CN110358688B - 一种产胞外葡萄糖氧化酶菌株cy-12及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及产胞外葡萄糖氧化酶菌株CY‑12及其应用，可有效解决现有技术存在着生产菌株单一、缺乏高产菌株、分离纯化工艺复杂的问题，其解决的技术方案是，本发明所述产胞外葡萄糖氧化酶菌株CY‑12，其分类命名为枝孢霉（Cladosporium sp.），已于2019年4月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC NO.17661，本发明菌株性状优良，所产胞外葡萄糖氧化酶，获得方法简单，易操作，回收率高，制备工艺简单、高效，节能环保，可为国内应用行业的科研人员提供一种新的葡萄糖氧化酶品种，在食品、医疗、饲料工业等领域有很高的应用潜力，是葡萄糖氧化酶菌株上的创新。

Description

一种产胞外葡萄糖氧化酶菌株CY-12及其应用
技术领域
本发明涉及微生物领域，特别是一种产胞外葡萄糖氧化酶菌株CY-12及其应用。
背景技术
葡萄糖氧化酶(glucose oxidase，GOD)是一种需氧脱氢酶，在有氧气存在的环境下，能高度专一地催化β-D-葡萄糖生成葡萄糖酸和过氧化氢，并且对甘露糖、半乳糖和木糖也具有较为缓慢的氧化作用。目前，该酶被广泛应用于食品、饲料、医药等领域。在食品工业中，可以去除食品中的葡萄糖、氧气，从而消除美拉德反应，有效抑制非酶褐变现象，并且延长保质期；葡萄糖氧化酶催化产生的过氧化氢具有杀菌作用，作为抑菌剂添加到食品中比化学抑菌剂更安全；在医药工业中，葡萄糖氧化酶是生产葡萄糖酸的催化剂，可催化生产出葡萄糖酸锌、葡萄糖酸钙、葡萄糖酸钠作为医药品或保健品；葡萄糖氧化酶可以用于葡萄糖的定量分析；可以制成生物传感器用来检测血糖浓度；还可用于防治口腔疾病和牙病的发生。在畜牧业中，葡萄糖氧化酶作为一种新型、绿色、安全的饲料添加剂，可以降低畜禽胃肠道pH，提高消化酶活性和营养物质的消化率；改善肠道形态结构，维持肠道菌群生态平衡、防止有害菌感染、提高机体免疫力，同时抑制多种霉菌，使饲料中霉菌毒素的含量得到明显的降低，从而延长饲料保质期。
葡萄糖氧化酶广泛分布于动植物和微生物体内，微生物是其主要来源，作为一种很有潜力的生物催化剂，目前存在着生产菌株单一、缺乏高产菌株、分离纯化工艺复杂等问题，主要生产菌株为黑曲霉和青霉，并且GOD大多分布于胞壁、胞浆、粘质液之中，胞外分泌酶量相对较少，分离纯化十分困难，在很大程度上限制了葡萄糖氧化酶的大规模工业化生产和应用。因此，发明一种新的葡萄糖氧化酶菌株势在必行。
发明内容
针对上述情况，为解决现有技术之缺陷，本发明之目的就是提供一种产胞外葡萄糖氧化酶菌株CY-12及其应用，可有效解决现有技术存在着生产菌株单一、缺乏高产菌株、分离纯化工艺复杂的问题。
本发明解决的技术方案是，本发明所述产胞外葡萄糖氧化酶菌株CY-12，其分类命名为枝孢霉（Cladosporium sp.），已于2019年4月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC NO .17661。保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。该菌株的18S rDNA 基因序列如SEQ ID NO1 所示。
产胞外葡萄糖氧化酶菌株CY-12的分离方法：
1）取葡萄园土壤样品，用常规梯度稀释法，称取10g土壤样品至90mL无菌水中，28℃恒温摇床振荡30min，即成10-1土壤悬液，另取装有9mL无菌水的试管，加入10-1的土壤悬液1mL，混匀，即成10-2的土壤稀释液，依次连续释稀后得到10-3，10-4，10-5及10-6土壤稀释液，吸取0.2mL 10-4、10-5及10-6三种浓度的稀释液分别涂布于初筛平板培养基上，涂布于初筛平板培养基上，28℃培养至菌落长出，放置于4℃冰箱，观察显色，所述的初筛平板培养基(g/L)组成：葡萄糖80，蛋白胨3，(NH4)2HPO4 0.4，KH2PO4 0.2，MgSO4•7H2O 0.2，CaCO3 3.5，可溶性淀粉10，KI1.7，脱氧胆酸钠0.2，琼脂18，pH自然，115℃条件下灭菌25min；
