CN105008532A - L-氨基酸的制造方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种L-氨基酸的制造方法。通过在培养基中培养已经以磷酸盐转运蛋白的活性增大的方式进行修饰的具有L-氨基酸生产能力的棒状杆菌型细菌并从该培养基采集L-氨基酸来制造L-氨基酸。

Description

L-氨基酸的制造方法
技术领域
本发明涉及一种使用了棒状杆菌型细菌的L-氨基酸的制造方法。L-氨基酸作为动物饲料用的添加物、调味料或饮食品的成分、或氨基酸输液等在工业上很有用。
背景技术
L-氨基酸例如可通过使用了具有L-氨基酸生产能力的各种微生物的发酵法进行工业生产。作为利用发酵法的L-氨基酸的制造方法，例如可以举出：使用野生型微生物(野生株)的方法、使用由野生株衍生的营养缺陷株的方法、使用由野生株衍生为各种药剂抗性突变株的代谢调节突变株的方法、使用具有营养缺陷株和代谢调节突变株两者的性质的菌株的方法。
另外，近年来，利用重组DNA技术提高L-氨基酸生产能力的微生物被用于L-氨基酸的制造。作为提高微生物的L-氨基酸生产能力的方法，例如可以举出：增强编码L-氨基酸生物合成体系酶的基因的表达(专利文献1、专利文献2)、或增强碳源向L-氨基酸生物合成体系的流入(专利文献3)。
大肠杆菌(Escherichia coli)具有至少2种无机磷酸摄入体系(非专利文献1)。一方面为低亲和性的无机磷酸盐转运蛋白(low-affinity inorganic phosphatetransporter；Pit)体系，另一方面为高亲和性的磷酸特异转运蛋白(high-affinityphosphate-specific transporter；Pst)体系。作为编码Pit体系的基因，已知有pitA基因及pitB基因。作为编码Pst体系的基因，已知有pstSCAB基因，pstSCAB基因的产物形成复合物，作为Pst体系发挥作用。然而，未知这些磷酸盐转运蛋白的活性和L-氨基酸生产的关联。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：美国专利第5,168,056号说明书
专利文献2：美国专利第5,776,736号说明书
专利文献3：美国专利第5,906,925号说明书
非专利文献
非专利文献1：R.M.Harris et al.,Journal of Bacteriology,Sept.2001,p5008-5014
发明内容
发明所要解决的课题
本发明的课题在于，开发一种提高棒状杆菌型细菌的L-氨基酸生产能力的新型技术，提供一种有效的L-氨基酸的制造方法。
用于解决课题的手段
本发明人为了解决上述课题进行了潜心研究，结果发现，通过以磷酸盐转运蛋白的活性增大的方式对棒状杆菌型细菌进行修饰，可以提高棒状杆菌型细菌的L-氨基酸生产能力，完成了本发明。
即，本发明可如下例示。
[1]一种L-氨基酸的制造方法，其包括在培养基中培养具有L-氨基酸生产能力的棒状杆菌型细菌及从该培养基中采集L-氨基酸，其特征在于，
所述细菌以磷酸盐转运蛋白的活性增大的方式进行了修饰。
[2]如上述的方法，其中，通过使编码磷酸盐转运蛋白的基因的表达上升，磷酸盐转运蛋白的活性增大。
[3]如上述的方法，其中，所述基因为pitA基因。
[4]如上述的方法，其中，所述pitA基因为下述(a)或(b)中记载的DNA：
(a)具有序列号5或25所示的碱基序列的DNA；
(b)在严格的条件下可与由序列号5或25所示的碱基序列的互补序列或与可自所述互补序列制备的探针杂交的DNA，且其中所述可杂交的DNA编码具有磷酸盐转运蛋白活性的蛋白质。
[5]如上述的方法，其中，所述pitA基因为编码下述(A)或(B)中记载的蛋白质的DNA：
(A)具有序列号6或26所示的氨基酸序列的蛋白质、
(B)具有在序列号6或26所示的氨基酸序列中含有1或者多个氨基酸残基的取代、缺失、插入、或添加的氨基酸序列的蛋白质，且其中所述蛋白质具有磷酸盐转运蛋白活性。
[6]如上述的方法，其中，所述基因的表达通过提高该基因的拷贝数和/或修饰该基因的表达调节序列来上升。
[7]如上述的方法，其中，通过在所述细菌中保持编码磷酸盐转运蛋白的突变型pitA基因，磷酸盐转运蛋白的活性增大，所述磷酸盐转运蛋白具有相当于序列号6的246位的苯丙氨酸残基的氨基酸残基被取代为苯丙氨酸以外的氨基酸残基的突变。
[8]如上述的方法，其特征在于，相当于序列号6的246位的苯丙氨酸残基的氨基酸残基被取代为丝氨酸残基。
[9]一种L-氨基酸的制造方法，其包括在培养基中培养具有L-氨基酸生产能力的棒状杆菌型细菌及从该培养基中采集L-氨基酸，其特征在于，
所述细菌保持有编码磷酸盐转运蛋白的突变型pitA基因，所述磷酸盐转运蛋白具有相当于序列号6的246位的苯丙氨酸残基的氨基酸残基被取代为苯丙氨酸以外的氨基酸残基的突变。
[10]如上述的方法，其特征在于，相当于序列号6的246位的苯丙氨酸残基的氨基酸残基被取代为丝氨酸残基。
[11]如上述的方法，其中所述细菌是棒状杆菌属(Corynebacterium)细菌。
[12]如上述的方法，其中，所述棒状杆菌型细菌为谷氨酸棒状杆菌。
[13]如上述的方法，其中，所述L-氨基酸为L-谷氨酸。
[14]如上述的方法，其中所述L-谷氨酸是L-谷氨酸单铵或L-谷氨酸单钠。
[15]一种编码磷酸盐转运蛋白的DNA，所述磷酸盐转运蛋白具有对应于SEQ ID NO:6中246位的苯丙氨酸残基的氨基酸残基被取代为丝氨酸残基的突变。
[16]一种携带突变型pitA基因的棒状杆菌型细菌，所述突变型pitA基因编码具有对应于SEQ ID NO:6中246位的苯丙氨酸残基的氨基酸残基被取代为丝氨酸残基的突变的磷酸盐转运蛋白。
具体实施方式
下面，对本发明详细地进行说明。
本发明的方法为一种L-氨基酸的制造方法，其包括在培养基中培养具有L-氨基酸生产能力的棒状杆菌型细菌及从该培养基中采集L-氨基酸，其特征在于，上述细菌已经以磷酸盐转运蛋白的活性增大的方式进行修饰。也将相同方法中所使用的棒状杆菌型细菌称为“本发明的细菌”。
<1>本发明的细菌
本发明的细菌为已经以磷酸盐转运蛋白的活性增大的方式进行修饰的具有L-氨基酸生产能力的棒状杆菌型细菌。
<1-1>具有L-氨基酸生产能力的棒状杆菌型细菌
在本发明中，所谓“具有L-氨基酸生产能力的细菌”是指在培养基中培养时，具有生成目标L-氨基酸并在培养基中或菌体内蓄积到可回收的程度的能力的细菌。具有L-氨基酸生产能力的细菌可以为能够在培养基中蓄积比非修饰株多的量的目标L-氨基酸的细菌。作为非修饰株，可以举出野生株及亲株。另外，具有L-氨基酸生产能力的细菌可以为能够在培养基中蓄积优选0.5g/L以上、更优选1.0g/L以上的量的目标L-氨基酸的细菌。
作为L-氨基酸，可以举出：L-赖氨酸、L-鸟氨酸、L-精氨酸、L-组氨酸、L-瓜氨酸等碱性氨基酸；L-异亮氨酸、L-丙氨酸、L-缬氨酸、L-亮氨酸、甘氨酸等脂肪族氨基酸；L-苏氨酸、L-丝氨酸等作为羟基单氨基羧酸的氨基酸；L-脯氨酸等环式氨基酸；L-苯丙氨酸、L-酪氨酸、L-色氨酸等芳香族氨基酸；L-半胱氨酸、L-胱氨酸、L-甲硫氨酸等含硫氨基酸；L-谷氨酸、L-天冬氨酸等酸性氨基酸；L-谷氨酰胺、L-天冬酰胺等侧链具有酰胺基的氨基酸。本发明的细菌可以具有2个或其以上的氨基酸的生产能力。
在本发明中，氨基酸只要没有特别记载，则均为L-氨基酸。L-氨基酸可以是游离化合物、其盐、或其混合物。也就是说，在本发明中，术语“L-氨基酸”可以意指游离形式的L-氨基酸、其盐、或其混合物。盐的例子包括例如硫酸盐、盐酸盐、碳酸盐、铵盐、钠盐、和钾盐。例如，L-赖氨酸可以是游离形式的L-赖氨酸、L-赖氨酸的盐酸盐、L-赖氨酸的碳酸盐、或其混合物。此外，L-谷氨酸可以是例如游离形式的L-谷氨酸、谷氨酸单钠(MSG)、谷氨酸单铵、或其混合物。
作为棒状杆菌型细菌，可以举出属于棒状杆菌(Corynebacterium)属、短杆菌(Brevibacterium)属、及微杆菌(Microbacterium)属等属的细菌。
作为棒状杆菌型细菌，具体而言，可以举出如下所述的种。
嗜乙酰乙酸棒状杆菌(Corynebacterium acetoacidophilum)
醋谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium acetoglutamicum)
解烷棒状杆菌(Corynebacterium alkanolyticum)
帚石南棒状杆菌(Corynebacterium callunae)
谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)
百合棒状杆菌(Corynebacterium lilium)
栖糖蜜棒状杆菌(Corynebacterium melassecola)
热产氨棒状杆菌(有效棒状杆菌)(Corynebacterium thermoaminogenes(Corynebacterium efficiens))
力士棒状杆菌(Corynebacterium herculis)
散枝短杆菌(Brevibacterium divaricatum)
黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)
Immariophilum短杆菌(Brevibacterium immariophilum)
乳酸发酵短杆菌(谷氨酸棒状杆菌)(Brevibacterium lactofermentum(Corynebacterium glutamicum))
玫瑰色短杆菌(Brevibacterium roseum)
解糖短杆菌(Brevibacterium saccharolyticum)
生硫短杆菌(Brevibacterium thiogenitalis)
产氨棒状杆菌(停滞棒状杆菌)(Corynebacterium ammoniagenes(Corynebacterium stationis))
白色短杆菌(Brevibacterium album)
蜡状短杆菌(Brevibacterium cerinum)
嗜氨微杆菌(Microbacterium ammoniaphilum)
作为棒状杆菌型细菌，具体而言，可以举出如下所述的菌株。
嗜乙酰乙酸棒状杆菌ATCC 13870
醋谷氨酸棒状杆菌ATCC 15806
解烷棒状杆菌ATCC 21511
帚石南棒状杆菌ATCC 15991
谷氨酸棒状杆菌ATCC 13020,ATCC 13032,ATCC 13060，ATCC 13869，FERM BP-734
百合棒状杆菌ATCC 15990
栖糖蜜棒状杆菌ATCC 17965
有效棒状杆菌(热产氨棒状杆菌)AJ12340(FERM BP-1539)
力士棒状杆菌ATCC 13868
谷氨酸棒状杆菌(散枝短杆菌)ATCC 14020
谷氨酸棒状杆菌(黄色短杆菌)ATCC 13826,ATCC 14067,AJ12418(FERMBP-2205)
Immariophilum短杆菌ATCC 14068
谷氨酸棒状杆菌(乳酸发酵短杆菌)ATCC 13869
玫瑰色短杆菌ATCC 13825
解糖短杆菌ATCC 14066
生硫短杆菌ATCC 19240
产氨棒状杆菌(停滞棒状杆菌)ATCC 6871,ATCC 6872
白色短杆菌ATCC 15111
蜡状短杆菌ATCC 15112
嗜氨微杆菌ATCC 15354
另外，棒状杆菌属细菌中也包含以往被分类为短杆菌属，但现在被统一为棒状杆菌属的细菌(Int.J.Syst.Bacteriol.,41,255(1991))。另外，停滞棒状杆菌中也包含以往被分类为产氨棒状杆菌，但通过16S rRNA的碱基序列分析等而被再分类为停滞棒状杆菌的细菌(Int.J.Syst.Evol.Microbiol.,60,874-879(2010))。
这些菌株例如可以由美国模式培养物保藏所(住所12301 Parklawn Drive,Rockville,Maryland 20852 P.O.Box 1549,Manassas,VA 20108,United States ofAmerica)接受出售。即，赋予有与各菌株对应的注册号，可以利用该注册号接受出售(参照http://www.atcc.org/)。与各菌株对应的注册号记载在美国模式培养物保藏所的目录中。
本发明的细菌可以为原本具有L-氨基酸生产能力的细菌，也可以为以具有L-氨基酸生产能力的方式进行修饰而成的细菌。具有L-氨基酸生产能力的细菌例如可通过对如上所述的细菌赋予L-氨基酸生产能力或通过增强如上所述的细菌的L-氨基酸生产能力来获得。
L-氨基酸生产能力的赋予或增强可以利用以往棒状杆菌型细菌或埃希氏菌属细菌等氨基酸生产菌的育种中所采用的方法来进行(参照氨基酸发酵、(株)学会出版中心、1986年5月30日初版发行、第77～100页)。作为如上所述的方法，例如可以举出：营养缺陷性突变株的获得、L-氨基酸的类似物抗性株的获得、代谢控制突变株的获得、L-氨基酸的生物合成体系酶的活性得到增强的重组株的创造。在L-氨基酸生产菌的育种中，所赋予的营养缺陷性、类似物抗性、代谢控制突变等性质可以为单独，也可以为2种或3种以上。另外，在L-氨基酸生产菌的育种中，活性得到增强的L-氨基酸生物合成体系酶可以为单独，也可以为2种或3种以上。进而，可以组合营养缺陷性、类似物抗性、代谢控制突变等性质的赋予和生物合成体系酶的活性的增强。
具有L-氨基酸生产能力的营养缺陷性突变株、类似物抗性株、或代谢控制突变株可通过将亲株或野生株供于通常的突变处理，从得到的突变株中选择显示营养缺陷性、类似物抗性或代谢控制突变，且具有L-氨基酸生产能力的菌株来获得。作为通常的突变处理，可以举出：X射线或紫外线的照射、利用N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)、甲磺酸乙酯(EMS)、甲磺酸甲酯(MMS)等突变剂的处理。
另外，L-氨基酸生产能力的赋予或增强也可以通过增强参与目标L-氨基酸的生物合成的酶的活性来进行。酶活性的增强例如可以通过以编码相同酶的基因的表达增强的方式修饰细菌来进行。增强基因的表达的方法记载在WO00/18935号小册子、欧洲专利申请公开1010755号说明书等中。对增强酶活性的详细的方法进行后述。
