JPS60137298A - 発酵法によるl−トリプトフアンの製造法 - Google Patents

発酵法によるl−トリプトフアンの製造法

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JPS60137298A
JPS60137298A JP24357283A JP24357283A JPS60137298A JP S60137298 A JPS60137298 A JP S60137298A JP 24357283 A JP24357283 A JP 24357283A JP 24357283 A JP24357283 A JP 24357283A JP S60137298 A JPS60137298 A JP S60137298A
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tryptophan
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tryptophane
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椎尾 勇
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愼一 杉本
Kazue Kawamura
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は発酵法によるL−)リプトファン(以下、トリ
プトファンと記す)α泰−造法に関する。
従来トリプトファンの製造法としては、トリプトファン
の前駆物l質であるアントラニル酸、インドール或いは
3−インドールピルビン酸よシトリシトファンを製造す
る方法が知られている。これに対し、本発明者たちは5
−メチルトリプトファン、5−フロロトリプトファン等
のトリシトファンアナログに耐性を有す石ゾレビバクテ
リウム属及びコリネバクテリウム属の微生物を用いて糖
類等の炭素源から直接発酵法によシトリシトファンを製
造する方法を開発した(%公開48−18828゜フラ
ンス特許公開2059715号、特開昭55−1627
71)。またこれらの菌株にフェニルアラニン、チロシ
ン等の栄養要求性、フェニルアラニン又はチロシンのア
ナログに対する耐性を付与することによシ(特公昭48
−18828.フランス特許公開2059715号)又
セリンアナ占グに対する耐性を付与することによυ(特
開昭57〜174096)トリプトファンの蓄積量が増
加することも明らかにした。
本発明者らはこれらの直接発酵法により更に安価にトリ
プトファンを製造する方法を開発すべく研究を行なった
結果、コリネバクテリウム属の従来知られているトリプ
トファン生産菌に更にサルファ剤として知られているサ
ルファグアニジンに対する耐性を付与せしめたところ、
従来のトリプトファン生産菌よシ更に大量にトリプトフ
ァンを生産することを思す出した。この発明はこの知見
に基づいて更に研究の結果完成されたものである。
本発明のトリプトファン製造法において用いらにる微生
物はコリネ・fクテリウム属に属しサルファグアニジン
に耐性かつトリプトファン生産能を有する変異株でおる
。サルファグアニジンに対する耐性の他に更にトリプト
ファンアナログ、フェニルアラニンアナログ、チロシン
アナログ、アザセリン、インドールマイシン、デコイニ
ン等ニ対する薬剤耐性、L−フェニルアラニン、L−チ
ロシン、L−ヒスチジン、L−メチオニン等O栄養要求
性を付与せしめた菌株を用いることによp)リデトファ
ン蓄積を増大させることができる。
本発明の変異株の親株はいわゆるL−グルタミン酸生産
菌として知られているコリネノずクテリウム属の微生物
である。例えば、コネリ・マクテリウムダルタミク’h
 ATCC13032、コリネノマクテリウムアセトア
シドフィラムATCC13870、コリネノぐクテリウ
ムリリウムATC015990等がある。
本発明で用いる変異株はこれら上述の菌株を親株として
変異操作を施して、トリシトファン生成に必要な性質、
例えば5−メチルトリシトファン耐性及びサルファグア
ニジン耐性を付与することによって得られる。この場合
両性質の付与の順序は任意に行えば良い。なお変異操作
は通常の方法、例えば紫外線照射或いはN−メチル−V
−ニトロ−N−ニトロングアニジン(JR下NGと略す
)、亜硝酸等の化学薬剤処理によって行うことができる
O 誘導方法とそのサルファグアニジンに対する耐性の度合
を示す実験例を示す。
コリネパクテリウムダルタミクムFERM−P 167
4を親株として用いた。本菌株は特公昭5l−1903