2）采用发酵复筛的方法，将初筛平板培养基上显蓝色的菌株接种于液体发酵培养基中，在25℃，180r/min培养3～7d，取2～5mL发酵液进行离心，即得粗酶液，检测粗酶液酶活力，筛选到编号为CY-12的产胞外葡萄糖氧化酶菌株CY-12，所述的液体发酵培养基(g/L)组成：葡萄糖60.0，蛋白胨5.0，KH2PO42.0，MgSO4•7H2O 0.5，KC1 0.5，CaCO3 3.0，pH自然，115℃条件下灭菌25min。
利用产胞外葡萄糖氧化酶菌株CY-12制备葡萄糖氧化酶的方法，包括以下步骤：
1）从斜面保藏培养基（PDA培养基）斜面上挑取菌株CY-12接种于活化平板培养基上，25～30℃活化培养至产生孢子；
2）用5mL 0.9%的生理盐水冲洗活化平板培养基，洗下孢子，制成孢子悬浮液，按照体积比5～10%接种于发酵培养基，25～30℃、180rpm培养60～72h，得到葡萄糖氧化酶发酵液；
3）用纱布过滤除去除菌体及杂质，用体积浓度为60～80％的硫酸铵沉淀葡萄糖氧化酶发酵液中的蛋白，按照质量比加入葡萄糖氧化酶发酵液1～2%的可溶性淀粉吸附蛋白，12000r、20min离心收集沉淀，用磷酸缓冲液溶解沉淀，透析除盐，将样品放入冷冻干燥机中-45℃、7Pa冷冻干燥至粉末状，得葡萄糖氧化酶。
所述的斜面保藏培养基（PDA培养基）组成：马铃薯20g，葡萄糖20g，琼脂15g，蒸馏水1000mL，pH自然，115℃灭菌25min。
所述的活化平板培养基（PDA平板培养基）组成：马铃薯20g，葡萄糖20g，琼脂15g，蒸馏水1000mL，pH自然，115℃灭菌25min，倒在平板上。
所述的发酵培养基(g/L) 组成：葡萄糖60～80g，蛋白胨3～5 g，KH2PO41.8～2.2g，MgSO4•7H2O 0.3～0.5 g，KC1 0.3～0.5 g，CaCO3 3.0～3.5 g，pH自然，115℃条件下灭菌25 min。
本发明菌株性状优良，所产胞外葡萄糖氧化酶，获得方法简单，易操作，回收率高，制备工艺简单、高效，节能环保，可为国内应用行业的科研人员提供一种新的葡萄糖氧化酶品种，在食品、医疗、饲料工业等领域有很高的应用潜力，是葡萄糖氧化酶菌株上的创新。
附图说明
图1为本发明葡萄糖氧化酶不同温度相对酶活和稳定性示意图。
图2为本发明葡萄糖氧化酶不同PH相对酶活和稳定性示意图。
具体实施方式
以下结合附图和实际情况对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
本发明产胞外葡萄糖氧化酶菌株CY-12的来源是从新乡长垣黄河滩地葡萄园土壤样品中分离纯化得到的。
相关实验资料如下：
1、产胞外葡萄糖氧化酶菌株的筛选和鉴定
采于新乡长垣黄河滩地葡萄园土壤样品，用常规梯度稀释法涂布于初筛平板培养基，28℃培养至菌落长出，放置于4℃冰箱，观察显色。
所述的初筛平板培养基(g/L)：葡萄糖80，蛋白胨3，(NH4)2HPO4 0.4，KH2PO4 0.2，MgSO4•7H2O 0.2，CaCO3 3.5，可溶性淀粉10，KI1.7，脱氧胆酸钠0.2，琼脂18，pH自然。115℃条件下灭菌25 min。
采用发酵复筛的方法，将初筛平板培养基上显蓝色的菌株接种于液体发酵培养基中，25℃，180r/min培养3～7d，取适量发酵液进行离心，即得粗酶液，检测粗酶液酶活力，最终，筛选到编号为CY-12的产胞外葡萄糖氧化酶菌株。
将分离纯化的菌株点接在PDA平板培养基上，28℃培养2～3d，观察其菌丝生长及产孢情况，菌落颜色、形态、边缘、菌丝长度等；直接制片观察法观察孢子、菌丝形态。
通过观察以及40倍显微镜下的镜检，菌株CY-12的菌落特征描述见表1。
菌株名称 菌落 菌丝体
