅した断片をbamHIとpstIで処理したpVK9プラスミド（US2006-0141588）にin-fusion（TaKaRa INC.）を用いて連結し、pitA発現プラスミドを構築した。構築したpitA発現プラスミドをpVK9-Plac-pitAとした。

構築したpVK9-Plac-pitAとベクターコントロールとしてpVK9をそれぞれGlu生産菌2256ΔldhAΔsucA yggB^*株に導入して、2256ΔldhAΔsucA yggB^*/pVK9-Plac-pitA株および2256ΔldhAΔsucA yggB^*/pVK9株を構築した。

（２）Glu生産培養
2256ΔldhAΔsucA yggB^*/pVK9-Plac-pitA株および2256ΔldhAΔsucA yggB^*/pVK9株を用いて、Glu生産培養を行った。用いた培地の組成を表２に示す。

KOHでpH8.0に調整した上記組成の培地を作製し、オートクレーブ（115℃、15min）により滅菌して培養に供した。

＜培養方法＞
培養（前培養および本培養）は、坂口フラスコに培地を20mL張り込み、CaCO₃を50g/Lになるように添加して、31.5℃のボックスシェーカーで振とうして行なった。最初に、前培養として、培地1を用いて上記の株のそれぞれを24時間培養した。次いで、得られた前培養液2mLを培地2に植菌し、植菌から2時間後にTween40（終濃度4g/L)を添加してメイン培養を行った。サンプリングは植菌から17時間後に行った。残存糖およびグルタミン酸は、AS-310（旭化成）を用いて定量した。

＜結果と考察＞
結果を表３に示す。表３中、「RS」は残存糖量を、「Glu」はグルタミン酸量を示す。本実施例により、C. glutamicumにおいてpitA遺伝子の発現を上昇させることで、C. glutamicumの生育とGlu生産性が向上することが明らかとなった。よって、pitA遺伝子がコードするリン酸トランスポーターの活性を増大させることは、グルタミン酸等のアミノ酸生産に有効であると考察された。

実施例２：pitA変異株を用いたGlu生産培養
本実施例では、pitA遺伝子に変異を導入したC. glutamicumのGlu生産株を用いてGlu生産を行い、pitA遺伝子の変異がGlu生産に与える影響について評価した。

使用菌株は以下の通りである。
C. glutamicum 2256ΔldhAΔsucA yggB^*
C. glutamicum 2256ΔldhAΔsucA yggB^* pitAmut

（１）菌株構築方法
実施例１で構築したモデルGlu生産株であるC. glutamicum 2256ΔldhAΔsucA yggB^*を親株として、pitA遺伝子に変異が導入された2256ΔldhAΔsucA yggB^* pitAmut株を構築した。使用したプライマーを表４に示す。

pitA変異導入用プラスミドpBS4S-pitAmutを以下の方法で構築した。pitA遺伝子のコード領域内にPitAタンパク質の246位のフェニルアラニン残基がセリン残基に置換される変異（Phe246Ser ttc→tcc）が入ったGlu生産菌B3株の染色体DNAを鋳型として、プライマー15と16を用いてPCRを行い、上記変異を有するpitA遺伝子断片を増幅した。次いで、増幅した断片をBamHIとPstI処理したpBS4Sプラスミドにin-fusion（TaKaRa INC.）を用いて連結し、pitA変異導入用プラスミドを構築した。構築したpitA変異導入用プラスミドをpBS4S-pitAmutとした。

構築したpBS4S-pitAmutをGlu生産菌2256ΔldhAΔsucA yggB^*株の染色体に挿入した後、脱落させることで、pitA遺伝子に変異が導入された2256ΔldhAΔsucA yggB^* pitAmut株を構築した。