另外，L-氨基酸生产能力的赋予或增强也可以通过使催化从目标L-氨基酸的生物合成途径中分支而生成目标L-氨基酸以外的化合物的反应的酶的活性降低来进行。另外，在此所谓的“催化从目标L-氨基酸的生物合成途径中分支而生成目标L-氨基酸以外的化合物的反应的酶”中也包含参与目标氨基酸的分解的酶。对使酶活性降低的方法进行后述。
以下，对L-氨基酸生产菌、及赋予或增强L-氨基酸生产能力的方法具体地进行例示。另外，如以下例示那样的L-氨基酸生产菌所具有的性质及用于赋予或增强L-氨基酸生产能力的修饰均可以单独使用，也可以适宜组合。
<L-谷氨酸生产菌>
作为L-谷氨酸生产菌或用于衍生其的亲株，可以举出选自L-谷氨酸生物合成体系酶中的1个或其以上的酶的活性得到增强的菌株。作为这样的酶，没有特别限制，可以举出：谷氨酸脱氢酶(gdhA)、谷氨酰胺合成酶(glnA)、谷氨酸合成酶(gltBD)、异柠檬酸脱氢酶(icdA)、乌头酸水合酶(acnA、acnB)、柠檬酸合酶(gltA)、甲基柠檬酸合酶(prpC)、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(ppc)、丙酮酸脱氢酶(aceEF,lpdA)、丙酮酸激酶(pykA,pykF)、磷酸烯醇式丙酮酸合酶(ppsA)、烯醇酶(eno)、磷酸甘油变位酶(pgmA,pgmI)、磷酸甘油酸激酶(pgk)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(gapA)、丙糖磷酸异构酶(tpiA)、果糖二磷酸醛缩酶(fbp)、磷酸果糖激酶(pfkA,pfkB)、葡萄糖磷酸异构酶(pgi)、6-磷酸葡萄糖酸脱水酶(edd)、2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡萄糖酸醛缩酶(eda)、转氢酶。需要说明的是，括弧内为编码其酶的基因的缩写(以下的记载中也相同)。在这些酶中，优选增强例如选自谷氨酸脱氢酶、柠檬酸合酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶及甲基柠檬酸合酶中的1个或其以上的酶的活性。
作为以谷氨酸合成酶基因(gltBD)的表达增大的方式进行修饰的棒状杆菌型细菌，可以举出WO99/07853中所公开的细菌。
另外，作为L-谷氨酸生产菌或用于衍生其的亲株，也可以举出选自催化从L-氨基酸的生物合成途径中分支而生成L-氨基酸以外的化合物的反应的酶中的1个或其以上的酶的活性降低或缺损的菌株。作为这样的酶，没有特别限制，可以举出：异柠檬酸裂合酶(aceA)、α-酮戊二酸脱氢酶(sucA、odhA)、磷酸转乙酰酶(pta)、乙酸激酶(ack)、乙酰羟酸合酶(ilvG)、乙酰乳酸合酶(ilvI)、甲酸乙酰转移酶(pfl)、乳酸脱氢酶(ldh)、谷氨酸脱羧酶(gadAB)、琥珀酸脱氢酶(sdhABCD)、1-吡咯啉-5-羧酸脱氢酶(putA)。
α-酮戊二酸脱氢酶活性降低或缺损的棒状杆菌型细菌及它们的获得方法记载在WO2008/075483中。作为α-酮戊二酸脱氢酶活性降低或缺损的棒状杆菌型细菌，具体而言，例如可以举出下述的菌株。
乳酸发酵短杆菌L30-2菌株(日本特开2006-340603号说明书)
乳酸发酵短杆菌ΔS菌株(国际公开95/34672号小册子)
乳酸发酵短杆菌AJ12821(FERM BP-4172；参照法国专利公报9401748号说明书)
黄色短杆菌AJ12822(FERM BP-4173；法国专利公报9401748号说明书)
谷氨酸棒状杆菌AJ12823(FERM BP-4174；法国专利公报9401748号说明书)
谷氨酸棒状杆菌L30-2菌株(日本特开2006-340603号)
另外，作为L-谷氨酸生产菌或用于衍生其的亲株，也可以举出α-酮戊二酸脱氢酶(sucA)活性及琥珀酸脱氢酶(sdh)活性两者均降低或缺损的菌株(日本特开2010-041920号)。作为这样的菌株，具体而言，例如可以举出：谷氨酸棒状杆菌ATCC14067的odhAsdhA双重缺损株(谷氨酸棒状杆菌8L3GΔSDH菌株)(日本特开2010-041920号)。
另外，作为L-谷氨酸生产菌或用于衍生其的亲株，也可以举出已经以增强D-木糖-5-磷酸-磷酸酮醇酶及/或果糖-6-磷酸磷酸酮醇酶活性的方式进行修饰的菌株(日本特表2008-509661)。可以增强D-木糖-5-磷酸-磷酸酮醇酶活性及果糖-6-磷酸磷酸酮醇酶活性中的任一者，也可以增强两者。需要说明的是，在本说明书中，有时将D-木糖-5-磷酸-磷酸酮醇酶和果糖-6-磷酸磷酸酮醇酶统称为磷酸酮醇酶。
所谓D-木糖-5-磷酸-磷酸酮醇酶活性是指消耗磷酸，将木酮糖-5-磷酸转化为甘油醛-3-磷酸和乙酰磷酸并放出一分子的H2O的活性。该活性可以通过Goldberg,M.等的文献(Methods Enzymol.,9,515-520(1966))或L.Meile的文献(J.Bacteriol.(2001)183；2929-2936)中记载的方法来测定。
另外，所谓果糖-6-磷酸磷酸酮醇酶活性是指消耗磷酸，将果糖-6-磷酸转化为赤藓糖-4-磷酸和乙酰磷酸并放出一分子的H2O的活性。该活性可以通过Racker,E的文献(Methods Enzymol.,5,276-280(1962))或L.Meile的文献(J.Bacteriol.(2001)183；2929-2936)中记载的方法来测定。
另外，作为对棒状杆菌型细菌赋予或增强L-谷氨酸生产能力的方法，也可以举出：赋予对有机酸类似物或呼吸抑制剂等的抗性的方法及赋予相对于细胞壁合成抑制剂的敏感性的方法。作为这样的方法，例如可以举出：赋予单氟醋酸抗性的方法(日本特开昭50-113209)、赋予腺嘌呤抗性或胸腺嘧啶抗性的方法(日本特开昭57-065198)、弱化脲酶活性的方法(日本特开昭52-038088)、赋予丙二酸抗性的方法(日本特开昭52-038088)、赋予苯并吡喃酮抗性或对萘醌类的抗性的方法(日本特开昭56-1889)、赋予HOQNO抗性的方法(日本特开昭56-140895)、赋予α-酮丙二酸抗性的方法(日本特开昭57-2689)、赋予胍抗性的方法(日本特开昭56-35981)、赋予相对于青霉素的敏感性的方法(日本特开平4-88994)。
作为这样的抗性菌或敏感性菌，具体而言，例如可以举出下述的菌株。
黄色短杆菌AJ3949(FERM BP-2632；参照日本特开昭50-113209)
谷氨酸棒状杆菌AJ11628(FERM P-5736；参照日本特开昭57-065198)
黄色短杆菌AJ11355(FERM P-5007；参照日本特开昭56-1889号公报)
谷氨酸棒状杆菌AJ11368(FERM P-5020；参照日本特开昭56-1889号公报)
黄色短杆菌AJ11217(FERM P-4318；参照日本特开昭57-2689号公报)
谷氨酸棒状杆菌AJ11218(FERM P-4319；参照日本特开昭57-2689号公报)
黄色短杆菌AJ11564(FERM P-5472；参照日本特开昭56-140895公报)
黄色短杆菌AJ11439(FERM P-5136；参照日本特开昭56-35981号公报)
谷氨酸棒状杆菌H7684(FERM BP-3004；参照日本特开平04-88994号公报)
乳酸发酵短杆菌AJ11426(FERM P-5123；参照日本特开平56-048890号公报)
谷氨酸棒状杆菌AJ11440(FERM P-5137；参照日本特开平56-048890号公报)
乳酸发酵短杆菌AJ11796(FERM P-6402；参照日本特开平58-158192号公报)
另外，作为对棒状杆菌型细菌赋予或增强L-谷氨酸生产能力的方法，也可以举出：增强yggB基因的表达的方法或导入在编码区域内导入了突变的突变型yggB基因的方法(WO2006/070944)。yggB基因为编码机械感应通路(mechanosensitive channel)的基因。谷氨酸棒状杆菌ATCC13032的yggB基因在以Genbank登录号NC_003450在NCBI数据库注册的基因组序列中，相当于1,336,091～1,337,692的序列的互补序列，也称为NCgl1221。谷氨酸棒状杆菌ATCC13032的yggB基因所编码的YggB蛋白质注册为GenBank登录号NP_600492。另外，将谷氨酸棒状杆菌2256(ATCC 13869)的yggB基因的碱基序列及相同基因编码的YggB蛋白质的氨基酸序列分别示于序列号21及22。
作为在此使用的突变型yggB基因，可以举出具有如下的突变的yggB基因。另外，也将突变型yggB基因所编码的YggB蛋白质称为突变型YggB蛋白质。另外，也将不具有该突变的yggB基因及被相同基因编码的YggB蛋白质分别称为野生型yggB基因及野生型YggB蛋白质。作为野生型YggB蛋白质，可以举出例如具有序列号22所示的氨基酸序列的蛋白质。
(1)C末端侧突变
C末端侧突变为导入到编码序列号22的氨基酸号419～533的序列的区域的碱基序列的一部分中的突变。C末端侧突变只要在上述区域的碱基序列中的至少一部分中导入有突变就没有特别限制，但优选插入有插入序列(以下也称为“IS”)或转座子的突变。C末端侧突变可以为伴随氨基酸取代的突变(错义突变)、通过上述IS等的插入导入移码突变的突变、导入有无义突变的突变中的任一者。作为具有C末端侧突变的突变型yggB基因，具体而言，例如可以举出在编码序列号22的419位的缬氨酸残基处插入有IS，编码总长比野生型YggB蛋白质(序列号22)短的423氨基残基的突变型YggB蛋白质的yggB基因(日本特开2007-222163)。将该突变型yggB基因(V419::IS)的碱基序列及相同基因编码的突变型YggB蛋白质的氨基酸序列分别示于序列号23及24。另外，作为C末端侧突变，也可以举出将存在于序列号22的氨基酸号419～533的区域内的脯氨酸取代为其它的氨基酸的突变。
(2)膜贯穿区域的突变
推测yggB基因编码的YggB蛋白质具有5个膜贯穿区域。在序列号22的野生型YggB蛋白质的氨基酸序列中，膜贯穿区域分别相当于氨基酸号1～23(第一膜贯穿区域)、25～47(第二膜贯穿区域)、62～84(第三膜贯穿区域)、86～108(第四膜贯穿区域)、110～132(第五膜贯穿区域)的区域。yggB基因可以在编码这些膜贯穿区域的区域内具有突变。膜贯穿区域的突变优选为含有1个或者多个氨基酸的取代、缺失、添加、插入或倒位的突变，且未伴随移码突变及无义突变。作为膜贯穿区域的突变，可以举出：在序列号22所示的氨基酸序列中，在14位的亮氨酸残基和15位的色氨酸残基间插入1个或多个氨基酸的突变、将100位的丙氨酸残基取代为其它的氨基酸残基的突变、将111位的丙氨酸残基取代为其它的氨基酸残基的突变等。具体地，“一个或多个”的数字优选是1至20，更优选1至10，仍更优选1至5，特别优选1至3。
另外，在野生型YggB蛋白质具有序列号22所示的氨基酸序列以外的氨基酸序列的情况下，突变型yggB基因只要在编码相当于序列号22中的上述处的氨基酸残基的氨基酸残基的区域具有突变即可。在任意的野生型YggB蛋白质中，任一氨基酸残基是否为“相当于序列号22中的上述处的氨基酸残基的氨基酸残基”可通过用该野生型YggB蛋白质的氨基酸序列和序列号22的氨基酸序列进行对准来确定。关于这样的突变型yggB基因及突变型YggB蛋白质的变体，可准用后述的关于突变型磷酸盐转运蛋白及编码其的基因的变体的记载。需要说明的是，所谓“序列号22的氨基酸号X”可以换一种读法为“序列号22的X位”。
<L-谷氨酰胺生产菌>
作为用于赋予或增强L-谷氨酰胺生产能力的方法，例如可以举出以选自L-谷氨酰胺生物合成体系酶中的1各或其以上的酶的活性增大的方式修饰细菌的方法。作为这样的酶，没有特别限制，可以举出：谷氨酸脱氢酶(gdhA)及谷氨酰胺合成酶(glnA)。
另外，作为用于赋予或增强L-谷氨酰胺生产能力的方法，例如也可以举出以选自催化从L-谷氨酰胺的生物合成途径中分支而生成L-谷氨酰胺以外的化合物的反应的酶中的1个或其以上的酶的活性降低的方式修饰细菌的方法。作为这样的酶，没有特别限制，可以举出谷氨酰胺酶。
作为L-谷氨酰胺生产菌或用于衍生其的亲株，可以举出增强了谷氨酸脱氢酶(gdhA)及/或谷氨酰胺合成酶(glnA)的活性的棒状杆菌型细菌(EP1229121、EP1424398)及谷氨酰胺酶活性降低了的棒状杆菌型细菌(日本特开2004-187684)。谷氨酰胺合成酶的活性增强也可通过谷氨酰胺腺嘌呤基转移酶基因(glnE)的破坏、PII调控蛋白质基因(glnB)的破坏来实现(EP1229121)。
另外，作为对棒状杆菌型细菌赋予或增强L-谷氨酰胺生产能力的方法，可以举出：赋予6-重氮-5-氧-正亮氨酸抗性的方法(日本特开平3-232497)、赋予嘌呤类似物抗性及甲硫氨酸亚砜抗性的方法(日本特开昭61-202694)、赋予α-酮马来酸抗性的方法(日本特开昭56-151495)。作为具有L-谷氨酰胺生产能力的棒状杆菌型细菌，具体而言，例如可以举出以下的菌株。
黄色短杆菌AJ11573(FERM P-5492、日本特开昭56-161495)
黄色短杆菌AJ11576(FERM BP-10381、日本特开昭56-161495)
黄色短杆菌AJ12212(FERM P-8123、日本特开昭61-202694)
<L-脯氨酸生产菌>
作为L-脯氨酸生产菌或用于衍生其的亲株，可以举出增强了选自L-脯氨酸生物合成体系酶中的1个或其以上的酶的活性的菌株。作为参与L-脯氨酸生物合成的酶，可以举出：谷氨酸5-激酶、γ-谷氨酰基-磷酸还原酶、吡咯啉-5-羧酸还原酶。酶活性的增强中例如可优选利用编码解除了L-脯氨酸导致的反馈抑制的谷氨酸激酶的proB基因(德国专利第3127361号)。
另外，作为L-脯氨酸生产菌或用于衍生其的亲株，也可以举出参与L-脯氨酸分解的酶的活性降低了的菌株。作为这样的酶，可以举出脯氨酸脱氢酶及鸟氨酸氨基转移酶。
<L-苏氨酸生产菌>
作为L-苏氨酸生产菌或用于衍生其的亲株，可以举出增强了选自L-苏氨酸生物合成体系酶中的1个或其以上的酶的活性的菌株。作为这样的酶，没有特别限制，可以举出：天冬氨酸激酶III(lysC)、天冬氨酸半醛脱氢酶(asd)、天冬氨酸激酶I(thrA)、高丝氨酸激酶(homoserine kinase)(thrB)、苏氨酸合酶(threonine synthase)(thrC)、天冬氨酸氨基转移酶(天冬氨酸转氨酶)(aspC)。在这些酶中，优选增强选自天冬氨酸激酶III、天冬氨酸半醛脱氢酶、天冬氨酸激酶I、高丝氨酸激酶、天冬氨酸氨基转移酶及苏氨酸合酶中的1个或其以上的酶的活性。L-苏氨酸生物合成体系基因可以导入到苏氨酸分解得到抑制的菌株中。
