JP6991423B2 - グルコースオキシダーゼCnGODA及びその遺伝子ならびに使用 - Google Patents
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Description
(a)配列番号1もしくは配列番号2に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、又は
(b)配列番号1もしくは配列番号2に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと75%~99%の相同性を有し、配列番号1もしくは配列番号2に示されるアミノ酸配列のポリペプチドと同じ活性もしくは特性を有する誘導ポリペプチドである。
(a)配列番号1もしくは配列番号2に示されるアミノ酸配列のポリペプチドをコードし、又は
(b)配列番号1もしくは配列番号2に示されるアミノ酸配列のポリペプチドの誘導ポリペプチドであって、配列番号1もしくは配列番号2に示されるアミノ酸配列を改変して得られ、配列番号1もしくは配列番号2に示されるアミノ酸配列のポリペプチドの活性及び特性を維持する誘導ポリペプチドをコードする。
(a)配列番号3もしくは配列番号4に示されるヌクレオチド配列を有するもの、又は
(b)配列番号3もしくは配列番号4に示されるヌクレオチド配列と75%~99%の相同性を有し、コードするポリペプチドが、配列番号1もしくは配列番号2に示されるアミノ酸配列のポリペプチドと同じ活性及び特性を有するものから選択される。
「ATGCATTCGA TTCATTTCCT AGCTGCTTTC CTGGCTGCAG TCTCTGAAGC T」である。
1)上記組換えベクターにより宿主細胞を形質転換して組換え菌株を得る工程、
2)組換え菌株を培養し、組換えグルコースオキシダーゼの発現を誘導する工程、
3)発現したグルコースオキシダーゼを回収して精製する工程、
を含むグルコースオキシダーゼの調製方法をさらに提供する。
1、菌株及びベクター:ピキア・パストリス(Pichia pastoris GS115);ピキア・パストリス発現ベクターpPIC9、及び菌株GS115は、いずれも外部で購入したものである。
2、酵素類及び他の生化学試薬:エンドヌクレアーゼ、リガーゼ、及び他の試薬は、いずれも外部で購入したものである。
3、培地:
(1)酵素生産培地(/L):グルコース172.11g、コーンスティープリカー11.05g、炭酸カルシウム52.29g、ビーフペプトン3.5g、(NH4)H2PO4 0.5g、MgSO4・7H2O 0.125g、FeSO4・7H2O 0.125g。121℃で20分間殺菌処理した。
(2)大腸菌LB培地:1%ペプトン、0.5%酵母エキス、1%NaCl、pH 7.0。
(3)BMGY培地:1%酵母エキス、2%ペプトン、1.34%YNB、0.000049%ビオチン、1%グリセリン(v/v)。
(4)BMMY培地:グリセリンの代わりに0.5%メタノールを用いた以外、残りの成分は、いずれもBMGYと同じであった。
(1)クラドスポリウムCladosporium neopsychrotolerns SL-16の全RNAの抽出
まず、酵素生産培地で3日間培養した菌を濾紙に収集して加圧乾燥し、高温で殺菌した乳鉢に加え、液体窒素で迅速に粉砕して粉末を得た。その後、粉砕した菌体を800μL Trizolが入った新しい1.5mL遠心管に移し、ピペッティングして均一に混合し、室温で5分間放置した。200μLのクロロホルムを加え、15秒間激しく振とうし、室温で3分間放置し、4℃、12000rpmで15分間遠心した。上清を抽出し、等容量のイソプロパノールを加え、均一に混合し、室温で10分間放置し、4℃、12000rpmで10分間遠心した。上清を捨て、沈殿物を70%エタノールで2回洗浄し、空気で5分間乾燥し、適量のDNase/RNase-Free脱イオン水を加えてRNAを溶解させた。
Oligo(dT)20と逆転写酵素により全cDNAの1本鎖を得た後、EcoRIとNotI制限酵素切断部位を有するプライマーFとRを設計し合成した(表1を参照)。CnGODAの成熟タンパク質のコード領域に対してPCR増幅を行い、グルコースオキシダーゼのcDNA配列を得た。
(1)発現ベクターの構築及びピキア・パストリスにおける発現
EcoRIとNotIにより実施例1におけるPCR生成物を酵素切断し、発現ベクターpPIC9(Invitrogen、San Diego)に接続して導入し、グルコースオキシダーゼGODの成熟タンパク質配列を上記発現ベクターのシグナルペプチド配列の下流に挿入し、シグナルペプチドと正確な読み枠を形成し、酵母発現ベクターpPIC9-CngodAとして構築し、大腸菌コンピテントセルTrans1から、陽性形質転換体を選択してDNAシーケンシングを行い、シーケンシングにより配列が正確であることが示された形質転換体を、組換えプラスミドの大量調製に用いた。制限エンドヌクレアーゼBglIIによりプラスミドベクターDNAを線状に発現させ、酵母GS115コンピテントセルをエレクトロポレーションし、30℃で2~3日培養し、MDプレートで成長した形質転換体を選択してさらに発現実験を行った。具体的な操作については、ピキア・パストリス発現操作説明書を参照した。