なお、上記pitA変異株2256ΔldhAΔsucA yggB^* pitAmut株は、Glu酸生産菌B3株の染色体DNAを鋳型として構築した変異導入用プラスミドを用いて構築したが、タカラバイオ製PrimeSTAR（登録商標） Mutagenesis Basal Kitによって作製した変異導入用プラスミドを用いても構築可能である。例えば、C. glutamicum 2256株（ATCC 13869）等の野生株の染色体DNAを鋳型として、プライマー15と16を用いてPCRを行い、変異を有さないpitA遺伝子断片を増幅する。ついで、増幅した断片をBamHIとPstI処理したpBS4Sプラスミドにin-fusion（TaKaRa INC.）を用いて連結し、野生型pitA遺伝子の配列を含むプラスミドを構築する。さらに、本プラスミドを鋳型として、PrimeSTAR（登録商標） Mutagenesis Basal Kitの使用説明書に従ってpitA遺伝子の737位のTがCに改変されるような適切なプライマーを用いてPCRを行い、pitA変異導入用プラスミドpBS4S-pitAmutが構築できる。これを用いて同一のpitA変異株の構築が可能である。

（２）Glu生産培養
2256ΔldhAΔsucA yggB^*株および2256ΔldhAΔsucA yggB^* pitAmut株を用いて、Glu生産培養を行った。用いた培地の組成を表５に示す。

KOHでpH8.0に調整した上記組成の培地を作製し、オートクレーブ（115℃、15min）により滅菌して培養に供した。

＜培養方法＞
培養（前培養および本培養）は、坂口フラスコに培地を20mL張り込み、CaCO₃を50g/Lになるように添加して、31.5℃のボックスシェーカーで振とうして行なった。最初に、前培養として、培地3を用いて上記の株のそれぞれを24時間培養した。次いで、得られた前培養液2mLを培地3に植菌し、植菌から2時間後にTween40（終濃度4g/L)を添加してメイン培養を行った。サンプリングは植菌から21.5時間後に行った。残存糖およびグルタミン酸は、AS-310（旭化成）を用いて定量した。

＜結果と考察＞
結果を表６に示す。表６中、「RS」は残存糖量を、「Glu」はグルタミン酸量を示す。本実施例により、C. glutamicumにおいてpitA遺伝子に変異（Phe246Ser）を導入することで、C. glutamicumの生育とGlu生産性が向上することが明らかとなった。よって、本pitA変異（Phe246Ser）はグルタミン酸等のアミノ酸生産に有効であると考察された。

本発明によれば、コリネ型細菌のＬ−アミノ酸生産能を向上させることができ、Ｌ−アミノ酸を効率よく製造することができる。

〔配列表の説明〕
配列番号１：E. coli MG1655のpitA遺伝子の塩基配列
配列番号２：E. coli MG1655のPitAタンパク質のアミノ酸配列
配列番号３：Pantoea ananatis LMG20103のpitA遺伝子の塩基配列
配列番号４：Pantoea ananatis LMG20103のPitAタンパク質のアミノ酸配列
配列番号５：Corynebacterium glutamicum 2256 (ATCC 13869)のpitA遺伝子の塩基配列
配列番号６：Corynebacterium glutamicum 2256 (ATCC 13869)のPitAタンパク質のアミノ酸配列
配列番号７〜２０：プライマー
配列番号２１：Corynebacterium glutamicum 2256 (ATCC 13869)のyggB遺伝子の塩基配列
配列番号２２：Corynebacterium glutamicum 2256 (ATCC 13869)のYggBタンパク質のアミノ酸配列
配列番号２３：Corynebacterium glutamicum 2256 (ATCC 13869)のyggB遺伝子（V419::IS）の塩基配列
配列番号２４：Corynebacterium glutamicum 2256 (ATCC 13869)のYggBタンパク質（V419::IS）のアミノ酸配列
配列番号２５：Corynebacterium glutamicum ATCC13032のpitA遺伝子の塩基配列
配列番号２６：Corynebacterium glutamicum ATCC13032のPitAタンパク質のアミノ酸配列
配列番号２７、２８：プライマー