L-苏氨酸生物合成体系酶的活性被最终产物的L-苏氨酸抑制。因此，为了构建L-苏氨酸生产菌，优选以不接受L-苏氨酸导致的反馈抑制的方式修饰L-苏氨酸生物合成体系基因。上述thrA、thrB、thrC基因构成苏氨酸操纵子，苏氨酸操纵子形成衰减子结构。苏氨酸操纵子的表达被培养液中的异亮氨酸、苏氨酸抑制，通过衰减来抑制。苏氨酸操纵子的表达的增强可通过除去衰减区域的前导序列或者衰减子来实现(参照Lynn,S.P.,Burton,W.S.,Donohue,T.J.,Gould,R.M.,Gumport,R.I.,and Gardner,J.F.J.Mol.Biol.194:59-69(1987)；WO02/26993；WO2005/049808；WO2005/049808；WO2003/097839)。
在苏氨酸操纵子的上游存在固有的启动子，但可以将相同启动子取代为非天然的启动子(参照WO98/04715号小册子)。另外，参与苏氨酸生物合成的基因可以以在λ噬菌体的抑制物及启动子的调控下表达的方式构建苏氨酸操纵子(参照欧洲专利第0593792号说明书)。另外，以不接受L-苏氨酸导致的反馈抑制的方式修饰的细菌也可通过挑选对作为L-苏氨酸类似物的α-氨基-β-羟基戊酸(AHV)具有抗性的菌株来获得。
如上以不接受L-苏氨酸导致的反馈抑制的方式修饰的苏氨酸操纵子优选通过拷贝数的上升或者通过与强有力的启动子连结来提高宿主内的表达量。拷贝数的上升可通过将含有苏氨酸操纵子的质粒导入到宿主中来实现。另外，拷贝数的上升也可以通过利用转座子、Mu噬菌体等使苏氨酸操纵子转移到宿主的基因组上来实现。
编码大肠杆菌的天冬氨酸激酶高丝氨酸脱氢酶I的thrA基因已明确(核苷酸号337～2799,GenBank登录号NC_000913.2,gi:49175990)。thrA基因在大肠杆菌K-12的染色体中位于thrL基因和thrB基因之间。编码大肠杆菌的高丝氨酸激酶的thrB基因已明确(核苷酸号2801～3733,GenBank登录号NC_000913.2,gi:49175990)。thrB基因在大肠杆菌K-12的染色体中位于thrA基因和thrC基因之间。编码大肠杆菌的苏氨酸合酶的thrC基因已明确(核苷酸号3734～5020,GenBank登录号NC_000913.2,gi:49175990)。thrC基因在大肠杆菌K-12的染色体中位于thrB基因和yaaX开放阅读框之间。另外，含有对苏氨酸导致的反馈抑制具有抗性的编码天冬氨酸激酶高丝氨酸脱氢酶I的突变型thrA基因和野生型thrBC基因的thrA*BC操纵子可从存在于苏氨酸生产株大肠杆菌VKPM B-3996的众所周知的质粒pVIC40(美国专利第5,705,371号)中获得。
大肠杆菌的rhtA基因存在于接近编码谷氨酰胺传输体系的要素的glnHPQ操纵子的大肠杆菌染色体的18分(min)中。rhtA基因与ORF1(ybiF基因,核苷酸号764～1651,GenBank登录号AAA218541,gi:440181)相同，位于pexB基因和ompX基因之间。表达由ORF1编码的蛋白质的单位被称为rhtA基因(rht:抗高丝氨酸和苏氨酸(对高丝氨酸及苏氨酸具有抗性))。另外，判明赋予对高浓度的苏氨酸或高丝氨酸的抗性的rhtA23突变相对于ATG起始密码子为-1位的G→A取代(ABSTRACTS of the 17th International Congress ofBiochemistry and Molecular Biology in conjugation with Annual Meeting of theAmerican Society for Biochemistry and Molecular Biology,San Francisco,California August 24-29,1997,abstract No.457,EP 1013765 A)。
大肠杆菌的asd基因已明确(核苷酸号3572511～3571408,GenBank登录号NC_000913.1,gi:16131307)，可通过使用基于其基因的碱基序列所制作的引物的PCR来获得(参照White,T.J.et al.,Trends Genet.,5,185(1989))。其它的微生物的asd基因也可以同样地得到。
另外，大肠杆菌的aspC基因也已经明确(核苷酸号983742～984932,GenBank登录号NC_000913.1,gi:16128895)，可以通过使用基于其基因的碱基序列所制作的引物的PCR来得到。其它的微生物的aspC基因也可以同样地得到。
另外，作为具有L-苏氨酸生产能力的棒状杆菌型细菌，例如可以举出嗜乙酰乙酸棒状杆菌AJ12318(FERM BP-1172)(参照美国专利第5,188,949号)。
<L-赖氨酸生产菌>
作为L-赖氨酸生产菌或用于衍生其的亲株，可以举出增强了选自L-赖氨酸生物合成体系酶中的1个或其以上的酶的活性的菌株。作为这样的酶，没有特别限制，可以举出：二氢吡啶二羧酸合酶(dihydrodipicolinatesynthase)(dapA)、天冬氨酸激酶III(aspartokinase III)(lysC)、二氢吡啶二羧酸还原酶(dihydrodipicolinate reductase)(dapB)、二氨基庚二酸脱羧酶(diaminopimelate decarboxylase)(lysA)、二氨基庚二酸脱氢酶(diaminopimelatedehydrogenase)(ddh)(美国专利第6,040,160号)、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(phosphoenolpyrvate carboxylase)(ppc)、天冬氨酸半醛脱氢酶(aspartatesemialdehyde dehydrogenease)(asd)、天冬氨酸氨基转移酶(aspartateaminotransferase)(天冬氨酸转氨酶(aspartate transaminase))(aspC)、二氨基庚二酸差向异构酶(diaminopimelate epimerase)(dapF)、四氢吡啶二羧酸琥珀酰酶(tetrahydrodipicolinate succinylase)(dapD)、琥珀酰基二氨基庚二酸脱酰酶(succinyl-diaminopimelate deacylase)(dapE)及天冬酶(aspartase)(aspA)(EP1253195 A)。在这些酶中，例如优选增强选自二氢吡啶二羧酸还原酶、二氨基庚二酸脱羧酶、二氨基庚二酸脱氢酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、天冬氨酸氨基转移酶、二氨基庚二酸差向异构酶、天冬氨酸半醛脱氢酶、四氢吡啶二羧酸琥珀酰酶及琥珀酰基二氨基庚二酸脱酰酶中的1个或其以上的酶的活性。另外，在L-赖氨酸生产菌或用于衍生其的亲株中，参与能量效率的基因(cyo)(EP 1170376 A)、编码烟酰胺核苷酸转氢酶(nicotinamide nucleotidetranshydrogenase)的基因(pntAB)(美国专利第5,830,716号)、ybjE基因(WO2005/073390)或这些的组合的表达水平可以增大。由于天冬氨酸激酶III(lysC)接受L-赖氨酸导致的反馈抑制，因此，为了增强相同酶的活性，也可以利用编码解除了L-赖氨酸导致的反馈抑制的天冬氨酸激酶III的突变型lysC基因(美国专利5,932,453号说明书)。另外，由于二氢吡啶二羧酸合成酶(dapA)接受L-赖氨酸导致的反馈抑制，因此，为了增强相同酶的活性，也可以利用编码解除了L-赖氨酸导致的反馈抑制的二氢吡啶二羧酸合成酶的突变型dapA基因。
另外，作为L-赖氨酸生产菌或用于衍生其的亲株，也可以举出选自催化从L-赖氨酸的生物合成途径中分支而生成L-赖氨酸以外的化合物的反应的酶中的1个或其以上的酶的活性降低或缺损的菌株。作为这样的酶，没有特别限制，可以举出：高丝氨酸脱氢酶(homoserine dehydrogenase)、赖氨酸脱羧酶(lysine decarboxylase)(美国专利第5,827,698号)及苹果酸酶(malicenzyme)(WO2005/010175)。
另外，作为L-赖氨酸生产菌或用于衍生其的亲株，也可以举出对L-赖氨酸类似物具有抗性的突变株。L-赖氨酸类似物抑制肠内细菌科的细菌及棒状杆菌型细菌等细菌的生长，但该抑制在L-赖氨酸共存于培养基中时被完全或部分解除。作为L-赖氨酸类似物，没有特别限制，可以举出：噁溶菌素、赖氨酸氧肟酸、S-(2-氨基乙基)-L-半胱氨酸(AEC)、γ-甲基赖氨酸、α-氯己内酰胺。对这些赖氨酸类似物具有抗性的突变株可以通过对细菌施以通常的人工突变处理来得到。
另外，作为具有L-赖氨酸生产能力的棒状杆菌型细菌，具体而言，例如可以举出：AEC抗性突变株(乳酸发酵短杆菌AJ11082(NRRL B-11470)菌株等；参照日本特公昭56-1914号公报、日本特公昭56-1915号公报、日本特公昭57-14157号公报、日本特公昭57-14158号公报、日本特公昭57-30474号公报、日本特公昭58-10075号公报、日本特公昭59-4993号公报、日本特公昭61-35840号公报、日本特公昭62-24074号公报、日本特公昭62-36673号公报、日本特公平5-11958号公报、日本特公平7-112437号公报、日本特公平7-112438号公报)；其生长需要L-高丝氨酸等氨基酸的突变株(参照日本特公昭48-28078号公报、日本特公昭56-6499号公报)；对AEC显示抗性，进而需要L-亮氨酸、L-高丝氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-精氨酸、L-丙氨酸、L-缬氨酸等氨基酸的突变株(参照美国专利第3708395号及第3825472号说明书)；对DL-α-氨基-ε-己内酰胺、α-氨基-月桂基内酰胺、天冬氨酸类似物、磺胺剂、醌型化合物、N-月桂酰基亮氨酸显示抗性的突变株；显示相对于草酰乙酸脱羧酶抑制剂或呼吸体系酶抑制剂的抗性的突变株(日本特开昭50-53588号公报、日本特开昭50-31093号公报、日本特开昭52-102498号公报、日本特开昭53-9394号公报、日本特开昭53-86089号公报、日本特开昭55-9783号公报、日本特开昭55-9759号公报、日本特开昭56-32995号公报、日本特开昭56-39778号公报、日本特公昭53-43591号公报、日本特公昭53-1833号公报)；需要肌醇或醋酸的突变株(日本特开昭55-9784号公报、日本特开昭56-8692号公报)；对氟丙酮酸或34℃以上的温度显示敏感性的突变株(日本特开昭55-9783号公报、日本特开昭53-86090号公报)；对乙二醇显示抗性的突变株(美国专利第4411997号说明书)。
<L-精氨酸生产菌>
作为L-精氨酸生产菌或用于衍生其的亲株，可以举出增强了选自L-精氨酸生物合成体系酶中的1个或其以上的酶的活性的菌株。作为这样的酶，没有特别限制，可以举出：N-乙酰谷氨酰基磷酸还原酶(argC)、鸟氨酸乙酰转移酶(argJ)、N-乙酰谷氨酸激酶(argB)、乙酰鸟氨酸转氨酶(argD)、鸟氨酸氨基甲酰基转移酶(argF)、精氨基琥珀酸合成酶(argG)、精氨基琥珀酸裂合酶(argH)、氨基甲酰基磷酸合成酶(carAB)。作为N-乙酰谷氨酸合酶(argA)基因，例如若使用编码取代了相当于野生型的15位～19位的氨基酸残基且解除了L-精氨酸导致的反馈抑制的突变型N-乙酰谷氨酸合酶的基因，则优选(欧洲申请公开1170361号说明书)。
另外，作为L-精氨酸生产菌或用于衍生其的亲株，也可以举出对氨基酸类似物等具有抗性的菌株。作为这样的菌株，例如除2-噻唑丙氨酸抗性以外，还可以举出具有L-组氨酸、L-脯氨酸、L-苏氨酸、L-异亮氨酸、L-甲硫氨酸或L-色氨酸需要性的棒状杆菌型细菌株(日本特开昭54-44096号公报)；对酮丙二酸、氟丙二酸或单氟醋酸具有抗性的棒状杆菌型细菌株(日本特开昭57-18989号公报)；对精氨醇具有抗性的棒状杆菌型细菌株(日本特公昭62-24075号公报)；对X-胍(X为脂肪酸或脂肪链的衍生物)具有抗性的棒状杆菌型细菌株(日本特开平2-186995号公报)；对精氨酸氧肟酸及6-氮杂尿嘧啶具有抗性的棒状杆菌型细菌株(日本特开昭57-150381号公报)。作为具有L-精氨酸生产能力的棒状杆菌型细菌的具体例，可以举出如下所述的菌株。
黄色短杆菌AJ11169(FERM BP-6892)
乳酸发酵短杆菌AJ12092(FERM BP-6906)
黄色短杆菌AJ11336(FERM BP-6893)
黄色短杆菌AJ11345(FERM BP-6894)
乳酸发酵短杆菌AJ12430(FERM BP-2228)
<L-瓜氨酸生产菌及L-鸟氨酸生产菌>
L-瓜氨酸及L-鸟氨酸与L-精氨酸生物合成途径共通。因此，可以通过使N-乙酰谷氨酸合酶(argA)、N-乙酰谷氨酰基磷酸还原酶(argC)、鸟氨酸乙酰转移酶(argJ)、N-乙酰谷氨酸激酶(argB)、乙酰鸟氨酸转氨酶(argD)及/或乙酰鸟氨酸脱乙酰酶(argE)的酶活性上升来赋予或增强L-瓜氨酸及/或L-鸟氨酸的生产能力(国际公开2006-35831号小册子)。
<L-组氨酸生产菌>
作为L-组氨酸生产菌或用于衍生其的亲株，可以举出增强了选自L-组氨酸生物合成体系酶中的1个或其以上的酶的活性的菌株。作为这样的酶，没有特别限制，可以举出：ATP磷酸核糖转移酶(hisG)、磷酸核糖-AMP环水解酶(hisI)、磷酸核糖-ATP焦磷酸水解酶(hisI)、磷酸核糖亚胺甲基-5-氨基咪唑氨甲酰核糖酸异构酶(hisA)、酰胺转移酶(hisH)、组氨醇磷酸氨基转移酶(hisC)、组氨醇磷酸酶(hisB)、组氨醇脱氢酶(hisD)。
其中，hisG及hisBHAFI所编码的L-组氨酸生物合成体系酶已知被L-组氨酸抑制。因此，L-组氨酸生产能力例如可以通过在ATP磷酸核糖转移酶基因(hisG)中导入赋予对反馈抑制的抗性的突变来赋予或增强(俄罗斯专利第2003677号及第2119536号)。
<L-半胱氨酸生产菌>