CY-12 圆形、墨绿色、干燥、中心突起边缘绒毛状，无分泌物 菌丝偶有分枝，分生孢子梗端生或侧生，孢子椭圆形，灰色或暗灰色
以提取的菌株DNA为模板，以NS1、NS8为引物进行PCR，扩增18s序列，扩增片段大小在1700bp左右，PCR产物经纯化后送华大基因进行测序。
提取真菌基因组DNA提取(酚抽提法)
菌株18S rRNA及ITS PCR扩增：采用通用引物（华大基因合成）
NS1：5’-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3’
NS8：5’-TCCGCAGGTTCACCTACGGA-3’
PCR扩增体系为25μL：RNAfree water 9.5µL，ES Taq MasterMix 12.5µL，模板DNA1µL，NS1、NS8上下游引物各1µL。
PCR扩增条件：95℃预变性4min，95℃变性30s，55℃复性30s，72℃延伸60s，30个循环，最后72℃延伸10min。
将PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，送华大基因测序。将菌株CY-12的18s 序列在NCBI中进行BLAST分析，下载相似性较大的序列和该属内代表种，利用MEGA6软件构建系统发育树。结合形态特征、显微观察，最终确定菌株CY-12为枝胞霉（Cladosporium sp.）。
2、葡萄糖氧化酶活力的测定方法
酶活力测定采用靛蓝胭脂红褪色分光光度计法，原理是：葡萄糖氧化酶能催化葡萄糖氧化，产生的过氧化氢在一定pH缓冲液和加热条件下，能使靛蓝胭脂红溶液发生褪色反应，并且反应的速度在一定范围内和过氧化氢浓度成正比。根据测定过氧化氢的量，计算出葡萄糖氧化酶的活力。
H2O2标准曲线绘制：准确吸取0、100、200、300、400、500、600、700µL H2O2标准溶液，分别置于2mLEP管中，加入200µL靛蓝胭脂红溶液、300µL缓冲液，加蒸馏水至1.5mL，于沸水浴中加热13min，用流水冷却EP管。吸取200µL至96孔板，用全波长扫描式多功能读数仪在波长615nm处测定其吸光度A0和A。以lg(A0/A)对过氧化氢浓度作图，得标准曲线。
取1mL粗酶液加入5mLEP管中，加入等体积的0.2%葡萄糖底物；对照取1mL磷酸缓冲液，加入等体积0.2%葡萄糖底物，作对照。在37℃，转速为180r/min的摇床上反应10min，得酶促反应液。取100µL酶促反应液、200µL靛蓝胭脂红溶液（1.0×10-3mol/L)，300µL的缓冲液，再加入蒸馏水至1.5mL，于沸水浴中加热13min，用流水冷却，吸取200µL至96孔板，在波长615nm处测定其吸光值A0和A。
根据标准曲线线性回归方程，可由lg(A0/A)求出相应的过氧化氢的浓度。
酶活力定义：在上述实验条件下，每分钟催化葡萄糖反应产生1µg H2O2所需的酶量定义为一个酶活力单位（U)。
3、粗酶液性质研究
分别在20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃进行酶促反应10 min，测定葡萄糖氧化酶活力，葡萄糖氧化酶反应最适温度如图1所示，本发明制备的葡萄糖氧化酶最适反应温度为60℃。
将上述制备的稀释酶液分别在20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃温度下水浴保温30min放入冰水混合物中，与未被保温处理的酶活力相比较，测定葡萄糖氧化酶剩余活力，葡萄糖氧化酶的热稳定性如图1所示，本发明制备的葡萄糖氧化酶耐热性较好， 80℃处理30min后，仍有70%左右的酶活。
配制pH 3.0（柠檬酸-磷酸）、pH4.0、pH 5.0（乙酸-乙酸钠）、pH6.0、pH 7.0（磷酸盐）缓冲液，分别用不同缓冲液和H2O2绘制标准曲线，在不同的缓冲液条件下测定酶活力值，结果表明，本发明制备的的葡萄糖氧化酶最适反应pH为6.0如图2所示。
