CN117836314A - 用于生产重组细菌胶原样蛋白(clp)的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及用于生产重组胶原样蛋白(CLP)的新型方法。
Description
技术领域
本发明涉及用于重组胶原样蛋白(collagen-like protein)(CLP)的生产和纯化的新型方法。更具体地，本发明涉及通过使用有机溶剂的沉淀来纯化三螺旋Scl2蛋白。
背景技术
细菌来源的胶原样蛋白(CLP)(最工业相关性的是酿脓链球菌(Streptococcuspyogenes)的产物)具有相当令人感兴趣的机械特性，其类似于高等真核生物的胶原蛋白的机械特性，而不需要真核生物对应物所需的复杂成熟步骤。CLP呈现以下共同结构：彼此稳定化的两个α螺旋构成“V结构域”，其后是杆状结构性胶原结构域(CL)。在该胶原结构域之后，通常在该蛋白的C末端存在膜锚(GPI样)。
在若干个系统中已经尝试了胶原样蛋白的表达，这些系统包括大肠杆菌(Escherichia coli)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)和酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)(J.Biol.Chem.277,27312-27318)。
对于在大肠杆菌中的表达，选择的用于此种生产的构建体携带特定且必要的修饰，以便于高效地去除潜在免疫原性的V结构域：此种修饰由通常插入在V结构域和胶原序列之间的蛋白酶切割位点组成。由于这种修饰，由细菌宿主产生的蛋白质必须从细胞内部分中提取，并用特定的蛋白酶处理以去除该V结构域。必须针对切割的V结构域、全部细胞内蛋白内容物和所添加的用于处理未成熟的CLP的蛋白酶来纯化仅由胶原样结构域组成的成熟蛋白。此种工作流程极大地阻碍整个过程的成本效益，原因在于1)必须将所选择的产物从表达宿主细胞的全部内容物中分离出，和2)蛋白酶通常是昂贵的酶。
如在各种出版物(Lukomski et al.2002、Brodsky et al.2009)中所描述的，对Scl2蛋白的折叠的当前理解是，需要V结构域以用于在体外将三个Scl2蛋白单体折叠成一个三螺旋结构(Lukomski et al.揭示没有V结构域的情况下的体内折叠)。尽管V结构域对这种过程可能有积极影响，但已发现的是它并不是折叠该蛋白的唯一因素。可以示出的是，在不存在V结构域的情况下也发生适当的折叠。所鉴定的主要因素是Scl2单体的浓度、温度、时间、pH值和盐浓度。
由于V结构域被认为对三螺旋Scl2的产生至关重要，因此从未考虑过去除该序列，这导致了以下挑战。
-V结构域大约占整个序列的三分之一，并且阻碍蛋白从巴斯德毕赤酵母宿主中运输出来。这需要含有细胞裂解的复杂下游过程，以从该细胞中去除靶蛋白。
-V结构域本身具有病原性特性，并且需要在纯化过程期间被去除。这通过蛋白酶消化来完成。蛋白酶的使用成本相当高，而且还需要在下游期间将它去除。
以下概述示出使用附接有V结构域的Scl2构建体的产物纯化所需的工艺步骤：
细胞分离(离心)
细胞裂解(压力均质器)
V结构域去除(蛋白酶消化)
细胞碎片的去除(pH改变、离心)
纯化(溶剂沉淀)
洗涤(TFF)
进一步的纯化(IEX)
此种方法公开在例如Peng et al.(Appl.Microbiol.Biotechnol.,98:1807-1815,2014)中。
本发明描述在若干种宿主中生产胶原样蛋白(CLP)的新型方法。
与哺乳动物胶原相比，在存在水混溶性有机溶剂例如丙酮、乙醇和2-丙醇的情况下，胶原样蛋白Scl2具有降低的溶解度。例如，在15％的2-丙醇、4g/L的三螺旋Scl2和5℃下，溶解度小于10％。这种特性从未在文献中揭示过，而对于哺乳动物胶原，已公开了在多至50％的乙醇下的提取方案。
