CN117957242A - 编码细菌胶原样蛋白的多核苷酸 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及具有截短的V‑结构域的细菌胶原样蛋白的分泌，具体地，涉及编码与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：9的氨基酸序列至少≥60％相同的氨基酸序列的多核苷酸，并且其中多肽是编码胶原样蛋白和其相应多肽的可复制的多肽，以及涉及用于在宿主中分泌细菌胶原样蛋白的发酵方法。
Description
技术领域
本发明涉及具有截短的V-结构域的细菌胶原样蛋白的分泌，具体地，涉及编码与SEQ ID NO：1的氨基酸序列至少60％相同的氨基酸序列的多核苷酸，其中该核苷酸序列是编码胶原样蛋白的可复制的核苷酸序列，并且其中该氨基酸序列包含在SEQ ID NO：1的氨基酸序列和相应多肽的N端处的至少38个氨基酸的缺失，以及涉及用于在宿主中分泌细菌胶原样蛋白的发酵方法。
背景技术
细菌来源的胶原样蛋白(CLP)(最工业相关的是酿脓链球菌(Streptococcuspyogenes)的产物)具有相当令人感兴趣的机械特性，其类似于高等真核生物的胶原蛋白的机械特性，而不需要真核对应物所需的复杂成熟步骤。CLP呈现共同的结构：彼此稳定的两个α螺旋构成“V结构域”，其后是杆状结构胶原结构域。在胶原结构域之后，在该蛋白的C端通常存在膜锚(GPI样)。
在几种系统中已经尝试了胶原样蛋白的表达，这些系统包括大肠杆菌(Escherichia coli)和酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。本发明重点关注由scl2基因编码的酿脓链球菌CLP在工业酵母巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)中的表达优化。
尽管在其它宿主(即大肠杆菌)中已经有可能实现scl2的表达(J.Biol.Chem.277,27312-27318)，并且甚至在细胞内表达后实现合理的效价(titer)(效价约为2g/L)，但在工业相关的酵母中的分泌生产(例如巴斯德毕赤酵母)从未实现，导致差的经济可行性方法。
对于在大肠杆菌中的表达，用于这种生产所选择的构建体携带特定且必要的修饰，以便于有效地去除潜在免疫原性的V结构域：这种修饰由通常插入V结构域和胶原序列之间的蛋白酶切割位点组成。由于这种修饰，由细菌宿主产生的蛋白必须从细胞内部分(fraction)中提取，并用特定的蛋白酶处理以去除V结构域。必须针对切割的V结构域、全部细胞内蛋白内容物和所加入的用于处理未成熟的CLP的蛋白酶来纯化仅由胶原样结构域组成的成熟蛋白。这种工作流程极大地阻碍整个过程的成本效益，原因在于1)必须将选择的产物从表达宿主细胞的全部内容物中分离出，和2)蛋白酶通常是昂贵的酶。
因此，本发明的目的是提供改进的生产CLP的方法，该方法是成本有效的并且是适用的，而不需要添加用于切割所述结构域的特定蛋白酶。
本发明的公开内容提供解决方案以通过使用工业主力例如巴斯德毕赤酵母来实现更具成本效益的方法的。巴斯德毕赤酵母已被用作用于其它种类的胶原分子的宿主，通常是哺乳动物来源的胶原分子的宿主，如由Werten及其同事最近报道的(BiotechnologyAdvances 37,Issue 5,2019,Pages 642-666)；然而，使用巴斯德毕赤酵母以用于CLP生产还没有被描述。此外，这种酵母的使用出人意料地提供了从成熟蛋白中切割V结构域的解决方案。
为了理解V结构域的存在是否可能是分泌型表达为何如此低效的原因，使用最近公开的X-射线结构已经分析了这种结构域(J.Biol.Chem.289，5122-5133)，通过使用公开可获得的工具即Jpred(http://www.compbio.dundee.ac.uk/jpred)的手动评价来补充。已经可以鉴定V结构域的结构决定因素：该结构域先前已经在绝大多数科学出版物(ProteinScience 2010,vol.19,pp775-785；J.Biol.Chem.,Vol.280,No.19,pp.19343-19349，以及许多其它文献)中被报道为对胶原折叠而言是必不可少的，尽管V结构域的存在对蛋白表达的影响曾被讨论或提及。Yu等人分析scl2细菌亚单位的不同片段(J.Biol.Chem.286,pp.18960-18968)在胶原稳定性中的竞争中的作用，将观测限制于结构性区域，但也生成缺乏V结构域的片段。此处未提及关于改善生产水平的报告：这并不出人意料，因为据认为，由于V结构域的截短而观测到的效果在分泌胶原时得以执行，这对于细菌胶原而言是迄今为止尚未描述的过程。