将稀释酶液分别加入到不同pH缓冲液中，4℃保存24h后，测定剩余酶活。结果表明，本发明制备的葡萄糖氧化酶在pH3.0-6.0均能表现较好的稳定性如图2所示。
本发明筛选的一株产葡萄糖氧化酶的枝孢霉（Cladosporium sp.）CY-12菌株，关于这个属的菌种产胞外葡萄糖氧化酶菌株的这个性能到目前为止没有文献报道和专利申请，因此，本发明丰富了产葡萄糖氧化酶的微生物范围，本发明所用到的发酵培养基成分和发酵条件简单，易于操作，另外菌株发酵周期短，只有3天，产胞外葡萄糖氧化酶，提取容易，便于大规模发酵生产，在本发明中，生产菌株所生产的葡萄糖氧化酶的性状优良，具体表现在，温度在60℃时，酶的活性最高，耐温性能好，80℃处理30min后，仍有70%左右的酶活，本发明菌株的发现具有实际的生产意义，适合大范围的推广和应用。
序列表
<110> 河南省科学院生物研究所有限责任公司
<120> 一种产胞外葡萄糖氧化酶菌株CY-12及其应用
<130> 2019
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1718
<212> DNA
<213> 枝孢霉(Cladosporium sp.)
<400> 1
tgtacatgca tgtctaagta taagcaacta tacggtgaaa ctgcgaatgg ctcattaaat 60
cagttatcgt ttatttgata gtaccttact acatggataa ccgtggtaat tctagagcta 120
atacatgcta aaaacctcga cttcggaagg ggtgtattta ttagataaaa aaccaatgcc 180
cttcggggct ccttggtgaa tcataataac ttaacgaatc gcatggcctt gcgccggcga 240
tggttcattc aaatttctgc cctatcaact ttcgatggta ggatagtggc ctaccatggt 300
atcaacgggt aacggggaat tagggttcga ctccggagag ggagcctgag aaacggctac 360
cacatccaag gaaggcagca ggcgcgcaaa ttacccaatc ccgacacggg gaggtagtga 420
caataaatac tgatacaggg ctcttttggg tcttgtaatt ggaatgagta caatttaaat 480
cccttaacga ggaacaattg gagggcaagt ctggtgccag cagccgcggt aattccagct 540
ccaatagcgt atattaaagt tgttgcagtt aaaaagctcg tagttgaacc ttgggcctgg 600
ctggccggtc cgcctcaccg cgtgtactgg tccggccggg cctttccttc tggggaacct 660
catgcccttc actgggcgtg ttggggaacc aggactttta ctttgaaaaa attagagtgt 720
tcaaagcagg cctttgctcg aatacattag catggaataa tagaatagga cgtgtggttc 780
tattttgttg gtttctagga ccgccgtaat gattaatagg gatagtcggg ggcatcagta 840
ttcaatcgtc agaggtgaaa ttcttggatt gattgaagac taactactgc gaaagcattt 900
gccaaggatg ttttcattaa tcagtgaacg aaagttaggg gatcgaagac gatcagatac 960
cgtcgtagtc ttaaccataa actatgccga ctagggatcg gacggtgtta gtattttgac 1020