作为L-半胱氨酸生产菌或用于衍生其的亲株，可以举出增强了选自L-半胱氨酸生物合成体系酶中的1个或其以上的酶的活性的菌株。作为这样的酶，没有特别限制，可以举出丝氨酸乙酰转移酶及3-磷酸甘油酸脱氢酶。丝氨酸乙酰转移酶活性例如可通过将编码对半胱氨酸导致的反馈抑制具有抗性的突变型丝氨酸乙酰转移酶的突变型cysE基因导入到细菌中来增强。突变型丝氨酸乙酰转移酶例如公开在日本特开平11-155571及美国专利公开第20050112731中。另外，3-磷酸甘油酸脱氢酶活性例如可通过将编码对丝氨酸导致的反馈抑制具有抗性的突变型3-磷酸甘油酸脱氢酶的突变型serA基因导入到细菌中来增强。突变型3-磷酸甘油酸脱氢酶例如公开在美国专利第6,180,373号中。
另外，作为L-半胱氨酸生产菌或用于衍生其的亲株，也可以举出选自催化从L-半胱氨酸的生物合成途径中分支而生成L-半胱氨酸以外的化合物的反应的酶中的1个或其以上的酶的活性降低或缺损的菌株。作为这样的酶，例如可以举出参与L-半胱氨酸的分解的酶。作为参与L-半胱氨酸的分解的酶，没有特别限制，可以举出半胱氨酸脱巯基酶(aecD)(日本特开2002-233384)。
另外，作为L-半胱氨酸生产菌或用于衍生其的亲株，也可以举出增强了L-半胱氨酸排出体系的菌株及增强了硫酸盐/硫代硫酸盐传输体系的菌株。作为L-半胱氨酸排出体系的蛋白质，可以举出：ydeD基因所编码的蛋白质(日本特开2002-233384)、yfiK基因所编码的蛋白质(日本特开2004-49237)、emrAB、emrKY、yojIH、acrEF、bcr及cusA各基因所编码的各蛋白质(日本特开2005-287333)、yeaS基因所编码的蛋白质(日本特开2010-187552)。作为硫酸盐/硫代硫酸盐传输体系的蛋白质，可以举出cysPTWAM基因簇所编码的蛋白质。
另外，作为具有L-半胱氨酸生产能力的棒状杆菌型细菌，可以举出通过保持减少了L-半胱氨酸导致的反馈抑制的丝氨酸乙酰转移酶来使细胞内的丝氨酸乙酰转移酶活性上升的棒状杆菌型细菌(日本特开2002-233384)。
<L-甲硫氨酸生产菌>
作为L-甲硫氨酸生产菌或用于衍生其的亲株，可以举出L-苏氨酸缺陷株及对正亮氨酸具有抗性的突变株(日本特开2000-139471)。另外，作为L-甲硫氨酸生产菌或用于衍生其的亲株，也可以举出保持对L-甲硫氨酸导致的反馈抑制具有抗性的突变型高丝氨酸转琥珀酰酶的菌株(日本特开2000-139471、US20090029424)。另外，由于L-甲硫氨酸能够以L-半胱氨酸为中间体进行生物合成，因此，也可以通过提高L-半胱氨酸的生产能力来提高L-甲硫氨酸的生产能力(日本特开2000-139471、US20080311632)。
<L-亮氨酸生产菌>
作为L-亮氨酸生产菌或用于衍生其的亲株，可以举出增强了选自L-亮氨酸生物合成体系酶中的1个或其以上的酶的活性的菌株。作为这样的酶，没有特别限制，可以举出leuABCD操纵子的基因所编码的酶。另外，在酶活性的增强中，例如可优选利用编码解除了L-亮氨酸导致的反馈抑制的异丙基苹果酸合酶的突变leuA基因(美国专利第6,403,342号)。
作为具有L-亮氨酸生产能力的棒状杆菌型细菌，例如可以举出对2-噻唑丙氨酸及β-羟基亮氨酸具有抗性，且异亮氨酸及甲硫氨酸需要性的乳酸发酵短杆菌AJ3718(FERM P-2516)。
<L-异亮氨酸生产菌>
作为用于赋予或增强L-异亮氨酸生产能力的方法，例如可以举出以选自L-异亮氨酸生物合成体系酶中的1个或其以上的酶的活性增大的方式修饰细菌的方法。作为这样的酶，没有特别限制，可以举出苏氨酸脱氨酶及乙酰羟酸合酶(日本特开平2-458号、FR 0356739及美国专利第5,998,178号)。
作为具有L-异亮氨酸生产能力的棒状杆菌型细菌，可以举出：扩增了编码支链氨基酸排出蛋白质的brnE基因的棒状杆菌型细菌(日本特开2001-169788)、通过与L-赖氨酸生产菌的原生质体融合来赋予L-异亮氨酸生产能力的棒状杆菌型细菌(日本特开昭62-74293)、增强了高丝氨酸脱氢酶的棒状杆菌型细菌(日本特开昭62-91193)、苏氨酸氧肟酸抗性株(日本特开昭62-195293)、α-酮丙二酸抗性株(日本特开昭61-15695)、甲基赖氨酸抗性株(日本特开昭61-15696)、黄色短杆菌AJ12149(FERM BP-759)(美国专利第4,656,135号)。
<L-缬氨酸生产菌>
作为L-缬氨酸生产菌或用于衍生其的亲株，可以举出增强了选自L-缬氨酸生物合成体系酶中的1个或其以上的酶的活性的菌株。作为这样的酶，没有特别限制，可以举出ilvGMEDA操纵子或ilvBNC操纵子的基因所编码的酶。ilvBN编码乙酰羟酸合酶，ilvC编码还原异构酶(国际公开00/50624号)。需要说明的是，ilvGMEDA操纵子及ilvBNC操纵子接受L-缬氨酸、L-异亮氨酸及/或L-亮氨酸导致的表达抑制(衰减)。因此，为了增强酶活性，优选除去或修饰衰减所需要的区域，解除生成的L-缬氨酸导致的表达抑制。另外，ilvA基因编码的苏氨酸脱氨酶为催化L-异亮氨酸生物合成体系的限速阶段即从L-苏氨酸向2-酮丁酸的脱氨基化反应的酶。因此，为了生产L-缬氨酸，优选破坏ilvA基因等来使苏氨酸脱氨酶活性降低。
另外，作为L-缬氨酸生产菌或用于衍生其的亲株，也可以举出选自催化从L-缬氨酸的生物合成途径中分支而生成L-缬氨酸以外的化合物的反应的酶中的1个或其以上的酶的活性降低了的菌株。作为这样的酶，没有特别限制，可以举出参与L-亮氨酸合成的苏氨酸脱水酶及参与D-泛酸合成的酶(国际公开00/50624号)。
另外，作为L-缬氨酸生产菌或用于衍生其的亲株，也可以举出对氨基酸类似物等具有抗性的菌株。作为这样的菌株，例如可以举出：L-异亮氨酸及L-甲硫氨酸需要性，以及对D-核糖、嘌呤核苷或嘧啶核苷具有抗性，且具有L-缬氨酸生产能力的棒状杆菌型细菌株(FERM P-1841、FERM P-29、日本特公昭53-025034)、对聚酮类具有抗性的棒状杆菌型细菌株(FERM P-1763、FERM P-1764、日本特公平06-065314)、在以醋酸为唯一的碳源的培养基中显示L-缬氨酸抗性，且在以葡萄糖为唯一的碳源的培养基中对丙酮酸类似物(氟丙酮酸等)具有敏感性的棒状杆菌型细菌株(FERM BP-3006、FERM BP-3007、专利3006929号)。
<L-丙氨酸生产菌>
作为L-丙氨酸生产菌或用于衍生其的亲株，可以举出缺失H+-ATPase的棒状杆菌型细菌(Appl Microbiol Biotechnol.2001 Nov；57(4):534-40)及增强了天冬氨酸β-脱羧酶活性的棒状杆菌型细菌(日本特开平07-163383)。
<L-色氨酸生产菌、L-苯丙氨酸生产菌、L-酪氨酸生产菌>
作为用于赋予或增强L-色氨酸生产能力、L-苯丙氨酸生产能力及/或L-酪氨酸生产能力的方法，例如可以举出以选自L-色氨酸、L-苯丙氨酸及/或L-酪氨酸的生物合成体系酶中的1个或其以上的酶的活性增大的方式修饰细菌的方法。
作为与这些芳香族氨基酸共通的生物合成体系酶，没有特别限制，可以举出：3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸合酶(aroG)、3-脱氢奎尼酸合酶(aroB)、莽草酸脱氢酶(aroE)、莽草酸激酶(aroL)、5-烯醇酸丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶(aroA)、分支酸合酶(aroC)(欧洲专利763127号)。编码这些酶的基因的表达可通过酪氨酸抑制物(tyrR)来控制，也可以通过使tyrR基因缺损来增强这些酶的活性(欧洲专利763127号)。
作为L-色氨酸生物合成体系酶，没有特别限制，可以举出：氨基苯甲酸合酶(trpE)、色氨酸合酶(trpAB)及磷酸甘油酸脱氢酶(serA)。例如可通过导入含有色氨酸操纵子的DNA来赋予或增强L-色氨酸生产能力。色氨酸合酶由由trpA及trpB基因所编码的α及β亚单位构成。由于氨基苯甲酸合酶接受L-色氨酸导致的反馈抑制，因此，为了增强相同酶的活性，可以利用编码导入了解除反馈抑制的突变的相同酶的基因。由于磷酸甘油酸脱氢酶接受L-丝氨酸导致的反馈抑制，因此，为了增强相同酶的活性，可以利用编码导入了解除反馈抑制的突变的相同酶的基因。进而，也可以通过增大由苹果酸合酶(aceB)、异柠檬酸裂合酶(aceA)及异柠檬酸脱氢酶激酶/磷酸酶(aceK)构成的操纵子(ace操纵子)的表达来赋予或增强L-色氨酸生产能力(WO2005/103275)。
作为L-苯丙氨酸生物合成体系酶，没有特别限制，可以举出分支酸变位酶及预苯酸脱水酶。分支酸变位酶及预苯酸脱水酶作为双功能酶由pheA基因编码。由于分支酸变位酶-预苯酸脱水酶接受L-苯丙氨酸导致的反馈抑制，因此，为了增强相同酶的活性，可以利用编码导入了解除反馈抑制的突变的相同酶的基因。
作为L-酪氨酸生物合成体系酶，没有特别限制，可以举出分支酸变位酶及预苯酸脱氢酶。分支酸变位酶及预苯酸脱氢酶作为双功能酶由tyrA基因编码。由于分支酸变位酶-预苯酸脱氢酶接受L-酪氨酸导致的反馈抑制，因此，为了增强相同酶的活性，可以利用编码导入了解除反馈抑制的突变的相同酶的基因。
L-色氨酸、L-苯丙氨酸及/或L-酪氨酸的生产菌可以以目标芳香族氨基酸以外的芳香族氨基酸的生物合成降低的方式进行修饰。另外，L-色氨酸、L-苯丙氨酸及/或L-酪氨酸的生产菌也可以以增强副产物的摄入体系的方式进行修饰。作为副产物，可以举出目标芳香族氨基酸以外的芳香族氨基酸。作为编码副产物的摄入体系的基因，例如可以举出：编码L-色氨酸的摄入体系的基因即tnaB及mtr、编码L-苯丙氨酸的摄入体系的基因即pheP、编码L-酪氨酸的摄入体系的基因即tyrP(EP1484410)。
作为具有L-色氨酸生产能力的棒状杆菌型细菌，可以举出：对磺胺胍具有抗性的谷氨酸棒状杆菌AJ12118(FERM BP-478日本专利01681002号)、导入有色氨酸操纵子的菌株(日本特开昭63240794号公报)、导入有编码源自棒状杆菌型细菌的莽草酸激酶的基因的菌株(日本特开01994749号公报)。
作为具有L-苯丙氨酸生产能力的棒状杆菌型细菌，例如可以举出：磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶或丙酮酸激酶活性降低了的谷氨酸棒状杆菌BPS-13菌株(FERM BP-1777)、谷氨酸棒状杆菌K77(FERM BP-2062)、谷氨酸棒状杆菌K78(FERM BP-2063)(欧洲专利公开公报331145号、日本特开平02-303495号)、酪氨酸缺陷株(日本特开平05-049489)。
作为具有L-酪氨酸生产能力的棒状杆菌型细菌，例如可以举出：谷氨酸棒状杆菌AJ11655(FERM P-5836)(日本特公平2-6517)、乳酸发酵短杆菌AJ12081(FERM P-7249)(日本特开昭60-70093)。
另外，作为赋予或增强L-氨基酸生产能力的方法，例如可以举出以从细菌的细胞中排出L-氨基酸的活性增大的方式修饰细菌的方法。排出L-氨基酸的活性例如可以通过使编码排出L-氨基酸的蛋白质的基因的表达上升来增大。作为编码排出各种氨基酸的蛋白质的基因，例如可以举出：b2682基因(ygaZ)、b2683基因(ygaH)、b1242基因(ychE)、b3434基因(yhgN)(日本特开2002-300874号公报)。
另外，作为赋予或增强L-氨基酸生产能力的方法，例如可以举出以参与糖代谢的蛋白质及参与能量代谢的蛋白质的活性增大的方式修饰细菌的方法。
作为参与糖代谢的蛋白质，可以举出参与糖的导入的蛋白质及解糖系酶。作为编码参与糖代谢的蛋白质的基因，可以举出：葡萄糖-6-磷酸异构酶基因(pgi；国际公开第01/02542号小册子)、磷酸烯醇式丙酮酸合酶基因(pps；欧洲申请公开877090号说明书)、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因(ppc；国际公开95/06114号小册子)、丙酮酸羧化酶基因(pyc；国际公开99/18228号小册子、欧洲申请公开1092776号说明书)、葡萄糖磷酸变位酶基因(pgm；国际公开03/04598号小册子)、果糖二磷酸醛缩酶基因(pfkB、fbp；国际公开03/04664号小册子)、丙酮酸激酶基因(pykF；国际公开03/008609号小册子)、转醛缩酶基因(talB；国际公开03/008611号小册子)、延胡索酸酶基因(fum；国际公开01/02545号小册子)、非PTS蔗糖导入基因(csc；欧洲申请公开149911号小册子)、蔗糖同化性基因(scrAB操纵子；国际公开第90/04636号小册子)。
作为编码参与能量代谢的蛋白质的基因，可以举出：转氢酶基因(pntAB；美国专利5,830,716号说明书)、细胞色素bo型氧化酶(cytochromoe bo typeoxidase)基因(cyoB；欧洲专利申请公开1070376号说明书)。
需要说明的是，上述的L-氨基酸生产菌的育种中所使用的基因只要不损伤所编码的蛋白质的功能就并不限定于上述例示的基因及具有公知的碱基序列的基因，也可以为其变体。例如L-氨基酸生产菌的育种中所使用的基因可以为编码在公知的蛋白质的氨基酸序列中具有1个或者多个位置取代、缺失、插入或添加1或多个氨基酸的氨基酸序列的蛋白质的基因。关于基因及蛋白质的变体，可准用后述的磷酸盐转运蛋白基因及涉及磷酸盐转运蛋白的变体的记载。
<1-2>磷酸盐转运蛋白活性的增强
本发明的细菌已经以磷酸盐转运蛋白活性增大的方式进行修饰。本发明的细菌可通过以磷酸盐转运蛋白活性增大的方式修饰具有L-氨基酸生产能力的棒状杆菌型细菌来获得。另外，本发明的细菌也可以通过在以磷酸盐转运蛋白活性增大的方式修饰棒状杆菌型细菌后，赋予或增强L-氨基酸生产能力来得到。需要说明的是，本发明的细菌可以通过以磷酸盐转运蛋白活性增大的方式进行修饰来获得L-氨基酸生产能力。用于构建本发明的细菌的改变可以以任意的顺序进行。
以下，对磷酸盐转运蛋白及编码其的基因进行说明。
在本发明中，所谓“磷酸盐转运蛋白”是指具有磷酸盐转运蛋白活性的蛋白质。在本发明中，所谓“磷酸盐转运蛋白活性”是指将无机磷酸(Pi)从细胞外摄入细胞内的活性。
作为磷酸盐转运蛋白，可以举出：低亲和性无机磷酸盐转运蛋白(low-affinity inorganic phosphate transporter；Pit)系及高亲和性磷酸盐特异性转运蛋白(high-affinity phosphate-specific transporter；Pst)系。作为编码磷酸盐转运蛋白的基因(也称为“磷酸盐转运蛋白基因”)，可以举出：编码Pit系的pitA基因及pitB基因、编码Pst系的pstSCAB基因(非专利文献1)。需要说明的是，Pst系以4个蛋白质(pstSCAB基因的产物)的复合物的形式发挥作用。