根据该假设，生成了一系列的截短：根本的逻辑是维持V结构域的通常被报道对于胶原折叠是必不可少的一部分，减少它的序列以最小化对细胞内的生产机制(machinery)的任何干扰，并因此能够在上清液中分泌显著量的蛋白。将这些构建体克隆并引入巴斯德毕赤酵母中后，出人意料地实现的是，当V结构域从原始完整序列截短时，CLP的分泌得到了极大的改进。V结构域的部分去除允许显著地提高在巴斯德毕赤酵母中的蛋白产量；出人意料地，V结构域的完全去除不如这种结构域的部分截短那样有效。
本发明的结果可以在技术上应用于在胶原结构域中的scl2的任何修饰序列，因为它旨在作为促进序列(facilitated sequence)以促进在巴斯德毕赤酵母中的有效翻译或通过分泌机制的有效转运。
发明内容
本发明描述在甲基营养型酵母巴斯德毕赤酵母中生产细菌胶原样蛋白(CLP)的新方法。相比于现有技术已知的当前方法，这种方法的关键特点是：1)蛋白被分泌在培养上清液中，允许在低成本培养基中达到高效价(＞5g/L)；2)蛋白容易从所述上清液中纯化，因为在培养基中不存在复杂组分。
出人意料地，来自分泌Scl2p的巴斯德毕赤酵母培养的上清液的纯化产物显示出了出人意料的特性(profile)，其与成熟的胶原样序列相容。进一步的分析显示出了细胞内酶，最可能是加工蛋白酶Kex2p，在不需要任何额外的蛋白酶步骤的情况下如何能够去除V结构域蛋白序列。此外，为了修饰存在于最终产物中的导致降解产物显著积累的切割位点，已对蛋白序列进行了突变，以对这种切割位点进行工程化改造并消除降解。出人意料地，当非极性氨基酸(缬氨酸，在野生型序列中)突变为极性氨基酸(谷氨酰胺)时，获得了最有效的性能。因此，所述方法：
1)与现有技术生产方法相比更具竞争性，允许在细胞外积累产物，因此允许避免任何细胞破坏以分离感兴趣的蛋白(protein of interest)；
2)出人意料地，不需要额外的用蛋白酶消化的步骤以去除主要产物的不需要的V结构域。这样的技术改进允许进一步改进方法的成本效益，允许直接在细胞培养物上清液中获得期望的产物。
3)所述方法(也)适用于携带V结构域截短的构建体。
4)所述方法还描述典型的发酵副产物，以及使最丰富的降解产物最小化的蛋白工程。
因此，本发明提供用于分泌细菌胶原样蛋白和相应的核苷酸序列以及多肽的新的发酵方法。
本发明涉及多核苷酸，其编码与SEQ ID NO：1的氨基酸序列至少60％相同的氨基酸序列，其中所述多核苷酸是编码胶原样蛋白的可复制的多核苷酸，并且其中所述氨基酸序列包含在SEQ ID NO：1的氨基酸序列的N端处的至少38个氨基酸的缺失。
出人意料地发现，胶原样蛋白的截短变体，包括具有截短的V-结构域的变体或没有任何V-结构域的变体，导致增加的胶原样蛋白的产量和分泌至发酵培养基中。
具体实施方式
优选地，该氨基酸序列包含在SEQ ID NO：1的氨基酸序列的N端处的38至90个氨基酸的缺失。这包括N端V-结构域(包含90个氨基酸)的完全缺失和至少38个氨基酸的V-结构域的不同截短。在一个优选的实施方案中，该氨基酸序列包含在SEQ ID NO：1的氨基酸序列的N端处的38至74个氨基酸的缺失或38至89个氨基酸的缺失。
在一个优选的实施方案中，该氨基酸序列与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ IDNO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、或SEQ ID NO：9的氨基酸序列至少60％相同。
在进一步的构型中，该氨基酸序列与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、或SEQ ID NO：9的氨基酸序列至少65％、或70％、或75％、或80％、或85％相同。
在一个优选的构型中，该多核苷酸编码与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、或SEQ ID NO：9的氨基酸序列至少90％、92％、94％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，优选地至少97％，特别优选地至少98％，非常特别优选地至少99％，极其优选地是100％相同的氨基酸序列。
在本发明的一个优选的实施方案中，该多核苷酸是编码来自酿脓链球菌的胶原样蛋白的可复制的核苷酸序列。