ccgttcggca ccttacgaga aatcaaagtt tttgggttct ggggggagta tggtcgcaag 1080
gctgaaactt aaagaaattg acggaagggc accaccaggc gtggagcctg cggcttaatt 1140
tgactcaaca cggggaaact caccaggtcc agacacaata aggattgaca gattgagagc 1200
tctttcttga ttttgtgggt ggtggtgcat ggccgttctt agttggtgga gtgatttgtc 1260
tgcttaattg cgataacgaa cgagacctta acctgctaaa tagccaggcc cgctttggcg 1320
ggtcgccggc ttcttagagg gactatcggc tcaagccgat ggaagtttga ggcaataaca 1380
ggtctgtgat gcccttagat gttctgggcc gcacgcgcgc tacactgaca gagccaacga 1440
gttcatttcc ttagccgaaa ggtttgggta atcttgttaa actctgtcgt gctggggata 1500
gagcattgca attattgctc ttcaacgagg aatgcctagt aagcgcatgt catcagcatg 1560
cgttgattac gtccctgccc tttgtacaca ccgcccgtcg ctactaccga ttgaatggct 1620
cggtgaggcc ttcggactgg cccagggagg tcggcaacga ccacccaggg ccggaaagtt 1680
ggtcaaaccc ggtcattaga gaagaaatgt tgtacccg 1718

Claims (2)

1.一种产胞外葡萄糖氧化酶菌株CY-12，其特征在于，其分类命名为枝孢霉（Cladosporium sp.），已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC NO .17661，该菌株的18S rDNA 基因序列如SEQ ID NO： 1 所示。
2.权利要求1所述的产胞外葡萄糖氧化酶菌株CY-12制备葡萄糖氧化酶的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）从斜面保藏培养基斜面上挑取菌株CY-12接种于活化平板培养基上，25～30℃活化培养至产生孢子；
2）用5mL 0.9%的生理盐水冲洗活化平板培养基，洗下孢子，制成孢子悬浮液，按照体积比5～10%接种于发酵培养基，25～30℃、180rpm培养60～72 h，得到葡萄糖氧化酶发酵液；
3）用纱布过滤除去除菌体及杂质，用体积浓度为60～80％的硫酸铵沉淀葡萄糖氧化酶发酵液中的蛋白，按照质量比加入葡萄糖氧化酶发酵液1～2%的可溶性淀粉吸附蛋白，12000r、20min离心收集沉淀，用磷酸缓冲液溶解沉淀，透析除盐，将样品放入冷冻干燥机中-45℃、7Pa冷冻干燥至粉末状，得葡萄糖氧化酶；
所述的斜面保藏培养基组成：马铃薯20g，葡萄糖20g，琼脂15g，蒸馏水1000mL，pH自然，115℃灭菌25min；
所述的活化平板培养基组成：马铃薯20g，葡萄糖20g，琼脂15g，蒸馏水1000mL，pH自然，115℃灭菌25min，倒在平板上；
所述的发酵培养基组成：葡萄糖60～80g，蛋白胨3～5 g，KH2PO41.8～2.2 g，MgSO4•7H2O0.3～0.5 g，KC1 0.3～0.5 g，CaCO3 3.0～3.5 g，pH自然，115℃条件下灭菌25 min。
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