在本发明中，可以增大Pit系和Pst系中的任一活性。在本发明中，优选增大Pit系的活性，更优选增大pitA基因产物即PitA蛋白质的活性。
大肠杆菌K12 MG1655菌株的pitA基因相当于在NCBI数据库中注册为GenBank登录号NC_000913(VERSION NC_000913.2 GI:49175990)的基因组序列中的3635665～3637164位的序列。大肠杆菌K12 MG1655菌株的pitA基因与ECK3478、JW3460含义相同。另外，大肠杆菌K12 MG1655菌株的PitA蛋白质注册为GenBank登录号NP_417950(version NP_417950.1 GI:16131365、locus_tag＝"b3493")。将MG1655菌株的pitA基因的碱基序列及相同基因编码的PitA蛋白质的氨基酸序列分别示于序列号1及2。
菠萝泛菌LMG20103菌株的pitA基因相当于在NCBI数据库中注册为GenBank登录号NC_013956(VERSION NC_013956.2 GI:332139403)的基因组序列中的1397898～1399514位的序列的互补序列。另外，菠萝泛菌LMG20103菌株的PitA蛋白质注册为GenBank登录号YP_003519531(versionYP_003519531.1 GI:291616789、locus_tag＝"PANA_1236")。将菠萝泛菌LMG20103菌株的pitA基因的碱基序列及相同基因编码的PitA蛋白质的氨基酸序列分别示于序列号3及4。
谷氨酸棒状杆菌ATCC13032的pitA基因相当于在NCBI数据库中注册为GenBank登录号NC_003450(VERSION NC_003450.3 GI:58036263)的基因组序列中的481391～482776位的序列的互补序列。谷氨酸棒状杆菌ATCC13032的pitA基因与Cgl0460含义相同。另外，谷氨酸棒状杆菌ATCC13032的PitA蛋白质注册为GenBan登录号NP_599707(version NP_599707.1 GI:19551705、locus_tag＝"NCgl0445")。将谷氨酸棒状杆菌ATCC13032的pitA基因的碱基序列及相同基因编码的PitA蛋白质的氨基酸序列分别示于序列号25及26。另外，将谷氨酸棒状杆菌2256(ATCC 13869)的pitA基因的碱基序列及相同基因编码的PitA蛋白质的氨基酸序列分别示于序列号5及6。
磷酸盐转运蛋白只要具有磷酸盐转运蛋白活性，则可以为上述磷酸盐转运蛋白，例如各种PitA蛋白质的变体。需要说明的是，有时将这样的变体称为“保守变体”。作为保守变体，例如可以举出上述磷酸盐转运蛋白，例如各种PitA蛋白质的同源物及人工修饰体。
编码上述PitA蛋白质的同源的基因例如可以通过将上述pitA基因的碱基序列(序列号1、3、5或25)用作查询序列的BLAST检索及FASTA检索从公开数据库中容易地获得。另外，编码上述PitA蛋白质的同源物的基因例如可以通过以细菌或酵母的染色体为模板，将基于这些公知的基因序列制作的寡核苷酸用作引物的PCR来获得。
编码磷酸盐转运蛋白的保守变体的基因例如可以为如下所述的基因。即，磷酸盐转运蛋白基因只要编码具有磷酸盐转运蛋白活性的蛋白质，则可以为编码在上述氨基酸序列中具有在1个或者多个位置取代、缺失、插入或添加1个或多个氨基酸的氨基酸序列的蛋白质的基因。此时，磷酸盐转运蛋白活性相对于取代、缺失、插入或添加1个或多个氨基酸之前的蛋白质，通常可维持70％以上，优选80％以上，更优选90％以上。需要说明的是，上述“1个或多个”也根据氨基酸残基的蛋白质的立体结构中的位置及氨基酸残基的种类而不同，但具体而言是指优选1～20个，更优选1～10个，进一步优选1～5个，特别优选1～3个。
上述的1个或者多个氨基酸的取代、缺失、插入或添加为正常地维持蛋白质的功能的保守突变。保守突变的代表性的突变为保守取代。所谓保守取代，在取代部位为芳香族氨基酸的情况下，为在Phe、Trp、Tyr间互相取代的突变，在取代部位为疏水性氨基酸的情况下，为在Leu、Ile、Val间互相取代的突变，在为极性氨基酸的情况下，为在Gln、Asn间互相取代的突变，在为碱性氨基酸的情况下，为在Lys、Arg、His间互相取代的突变，在为酸性氨基酸的情况下，为在Asp、Glu间互相取代的突变，在为具有羟基的氨基酸的情况下，为在Ser、Thr间互相取代的突变。作为被视为保守取代的取代，具体而言，可以举出：从Ala向Ser或Thr的取代、从Arg向Gln、His或Lys的取代、从Asn向Glu、Gln、Lys、His或Asp的取代、从Asp向Asn、Glu或Gln的取代、从Cys向Ser或Ala的取代、从Gln向Asn、Glu、Lys、His、Asp或Arg的取代、从Glu向Gly、Asn、Gln、Lys或Asp的取代、从Gly向Pro的取代、从His向Asn、Lys、Gln、Arg或Tyr的取代、从Ile向Leu、Met、Val或Phe的取代、从Leu向Ile、Met、Val或Phe的取代、从Lys向Asn、Glu、Gln、His或Arg的取代、从Met向Ile、Leu、Val或Phe的取代、从Phe向Trp、Tyr、Met、Ile或Leu的取代、从Ser向Thr或Ala的取代、从Thr向Ser或Ala的取代、从Trp向Phe或Tyr的取代、从Tyr向His、Phe或Trp的取代及从Val向Met、Ile或Leu的取代。另外，如上所述的氨基酸的取代、缺失、插入、添加或倒位等中也包含因基于基因来源的生物的个体差、种类的不同的情况等天然产生的突变(突变体或突变体)而产生的氨基酸的取代、缺失、插入、添加或倒位等。
进而，具有如上所述的保守突变的基因可以为编码相对于上述氨基酸序列整体具有80％以上、优选90％以上、更优选95％以上、进一步优选97％以上、特别优选99％以上的同源性，且具有磷酸盐转运蛋白活性的蛋白质的基因。另外，在本说明书中，“同源性”(homology)是指“同一性”(identity)。
另外，磷酸盐转运蛋白基因可以为在严格的条件下与可由公知的基因序列制备的探针，例如相对于上述碱基序列的整体或一部分的互补序列杂交的DNA且该DNA编码具有磷酸盐转运蛋白活性的蛋白质。所谓“严格的条件”是指可形成所谓的特异性杂交且未形成非特异性杂交的条件。若示出一个例子，则可以举出：同源性较高的DNA彼此，例如具有80％以上、优选90％以上、更优选95％以上、更优选97％以上、特别优选99％以上的同源性的DNA彼此杂交，同源性比其低的DNA彼此不杂交的条件、或者通常的Southern杂交的清洗的条件即在相当于60℃、1×SSC、0.1％SDS、优选60℃、0.1×SSC、0.1％SDS、更优选68℃、0.1×SSC、0.1％SDS的盐浓度及温度下清洗1次、优选2～3次的条件。
如上所述，用于上述杂交的探针可以为基因的互补序列的一部分。如上所述的探针可以通过以基于公知的基因序列制作的寡核苷酸为引物，以含有这些碱基序列的DNA片段为模板的PCR来制作。例如，可以使用具有约300bp长度的DNA片段作为探针。特别地，在使用300bp左右的长度的DNA片段作为探针的情况下，作为杂交的清洗的条件，可以举出50℃、2×SSC、0.1％SDS。
另外，磷酸盐转运蛋白基因只要编码具有磷酸盐转运蛋白活性的蛋白质，则可以为任意的密码子取代为与其等价的密码子的基因。例如磷酸盐转运蛋白基因可以为以根据使用的宿主的密码子使用频度具有最佳的密码子的方式进行修饰而成的基因。
可以通过例如使用数学算法测定两种序列间的序列同一性的百分比。此类数学算法的非限制性例子包括Myers和Miller(1988)CABIOS 4:11-17的算法、Smith等(1981)Adv.Appl.Math.2:482的局部同源性算法、Needleman和Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48:443-453的同源性比对算法、Pearson和Lipman(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.85:2444-2448的用于搜索同源性的方法、和Karlin和Altschul(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:2264的算法的修改形式，诸如记载于Karlin和Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873-5877的算法。
通过使用基于此类数学算法的程序，可以实施用于测定序列同一性的序列比较(即比对)。程序可以由计算机适当执行。此类程序的例子包括但不限于PC/Gene程序(可购自Intelligenetics,Mountain View,Calif.)的CLUSTAL、ALIGN程序(Version 2.0)、和Wisconsin遗传学软件包，第8版(可购自GeneticsComputer Group(GCG),575Science Drive,Madison,Wis.,USA)的GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA、和TFASTA。可以例如通过使用初始参数实施使用这些程序的比对。CLUSTAL程序充分记载于Higgins et al.(1988)Gene73:237-244(1988),Higgins et al.(1989)CABIOS 5:151-153,Corpet et al.(1988)Nucleic Acids Res.16:10881-90,Huang et al.(1992)CABIOS 8:155-65及Pearson et al.(1994)Meth.Mol.Biol.24:307-331。
为了获得与靶核苷酸序列同源的核苷酸序列，特别地，例如可以通过使用具有得分100和字长度12的BLASTN程序实施BLAST核苷酸搜索。为了获得与靶蛋白同源的氨基酸序列，特别地，例如可以通过使用具有得分50和字长度3的BLASTX程序实施BLAST蛋白质搜索。关于BLAST核苷酸搜索和BLAST蛋白质搜索，参见http://www.ncbi.nlm.nih.gov。另外，为了比较目的，可以使用缺口BLAST(BLAST 2.0)以获得包含缺口的比对。另外，可以使用PSI-BLAST以实施用于检测序列间的远离关系的重复搜索。关于缺口BLAST和PSI-BLAST，参见Altschul et al.(1997)Nucleic Acids Res.25:3389。在使用BLAST、缺口BLAST、或PSI-BLAST时，可以使用每种程序(例如对于核苷酸序列为BLASTN，并且对于氨基酸序列为BLASTX)的初始参数。也可以手动实施比对。
两种序列间的序列同一性以在比对两种序列，使得彼此最大符合时两种序列中匹配的残基的比率计算。
需要说明的是，涉及上述的基因及蛋白质的变体的记载也可准用于L-氨基酸生物合成体系酶等任意的蛋白质及编码它们的基因。
<1-3>使蛋白质的活性增大的方法
以下，对增大蛋白质的活性的方法进行说明。
所谓“蛋白质的活性增大”是指相同蛋白质的每个细胞的活性相对于野生株或亲株等非修饰株增大。另外，也将“蛋白质的活性增大”称为“蛋白质的活性被增强”。所谓“蛋白质的活性增大”，具体而言，是指与非修饰株相比，相同蛋白质的每个细胞的分子数增加及/或相同蛋白质的每个分子功能增大。即，称为“蛋白质的活性增大”时的“活性”不仅限于蛋白质的催化活性，也可以指编码蛋白质的基因的转录量(mRNA量)或翻译量(蛋白质的量)。蛋白质的活性只要与非修饰株相比增大就没有特别限制，例如与非修饰株相比，可以上升至1.5倍以上、2倍以上或3倍以上。另外，所谓“蛋白质的活性增大”，不仅包含在原本具有靶的蛋白质的活性的菌株中使相同蛋白质的活性增大，而且包含对原本不存在靶的蛋白质的活性的菌株赋予相同蛋白质的活性。另外，结果，只要蛋白质的活性增大，则使宿主原本具有的靶蛋白质的活性弱化及/或缺损，此外，也可以导入优选的相同蛋白质。
蛋白质的活性增大这样的修饰例如可通过使编码相同蛋白质的基因的表达上升来实现。另外，也将“基因的表达上升”称为“基因的表达被增强”。基因的表达例如与非修饰株相比可以上升至1.5倍以上、2倍以上或3倍以上。另外，所谓“基因的表达上升”不仅包含在原本靶基因表达的菌株中使相同基因的表达量上升，而且包含在原本靶基因未表达的菌株中使相同基因表达。即，所谓“基因的表达上升”例如包含在未保持靶基因的菌株中导入相同基因使相同基因表达。
基因的表达的上升例如可通过增加基因的拷贝数来实现。
基因的拷贝数的增加可通过向宿主的染色体导入相同基因来实现。向染色体的基因的导入例如可以利用同源重组进行(MillerI,J.H.Experiments inMolecular Genetics,1972,Cold Spring Harbor Laboratory)。基因可以仅导入1拷贝，也可以导入2拷贝以上。例如可以通过以染色体上存在多个拷贝的序列为靶进行同源重组来向染色体导入基因的多个拷贝。作为染色体上存在多个拷贝的序列，可以举出：反复DNA序列(repetitive DNA)、存在于转座子的两端的反向重复序列。另外，也可以以L-氨基酸生产所不需要的基因等的染色体上的适当的序列为靶进行同源重组。同源重组例如可以通过Red驱动整合(Red-driven integration)法(Datsenko,K.A,and Wanner,B.L.Proc.Natl.Acad.Sci.U S A.97:6640-6645(2000))等使用直链状DNA的方法、使用含有温度敏感性复制起点的质粒的方法、使用可接合转移的质粒的方法、使用不具有在宿主内发挥作用的复制起点的自杀载体的方法、或使用了噬菌体的转导法来进行。另外，基因也可以使用转座子或Mini-Mu随机地导入到染色体上(日本特开平2-109985号公报、US5,882,888、EP805867B1)。
在染色体上导入有靶基因的确认可通过使用了具有与相同基因的全部或一部分互补的序列的探针的Southern杂交、或使用了基于相同基因的序列制作的引物的PCR等来确认。