本发明相应地还涉及包含此类序列并编码SEQ ID NO：2至9的多肽变体的多核苷酸和核酸分子，所述多肽变体含有一个或多个插入或缺失。优选地，该多肽含有最多5个、最多4个、最多3个或最多2个氨基酸的插入或缺失。
本发明另外涉及包含由根据本发明的核苷酸序列编码的氨基酸序列的多肽。
本发明还涉及多肽的混合物，所述多肽包括SEQ ID NO：2至9的多肽变体之一和SEQ ID NO：10至17的胶原样蛋白的截短变体中的一种或多种。那些涉及来自发酵的特定副产物。
在另一具体的实施方案中，所述多肽含有在位置132或135处的至少一个氨基酸交换。
本发明另外涉及质粒和载体，其包含根据本发明的核苷酸序列，并任选地在毕赤酵母属(Pichia)、棒杆菌属(Corynebacterium)、假单胞菌属(Pseudomonas)或埃希氏菌属(Escherichia)的微生物中复制，或其适合用于此。在一个优选的构型中，包含根据本发明的核苷酸序列的载体适合用于在巴斯德毕赤酵母属的酵母中的复制。
本发明另外涉及毕赤酵母属、棒杆菌属、假单胞菌属或埃希氏菌属的微生物，所述微生物包含根据本发明的多核苷酸、载体和多肽。优选的微生物是巴斯德毕赤酵母、桥石短芽孢杆菌(Brevibacillus choshinensis)或谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)。
本发明另外涉及根据本发明的微生物，其特征在于，根据本发明的多肽被整合在染色体中。利用根据本发明的载体，同源重组允许将染色体上的DNA区段(section)交换成根据本发明的多核苷酸，该多核苷酸通过载体转运至细胞中。对于在载体的环状DNA分子和在染色体上的靶DNA之间有效重组，在具有与靶位点同源的核苷酸序列的末端处提供含有根据本发明的多核苷酸的待交换的DNA区域；这些确定了载体整合的位点和DNA交换的位点。
本发明提供巴斯德毕赤酵母、大肠杆菌、恶臭假单胞菌(P.putida)或谷氨酸棒杆菌(C.glutamicum)物种的微生物，所述微生物包含如要求保护的任何核苷酸序列、或如要求保护的任何多肽、或如要求保护的任何载体。
所述微生物可以是这样的微生物，在所述微生物中核苷酸序列以过表达形式存在。
该微生物的特征可以在于，该微生物具有生产和分泌精细化学品的能力。该精细化学品优选为细菌胶原样蛋白。
过表达通常是指，相比于起始菌株(亲本菌株)或野生型菌株，如果这是起始菌株的话，核糖核酸、蛋白(多肽)或酶的细胞内浓度或活性的增加。起始菌株(亲本菌株)是指这样的菌株，对该菌株进行导致过表达的措施。
在过表达中，优选重组过表达的方法。这些方法包括使用体外提供的DNA分子产生微生物的所有方法。这些DNA分子包括，例如启动子、表达盒、基因、等位基因、编码区域等。这些通过转化法、缀合(conjugation)法、转导法或类似方法被转换(convert)至需要的微生物中。
通过测量由基因转录的mRNA的量，通过确定多肽的量，和通过测定酶活力，可以确定表达或过表达的程度。
公开了用于在宿主中分泌细菌胶原样蛋白的发酵方法，其包括以下步骤：
a)在培养基中发酵根据本发明的微生物，
b)在所述培养基中积累细菌胶原样蛋白，其中获得发酵液。
如实施例所示出，相比于相应的起始菌株，根据本发明的这种方法的使用导致产物浓度和细菌胶原样蛋白的分泌量的异常增加。
待使用的培养基或发酵培养基必须适当地满足相应菌株的要求。在美国细菌学会(American Society for Bacteriology)的手册“普通细菌学方法手册(Manual ofMethods for General Bacteriology)”(Washington D.C.,USA,1981)中包括各种微生物的培养基的描述。术语“培养基(culture medium)”和术语“发酵培养基”或“培养基(medium)”是相互可交换的。
可以使用以下作为碳源：糖和碳水化合物，例如葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、糖蜜、来自甜菜糖或甘蔗加工的含蔗糖溶液、淀粉、淀粉水解产物和纤维素；油和脂肪，例如大豆油、向日葵油、花生油和椰子脂(coconut fat)；脂肪酸，例如棕榈酸、硬脂酸和亚油酸；醇，例如甘油、甲醇和乙醇；和有机酸，例如乙酸或乳酸。
可以使用以下作为氮源：有机氮化合物，例如蛋白胨、酵母提取物、肉提取物、麦芽提取物、玉米浆、豆粕和脲；或无机化合物，例如硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵和硝酸铵。氮源可以单独使用，或可以作为混合物使用。
可以使用以下作为磷源：磷酸、磷酸二氢钾或磷酸氢二钾或相应的含钠盐。