殺菌済みの爪楊枝で形質転換体が成長したMDプレートからシングルコロニーをかきとり、番号順にMDプレートに添加し、コロニーが成長するまでMDプレートを30℃のインキュベーターで1~2日培養した。番号の順にMDプレートから形質転換体をかきとり、3mL BMGY培地が入った遠心管に接種し、30℃、220rpmでシェーカーにより48時間培養した。シェーカーにより48時間培養した菌液を3,000×gで15分間遠心し、上清を捨て、遠心管に0.5%メタノール含有BMMY培地1mLを加え、30℃、220rpmで誘導培養した。48時間誘導培養した後、3,000×gで5分間遠心し、上清を取って酵素活性検出に用い、グルコースオキシダーゼ活性の高い形質転換体をスクリーニングした。具体的な操作については、ピキア・パストリス発現操作説明書を参照した。
(1)組換えグルコースオキシダーゼの振とうフラスコレベルでの大量発現
スクリーニングされた酵素活性の高い形質転換体をBMGY液体培地300mLに接種し、30℃、220rpmでシェーカーにより48時間振とう培養し、菌体を富化させ、4,500rpmで5分間遠心し、上清を軽く捨て、菌体を0.5%メタノール含有BMMY液体培地100mLに移し、30℃、220rpmで72時間誘導培養した。誘導培養中、24時間おきにメタノール溶液を補充してメタノールの損失を補償し、メタノールの最終濃度を0.5%程度に維持した。12,000×gで10分間遠心し、上清発酵液を回収し、酵素活性を検出しSDS-PAGEタンパク質電気泳動分析を行った。
振とうフラスコで発現された組換えグルコースオキシダーゼの上清を回収し、まず、10kDa限外ろ過モジュールにより濃縮し、この過程において低塩緩衝液で発酵液中の培地を置換した。その後10kDa限外濾過チューブによりさらに濃縮した。一定の倍数に希釈した組換えCnGODAを濃縮し、イオン交換クロマトグラフィーにより精製した。具体的には、CnGODA濃縮液2.0mLを取り、予め20mM PBS(pH6.9)で平衡化されたHiTrap Q Sepharose XL陰イオンカラムを通過させ、0-1mol/LのNaClで直線勾配溶出を行い、分別回収された溶出液の酵素活性を検出しタンパク質濃度を測定した。
分光光度法により本発明のグルコースオキシダーゼについて酵素活性を測定した。具体的には、pH6.0、30℃の条件下で、o-ジアニシジン緩衝液2.5mL、18%グルコース溶液0.3mL、90U/mLホースラディシュペルオキシダーゼ0.1mL、適当な酵素希釈液0.1mLを含む反応系5mLを3分間反応させ、2M硫酸2mLを加えて反応を停止させ、冷却した後OD540吸光値を測定した。グルコースオキシダーゼの活性単位については、一定の条件下で、1分間でβ-D-グルコース1μmolを酸化してD-グルコン酸と過酸化水素を生成することができる酵素量を1つの活性単位(U)とすると定義した。
精製された実施例2のグルコースオキシダーゼサンプルを、異なるpHで酵素活性を測定して最適反応を確定した。異なるpHで用いられた緩衝液:pH1.0~3.0ではグリシン-塩酸緩衝液、pH3.0~8.0ではクエン酸-リン酸水素二ナトリウム系緩衝液、及びpH8.0~10.0ではグリシン-水酸化ナトリウム系緩衝液を調製し、異なるpHの緩衝液でo-ジアニシジン溶液を調製した。30℃で測定された最適pH結果(図1)から、CnGODAは、最適pHが7.0であり、pH6.0~pH8.0の範囲で酵素活性を60%以上に維持できることが示された。
pH6.0の条件下で、異なる温度(0~55℃)で精製されたグルコースオキシダーゼサンプルの酵素活性を測定した。分析した実験結果から、当該酵素は、最適反応温度が30℃であり、15~50℃で依然として50%以上の酵素活性を有することが示された(図3)。
Claims (9)
- 配列番号1または配列番号2に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドであることを特徴とする、グルコースオキシダーゼCnGODA。
- 請求項1に記載のグルコースオキシダーゼCnGODAをコードすることを特徴とする、グルコースオキシダーゼ遺伝子。
- 配列番号1に示されるアミノ酸配列をコードする配列番号3に示されるヌクレオチド配列、又は、
配列番号2に示されるアミノ酸配列をコードする配列番号4に示されるヌクレオチド配列からなることを特徴とする、
請求項2に記載のグルコースオキシダーゼ遺伝子。 - 請求項2に記載のグルコースオキシダーゼ遺伝子を含む、組換え発現ベクター。
- 請求項2に記載のグルコースオキシダーゼ遺伝子を含む、組換え発現ベクターpPIC9-CngodAであって、
配列番号4に示されるヌクレオチド配列を有するグルコースオキシダーゼ遺伝子がAOX1プロモーターの下流に位置しかつ該プロモーターによって調節されるように、プラスミドpPIC9のEcoRIとNotI制限酵素切断部位の間に挿入された、
組換え発現ベクターpPIC9-CngodA。 - 請求項2に記載のグルコースオキシダーゼ遺伝子を含む、組換え菌株。
- 請求項2に記載のグルコースオキシダーゼ遺伝子を含む、組換え菌株GS115/CngodAであって、
請求項5に記載の組換え発現ベクターpPIC9-CngodAで形質転換されたピキア・パストリス細胞であることを特徴とする、
組換え菌株GS115/CngodA。 - (1)請求項4に記載の組換え発現ベクターにより宿主細胞を形質転換する工程、
(2)形質転換された前記宿主細胞を培養する工程、及び
(3)分離精製してグルコースオキシダーゼCnGODAを得る工程。
を含むことを特徴とする、グルコースオキシダーゼCnGODAの製造方法。 - β-D-グルコースの酸化のための、請求項1に記載のグルコースオキシダーゼCnGODAの使用。
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