起源于巴斯德毕赤酵母发酵的三螺旋Scl2蛋白的纯化需要去除相当复杂的基质。发酵上清液含有盐、碳水化合物、脂肪、蛋白酶和其它化合物。去除这些化合物的第一方案是进行一系列的超滤。
在细胞分离(通过离心)和折叠(通过冷却浓缩物)之后，进行三轮超滤。在第一超滤步骤中，将三螺旋Scl2蛋白在40℃下展开，并通过100kD膜来过滤。这一步骤用于去除大尺寸的杂质。然后，将收集的渗透物在连续的10kD过滤中浓缩。在折叠Scl2蛋白之后，进行最后的超滤以去除小尺寸的杂质。这种方法不能提供具有＞50重量％的纯度的Scl2蛋白。
因此，本发明的目的是提供用于具有高纯度的重组胶原样蛋白的生产的方法。
发明内容
在所述背景下，出人意料地发现，借助于溶剂沉淀可以纯化胶原样蛋白。
因此，本发明提供用于生产重组胶原样蛋白(CLP)的新型方法，其包括以下步骤：
a)发酵宿主细胞，所述宿主细胞表达编码氨基酸序列的多核苷酸，所述氨基酸序列编码CLP，
b)在不超过25℃下将发酵液孵育至少1小时以用于所述CLP的折叠，
c)通过溶剂沉淀来纯化所述CLP。
所述宿主细胞优选地选自细菌细胞、酵母细胞或植物细胞。优选的是，使用细菌细胞或酵母细胞。
具体实施方式
优选的是，所述CLP具有与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9至少60％相同的氨基酸序列。
优选的是，所述氨基酸序列包含在SEQ ID NO:1的氨基酸序列的N末端处的38至90个之间的氨基酸的缺失。这包括N末端的V结构域(包含74个氨基酸)的完全缺失和至少38个氨基酸的V结构域的不同截短。
在一个优选的实施方案中，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:3、SEQ IDNO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9的氨基酸序列至少60％相同。
在一个优选的配置中，该氨基酸序列与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9的氨基酸序列至少90％、92％、94％、96％、97％、98％、99％或100％相同，优选地至少97％，特别优选地至少98％，非常特别优选地至少99％，极其优选地是100％相同。
在本发明的一个优选的实施方案中，该CLP是来自酿脓链球菌的细菌胶原样蛋白。
在一个优选的实施方案中，用于生产重组胶原样蛋白(CLP)的方法进一步包括以下步骤：
在培养基中积累所述CLP，其中获得发酵液并且从所述发酵液分离所述宿主细胞，或
在所述宿主细胞中积累所述CLP，并且从所述宿主细胞提取所述CLP(例如针对大肠杆菌)。
在一个优选的实施方案中，步骤c)中的溶剂沉淀在至少5％，优选地至少10％，更优选地至少15％的溶剂浓度下进行。
在一个优选的实施方案中，溶剂沉淀在37℃或更低，优选地34℃或更低，更优选地32℃或更低，最优选地24℃或更低，或20℃或更低的温度下进行。
在一个优选的实施方案中，用于溶剂沉淀的溶剂是有机溶剂，优选地是有机极性溶剂。
在一个优选的实施方案中，用于溶剂沉淀的溶剂是具有小于0.9，更优选地小于0.8，最优选地小于0.7的相对极性的极性溶剂。
在一个优选的实施方案中，用于溶剂沉淀的溶剂选自2-丙醇、乙醇、丙酮和二甲基亚砜(DMSO)。
优选的是，根据本发明的方法进一步包括以下步骤中的一个或多个：
d)在低于37℃的低温下的干燥，优选地是喷雾干燥、冷冻干燥或接触干燥；
e)一个或多个额外的纯化步骤，所述纯化步骤选自：超滤、溶剂沉淀、切向流过滤(TFF)、离子交换色谱；
f)与蛋白酶一起孵育，优选地与胰蛋白酶、胃蛋白酶、凝乳酶一起孵育，以切割N末端可变球状(V)结构域的。