此外，培养基必须含有对于生长所必需的盐，例如以金属如钠、钾、镁、钙和铁的氯化物或硫酸盐的形式的盐，例如硫酸镁或硫酸铁。最后，除了上述物质之外，还可以使用必需的生长物质，例如氨基酸，如高丝氨酸，和维生素，如硫胺素、生物素或泛酸。
可以将所述起始材料以单一批次的形式加入至培养物中，或在培养期间以合适的方式供应。
以合适的方式使用碱性化合物例如氢氧化钠、氢氧化钾、氨或氨水，或酸性化合物例如磷酸或硫酸，以用于培养物的pH控制。通常将pH调节至6.0至8.5，优选地6.5至8。为了泡沫进展(development)的控制，可以使用消泡剂，例如脂肪酸的聚乙二醇酯。为了维持质粒的稳定性，可以向培养基中加入合适的选择性作用物质，例如抗生素。发酵优选在有氧条件下进行。为了维持有氧条件，将氧气或含氧气体混合物例如空气引入至培养物中。同样可以使用富含过氧化氢的液体。任选地，发酵在超大气压力下进行，例如在0.03至0.2MPa的超大气压力下进行。培养的温度通常为20℃至45℃，优选地是25℃至40℃，特别优选地是30℃至37℃。在分批法或补料分批法的情况下，优选地继续培养直至已形成足够的量以用于获得需要的有机化学化合物的措施。该目标通常在10小时至160小时内达到。在连续法中，更长的培养时间是可能的。由于微生物的活性，因此发生精细化学品在该微生物的发酵培养基中和/或在该微生物的细胞中的富集(积累)。
合适的发酵培养基的实例可被找到，特别可在专利文献US 5,770,409、US 5,990,350、US 5,275,940、WO 2007/012078、US 5,827,698、WO 2009/043803、US 5,756,345或US7,138,266中找到；可以任选地对所用菌株的要求进行适当的修饰。
该方法的特征在于，它是选自分批法、补料分批法、重复补料分批法和连续法的方法。
基于用存在根据本发明的启动子变体的微生物的方法或发酵方法，就选自浓度(每体积形成的化合物)、转化率(每消耗的碳源形成的化合物)、体积生产率(每体积和时间形成的化合物)和生物质特定生产率(每细胞干质量或生物干质量和时间形成的化合物，或每细胞蛋白和时间形成的化合物)或其它过程参数、和它们的组合的参数中的一个或多个而言，根据本发明的方法或发酵方法的性能提高至少0.5％、至少1％、至少1.5％或至少2％。
在一个优选的实施方案中，发酵液是指其中微生物在特定的温度下培养特定的时间的发酵培养基或营养培养基。发酵培养基或发酵期间使用的培养基含有确保需要的化合物的生产且通常确保生长和/或活力的所有物质或组分。
在发酵完成时，所得发酵液相应地含有：
a)由微生物细胞的生长产生的微生物的生物质(细胞团(cell mass))，
b)在发酵的过程中形成的期望的精细化学品，
c)在发酵的过程中可能形成的有机副产物，和
d)未被发酵消耗的所使用的发酵培养基的组分或起始材料的组分，例如维生素如生物素，或盐如硫酸镁。
除了相应的需要的化合物之外，有机副产物还包括由发酵中使用的微生物生成的并可能分泌的物质。
将发酵液从培养器皿或发酵容器中取出，任选地收集，并用于提供含有精细化学品的以液体或固体形式的产物。表述“获得含精细化学品的产物”也用于此。在最简单的情况下，从发酵容器中取出的含精细化学品的发酵液本身就是所获得的产物。
通过选自以下的一项或多项措施，
a)水的部分(>0％至<80％)至完全(100％)或几乎完全(≥80％、≥90％、≥95％、≥96％、≥97％、≥98％、≥99％)去除，
b)生物质的部分(>0％至<80％)至完全(100％)或几乎完全(≥80％、≥90％、≥95％、≥96％、≥97％、≥98％、≥99％)去除，其中在该去除之前任选地将该生物质灭活，
c)在发酵的过程中形成的有机副产物的部分(>0％至<80％)至完全(100％)或几乎完全(≥80％、≥90％、≥95％、≥96％、≥97％、≥98％、≥99％、≥99.3％、≥99.7％)去除，和
d)未被发酵消耗的所使用的发酵培养基的组分或起始材料的组分的部分(>0％)至完全(100％)或几乎完全(≥80％、≥90％、≥95％、≥96％、≥97％、≥98％、≥99％、≥99.3％、≥99.7％)去除，
从发酵液中实现需要的有机化合物的浓缩或纯化。以这种方式，分离出具有需要含量的所述化合物的产物。
水的部分(＞0％至＜80％)至完全(100％)或几乎完全(≥80％至＜100％)去除(措施a))也被称为干燥。
在该方法的一个变体中，通过水、生物质、有机副产物、和所使用的发酵培养基中的未消耗组分的完全或几乎完全去除，成功地得到纯(≥80重量％、≥90重量％)或高纯度(≥95重量％、≥97重量％、≥99重量％)产物形式的需要的有机化学化合物，优选地是细菌胶原样蛋白。对于根据a)、b)、c)或d)的措施，在现有技术中可获得多种技术说明。