另外，基因的拷贝数的增加也可通过将含有靶基因的载体导入到宿主中来实现。例如可以通过将含有靶基因的DNA片段与在宿主中发挥作用的载体连结而构建相同基因的表达载体，在该表达载体中转化宿主来增加相同基因的拷贝数。含有靶基因的DNA片段例如可通过以具有靶基因的微生物的基因组DNA为模板的PCR来获得。作为载体，可以使用能够在宿主的细胞内自主复制的载体。载体优选为多拷贝载体。另外，为了选择转化体，优选载体具有抗生素抗性基因等标记物。载体例如可以为源自细菌质粒的载体、源自酵母质粒的载体、源自细菌噬菌体的载体、粘粒或噬菌粒等。作为可在棒状杆菌型细菌中自主复制的载体，具体而言，例如可以举出：pHM1519(Agric,Biol.Chem.,48,2901-2903(1984))；pAM330(Agric.Biol.Chem.,48,2901-2903(1984))；具有改良了这些载体的药剂抗性基因的质粒；日本特开平3-210184号公报中记载的质粒pCRY30；日本特开平2-72876号公报及美国专利5,185,262号说明书公报中记载的质粒pCRY21、pCRY2KE、pCRY2KX、pCRY31、pCRY3KE及pCRY3KX；日本特开平1-191686号公报中记载的质粒pCRY2及pCRY3；日本特开昭58-192900号公报中记载的pAJ655、pAJ611及pAJ1844；日本特开昭57-134500号公报中记载的pCG1；日本特开昭58-35197号公报中记载的pCG2；日本特开昭57-183799号公报中记载的pCG4及pCG11。
在导入基因的情况下，基因只要可表达地保持在本发明的细菌中即可。具体而言，基因只要以接受在本发明的细菌中发挥作用的启动子序列的控制而表达的方式导入即可。启动子可以为源自宿主的启动子，也可以为源自异种的启动子。启动子可以为导入的基因的固有的启动子，也可以为其它的基因的启动子。作为启动子，例如可以利用如后所述的更强有力的启动子。
另外，在导入2个或其以上的基因的情况下，各基因只要可表达地保持在本发明的细菌中即可。例如各基因可以全部保持在单一的表达载体上，也可以全部保持在染色体上。另外，各基因可以分别保持在多个表达载体上，也可以分别保持在单一或多个表达载体上和染色体上。另外，可以采用2个或其以上的基因构成操纵子来导入。
所导入的基因只要编码在宿主中发挥作用的蛋白质就没有特别限制。所导入的基因可以为源自宿主的基因，也可以为源自异种的基因。
另外，基因的表达的上升可通过提高基因的转录效率来实现。基因的转录效率的提高例如可通过将染色体上的基因的启动子取代为更强有力的启动子来实现。所谓“更强有力的启动子”是指基因的转录比原本存在的野生型的启动子提高的启动子。另外，作为能够在棒状杆菌型细菌中利用的更强有力的启动子，可以举出：人工设计变更而成的P54-6启动子(Appl.Microbiol.Biotechnolo.,53,674-679(2000))、能够在棒状杆菌型细菌内用醋酸、乙醇、丙酮酸等衍生的pta、aceA、aceB、adh、amyE启动子、在棒状杆菌型细菌内表达量多的强有力的启动子即cspB、SOD、tuf启动子(Journal ofBiotechnology 104(2003)311-323,Appl Environ Microbiol.2005Dec；71(12):8587-96.)、lac启动子、tac启动子、trc启动子。另外，作为更强有力的启动子，可以通过使用各种报告基因来获得原有的启动子中的高活性的启动子。例如可以通过使启动子区域内的-35、-10区域接近于共有序列来提高启动子的活性(国际公开第00/18935号)。启动子的强度的评价法及强有力的启动子的例子记载在Goldstein等的论文(Prokaryotic promoters inbiotechnology.Biotechnol.Annu.Rev.,1,105-128(1995))等中。
另外，基因的表达的上升可通过提高基因的翻译效率来实现。基因的翻译效率的提高例如可通过将染色体上的基因的夏因-达尔加诺(SD)序列(也称为核糖体结合部位(RBS))取代为更强有力的SD序列来实现。所谓“更强有力的SD序列”是指mRNA的翻译比原本存在的野生型的SD序列提高的SD序列。作为更强有力的SD序列，例如可以举出源自噬菌体T7的基因10的RBS(Olins P.O.et al,Gene,1988,73,227-235)。进而，已知RBS和起始密码子之间的间隔区域、特别是起始密码子的近上游的序列(5’-UTR)中的多个核苷酸的取代、或者插入、或者缺失对mRNA的稳定性及翻译效率造成非常大的影响，也可以通过改变这些来提高基因的翻译效率。
在本发明中，也将影响到启动子、SD序列及RBS和起始密码子之间的间隔区域等基因的表达的部位统称为“表达调节区域”。表达调节区域可以使用启动子检索载体及GENETYX等基因分析软件来确定。这些表达调节区域的修饰例如可以通过使用了温度敏感性载体的方法及Red驱动整合法(WO2005/010175)来进行。
基因的翻译效率的提高例如也可通过改变密码子来实现。例如在进行基因的异种表达等的情况下，可以通过将存在于基因中的稀有密码子取代为以更高频度利用的同义密码子来提高基因的翻译效率。密码子的取代例如可以通过在DNA的目标部位导入目标突变的部位特异性突变法来进行。另外，可以全合成取代了密码子的基因片段。各种生物中的密码子的使用频度公开在“密码子使用数据库”(http://www.kazusa.or.jp/codon；Nakamura,Y.et al,Nucl.Acids Res.,28,292(2000))中。
另外，基因的表达的上升也可通过扩增使基因的表达上升这样的调节基因、或缺失或弱化使基因的表达降低这样的调节基因来实现。
如上所述的使基因的表达上升的方法可以单独使用，也可以以任意的组合使用。
另外，酶活性增大这样的改变例如也可通过增强酶的比活性来实现。比活性得到增强的酶例如可以探索各种生物来获得。另外，也可以通过在原有的酶中导入突变来获得高活性的酶。比活性的增强可以单独使用，也可以与如上所述的使基因的表达增强的方法任意地组合使用。
磷酸盐转运蛋白的活性例如也可以通过使编码具有“特定的突变”的磷酸盐转运蛋白的磷酸盐转运蛋白基因保持在宿主中来增大。在本发明中，也将具有该“特定的突变”的磷酸盐转运蛋白称为突变型磷酸盐转运蛋白，将编码其的基因称为突变型磷酸盐转运蛋白基因。另外，在本发明中，也将不具有该“特定的突变”的磷酸盐转运蛋白称为野生型磷酸盐转运蛋白，将编码其的基因称为野生型磷酸盐转运蛋白基因。具有该“特定的突变”的突变型磷酸盐转运蛋白与野生型磷酸盐转运蛋白相比，可以具有较高的比活性。
作为野生型磷酸盐转运蛋白，可以举出不具有“特定的突变”的PitA蛋白质(野生型PitA蛋白质)。作为突变型磷酸盐转运蛋白，可以举出具有“特定的突变”的PitA蛋白质(突变型PitA蛋白质)。也将编码野生型PitA蛋白质的基因称为野生型pitA基因，将编码突变型PitA蛋白质的基因称为突变型pitA基因。作为野生型PitA蛋白质，可以举出上述例示的各种PitA蛋白质及其保守变体即不具有“特定的突变”的蛋白质。即，突变型磷酸盐转运蛋白除具有“特定的突变”以外，例如可以与选自上述例示的各种PitA蛋白质及其保守变体中的任一蛋白质相同。
具体而言，例如突变型磷酸盐转运蛋白可以为除具有“特定的突变”以外，具有序列号2、4、6或26所示的氨基酸序列的蛋白质。另外，具体而言，例如突变型磷酸盐转运蛋白可以为除具有“特定的突变”以外，具有在序列号2、4、6或26所示的氨基酸序列中含有1个或者多个氨基酸的取代、缺失、插入或添加的氨基酸序列的蛋白质。另外，具体而言，例如突变型磷酸盐转运蛋白可以为除具有“特定的突变”以外，具有相对于序列号2、4、6或26所示的氨基酸序列具有80％以上、优选90％以上、更优选95％以上、更优选97％以上、特别优选99％以上的同源性的氨基酸序列的蛋白质。另外，在本说明书中，“同源性”意指“同一性”。
另外，换言之，突变型磷酸盐转运蛋白可以为在上述例示的各种PitA蛋白质中具有“特定的突变”，且在该“特定的突变”以外的位置还含有保守突变的变体。
具体而言，例如突变型磷酸盐转运蛋白可以为在序列号2、4、6或26所示的氨基酸序列中具有“特定的突变”，且具有在该“特定的突变”以外的位置还含有1个或者多个氨基酸的取代、缺失、插入或添加的氨基酸序列的蛋白质。
特别地，“一个或多个”的数字优选是1至20，更优选1至10，仍更优选1至5，特别优选1至3。一个或多个氨基酸残基的前述取代、缺失、插入或添加是维持蛋白质的正常功能的保守突变。保守突变的典型例子是保守取代。保守取代是如下的取代，其中若取代位点是芳香族氨基酸，则取代在Phe、Trp、和Tyr间互相发生；若它是疏水性氨基酸，则取代在Leu、Ile、和Val间互相发生；若它是极性氨基酸，则取代在Gln和Asn间互相发生；若它是碱性氨基酸，则取代在Lys、Arg、和His间互相发生；若它是酸性氨基酸，则取代在Asp和Glu间互相发生；并且如它是具有羟基基团的氨基酸，则取代在Ser和Thr间互相发生。视为保守取代的取代的例子特别包括用Ser或Thr取代Ala，用Gln、His、或Lys取代Arg，用Glu、Gln、Lys、His、或Asp取代Asn，用Asn、Glu、或Gln取代Asp，用Ser或Ala取代Cys，用Asn、Glu、Lys、His、Asp、或Arg取代Gln，用Gly、Asn、Gln、Lys、或Asp取代Glu，用Pro取代Gly，用Asn、Lys、Gln、Arg、或Tyr取代His，用Leu、Met、Val、或Phe取代Ile，用Ile、Met、Val、或Phe取代Leu，用Asn、Glu、Gln、His、或Arg取代Lys，用Ile、Leu、Val、或Phe取代Met，用Trp、Tyr、Met、Ile、或Leu取代Phe，用Thr或Ala取代Ser，用Ser或Ala取代Thr，用Phe或Tyr取代Trp，用His、Phe、或Trp取代Tyr，和用Met、Ile、或Leu取代Val。此外，如上文提及的氨基酸残基的此类取代、缺失、插入、添加、倒位等包括因个体差异、或基因来源的生物的种类差异所致的天然存在的突变(突变体或变体)。
作为“特定的突变”，例如可以举出相当于序列号6的246位的苯丙氨酸残基的氨基酸残基被取代为苯丙氨酸以外的氨基酸残基的突变。取代后的氨基酸残基只要为苯丙氨酸以外的氨基酸且为天然型氨基酸，则任一氨基酸均可，选自赖氨酸、谷氨酸、酪氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、精氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸、色氨酸、甘氨酸、丙氨酸、组氨酸，但特别优选丝氨酸。
所谓氨基酸序列中的“X位”是指从相同氨基酸序列的N末端数第X个位置，N末端的氨基酸残基为1位的氨基酸残基。需要说明的是，氨基酸残基的位置显示相对位置，有时其绝对位置因氨基酸的缺失、插入、添加等而颠倒。即，所谓“相当于序列号6的246位的苯丙氨酸残基的氨基酸残基”是指在序列号6中比246位更靠N末端侧的1个氨基酸残基缺失的情况下，从N末端数第245个氨基酸残基。另外，所谓“相当于序列号6的246位的苯丙氨酸残基的氨基酸残基”是指在序列号6中比246位更靠N末端侧插入有1个氨基酸残基的情况下，从N末端数第247个氨基酸残基。
在任意的氨基酸序列中，任一氨基酸残基是否为“相当于序列号6的246位的苯丙氨酸残基的氨基酸残基”可以用该任意的氨基酸序列和序列号6的氨基酸序列进行对准来确定。对准例如可以利用公知的基因分析软件进行。作为具体的软件，可以举出日立Solutions制的DNASIS及Genetyx制的GENETYX等(Elizabeth C.Tyler et al.,Computers and Biomedical Research,24(1),72-96,1991；Barton GJ et al.,Journal of molecular biology,198(2),327-37.1987)。
需要说明的是，在本发明中，在野生型磷酸盐转运蛋白具有序列号6所示的氨基酸序列以外的氨基酸序列的情况下，“相当于序列号6的246位的苯丙氨酸残基的氨基酸残基”有时可以不是苯丙氨酸残基。即，例如对“相当于序列号6的246位的苯丙氨酸残基的氨基酸残基被丝氨酸残基取代的突变”而言，并不限于在野生型酸性磷酸盐转运蛋白中相当于序列号6所示的氨基酸序列中的246位的苯丙氨酸残基的氨基酸残基为苯丙氨酸残基的情况下将该苯丙氨酸残基取代为丝氨酸残基的突变，也包含在野生型酸性磷酸盐转运蛋白中相当于序列号6所示的氨基酸序列中的246位的苯丙氨酸残基的氨基酸残基为苯丙氨酸残基及丝氨酸残基以外的任一氨基酸残基的情况下将该氨基酸残基取代为丝氨酸残基的突变。
突变型磷酸盐转运蛋白基因可通过以所编码的磷酸盐转运蛋白具有“特定的突变”的方式修饰野生型磷酸盐转运蛋白基因来获得。野生型磷酸盐转运蛋白基因可以为源自导入突变型磷酸盐转运蛋白基因的宿主的基因，也可以为源自异种的基因。DNA的修饰可以通过公知的方法进行。具体而言，例如，作为在DNA的目标部位导入目标突变的部位特异突变法，可以举出：使用PCR的方法(Higuchi,R.,61,in PCR technology,Erlich,H.A.Eds.,Stocktonpress(1989)；Carter,P.,Meth.in Enzymol.,154,382(1987))及使用噬菌体的方法(Kramer,W.and Frits,H.J.,Meth.in Enzymol.,154,350(1987)；Kunkel,T.A.et al.,Meth.in Enzymol.,154,367(1987))。另外，突变型磷酸盐转运蛋白基因也可通过化学合成来获得。
可以通过将突变型磷酸盐转运蛋白基因导入到棒状杆菌型细菌中来使突变型磷酸盐转运蛋白基因保持在棒状杆菌型细菌中。将突变型磷酸盐转运蛋白基因导入到棒状杆菌型细菌中的方法没有特别限制，可以使用现有已知的方法。例如可以与增加上述的基因的拷贝数的方法同样地将突变型磷酸盐转运蛋白基因导入到棒状杆菌型细菌中。另外，也可以通过自然突变及突变原处理以所编码的磷酸盐转运蛋白具有“特定的突变”的方式修饰棒状杆菌型细菌具有的野生型磷酸盐转运蛋白基因。在本发明的细菌保持突变型磷酸盐转运蛋白基因的情况下，本发明的细菌可以具有野生型磷酸盐转运蛋白基因，也可以不具有。本发明的细菌也可以具有1种以上的拷贝的突变型磷酸盐转运蛋白基因。