在一个优选的实施方案中，在如下条件下进行步骤b)中的CLP的折叠，
-在-80℃至25℃，优选地在0℃至20℃的温度下，
-持续1小时至48小时，优选1小时至24小时的时间，
-以至少1mg/ml，优选地至少4mg/ml的CLP-浓度。
在一个优选的实施方案中，核苷酸序列是编码来自酿脓链球菌的胶原样蛋白的可复制的核苷酸序列。
在一个优选的实施方案中，该宿主细胞是酵母细胞，优选地巴斯德毕赤酵母，或细菌细胞，优选地大肠杆菌、棒状杆菌(Corynebacterium)或短杆菌(Brevibacterium)。
根据本发明，用于发酵的微生物的特征在于，根据本发明的核苷酸序列被整合在染色体中。在使用根据本发明的载体的情况下，同源重组允许将该染色体上的DNA片段交换为根据本发明的多核苷酸，该多核苷酸通过所述载体被运输至细胞中。对于所述载体的环型DNA分子和在所述染色体上的靶DNA之间的有效重组，在具有与靶位点同源的核苷酸序列的末端处提供含有根据本发明的多核苷酸的待交换的DNA区域；这些确定了所述载体的整合的位点和所述DNA的交换的位点。
该微生物可以是这样的微生物，在所述微生物中核苷酸序列以过表达的形式存在。
该微生物的特征可以在于，该微生物具有生产和分泌精细化学品的能力。该精细化学品优选地是胶原样蛋白。
过表达通常意指，相比于起始菌株(亲本菌株)或野生型菌株，如果这是起始菌株的话，核糖核酸、蛋白(多肽)或酶的细胞内浓度或活性的增加。起始菌株(亲本菌株)意指这样的菌株，对该菌株进行了导致过表达的措施。
在过表达中，优选重组过表达的方法。这些方法包括使用体外提供的DNA分子产生微生物的所有方法。此类DNA分子包含例如启动子、表达盒、基因、等位基因、编码区等。这些通过转化法、缀合法、转导法或类似方法转变成期望的微生物。
通过测量由基因转录的mRNA的量，通过确定多肽的量，和通过确定酶活性，可以确认表达或过表达的程度。
待使用的培养基或发酵培养基必须适当地满足相应菌株的要求。在美国细菌学会(the American Society for Bacteriology)的指南“普通细菌学方法手册(Manual ofMethods for General Bacteriology)”(Washington D.C.,USA,1981)中含有各种微生物的培养基的描述。术语“培养基”(culture medium)”和术语“发酵培养基”或“培养基(medium)”是相互可交换的。
可以使用以下作为碳源：糖和碳水化合物，例如葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、糖蜜、来自甜菜糖或甘蔗加工的含蔗糖溶液、淀粉、淀粉水解物和纤维素；油和脂肪，例如豆油、向日葵油、花生油和椰子脂；脂肪酸，例如棕榈酸、硬脂酸和亚油酸；醇，例如甘油、甲醇和乙醇；和有机酸，例如乙酸或乳酸。
可以使用以下作为作为氮源：有机氮化合物，例如蛋白胨、酵母提取物、肉提取物、麦芽提取物、玉米浆、豆粕和脲；或无机化合物，例如硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵和硝酸铵。氮源可以单独使用，或可以作为混合物使用。
可以使用以下作为磷源：磷酸、磷酸二氢钾或磷酸氢二钾或对应的含钠盐。
另外，培养基必须含有对于生长所必要的盐，例如以金属如钠、钾、镁、钙和铁的氯化物或硫酸盐的形式的盐，例如硫酸镁或硫酸铁。最后，除上文提及的物质之外，还可以使用必需的生长物质，例如氨基酸如高丝氨酸，和维生素如硫胺素、生物素或泛酸。
可以将所述起始材料以单一批次的形式添加至培养物中，或在培养期间以合适的方式供应。