7(特開昭49−71194)において例示された菌株
で、その性質としてはフェニルアラニン及びチロシン要
求性とフェニルアラニン、チロシンのアナログであるノ
ぐラアミノフェニルアラニン、ノぐラフロロフェニルア
ラニン及びチロシンノへイドロキサメートに対する耐性
が記載されているd!、更にトリプトファンアナログ耐
性を有する。例えばフランス特許公開2059715号
記載の方法でこのFERM−P 1674株のトリプト
7アンアナログの一つである5−メチルトリプトファン
に対する耐性の度合をコリネパクテリウムダルタミクム
の野生株ATCC13032と比較した時、5−メチル
−DL−トリプトファンを各600.900μ97m1
含む試験培地におよそ10’コ接種し30℃で4日間培
養後野生株ではそれぞれ122コ、0コに対しFERM
−P1674株ではそれぞれ1000コ以上のコロニー
ヲ生成した。次にFERM−P 1674株よシサルフ
ァグアニジン耐性0株を誘導した。400μ9 /rn
lのNGで30℃15分間処理した(生残率12%)の
ち、第−表に示す最少培地に親株が生育できない濃度の
1000μII/mlになるようにサルファグアニジン
を添加して°平板培地を作製し、これに接種した。
30℃に10日間放置後コロニーとして生育する菌株即
ちサルファグアニジン耐性変異株を採取νこのうちトリ
シトファン生産能のすぐれた変異株AJ 12118 
(FERM−P7374) (サルファグアニジン耐性
、トリプトファンアナログ耐性、パラアミノフェニルア
ラニン耐性、)97フロロフエニルアラニン耐性、チロ
シンハイドロキサメート耐性フェニルアラニン要求性、
及びチロシン要求性)を採取゛した。この変異株は実施
例に示すように親株よりトリプトファンを2.16倍多
く生成した。
次にとのAJ 12118 株のサルファグアニジンに
対する耐性の度合を調べた結果を第二衣に示す。
第−表に示す最少培地にサルファグアニジンを第二衣に
示した濃度になるように溶解して平板培地を作シ各々の
培地に完全培地(酵母エキス10i/l、ポリペプトン
109/l、塩化ナトリウム5g/l、グルコース51
1/II%L−メチオニン2QO■/1%L−チロシン
200■/1.奢含み−7,0)に生育したコリネパク
テリウムダルタミクムFIRM−P 1674及びコリ
ネバクテリウムダルタミクムAJ 12118 (FI
RM−P 73’14 )をおよそi o’コ接種した
のち30℃で3日間培養を行ない生成したコロニー数を
調べた。その結果を第二衣に示す。
尚本発明で言うサルファグアニジン耐性とけ上記培養条
件下においてサルファグアニジンを1000μg/il
l含む上記培地に微生物をおよそ10コ接種し、30℃
3日間培養後1000コ以上のコロニーを生成する場合
を言う〇 トリプトファン生産用の培養培地は特に制限するところ
はなく、炭素源、窒素源、無楼廖及び必要ならば有機微
量栄養素を含有する通常の培地である。炭素源として炭
水化物(グルツース、フラクトース或いはデンプン・、
セルロース等の加水分解物、糖蜜等)、有機w(酢酸、
クエン酸等)、アルコール(グリセリン、エタノール等
)、或いは炭化水素(ノルマンパラフィン等)が使用で
きる。窒素源としては硫酸アンモニウム、尿素、硝酸ア
ンモニウム、リン酸アンモニウム、塩化アンモニウム、
アンモニアガス、その他を、無機塩としてはリン酸塩、
マグネシウム塩、カルシウム塩、鉄塩、マンガン塩、そ
の他微量金属塩等を必要に応じて使用する。有機微量栄
養素としては栄養要求性のある場合には該当するアミノ
酸、ビタミ、ン、脂肪酸類、有機塩基物質等を適量添加
し、必要に第−表 最少培地組成 成 分 濃 度 グルコース 5 g/を 尿 素 1.5 11/を 硫酸アンモニウム 1.5 g/l リン酸1カリウム 3 9/l リン酸2カリウム I E/を 硫酸マグネシウム 0.1 11/を 塩化カルシウム o、o o i g7tビタミンB、
・塩酸塩 100μg/lビオチン 30 μEl/を 微量金属要素 1 吟t * L−フェニルアラニン100 m9/LL−チロシン 
100 ■/L (P)17.2)1微貴金属要素とし
てXt中に次のものを含む。
8800?#のZn804’7H20、970119の
F@CL、−6H20,、270即のCuSO4・5H
20,72雫のMnC42’4H20、881119N
i2B407・l 0H20、37’ln9の(NH4
)6MO、O□4−4H20 第二表 菌株のサルファグアニジン耐性塵0 + −+ 1000 + 注)表中(ト)はコロニー数が1000コ以上を表わし
、(へ)はコロニー数0の場合を示す。
応じて更に生育促進物質としてアミノ酸、ビタミン、味