转化的方法没有特别限定，可以使用现有已知的方法。例如可以使用如关于大肠杆菌K-12所报告那样的用氯化钙处理受体菌细胞而增加DNA的透过性的方法(Mandel,M.and Higa,A.,J.Mol.Biol.1970,53,159-162)、及如关于枯草芽孢杆菌所报告那样的由增殖阶段的细胞制备感应细胞而导入DNA的方法(Duncan,C.H.,Wilson,G.A.and Young,F.E..,1997.Gene 1:153-167)。或者，也可应用如关于枯草芽孢杆菌、放线菌类及酵母已知那样的使DNA受体菌的细胞成为容易摄入重组DNA的原生质体或原生质球的状态将重组DNA导入到DNA受体菌中的方法(Chang,S.and Choen,S.N.,1979.Mol.Gen.Genet.168:111-115；Bibb,M.J.,Ward,J.M.and Hopwood,O.A.1978.Nature 274:398-400；Hinnen,A.,Hicks,J.B.and Fink,G.R.1978.Proc.Natl.Acad.Sci.USA75:1929-1933)。进而，可以利用关于棒状杆菌型细菌所报告的电脉冲法(日本特开平2-207791)。
蛋白质的活性增大可通过测定相同蛋白质的活性来确认。磷酸盐转运蛋白活性例如可通过利用公知的方法测定无机磷酸的摄入来测定(R.M.Harriset al.,Journal of Bacteriology,Sept.2001,p5008-5014)。
蛋白质的活性增大也可通过确认编码相同蛋白质的基因的表达上升来确认。基因的表达上升可通过确认相同基因的转录量上升或通过确认由相同基因表达的蛋白质的量上升来确认。
基因的转录量上升的确认可以通过将由相同基因所转录的mRNA的量与野生株或亲株等非修饰株相比来进行。作为评价mRNA的量的方法，可以举出：印迹杂交、RT-PCR等(Sambrook,J.,et al.,Molecular Cloning A LaboratoryManual/Third Edition,Cold spring Harbor Laboratory Press,Cold spring Harbor(USA),2001)。mRNA的量与非修饰株相比例如可以上升至1.5倍以上、2倍以上或3倍以上。
蛋白质的量上升的确认可以使用抗体通过蛋白质印迹法来进行(Molecular cloning(Cold spring Harbor Laboratory Press,Cold spring Harbor(USA),2001))。蛋白质的量与非修饰株相比，例如可以上升至1.5倍以上、2倍以上或3倍以上。
增大上述的蛋白质的活性的方法除磷酸盐转运蛋白的活性增强以外，可用于任意的蛋白质，例如L-氨基酸生物合成体系酶的活性增强及任意的基因，例如编码这些任意的蛋白质的基因的表达增强。
<1-4>使蛋白质的活性降低的方法
以下，对降低蛋白质的活性的方法进行说明。
所谓“蛋白质的活性降低”是指相同蛋白质的每个细胞的活性与野生株或亲株等非修饰株相比减少，包括活性完全消失的情况。所谓“蛋白质的活性降低”，具体而言是指与非修饰株相比，相同蛋白质的每个细胞的分子数降低及/或相同蛋白质的每个分子功能降低。即，称为“蛋白质的活性降低”时的“活性”不仅限于蛋白质的催化活性，也可以指编码蛋白质的基因的转录量(mRNA量)或翻译量(蛋白质的量)。需要说明的是，“蛋白质的每个细胞的分子数降低”中包含相同蛋白质完全不存在的情况。另外，“蛋白质的每个分子的功能降低”中包含相同蛋白质的每个分子的功能完全消失的情况。蛋白质的活性只要与非修饰株相比降低就没有特别限制，例如与非修饰株相比，可以降低至50％以下、20％以下、10％以下、5％以下或0％。
蛋白质的活性降低这样的修饰例如可通过使编码相同蛋白质的基因的表达降低来实现。“基因的表达降低”中包含相同基因完全未表达的情况。另外，也将“基因的表达降低”称为“基因的表达得到弱化”。基因的表达例如与非修饰株相比可以降低至50％以下、20％以下、10％以下、5％以下或0％。
基因的表达的降低例如可以为转录效率的降低导致的，也可以为翻译效率的降低导致的，还可以为它们的组合导致的。基因的表达的降低例如可通过改变基因的启动子及夏因-达尔加诺(SD)序列等表达调节序列来实现。在改变表达调节序列的情况下，表达调节序列可优选改变1碱基以上，更优选2碱基以上，特别优选3碱基以上。另外，可以使表达调节序列的一部分或全部缺失。另外，基因的表达的降低例如也可通过操作与表达调控相关的因子来实现。作为与表达调控相关的因子，可以举出：与转录及翻译调控相关的低分子(衍生物质、抑制物质等)、蛋白质(转录因子等)、核酸(siRNA等)等。
另外，蛋白质的活性降低这样的修饰例如可通过破坏编码相同蛋白质的基因来实现。基因的破坏例如可通过使染色体上的基因的编码区域的一部分或全部缺损来实现。进而，包含染色体上的基因的前后的序列在内，也可以使基因整体缺失。只要可实现蛋白质的活性的降低，则缺失的区域可以为N末端区域、内部区域、C末端区域等中的任一区域。通常缺失的区域较长的一方能够可靠地使基因失活。另外，优选缺失的区域的前后的序列的阅读框不一致。
另外，基因的破坏例如可通过在染色体上的基因的编码区域中导入氨基酸取代(错义突变)、导入终止密码子(无义突变)、或者导入添加或缺失1～2个碱基的移码突变等来实现(Journal of Biological Chemistry 272:8611-8617(1997)Proceedings of the National Academy of Sciences,USA 95 5511-5515(1998),Journal of Biological Chemistry 26 116,20833-20839(1991))。
另外，基因的破坏例如也可通过在染色体上的基因的编码区域中插入其它的序列来实现。插入部位可以为基因的任一区域，但插入的序列较长的一方能够可靠地使基因失活。另外，优选插入部位的前后的序列的阅读框不一致。作为其它的序列，只要使所编码的蛋白质的活性降低或消失就没有特别限制，例如可以举出抗生素抗性基因等标记基因及对异种蛋白质生产有用的基因。
如上修饰染色体上的基因例如可通过如下操作实现：制作缺失基因的部分序列，以不会产生正常起作用的蛋白质的方式进行修饰的缺失型基因，在含有该缺失型基因的重组DNA中转化宿主，在缺失型基因和染色体上的野生型基因中产生同源重组，由此将染色体上的野生型基因取代为缺失型基因。此时，若使重组DNA根据宿主的营养缺陷性等性状而预先含有标记基因，则容易操作。即使生成由缺失型基因编码的蛋白质也具有与野生型蛋白质不同的立体结构，功能降低或消失。利用了这样的同源重组的基因取代导致的基因破坏已经确立，有被称为“Red驱动整合(Red-driven integration)”的方法(Datsenko,K.A,and Wanner,B.L.Proc.Natl.Acad.Sci.U S A.97:6640-6645(2000))、组合了Red驱动整合法和源自λ噬菌体的切出系统(Cho,E.H.,Gumport,R.I.,Gardner,J.F.J.Bacteriol.184:5200-5203(2002))的方法(参照WO2005/010175号)等使用直链状DNA的方法、及使用含有温度敏感性复制起点的质粒的方法、使用可接合转移的质粒的方法、使用不具有在宿主内发挥作用的复制起点的自杀载体的方法等(美国专利第6303383号、日本特开平05-007491号)。
另外，蛋白质的活性降低这样的修饰例如可以通过突变处理来进行。作为突变处理，可以举出：利用X射线或者紫外线的照射、或N-甲基-N'-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)、甲磺酸乙酯(EMS)、甲磺酸甲酯(MMS)等突变剂进行的通常的突变处理。
蛋白质的活性降低可通过测定相同蛋白质的活性来确认。
基因的表达降低可通过确认相同基因的转录量降低、或通过确认由相同基因表达的蛋白质的量降低来确认。
基因的转录量降低的确认可以通过将由相同基因所转录的mRNA的量与非修饰株相比来进行。作为评价mRNA的量的方法，可以举出：印迹杂交、RT-PCR等(Molecular cloning(Cold spring Harbor Laboratory Press,Cold springHarbor(USA),2001))。mRNA的量与非修饰株相比，例如可以降低至50％以下、20％以下、10％以下、5％以下或0％。
蛋白质的量降低的确认可以使用抗体通过蛋白质印迹法来进行(Molecular cloning(Cold spring Harbor Laboratory Press,Cold spring Harbor(USA),2001))。蛋白质的量与非修饰株相比，例如可以降低至50％以下、20％以下、10％以下、5％以下或0％。
基因被破坏可以根据用于破坏的方法确认相同基因的一部分或全部的碱基序列、限制酶图谱或总长等来确认。
降低上述的蛋白质的活性的方法可用于任意的蛋白质，例如催化从目标L-氨基酸的生物合成途径中分支而生成目标L-氨基酸以外的化合物的反应的酶的活性降低、任意的基因，例如编码这些任意的蛋白质的基因的表达降低。
<2>本发明的L-氨基酸的制造方法
本发明的方法为包含在培养基中培养本发明的细菌及从该培养基中采集L-氨基酸的L-氨基酸的制造方法。
使用的培养基只要本发明的细菌能够增殖且可生产目标L-氨基酸就没有特别限制。作为培养基，例如可以使用细菌等细菌的培养中所使用的通常的培养基。作为培养基，例如可以使用根据需要含有选自碳源、氮源、磷酸源、硫源、其它的各种有机成分及无机成分中的成分的培养基。培养基成分的种类及浓度可以根据使用的细菌的种类及制造的氨基酸的种类等诸条件适宜设定。
作为碳源，具体而言，例如可以举出：葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖、半乳糖、木糖、果胶糖、糖蜜、淀粉水解物、生物质的水解物等糖类；醋酸、富马酸、柠檬酸、琥珀酸等有机酸类；甘油、粗甘油、乙醇等醇类；脂肪酸类。作为碳源，可以使用1种碳源，也可以组合使用2种或其以上的碳源。
作为氮源，具体而言，例如可以举出：硫酸铵、氯化铵、磷酸铵等铵盐；胨、酵母提取物、肉提取物、大豆蛋白质分解物等有机氮源；氨、脲。可以将pH调节中所使用的氨气或氨水用作氮源。作为氮源，可以使用1种氮源，也可以组合使用2种或其以上的氮源。
作为磷酸源，具体而言，例如可以举出：磷酸二氢钾、磷酸氢二钾等磷酸盐；焦磷酸等磷酸聚合物。作为磷酸源，可以使用1种磷酸源，也可以组合使用2种或其以上的磷酸源。
作为硫源，具体而言，例如可以举出：硫酸盐、硫代硫酸盐、亚硫酸盐等无机硫化合物；半胱氨酸、胱氨酸、谷胱甘肽等含硫氨基酸。作为硫源，可以使用1种硫源，也可以组合使用2种或其以上的硫源。
作为其它的各种有机成分及无机成分，具体而言，例如可以举出：氯化钠、氯化钾等无机盐类；铁、锰、镁、钙等微量金属类；维生素B1、维生素B2、维生素B6、烟酸、烟酸酰胺、维生素B12等维生素类；氨基酸类；核酸类；含有这些的胨、酪蛋白氨基酸、酵母提取物、大豆蛋白质分解物等有机成分。作为其它的各种有机成分及无机成分，可以使用1种成分，也可以组合使用2种或其以上的成分。
另外，在生长中使用需要氨基酸等的营养缺陷性突变株的情况下，优选在培养基中添补所需要的营养素。例如L-赖氨酸生产菌大多可增强L-赖氨酸生物合成途径，弱化L-赖氨酸分解能力。因此，在培养这样的L-赖氨酸生产菌的情况下，例如优选在培养基中添补选自L-苏氨酸、L-高丝氨酸、L-异亮氨酸、L-甲硫氨酸中的1个或其以上的氨基酸。
另外，例如在利用棒状杆菌型细菌制造L-谷氨酸的情况下，优选限制培养基中的生物素量、或在培养基中添加表面活性剂或青霉素。
培养条件只要本发明的细菌能够增殖且可生产目标L-氨基酸就没有特别限制。培养例如可以在细菌等细菌的培养中所使用的通常的条件下进行。培养条件可以根据使用的细菌的种类及制造的氨基酸的种类等诸条件适宜设定。
培养可以使用液体培养基需氧地进行。培养具体而言可以通过通气培养或震荡培养进行。培养温度例如可以为20～40℃，优选为25℃～37℃。培养基的pH例如可以调节为5～8。pH调节中可以使用无机或者有机的酸性或者碱性物质、或氨气等。培养期间例如可以为15小时～90小时。培养可以通过分批培养(batch culture)、加料分批培养(Fed-batch culture)、连续培养(continuousculture)或它们的组合来实施。另外，培养可以分为种子培养和主培养来进行。此时，种子培养和主培养的培养条件可以相同，也可以不同。例如可以均采用分批培养进行种子培养和主培养。另外，例如可以采用分批培养进行种子培养，采用加料分批培养或连续培养进行主培养。通过在这样的条件下培养本发明的细菌使L-氨基酸在培养基中蓄积。
另外，在制造L-谷氨酸的情况下，也可以使用调节为L-谷氨酸析出的条件的液体培养基一边在培养基中析出L-谷氨酸一边进行培养。作为L-谷氨酸析出的条件，例如可以举出：pH5.0～4.0、优选pH4.5～4.0、进一步优选pH4.3～4.0、特别优选pH4.0的条件(欧洲专利申请公开第1078989号说明书)。
另外，在制造L-赖氨酸等碱性氨基酸的情况下，可以利用将重碳酸离子及/或碳酸离子用作碱性氨基酸的主要的抗衡离子来发酵生产碱性氨基酸的方法(日本特开2002-65287、US2002-0025564A、EP1813677A)。根据这些方法，可以在削减现有用作碱性氨基酸的抗衡离子的硫酸离子及/或氯离子的使用量的同时制造碱性氨基酸。
来自发酵液的L-氨基酸的回收通常可通过组合离子交换树脂法(Nagai,H.et al.,Separation Science and Technology,39(16),3691-3710)、沉淀法、膜分离法(日本特开平9-164323号、日本特开平9-173792号)、晶析法(WO2008/078448、WO2008/078646)、其它的公知的方法来实施。需要说明的是，L-氨基酸在菌体内蓄积的情况下，例如可以利用超声波等破碎菌体，通过离子交换树脂法等从通过离心分离除去菌体而得到的上清液中回收L-氨基酸。所回收的L-氨基酸可以为游离体、其盐、或它们的混合物。作为盐，例如可以举出：硫酸盐、盐酸盐、碳酸盐、铵盐、钠盐、钾盐。例如，在L-谷氨酸的情况中，可以如下获得L-谷氨酸单钠(MSG)，即通过添加酸结晶发酵液中的L-谷氨酸单铵，然后通过将等摩尔的氢氧化钠添加至晶体。另外，可以通过在结晶之前和/或之后使用活性炭实施脱色(参见Tetsuya KAWAKITA,“Industrial Crystallization for Monosodium L-Glutamate.”,Bulletin of the Societyof Sea Water Science,Japan,Vol.56:5)。