また、リン酸トランスポーター遺伝子は、公知の遺伝子配列から調製され得るプローブ、例えば上記塩基配列の全体または一部に対する相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、リン酸トランスポーター活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡであってもよい。「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。一例を示せば、相同性が高いＤＮＡ同士、好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、より好ましくは97%以上、特に好ましくは99%以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いＤＮＡ同士がハイブリダイズしない条件を挙げることができる。

Claims (16)

1. Ｌ−アミノ酸生産能を有するコリネ型細菌を培地で培養すること、および該培地よりＬ−アミノ酸を採取すること、を含むＬ−アミノ酸の製造法であって、
   前記細菌が、リン酸トランスポーターの活性が増大するように改変されていることを特徴とする、方法。
2. リン酸トランスポーターをコードする遺伝子の発現を上昇させることにより、リン酸トランスポーターの活性が増大した、請求項１に記載の方法。
3. 前記遺伝子がｐｉｔＡ遺伝子である、請求項２に記載の方法。
4. 前記ｐｉｔＡ遺伝子が、下記（ａ）又は（ｂ）に記載のＤＮＡである、請求項３に記載の方法：
   （ａ）配列番号５または２５に示す塩基配列を有するＤＮＡ、
   （ｂ）配列番号５または２５に示す塩基配列の相補配列又は同相補配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、リン酸トランスポーター活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
5. 前記ｐｉｔＡ遺伝子が、下記（Ａ）又は（Ｂ）に記載のタンパク質をコードするＤＮＡである、請求項３または４に記載の方法：
   （Ａ）配列番号６または２６に示すアミノ酸配列を有するタンパク質、
   （Ｂ）配列番号６または２６に示すアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を有し、かつ、リン酸トランスポーター活性を有するタンパク質。
6. 前記遺伝子の発現が、該遺伝子のコピー数を高めること、及び／又は該遺伝子の発現調節配列を改変することによって上昇した、請求項２〜５のいずれか一項に記載の方法。
7. 配列番号６の２４６位のフェニルアラニン残基に相当するアミノ酸残基がフェニルアラニン以外のアミノ酸残基に置換される変異を有するリン酸トランスポーターをコードする変異型ｐｉｔＡ遺伝子を前記細菌に保持させることにより、リン酸トランスポーターの活性が増大した、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
8. 配列番号６の２４６位のフェニルアラニン残基に相当するアミノ酸残基が、セリン残基に置換されたことを特徴とする、請求項７に記載の方法。
9. Ｌ−アミノ酸生産能を有するコリネ型細菌を培地で培養すること、および該培地よりＬ−アミノ酸を採取すること、を含むＬ−アミノ酸の製造法であって、
   前記細菌が、配列番号６の２４６位のフェニルアラニン残基に相当するアミノ酸残基がフェニルアラニン以外のアミノ酸残基に置換される変異を有するリン酸トランスポーターをコードする変異型ｐｉｔＡ遺伝子を保持していることを特徴とする、方法。
10. 配列番号６の２４６位のフェニルアラニン残基に相当するアミノ酸残基が、セリン残基に置換されたことを特徴とする、請求項９に記載の方法。
11. 前記コリネ型細菌が、コリネバクテリウム属細菌である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
12. 前記コリネ型細菌が、コリネバクテリウム・グルタミカムである、請求項１１に記載の方法。
13. 前記Ｌ−アミノ酸が、Ｌ−グルタミン酸である、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
14. 前記Ｌ−グルタミン酸が、Ｌ−グルタミン酸アンモニウムまたはＬ−グルタミン酸ナトリウムである、請求項１３に記載の方法。
15. 配列番号６の２４６位のフェニルアラニン残基に相当するアミノ酸残基がセリン残基に置換される変異を有するリン酸トランスポーターをコードするＤＮＡ。
16. 配列番号６の２４６位のフェニルアラニン残基に相当するアミノ酸残基がセリン残基に置換される変異を有するリン酸トランスポーターをコードする変異型ｐｉｔＡ遺伝子を保持しているコリネ型細菌。