在用于生产细菌胶原样蛋白的方法的情况下，优选这样的方法，其中获得不含有发酵液的任何组分的产物。这些产物特别用于人类医药中，用于制药工业中，且用于食品工业中。
本发明的方法用于细菌胶原样蛋白的发酵生产和分泌。
本发明最后涉及根据本发明的微生物的用途，其用于细菌胶原样蛋白的发酵生产和分泌。
实施例
A)在巴斯德毕赤酵母中的发酵
为了实现生产可易于从上清液中纯化的蛋白的目的，使用不同的算法对编码胶原样蛋白的来自酿脓链球菌的基因scl2的序列已进行密码子优化，并将其克隆在用于巴斯德毕赤酵母的分泌载体pBSY5S1Z(Bisy GmbH，奥地利)中；这种载体依赖于在培养基中的作为碳源的低水平甘油而触发蛋白表达。按照标准方案在巴斯德毕赤酵母中转化(Cereghinoet al.,Biotechniques(2005),38(1):p44)和以补料分批模式应用表达方案后，在细胞培养物的上清液中检测到了对应于Scl2p的蛋白。使用了根据SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：4的Scl2p构建体。
由于已经报道了V结构域潜在地与人受体或配体相互作用(Squeglia etal.,Journal of Biological Chemistry(2014),289:p5122)，用于在巴斯德毕赤酵母中表达的构建体携带在V结构域和成熟胶原样结构域之间的蛋白酶切割位点。必须去除这种结构域，用蛋白酶例如胰蛋白酶消化产物。
如上所述，假设的是，V-结构域的存在可能代表对有效蛋白表达的阻碍；因此，按照V-结构域本身的结构架构，产生了几种截短形式的V-结构域。图1报告了不同截短的结构描述，参考α螺旋结构的V结构域(图中用H表示)。
携带不同的构建体的不同巴斯德毕赤酵母菌株，在含有10mL的BMGY培养基(2％的蛋白胨、1％的酵母提取物、100mM的磷酸钾pH6.0、1.34％的酵母氮源基础(w/o AA)、0.4μg/mL的生物素，1％的甘油)的100mL摇瓶中已经培养过周末。随后，已经将2％的培养物转移到含有50mL的BMGY的新的500mL摇瓶中过夜培养。4.5％的这种培养物已用于接种含有1L生产培养基的2L钢发酵罐(表1)。在28℃、pH 5.5、压力800毫巴下运行了发酵，将溶解氧控制在20％；一旦分批阶段结束了(约20小时)，执行了补料分批阶段，以2.1g/h进料80％甘油的溶液，在20小时内斜升至5.7g/h；然后，进料速率在15小时内从5.7g/h斜升至12g/h。然后，在剩余的补料分批阶段，将进料速率保持恒定(补料分批的总持续时间约50小时)。
| 成分 | 量[g/kg] |
| 甘油 | 20.0 |
| 水龙头-H2O | 950.0 |
| CaSO4*2H2O | 0.17 |
| NaCl | 0.22 |
| KH2PO4 | 22.00 |
| K2SO4 | 2.86 |
| MgSO4*7H2O | 14.0 |
| PTM1a | 2.18ml |
| PTM1b | 2.18ml |
| 生物素(100％) | 0.0009 |
| 磷酸85％ | 5.4 |
| Antischaum(Delamex) | 0.2 |
表1：生产培养基
| H3BO3 | 0.040g/L |
| CoCl2 6H2O | 1.840g/L |
| NaJ | 2.130g/L |
| Na2MoO4 2H2O | 0.400g/L |
表2：PTM1A配制物
| CuSO4 5H2O | 11.980g/L |
| FeSO4 7H2O | 130.000g/L |
| MnSO4 H2O | 6.000g/L |
| ZnSO4 7H2O | 84.360g/L |
| H2SO4,96％ | 11.500g/L |
表3：PTM1B配制物
如上所述已经进行表达最有希望的V-结构域变体的代表性克隆的巴斯德毕赤酵母菌株的发酵。发酵后，从生物质中已经分离上清液并通过反相高效液相色谱法(RP-HPLC)进一步分析以鉴定切割产物。在Thermomixer中在15℃和1000rpm下用0.4g/L的重组胰蛋白酶(rTrypsin)将样品孵育了17小时，并使用RP-HPLC方法分析以确定蛋白长度(AgilentZorbax 300SB-C84.6x150 mm，3.5μm粒径)。
将来自携带不同截短构建体的至少5个独立克隆的上清液样品加载在SDS-PAGE上，清楚地显示出从截短1至截短5改善表达水平的一般趋势。