以合适的方式使用碱性化合物例如氢氧化钠、氢氧化钾、氨或氨水，或酸性化合物例如磷酸或硫酸，以用于培养物的pH控制。通常将pH调节至6.0至8.5，优选地6.5至8。对于泡沫形成的控制，可以使用消泡剂，例如脂肪酸的聚乙二醇酯。对于维持质粒的稳定性，可以将合适的选择性作用物质例如抗生素添加至培养基中。发酵优选地在有氧条件下进行。为了维持所述有氧条件，将氧气或含氧气体混合物例如空气引入至培养物中。同样可以使用富含过氧化氢的液体。任选地，发酵在超大气压下进行，例如在0.03至0.2MPa的超大气压下进行。培养的温度通常为20℃至45℃，优选地为25℃至40℃，特别优选地为30℃至37℃。在分批方法或补料分批方法的情况下，优选地继续培养直至已形成足够的量以用于获得期望的有机化学化合物的措施。这一目的通常在10小时至160小时内实现。在连续方法中，更长的培养时间是有可能的。由于微生物的活性，因此发生精细化学品在发酵培养基中和/或在微生物的细胞中的富集(积累)。
合适的发酵培养基的实例可被找到，特别可在专利文件US 5,770,409、US 5,990,350、US 5,275,940、WO 2007/012078、US 5,827,698、WO 2009/043803、US 5,756,345或US7,138,266中找到；可以任选地对所使用菌株的要求进行适当的修改。
该方法的特征可以在于，它是选自分批方法、补料分批方法、重复补料分批方法和连续方法的方法。
该方法的特征可以进一步在于，精细化学品或含有液体或固体精细化学品的产物从含有精细化学品的发酵液中获得。
基于用存在根据本发明的启动子变体的微生物的方法或发酵方法，相对于选自浓度(每体积形成的化合物)、转化率(每消耗的碳源形成的化合物)、体积生产率(每体积和时间形成的化合物)和生物质特定生产率(每细胞干物质或生物干物质和时间形成的化合物，或每细胞蛋白和时间形成的化合物)、或其它过程参数、和它们的组合的参数中的一个或多个，根据本发明的方法或发酵方法的性能增加至少0.5％、至少1％、至少1.5％或至少2％。
由于发酵的措施，获得这样的发酵液，所述发酵液含有期望的精细化学品，优选地含有氨基酸或有机酸。
然后，提供或产生或获得含有精细化学品的以液体或固体形式的产物。
在一个优选的实施方案中，发酵液意指发酵培养基或营养培养基，其中将微生物在特定的温度下培养特定的时间。发酵培养基或发酵期间使用的培养基含有确保期望的化合物的生产且通常确保生长和/或活力的所有物质或组分。
发酵完成后，所得发酵液相应地含有：
a)由微生物细胞的生长产生的微生物的生物质(细胞团块(cell mass))，
b)在发酵的过程中形成的期望的精细化学品，
c)在发酵的过程中可能形成的有机副产物，和
d)未被发酵消耗的所使用的发酵培养基的组分或起始材料的组分，例如维生素如生物素，或盐如硫酸镁。
除相应期望的化合物之外，有机副产物还包括由发酵中使用的微生物生成的并可能分泌的物质。
将发酵液从培养器皿或发酵容器中取出，任选地收集，并且用于提供含有精细化学品的以液体或固体形式的产物。为此还使用表述“获得含精细化学品的产物”。在最简单的情况下，从发酵容器中取出的含精细化学品的发酵液本身就是所获得的产物。
通过选自以下的措施中的一个或多个，
a)水的部分(>0％至<80％)至完全(100％)或几乎完全(≥80％、≥90％、≥95％、≥96％、≥97％、≥98％、≥99％)去除，
b)生物质的部分(>0％至<80％)至完全(100％)或几乎完全(≥80％、≥90％、≥95％、≥96％、≥97％、≥98％、≥99％)去除，其中在该去除之前任选地将该生物质灭活，
c)在发酵的过程中形成的有机副产物的部分(>0％至<80％)至完全(100％)或几乎完全(≥80％、≥90％、≥95％、≥96％、≥97％、≥98％、≥99％、≥99.3％、≥99.7％)去除，和
d)未被发酵消耗的所使用的发酵培养基的组分或起始材料的组分的部分(>0％)至完全(100％)或几乎完全(≥80％、≥90％、≥95％、≥96％、≥97％、≥98％、≥99％、≥99.3％、≥99.7％)去除，