另外，在L-氨基酸在培养基中析出的情况下，可以通过离心分离或过滤等来回收。另外，培养基中所析出的L-氨基酸可以在晶析溶解在培养基中的L-氨基酸后，同时分离。
另外，所回收的L-氨基酸除L-氨基酸以外，可以含有细菌菌体、培养基成分、水分及细菌的代谢副产物。所回收的L-氨基酸的纯度例如可以为50％以上，优选为85％以上，特别优选为95％以上(JP1214636B,USP5,431,933,USP4,956,471,USP4,777,051,USP4,946,654,USP5,840,358,USP6,238,714,US2005/0025878))。
当L-氨基酸是L-谷氨酸时，例如可以使用L-谷氨酸单钠晶体作为鲜味调味品(umami seasoning)。可以与核酸诸如5’-GMP二钠盐和5’-IMP二钠盐(它们也具有鲜味)组合使用L-谷氨酸单钠晶体作为调味品。
需要说明的是，本发明的方法的一样态为一种L-氨基酸的制造方法，其包括在培养基中培养具有L-氨基酸生产能力的棒状杆菌型细菌及从该培养基中采集L-氨基酸，其特征在于，所述细菌保持有编码磷酸盐转运蛋白的突变型pitA基因，所述磷酸盐转运蛋白具有相当于序列号6的246位的苯丙氨酸残基的氨基酸残基被取代为苯丙氨酸以外的氨基酸残基的突变。
关于本发明的方法的该样态，可准用涉及上述的本发明的细菌及本发明的方法的记载。例如在该方式中，优选相当于序列号6的246位的苯丙氨酸残基的氨基酸残基被取代为丝氨酸残基。另外，在该样态中，优选棒状杆菌型细菌为谷氨酸棒状杆菌。另外，在该方式中，所制造的L-氨基酸可以为任一氨基酸，但优选L-谷氨酸。
实施例
本发明可通过以下的实施例进一步具体地进行说明，但这些实施例为如何含义也不可理解为限定本发明的意图。
实施例1：使用了pitA强化株的Glu生产培养
在本实施例中，使用pitA基因的表达得到增强的谷氨酸棒状杆菌的Glu生产株进行Glu生产，对pitA基因的表达增强对Glu生产造成的影响进行评价。
使用菌株如下所述。
谷氨酸棒状杆菌2256ΔldhAΔsucA yggB*/pVK9
谷氨酸棒状杆菌2256ΔldhAΔsucA yggB*/pVK9-Plac-pitA
(1)菌株构建方法
将谷氨酸棒状杆菌2256菌株(ATCC 13869)用作亲株，通过以下的方法构建2256ΔldhAΔsucA yggB*菌株作为模型Glu生产株。将使用的引物示于表1。
表1
首先，以2256菌株的染色体DNA为模板，分别使用引物1、2一对、及引物3、4一对扩增ldhA基因缺损用的DNA片段。接着，以等量混合所扩增的2片段而成的基因为模板，使用引物5、6进行PCR，得到2片段结合而成的DNA片段。用SalI处理得到的DNA片段并导入到pBS4S(WO2005/113745)的SalI部位中，由此构建ldhA缺损用质粒。将该ldhA缺损用质粒插入到2256菌株的染色体中后，使其脱落，由此使ldhA基因缺损。
接着，以2256菌株的染色体DNA为模板，分别使用引物7、8一对、及引物9、10一对扩增sucA基因缺损用的DNA片段。接着，以等量混合所扩增的2片段而成的基因为模板，使用引物11、12进行PCR，得到2片段结合而成的DNA片段。用BamHI处理得到的DNA片段并导入到pBS3(WO2006/070944)的BamHI部位中，由此构建sucA缺损用质粒。将该sucA缺损用质粒插入到2256ΔldhA菌株的染色体中后，使其脱落，由此使sucA基因缺损。在生物素充分条件下培养得到的sucA缺损株中的多个变体，挑选具有Glu生产能力的菌株，结果，获得IS突变(V419::IS)进入到yggB基因的Glu生产株。将IS突变(V419::IS)进入的yggB基因的碱基序列及相同基因编码的YggB蛋白质的氨基酸序列分别示于序列号23及24。将得到的Glu生产株作为2256ΔldhAΔsucA yggB*菌株。
通过以下的方法构建pitA表达质粒(pVK9-Plac-pitA)。首先，以2256菌株的染色体DNA为模板，使用引物13、14扩增pitA基因片段。接着，使用in-fusion(TaKaRa INC.)将扩增了的片段与用bamHI和pstI处理了的pVK9质粒(US2006-0141588)连结，构建pitA表达质粒。将构建的pitA表达质粒作为pVK9-Plac-pitA。
分别将构建的pVK9-Plac-pitA和作为载体对照的pVK9导入到Glu生产菌2256ΔldhAΔsucA yggB*菌株中，构建2256ΔldhAΔsucAyggB*/pVK9-Plac-pitA菌株及2256ΔldhAΔsucA yggB*/pVK9菌株。
(2)Glu生产培养
使用2256ΔldhAΔsucA yggB*/pVK9-Plac-pitA菌株及2256ΔldhAΔsucAyggB*/pVK9菌株，进行Glu生产培养。将使用的培养基的组成示于表2。
表2
制作用KOH调整为pH8.0的上述组成的培养基，利用高压釜(115℃、15min)灭菌，供于培养。
<培养方法>
在坂口烧瓶中装入20mL培养基，以成为50g/L的方式添加CaCO3，在31.5℃的箱式振荡器中振荡，进行培养(预培养及主培养)。最初，作为预培养，使用培养基1将上述的菌株分别培养24小时。接着，将得到的预培养液2mL接种于培养基2中，在接种2小时后添加吐温40(最终浓度4g/L)进行主培养。在接种17小时后进行取样。使用AS-310(旭化成)对残留糖及谷氨酸进行定量。
<结果和考察>
将结果示于表3。表3中，“RS”表示残留糖量，“Glu”表示谷氨酸量。由本实施例明确，在谷氨酸棒状杆菌中使pitA基因的表达上升，由此使谷氨酸棒状杆菌的生长和Glu生产率提高。因此，考察到增大pitA基因编码的磷酸盐转运蛋白的活性对谷氨酸等氨基酸生产有效。
表3
实施例2：使用了pitA突变株的Glu生产培养
在本实施例中，使用在pitA基因中导入了突变的谷氨酸棒状杆菌的Glu生产株进行Glu生产，对pitA基因的突变对Glu生产造成的影响进行评价。
使用菌株如下所述。
谷氨酸棒状杆菌2256ΔldhAΔsucA yggB*
谷氨酸棒状杆菌2256ΔldhAΔsucA yggB*pitAmut
(1)菌株构建方法
将实施例1中构建的模型Glu生产株即谷氨酸棒状杆菌2256ΔldhAΔsucAyggB*作为亲株，构建在pitA基因中导入有突变的2256ΔldhAΔsucA yggB*pitAmut菌株。将使用的引物示于表4。
表4
通过以下的方法构建itA突变导入用质粒pBS4S-pitAmut。以PitA蛋白质的246位的苯丙氨酸残基被取代为丝氨酸残基的突变(Phe246Ser ttc→tcc)进入到pitA基因的编码区域内的Glu生产菌B3菌株的染色体DNA为模板，使用引物15、16进行PCR，扩增具有上述突变的pitA基因片段。接着，使用in-fusion(TaKaRa INC.)将扩增了的片段和用BamHI和PstI处理了的BS4S质粒连结，构建pitA突变导入用质粒。将构建的pitA突变导入用质粒作为pBS4S-pitAmut。
将构建的pBS4S-pitAmut插入到Glu生产菌2256ΔldhAΔsucA yggB*菌株的染色体中后，使其脱落，由此构建在pitA基因中导入有突变的2256ΔldhAΔsucA yggB*pitAmut菌株。
需要说明的是，上述pitA突变株2256ΔldhAΔsucA yggB*pitAmut菌株使用以Glu酸生产菌B3菌株的染色体DNA为模板所构建的突变导入用质粒进行构建，但也可使用通过Takara bio制Mutagenesis Basal Kit制作的突变导入用质粒构建。例如以谷氨酸棒状杆菌2256菌株(ATCC 13869)等野生株的染色体DNA为模板，使用引物15、16进行PCR，扩增不具有突变的pitA基因片段。接着，可使用in-fusion(TaKaRa INC.)将扩增了的片段和进行了BamHI和PstI处理的pBS4S质粒连结，构建含有野生型pitA基因的序列的质粒。进而，以该质粒为模板，按照Mutagenesis Basal Kit的使用说明书使用pitA基因的737位的T被改变为C这样的适当的引物进行PCR，构建pitA突变导入用质粒pBS4S-pitAmut。可使用其构建相同的pitA突变株。
(2)Glu生产培养
使用2256ΔldhAΔsucA yggB*菌株及2256ΔldhAΔsucA yggB*pitAmut菌株进行Glu生产培养。将使用的培养基的组成示于表5。
表5
制作用KOH调整为pH8.0的上述组成的培养基，利用高压釜(115℃、15min)灭菌，供于培养。
<培养方法>
在坂口烧瓶中装入培养基20mL，以成为50g/L的方式添加CaCO3，在31.5℃的箱式振荡器中振荡，进行培养(预培养及主培养)。最初，作为预培养，使用培养基3将上述的菌株分别培养24小时。接着，将得到的预培养液2mL接种于培养基3中，在接种2小时后添加吐温40(最终浓度4g/L)，进行主培养。在接种21.5小时后进行取样。使用AS-310(旭化成)对残留糖及谷氨酸进行定量。
<结果和考察>
将结果示于表6。表6中，“RS”表示残留糖量，“Glu”表示谷氨酸量。由本实施例明确，通过在谷氨酸棒状杆菌中向pitA基因中导入突变(Phe246Ser)，谷氨酸棒状杆菌的生长和Glu生产率提高。因此，考察到该pitA突变(Phe246Ser)对谷氨酸等氨基酸生产有效。
表6
工业适用性
根据本发明，可以改善棒状杆菌细菌的L-氨基酸生产能力，并且可以有效生产L-氨基酸。
[序列表的说明]
序列号1：大肠杆菌MG1655的pitA基因的碱基序列
序列号2：大肠杆菌MG1655的PitA蛋白质的氨基酸序列
序列号3：菠萝泛菌LMG20103的pitA基因的碱基序列
序列号4：菠萝泛菌LMG20103的PitA蛋白质的氨基酸序列
序列号5：谷氨酸棒状杆菌2256(ATCC 13869)的pitA基因的碱基序列
序列号6：谷氨酸棒状杆菌2256(ATCC 13869)的PitA蛋白质的氨基酸序列
序列号7～20：引物
序列号21：谷氨酸棒状杆菌2256(ATCC 13869)的yggB基因的碱基序列
序列号22：谷氨酸棒状杆菌2256(ATCC 13869)的YggB蛋白质的氨基酸序列
序列号23：谷氨酸棒状杆菌2256(ATCC 13869)的yggB基因(V419::IS)的碱基序列
序列号24：谷氨酸棒状杆菌2256(ATCC 13869)的YggB蛋白质(V419::IS)的氨基酸序列
序列号25：谷氨酸棒状杆菌ATCC13032的pitA基因的碱基序列
序列号26：谷氨酸棒状杆菌ATCC13032的PitA蛋白质的氨基酸序列
序列号27、28：引物

Claims (16)

1.一种制造L-氨基酸的方法，包括：
在培养基中培养具有L-氨基酸产生能力的棒状杆菌型细菌；和
从该培养基收集L-氨基酸，其中，
所述细菌已经经过修饰而增加了磷酸盐转运蛋白的活性。
2.如权利要求1所述的方法，其中，磷酸盐转运蛋白的活性是通过增加编码磷酸盐转运蛋白的基因的表达而增加的。
3.如权利要求2所述的方法，其中，所述基因为pitA基因。
4.如权利要求3所述的方法，其中，所述pitA基因是下面(a)或(b)中限定的DNA：
(a)具有SEQ ID NO:5或25所示的核苷酸序列的DNA；
(b)可在严格条件下与由SEQ ID NO:5或25所示的核苷酸序列的互补序列或与可自所述互补序列制备的探针杂交的DNA，且其中所述可杂交的DNA编码具有磷酸盐转运蛋白活性的蛋白质。
5.如权利要求3或4所述的方法，其中，所述pitA基因为编码下述(A)或(B)中限定的蛋白质的DNA：
(A)包含SEQ ID NO:6或26所示的氨基酸序列的蛋白质；
(B)包含在SEQ ID NO:6或26所示的氨基酸序列中包含1个或数个氨基酸残基的取代、缺失、插入、或添加而得到的氨基酸序列的蛋白质，且其中所述蛋白质具有磷酸盐转运蛋白活性。
6.如权利要求2-5中任一项所述的方法，其中，所述基因的表达是通过提高该基因的拷贝数和/或修饰该基因的表达调控序列而增加的。
7.如权利要求1至6中任一项所述的方法，其中，磷酸盐转运蛋白的活性是通过使所述细菌携带突变型pitA基因而增加的，所述突变型pitA基因编码具有对应于SEQ ID NO:6中246位的苯丙氨酸残基的氨基酸残基被取代为苯丙氨酸残基以外的氨基酸残基的突变的磷酸盐转运蛋白。
8.如权利要求7所述的方法，其中，对应于SEQ ID NO:6中246位的苯丙氨酸残基的氨基酸残基被取代为丝氨酸残基。
9.一种制造L-氨基酸的方法，其包括：
在培养基中培养具有L-氨基酸产生能力的棒状杆菌型细菌，和
从该培养基中收集L-氨基酸，其中，
所述细菌携带突变型pitA基因，所述突变型pitA基因编码具有对应于SEQ ID NO:6中246位的苯丙氨酸残基的氨基酸残基被取代为苯丙氨酸残基以外的氨基酸残基的突变的磷酸盐转运蛋白。
10.如权利要求9所述的方法，其中，对应于SEQ ID NO:6中246位的苯丙氨酸残基的氨基酸残基被取代为丝氨酸残基。
11.如权利要求1至10中任一项所述的方法，其中所述细菌是棒状杆菌属(Corynebacterium)细菌。
12.如权利要求11所述的方法，其中，所述棒状杆菌型细菌为谷氨酸棒状杆菌。
13.如权利要求1-12中任一项所述的方法，其中，所述L-氨基酸为L-谷氨酸。
14.如权利要求13所述的方法，其中所述L-谷氨酸是L-谷氨酸单铵或L-谷氨酸单钠。
15.一种编码磷酸盐转运蛋白的DNA，所述磷酸盐转运蛋白具有对应于SEQ ID NO:6中246位的苯丙氨酸残基的氨基酸残基被取代为丝氨酸残基的突变。
16.一种携带突变型pitA基因的棒状杆菌型细菌，所述突变型pitA基因编码具有对应于SEQ ID NO:6中246位的苯丙氨酸残基的氨基酸残基被取代为丝氨酸残基的突变的磷酸盐转运蛋白。
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