已经在生物反应器中培养了携带被评估为最有希望的截短形式的所选克隆(参见上文的发酵方案)。图2清楚地显示了“无V结构域”形式与截短3和5相比的蛋白产量的明确改善。对于全长V结构域构建体的所获得的效价低于或类似于对于“无V结构域”形式构建体的所获得的效价。最终胶原浓度(g/L)总结于表4中。
| 胶原形式 | 最终胶原浓度(g/L) | CLP序列 |
| 全长 | 0.1 | SEQ ID NO：1 |
| 无V-结构域 | 2.37 | SEQ ID NO：4 |
| 截短2 | 0.06 | |
| 截短3 | 2.69 | SEQ ID NO：2 |
| 截短5 | 4.85 | SEQ ID NO：3 |
表4：巴斯德毕赤酵母发酵后的最终胶原浓度
HPLC分析
如上所述已经进行了含有V-结构域截短的巴斯德毕赤酵母菌株的发酵。发酵后，通过离心(12000g，室温下5分钟)已经从生物质中分离出上清液；在胰蛋白酶消化之前和之后，分析了来自V-结构域的截短3或截短5的上清液，以将结果与CL标准溶液(无V-结构域)进行比较。
特别地，在Thermomixer中在15℃和1000rpm下用具有不同浓度的重组胰蛋白酶(以避免过度消化)将样品孵育了17小时，并使用RP-HPLC方法分析，以确定蛋白长度(Agilent Zorbax 300SB-C8 4.6x150 mm，3.5μm粒径)。
如图3至图5所示，比较衍生自截短5构建体的细菌胶原(图4)和不携带任何V-结构域的细菌胶原标准物(图3)，没有检测到蛋白长度的差异。当发酵样品用0.4g/L的胰蛋白酶孵育时，也没有观测到差异(图5)，表明V-结构域已经被加工。
图3至图5的色谱图的保留时间(RT)总结在表5至表7中，其中表5显示胰蛋白酶消化后的纯化产物的RT，表6显示出胰蛋白酶消化前的截短5，并且表7显示出胰蛋白酶消化后的截短5。
| RT[分钟] | 备注 | 面积 | 高度 | 宽度[分钟] | 面积％ |
| 14.18 | 3248.4 | 224.5 | 0.24 | 17.7 | |
| 14.26 | 目标胶原产物 | 9581.7 | 1074.6 | 0.14 | 52.1 |
| 15.31 | 5564.1 | 201.8 | 0.34 | 30.2 |
表5.胰蛋白酶消化后的纯化产物
| RT[分钟] | 备注 | 面积 | 高度 | 宽度[分钟] | 面积％ |
| 14.11 | 3129.7 | 116.0 | 0.33 | 20.6 | |
| 14.32 | 目标胶原产物 | 8457.9 | 938.9 | 0.13 | 55.7 |
| 15.49 | 3593.2 | 163.8 | 0.37 | 23.7 |
表6.截短5，胰蛋白酶消化前
| RT[分钟] | 备注 | 面积 | 高度 | 宽度[分钟] | 面积％ |
| 14.18 | 3248.4 | 224.5 | 0.24 | 17.7 | |
| 14.26 | 目标胶原产物 | 9581.7 | 1074.6 | 0.14 | 52.1 |
| 15.31 | 5564.1 | 201.6 | 0.34 | 30.2 |
表7.截短5，胰蛋白酶消化后
通过HPLC分析发酵上清液，除了对应于目标产物的大峰外，还检测到了典型的副产物谱(profile)(参见表8)。用LC/MS的进一步分析允许鉴定峰的性质以及涉及的所有分子质量，允许鉴定产生的每种产物的序列。副产物的序列概括在SEQ ID NO：10至SEQ IDNO：17中。
| 大小(kDa) | 氨基酸 | RT(分钟) | 量 | |
| 全长 | 22840 | 240 | 13.73-13.81 | |
| 副产物1 | 9916 | 102 | 9.91-9.94 | ＞5％(主峰) |
| 副产物2 | 12941 | 138 | 14.64-14.70 | ＞5％(主峰) |
| 副产物3 | 16096 | 168 | 10.69 | ＞1％ |
| 副产物4 | 18317 | 192 | 11.08-11.13 | ＞5％(主峰) |
| 副产物5 | 20660 | 216 | 12.89-12.93 | ＞1％ |
| 副产物6 | 22020 | 231 | 13.50-13.70 | ＞1％ |
| 副产物7 | 6761 | 72 | 15.39 | ＞1％ |
| 副产物8 | 4539 | 48 | 15.78-15.81 | ＞5％(主峰) |
表8：发酵后在上清液中的副产物