从发酵液中实现期望的有机化学化合物的浓缩或纯化。以这种方式，分离出具有期望含量的所述化合物的产物。
水的部分(＞0％至＜80％)至完全(100％)或几乎完全(≥80％至＜100％)去除(措施a))也被称为干燥。
在该方法的变体中，通过水、生物质、有机副产物和所使用的发酵培养基的未消耗组分的完全或几乎完全去除，成功地获得纯(≥80重量％、≥90重量％)或高纯度(≥95重量％、≥97重量％、≥99重量％)产物形式的期望的有机化学化合物，优选地胶原样蛋白。对于根据a)、b)、c)或d)的措施，在现有技术中可获得多种多样的技术指导。
在用于生产胶原样蛋白的方法的情况下，优选这样的方法，其中获得不含有发酵液的任何组分的产物。这些产物特别用于人类医学中，用于制药工业中，且用于食品工业中。
实施例
通过发酵在酵母宿主细胞巴斯德毕赤酵母中，生产了胶原样蛋白。为了在巴斯德毕赤酵母中生产来自酿脓链球菌的Scl2，使用不同的算法已经对胶原样蛋白(全长蛋白和截短变体以及无V结构域变体)的序列进行了密码子优化，并且将其克隆在巴斯德毕赤酵母的分泌载体中。所使用的序列概述于SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:9中。对于特定序列中的每一个，按照标准方案在巴斯德毕赤酵母中转化载体，并且应用了补料分批模式的标准表达方案(Damasceno,L.M.,Huang,CJ.&Batt,C.A.Protein secretion in Pichia pastorisand advances in protein production.Appl Microbiol Biotechnol 93,31–39(2012))。在细胞培养物的上清液中，通过HPLC分析检测了Scl2p蛋白的胶原结构域。发酵后，通过离心(12000g，室温下5分钟)已经将上清液与生物质分离。
使用大肠杆菌、桥石短芽孢杆菌(B.choshinensis)或谷氨酸棒状杆菌，在类似条件下可以生产基于序列SEQ ID NO:1至序列SEQ ID NO:9的Scl2p蛋白的胶原结构域。在酵母或谷氨酸棒状杆菌中的生产的情况下，由细胞分泌胶原结构域。在这种方式中，不需要细胞裂解作为初始纯化步骤。在大肠杆菌中的生产的情况下，细胞裂解是强制的，以从该细胞中去除胶原结构域。
在桥石短芽孢杆菌(Brevibacillus choshinensis)中也表达了全长胶原样蛋白、截短变体(截短3)和无V结构域变体(基于来自酿脓链球菌的基因scl2)。因此，对应的DNA序列被克隆至对于桥石短芽孢杆菌合适的分泌载体中。用新构建的质粒转化桥石短芽孢杆菌是根据Mizukami et al.2010(Curr Pharm Biotechnol 2010,13:151-258)来完成的。
使用来自Eppendorf(Hamburg，德国)的平行生物反应器系统，在33℃和pH 7下的分批培养中，分析了桥石短芽孢杆菌菌株的生产不同胶原蛋白的能力。使用1L反应器进行了发酵。生产培养基(TM培养基，Biomed Res Int 2017,2017:5479762)含有了10g/L的葡萄糖。发酵后，通过离心已经将上清液与生物质分离，并且将该上清液用于SDSPAGE分析。对于所有三种变体，都产生了胶原样蛋白。
在谷氨酸棒状杆菌中也表达了全长胶原样蛋白和无V结构域变体(基于来自酿脓链球菌的基因scl2)。因此，对应的DNA序列与位于上游的用于蛋白分泌的信号肽一起被克隆至用于谷氨酸棒状杆菌的穿梭载体中(Biotechnology Techniques 1999,13:437-441.)。通过电穿孔的方式，例如由Ruan et al.(Biotechnology Letters 2015,37:2445-2452)所描述的，用新构建的质粒转化了谷氨酸棒状杆菌菌株ATCC 13032。