液(登録商標、大豆加水分解物)酵母エキス、ペグトン
、カブミノ酸、NZアミン、コーンスチープリカー等が
使用できる1゜ 培養条件は゛、通常の方法□でpH5ないし9、温度は
20ないし40℃で好気的条件下[24ないし72時間
培養すれば良い。培養中Kp)Iが下がる場合には炭酸
カルシウムを別殺菌して力♂えるか又は77%ニア水、
アンモニアガス等のアルカリで中和する。又、有機酸を
炭素源とする場合は−の上昇を鉱酸又は有機酸で中和す
る。
トリプトファンの単離採取は常法によって行いうる。得
られたものはペーノや一クロマドグ2ム上のRf値、エ
ーリッヒ試薬によるトリットファン特異反応、或いは微
生物定量法による生物活性値によシ、トリブトファン標
品のそれらと一致することを確かめトリプトファンと同
定した。
−トリプトファンの定量はロイコノストック メセンテ
ロイデス(ATCC8042)を用いる微生物定量法に
従って行った。
以下、実施例にて説明する。
実施例1 下記第三衣に示した組成のトリブトファン生産用培地2
Qmlを500d容のフラスコに分注し、これを第四衣
に示す微生物をそれぞれ1/3スラント量植えつけ30
℃で72時間振盪培養した。それぞれの培養液中のトリ
プトファン生成量は第四衣の如くであった。
第三表 トリプトファン生産用石地組成成 分 濃 塵 垢 蜜 100 g/L Cnガー不庚算)リン酸1カ
リウム 0.5 9/l リン酸2カリウム 0.5 Ii/を 硫酸マグネシウム 0.25 9/を 硫酸アンモニウム 20 g/l コーンスチーノリカ−1011/を 炭酸カルシウム(別殺菌) 20 g/lL−フェニル
アラニン 200m9/1L−fo シフ 175 n
Q/L (pH7,2) ’ 、第四表 トリブトファン生成量 菌 、株 サルファグアニジン トリプトファンFER
M−P 1674 − 4.3 AJ12118(FERM−P 7374) + 、9
.3注)表中(ト)は耐性あシ、(→は耐性なしを示す
手続補正音 昭和59年1月10「1 1、事件の表示 昭和58年特許願第243572@ 2、発明の名称 発酵法によるし一トリプトファンの製造法3、補正をす
る者 事件との関係 特許出願人 住所 東京都中央区京橋−丁目5N8号6、補正の対象
 明細書の発明の詳細な説明の欄7、補正の内容 (1)明細書第2頁、最終行の「思い出した。」を「見
い出した。」と訂正する。
(2)明細書第3頁、下から6行目の「コリネクテリウ
ム」を「コリネバクテリウム」と訂正する。
(3)明細書第5頁、5行目の「ダリタミクム」を「グ
ルタミクム」と訂正する。
〈4)明細内筒6頁、3〜4行目の「・・・キサメート
耐性フェニルアラニン要求性」を[・・・キサメート耐
性、フェニルアラニン要求性]と訂正する。
(5)明細書第7頁、122行目「ノルマンパラフィン
」を「ノルマルパラフィン」と訂正する。
(6)明りIl書第8頁、下から5行目の「本微量金属
要素として」を「車使用した微」金属要素液」と訂正す
る。
(7)明細■第9頁、下から8行目の[大豆加水分解物
〉酵母」を[大豆加水分解物)、酵母」と訂正する。
以上

Claims (1)

    【特許請求の範囲】
  1. コリネバクテリウム属に属しサルファグアニジンに耐性
    を有し、かっL−)リプトファン生産れを採取すること
    を特徴とするL−)リプトファンの製造法。
JP24357283A 1983-04-13 1983-12-23 発酵法によるl−トリプトフアンの製造法 Granted JPS60137298A (ja)

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DE8484302185T DE3464934D1 (en) 1983-04-13 1984-03-30 Process for the production of l-tryptophan by a fermentation process
EP84302185A EP0128637B1 (en) 1983-04-13 1984-03-30 Process for the production of l-tryptophan by a fermentation process
US06/599,922 US4618580A (en) 1983-04-13 1984-04-13 Process for the production of L-tryptophan using sulfaguanidine-resistant microorganisms

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