专注于在与预期产物相比的丰度的方面的最相关的降解产物，精确的质量鉴定允许假设沿蛋白序列的切割位点。因此，测试了替代关键氨基酸以防止切割的工程策略。特别地，假设的是，序列VGPR(缬氨酸-甘氨酸-脯氨酸-精氨酸(Val-Gly-Pro-Arg)，在位置132处具有缬氨酸)可以在位置-4(＝V，缬氨酸)或-1(＝R，精氨酸)处被校正：因此，产生并测试了几种突变序列(参见表9和表10)。以前，对于明胶报道了以某种方式相似的切割，其中序列MGPR(甲硫氨酸-甘氨酸-脯氨酸-精氨酸(Met-Gly-Pro-Arg))被认为产生降解，并被校正为RGPM(精氨酸-甘氨酸-脯氨酸-甲硫氨酸(Arg-Gly-Pro-Met))，其通常保持氨基酸极性(Werten et al.,Yeast 15(1999),p1087-1096)。
| 序列 | 描述 |
| VGPR | 野生型序列 |
| AGPR | 提出的突变体 |
| QGPR | 提出的突变体 |
| VGPA | 提出的突变体 |
| SGPR | 提出的突变体 |
| VGPK | 提出的突变体 |
表9：切割位点的不同突变体
即使在所有情况下，通过SDS-PAGE或HPLC显著减少了分子内切割产物，但相当出人意料的是，用极性氨基酸(谷氨酰胺，在突变体QGPR中，表9)取代非极性氨基酸(在位置132处的缬氨酸)导致了在切割位点校正和产物效价方面的最佳性能。使用表达构建体作为模板，通过野生型序列的定向位点的诱变已经引入了上述突变。在证实成功诱变后，已经将修饰的表达载体以与如上所述类似的方式引入巴斯德毕赤酵母中。如下所述在生物反应器中已经培养了所有构建体(根据SEQ ID NO：5至SEQ ID NO：10)。通过SDS-PAGE(小规模培养)和RP-HPLC的分析证实了先前通过在假设的切割位点的蛋白水解所衍生的降解产物在修饰这种切割位点时是如何完全不存在的。来自最有希望的突变体的4种独立培养物的SDS-PAGE分析显示出了与野生型序列(AGPR、QGPR和VGPA)不同的切割模式。此外，分析了在YPS1蛋白酶基因座中缺失的突变体(Δyps1突变体)。在所有情况下，携带修饰形式的野生型序列的克隆不呈现降解带，这在来自具有携带野生型序列的克隆的培养物的上清液中是可检测到的。来自SDS-PAGE的结果总结于表10中。结果通过RP-HPLC分析确认。
| 突变体 | 降解带的存在 |
| 野生型序列 | 是(＜10kDa) |
| AGPR突变体 | 否 |
| QGPR突变体 | 否 |
| VGPA突变体 | 否 |
| Δyps1突变体 | 是(＜10kDa) |
表10：来自最有希望的突变体的4种独立培养物的SDS-PAGE分析
B)在桥石短芽孢杆菌(B.choshinensis)中的发酵
也在桥石短芽孢杆菌中表达了全长胶原样蛋白、截短变体(截短3)、和无V-结构域变体(基于如在实施例A中使用的来自酿脓链球菌的基因scl2)。因此，将相应的DNA序列克隆至用于桥石短芽孢杆菌的合适的分泌载体中。根据Mizukami等人2010(Curr PharmBiotechnol 2010,13:151-258)用新构建的质粒完成了桥石短芽孢杆菌的转化。
使用来自Eppendorf(Hamburg，德国)的平行生物反应器体系，在33℃和pH 7下的分批培养中，分析了桥石短芽孢杆菌菌株的产生不同胶原蛋白的能力。使用1L反应器进行了发酵。生产培养基(TM培养基，Biomed Res Int 2017,2017:5479762)含有10g/L的葡萄糖。发酵后，通过离心已经从生物质中分离了上清液并将其用于SDS PAGE分析。对于所有三种变体，产生了胶原样蛋白。
C)在谷氨酸棒杆菌中的发酵
也在谷氨酸棒杆菌中表达了全长胶原样蛋白、和无V-结构域变体(基于如在实施例A中使用的来自酿脓链球菌的基因scl2)。因此，将相应的DNA序列与上游定位的用于蛋白分泌的信号肽一起克隆至用于谷氨酸棒杆菌的穿梭载体中(Biotechnology Techniques1999,13:437-441)。谷氨酸棒杆菌菌株ATCC 13032通过如由Ruan等人描述的电穿孔用新构建的质粒转化(Biotechnology Letters 2015,37:2445-2452)。
使用来自Eppendorf(Hamburg，德国)的平行生物反应器体系，在30℃和pH 7下的补料分批培养中，分析了谷氨酸棒杆菌菌株的产生不同胶原蛋白的能力。使用1L反应器进行了发酵。在分批阶段中，生产培养基含有20g/L的葡萄糖，并且用4g/L*h的葡萄糖进料运行了补料分批阶段。发酵后，通过离心从生物质中已经分离了上清液并将其用于HPLC分析。对于这两种变体，都产生了胶原蛋白。对于胶原样蛋白的截短变体，产物效价高于全长变体。