使用来自Eppendorf(Hamburg，德国)的平行生物反应器系统，在30℃和pH 7下的补料分批培养中，分析了谷氨酸棒状杆菌菌株生产不同胶原蛋白的能力。使用1L反应器进行了发酵。生产培养基在分批阶段含有了20g/L的葡萄糖，并且用4g/L*h的葡萄糖进料运行了补料分批阶段。发酵后，通过离心已经将上清液与生物质分离，并且将该上清液用于HPLC分析。对于两种变体，都产生了胶原蛋白。对于胶原样蛋白的截短变体，产品效价(titer)与全长变体相比更高。
方法步骤总结如下：
1.在酵母、大肠杆菌或棒状杆菌中的胶原样蛋白的生产
2.细胞裂解(仅针对大肠杆菌)
3.细胞分离(过滤或离心)
4.CL单链的折叠以形成三螺旋结构
5.通过溶剂沉淀和超滤的进一步的纯化
6.对纯化的CL蛋白的冷冻干燥
1.使用不同的溶剂来沉淀胶原样蛋白
在各种有机溶剂中分析了胶原样蛋白的溶解度。为此，将来自在酵母巴斯德毕赤酵母中的生产的冷冻干燥的Scl2p蛋白的胶原结构域以5g/L的浓度溶解在去离子(DI)水中。在5℃温度下将800μL的这种溶液放置在1.5mL Eppendorf杯中。向测试样品添加200μL的预冷却MilliQ水(比较)、DMF、乙腈、THF、乙酸甲酯、丙酮、乙醇、异丙醇(IPA)或DMSO。然后，将混合物在5℃和1000rpm下在混匀仪中孵育15分钟。将该混合物离心3分钟(16100x g/5℃)，并且将上清液在用50mM的磷酸钠缓冲液(pH7.2)以倍数10稀释之后注入。在有机溶剂中的CL回收率总结在图1中。
2.不同溶剂浓度下的沉淀
除此之外，还在5至40体积％的溶剂浓度范围内并在4至30℃的温度范围内，确定了Scl2p蛋白的胶原结构域在异丙醇(IPA)和丙酮中的溶解度。
将来自在细菌(谷氨酸棒状杆菌或桥石短芽孢杆菌)中的生产的冷冻干燥的Scl2p蛋白的胶原结构域以6g/L的浓度溶解在50mM的磷酸钠缓冲液pH 7.2中。在5℃的温度下将800μL的CL储备溶液放置在1.5mL Eppendorf杯中。将200μL的预冷却MilliQ水(比较)、IPA或丙酮以不同的量添加至测试样品中。然后，将混合物在5℃和1000rpm下在混匀仪中孵育15分钟。
将所述混合物离心3分钟(16100x g/5℃)，并且上清液在用50mM的磷酸钠缓冲液pH 7.2稀释之后根据SEC注入。结果总结在图2中。
3.不同温度下的沉淀
将来自在细菌(谷氨酸棒状杆菌或桥石短芽孢杆菌)中的产生的冷冻干燥的Scl2p蛋白的胶原结构域以6g/L的浓度溶解在50mM的磷酸钠缓冲液pH 7.2中。在不同温度下将800μL的CL储备溶液放置在1.5mL Eppendorf杯中。将200μL的预冷却MilliQ水(比较)、IPA或丙酮添加至测试样品中。然后，将混合物在不同温度和1000rpm下在混匀仪中孵育15分钟。
将所述混合物离心3分钟(16100x g/5℃)，并且上清液在用50mM的磷酸钠缓冲液pH7.2稀释之后根据SEC注入。结果总结在图3中。
4.胶原样蛋白的纯化
在细胞分离(通过离心)和Scl2p蛋白的胶原结构域的折叠(通过冷却浓缩物)之后，使用采用15体积％的2-丙醇的沉淀来对它纯化。在该Scl2p蛋白的胶原结构域的沉淀之后，进行了离心。将沉淀物溶解在水中，将三螺旋Scl2蛋白在40℃下展开并通过100kD膜过滤。该步骤用于去除大尺寸的杂质。然后，将收集的渗透物在连续的10kD过滤中浓缩。洗涤了渗余物以去除小尺寸的杂质。
通过此种方式，实现了三螺旋Scl2蛋白纯度>75重量％。
蛋白质序列
SEQ ID NO:1 酿脓链球菌胶原样蛋白(CLP)，全长蛋白
SEQ ID NO:2 酿脓链球菌CLP，截短3