蛋白序列
SEQ ID NO：1酿脓链球菌胶原样蛋白(CLP)，全长蛋白SEQ ID NO：2 酿脓链球菌CLP，截短3
SEQ ID NO：3 酿脓链球菌CLP，截短5
SEQ ID NO：4酿脓链球菌CLP，无V-结构域SEQ ID NO：5酿脓链球菌CLP，截短5(AGPR突变体)SEQ ID NO：6酿脓链球菌CLP，截短5(QGPR突变体)SEQ ID NO：7酿脓链球菌CLP，截短5(VGPA突变体)SEQ ID NO：8酿脓链球菌CLP，截短5(SGPR突变体)SEQ ID NO：9酿脓链球菌CLP，截短5(VGPK突变体)SEQ ID NO：10 酿脓链球菌CLP，副产物1
SEQ ID NO：11 酿脓链球菌CLP，副产物2
SEQ ID NO：12 酿脓链球菌CLP，副产物3
SEQ ID NO：13 酿脓链球菌CLP，副产物4
SEQ ID NO：14 酿脓链球菌CLP，副产物5
SEQ ID NO：15 酿脓链球菌CLP，副产物6
SEQ ID NO：16 酿脓链球菌CLP，副产物7
SEQ ID NO：17 酿脓链球菌CLP，副产物8
SEQ ID NO：18酿脓链球菌CLP，来自图1的片段
Claims (14)
1.多核苷酸，其编码与SEQ ID NO：1的氨基酸序列至少60％相同的氨基酸序列，其中所述多核苷酸是编码胶原样蛋白的可复制的多核苷酸，并且其中所述氨基酸序列包括在SEQID NO：1的氨基酸序列的N端处的至少38个氨基酸的缺失。
2.根据权利要求1所述的多核苷酸，其中，所述氨基酸序列包含在SEQ ID NO：1的氨基酸序列的N端处的38至90个氨基酸的缺失。
3.根据权利要求1或2所述的多核苷酸，所述多核苷酸编码与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：9的氨基酸序列至少60％相同的氨基酸序列。
4.根据前述权利要求中的任意一项所述的多核苷酸，所述多核苷酸编码与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：9的氨基酸序列至少90％、92％、94％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，优选地至少97％，特别优选地至少98％，非常特别优选地至少99％，极其优选地为100％相同的氨基酸序列。
5.根据前述权利要求中的任意一项所述的多核苷酸，其中核苷酸序列是编码来自酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)的胶原样蛋白的可复制的核苷酸序列。
6.载体，其包含根据权利要求1至5中的任意一项所述的多核苷酸。
7.多肽，其包含由根据权利要求1至5中的任意一项所述的多核苷酸编码的氨基酸序列。
8.微生物，其包含根据权利要求1至5中的任意一项所述的多核苷酸、或根据权利要求7所述的多肽、或根据权利要求6所述的载体。
9.根据权利要求8所述的微生物，其中，所述微生物属于毕赤酵母属(Pichia)、短芽孢杆菌属(Brevibacillus)、芽孢杆菌属(Bacillus)、埃希氏菌属(Escherichia)、或棒杆菌属(Corynebacterium)，优选地是巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、桥石短芽孢杆菌(Brevibacillus choshinensis)、或谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)。
10.根据权利要求9所述的微生物，其中，根据权利要求1至5中的任意一项所述的多核苷酸以过表达的形式存在。
11.根据权利要求8至10中的任意一项所述的微生物，其特征在于，所述微生物具有分泌细菌胶原样蛋白的能力。
12.用于在宿主中分泌细菌胶原样蛋白的发酵方法，其包括以下步骤：
a)在培养基中发酵根据权利要求8至11中的任意一项所述的微生物，
b)在所述培养基中积累细菌胶原样蛋白，其中获得发酵液。
13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，所述方法是选自分批法、补料分批法、重复补料分批法和连续法的方法。
14.根据权利要求8至11中的任意一项所述的微生物的用途，其用于细菌胶原样蛋白的发酵生产和分泌。
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