SEQ ID NO:3 酿脓链球菌CLP，截短5
SEQ ID NO:4 酿脓链球菌CLP，无V结构域
SEQ ID NO:5 酿脓链球菌CLP，截短5(AGPR突变体)
SEQ ID NO:6 酿脓链球菌CLP，截短5(QGPR突变体)
SEQ ID NO:7 酿脓链球菌CLP，截短5(VGPA突变体)
SEQ ID NO:8 酿脓链球菌CLP，截短5(SGPR突变体)
SEQ ID NO:9 酿脓链球菌CLP，截短5(VGPK突变体)
Claims (11)
1.用于生产重组胶原样蛋白(CLP)的方法，其包括以下步骤：
a)发酵宿主细胞，所述宿主细胞表达编码氨基酸序列的多核苷酸，所述氨基酸序列编码CLP，
b)在不超过25℃下将发酵液孵育至少1小时以用于所述CLP的折叠，
c)通过溶剂沉淀来纯化所述CLP。
2.根据权利要求1所述的方法，所述方法进一步包括以下步骤：
-在培养基中积累所述CLP，其中获得发酵液并且从所述发酵液分离所述宿主细胞，或
-在所述宿主细胞中积累所述CLP，并且从所述宿主细胞提取所述CLP。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中步骤c)中的溶剂沉淀在至少5％，优选地至少10％，更优选地至少15％的溶剂浓度下进行。
4.根据前述权利要求中的任意一项所述的方法，其中溶剂沉淀在37℃或更低，优选地34℃或更低，更优选地32℃或更低，最优选地24℃或更低，或20℃或更低的温度下进行。
5.根据前述权利要求中的任意一项所述的方法，其中用于溶剂沉淀的溶剂是有机溶剂，优选地是有机极性溶剂。
6.根据前述权利要求中的任意一项所述的方法，其中用于溶剂沉淀的溶剂是具有小于0.9，更优选地小于0.8，最优选地小于0.7的相对极性的极性溶剂。
7.根据前述权利要求中的任意一项所述的方法，其中用于溶剂沉淀的溶剂选自2-丙醇、乙醇、丙酮和二甲基亚砜(DMSO)。
8.根据前述权利要求中的任意一项所述的方法，所述方法进一步包括以下步骤中的一个或多个：
d)在低于37℃的低温下的干燥，优选地是喷雾干燥、冷冻干燥或接触干燥；
e)一个或多个额外的纯化步骤，所述纯化步骤选自：超滤、溶剂沉淀、切向流过滤(TFF)、离子交换色谱；
f)与蛋白酶一起孵育，优选地与胰蛋白酶、胃蛋白酶、凝乳酶一起孵育，以切割N末端可变球状(V)结构域。
9.根据前述权利要求中的任意一项所述的方法，其中在如下条件下进行步骤b)中的CLP的折叠，
-在-80℃至25℃，优选0℃至20℃的温度下，
-持续1小时至48小时，优选地1小时至24小时的时间，
-以至少1mg/ml，优选地至少4mg/ml的CLP-浓度。
10.根据前述权利要求中的任意一项所述的方法，其中所述核苷酸序列是编码来自酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)的胶原样蛋白的可复制的核苷酸序列。
11.根据前述权利要求中的任意一项所述的方法，其中所述宿主细胞是酵母细胞，优选地是巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)，或细菌细胞，优选地是大肠杆菌(E.coli)、棒状杆菌(Corynebacterium)或短杆菌(Brevibacterium)。
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Legal Events
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|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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