KR100755727B1 - β-갈락토시다제 유래의 융합 단편 펩타이드 및 이를 융합파트너로 이용하는 재조합 단백질의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 β-갈락토시다제(β-galactosidase)로부터 유래한 융합단편 펩타이드(MTMITDSLAVVL)와 상기 펩타이드를 융합 파트너로 이용하여 목적 단백질을 융합 단백질 형태로 발현하는 재조합 발현벡터 및 상기 발현벡터에 의해 형질전환된 대장균을 배양하여 재조합 단백질을 제조하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 재조합 발현벡터를 이용하여 발현한 β-갈락토시다제 N-말단의 12개 아미노산이 융합된 인슐린 유사 성장인자-1(IGF-1) 융합 단백질의 회수율은 종래의 융합 파트너를 사용하지 않은 발현벡터 및 β-갈락토시다제의 전체서열(38kDa) 또는 부분서열(13kDa)을 융합 파트너로 사용하는 발현벡터로 발현한 IGF-1의 회수율보다 약 1.5 내지 5배 정도 높기 때문에, 대장균에서 발현이 잘 되지 않는 재조합 단백질의 대량생산을 위한 방법으로 널리 이용될 수 있다.

β-갈락토시다제, 융합 파트너, 인슐린 유사 성장인자-1(IGF-1)

Description

β-갈락토시다제 유래의 융합 단편 펩타이드 및 이를 융합 파트너로 이용하는 재조합 단백질의 제조방법{Fragment Peptide of β-Galactosidase as a Fusion Partner and Preparation Method of Recombinant Protein Using the Same}

도 1은 β-갈락토시다제 유래의 N-말단 단편을 융합 파트너로 이용하여 인슐린 유사 성장인자-1을 융합 단백질 형태로 발현하는 발현벡터 pCGI-2의 제조과정에 대한 개략도이다.

도 2는 인슐린 유사 성장인자-1 및 β-갈락토시다제 유래의 N-말단 단편과 융합된 인슐린 유사 성장인자-1 융합 단백질의 발현 정도를 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동(SDS-PAGE)을 통해 확인한 결과를 나타내는 사진이다. 레인 1은 분자량 마커, 레인 2는 pCG 함유 대장균의 배양액, 레인 3은 pCGI-1 함유 대장균의 배양액 및 레인 4는 pCGI-2 함유 대장균의 배양액을 각각 취하여 전기영동한 결과이다.

도 3은 인슐린 유사 성장인자-1 융합 단백질을 NTA 크로마토그래피를 통해 정제한 후, HPLC로 분석한 프로파일이다.

도 4는 본 발명의 일 실시예에 의하여 제조된 인슐린 유사 성장인자-1 융합 단백질의 생리활성도를 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.

본 발명은 β-갈락토시다제의 N-말단 단편을 융합 파트너로 이용하여 재조합 단백질을 효과적으로 제조하는 방법에 관한 것으로, 구체적으로 목적 단백질에 β-갈락토시다제 유래의 N-말단 단편이 융합된 융합 단백질을 암호화하는 유전자 단편을 얻는 단계; 상기 유전자 단편을 포함하는 발현벡터를 제조하는 단계; 상기 발현벡터로 형질전환된 형질전환 미생물을 제조하는 단계; 및 상기 형질전환 미생물로부터 목적 단백질을 발현 및 정제하는 단계로 구성된 제조방법에 관한 것이다.

사람 또는 동물의 장기로부터 어렵게 얻어지던 여러가지 중요한 단백질들을 유전자 재조합 방법을 이용하여 미생물로부터 생산하기 위해서는 목적 단백질의 유전자를 발현벡터에 클로닝하여 재조합 발현벡터를 얻고, 이를 적당한 숙주세포에 형질전환시켜 형질전환 균체를 선별한 후, 상기 형질전환 균체를 배양함으로써 목적 단백질을 수득하게 된다. 이를 위한 숙주세포로서 가장 많이 이용되고 있는 대장균은 다른 생물체에 비하여 그의 유전자 및 대사체계에 대한 정보가 가장 많이 알려져 있어 유전자 재조합 기술에 의하여 유용한 외래 단백질을 생산하기가 매우 용이하다. 그러나, 모든 목적 단백질이 상기 대장균 시스템에서 과발현되는 것은 아니기 때문에, 이러한 문제점을 해결하기 위하여 목적 단백질의 N-말단에 적절한 융합 파트너를 융합시켜 발현시키는 방법이 이용되고 있다.

상기 방법은 선택된 숙주에서 안정적으로 생산되는 것으로 알려진 수용성 단백질을 융합 파트너로 이용하여 목적 단백질을 생산하는 방법인데, 대표적인 수용성 단백질로는 예를 들면, 글루타치온-S-전달효소(GST: glutathione-S-transferase), 말토오즈 결합 단백질(MBP: maltose binding protein), β-갈락토시다제(β-galactosidase), 클로람페니콜 아세틸전달효소(CAT: chloramphenicol acetyltransferase) 및 티오레독신(TRX: thioredoxin) 등이 있다.

상기 수용성 단백질 중, β-갈락토시다제는 38kDa의 분자량을 갖는 대장균 유래 단백질로서 여러 융합 파트너 중 그 사용빈도가 높으며, 대장균 내에서 많은 양이 발현되고 다른 단백질과의 융합 시스템에서도 비교적 발현이 잘 되는 것으로 알려져 있다.

예를 들면, 인슐린 유사 성장인자-1(이하, 'IGF-1'으로 명명)의 경우, 대장균 시스템의 세포 내 발현으로는 그 발현 양 자체가 미미하여 그 활용 가능성이 매우 낮은 편인데, 대한민국 특허공고 제 1992-3787호 및 대한민국 특허공고 제149254호에서는 이러한 IGF-1의 발현량을 늘리기 위한 방법으로 β-갈락토시다제와의 융합 단백질(이하, 'lacZ-IGF-1'으로 명명) 발현을 사용하여, 대장균 전체 단백질의 20 내지 30% 정도로 lacZ-IGF-1을 발현시켜, 재조합 IGF-1의 생산량을 증가시킨 예가 개시되어 있다.

그러나, 상기와 같은 융합 단백질의 발현에서의 문제점은 융합 파트너의 크기가 커서, 융합 단백질의 발현량이 많다고 하더라도 실제로 얻고자 하는 목적 단백질의 양은 상대적으로 적으며, 큰 분자량의 융합 단백질로 인하여 대장균 자체에 주는 대사적인 부담감(metabolic burden)이 크다는 것이다. 그러므로, 융합 단백질의 발현량 및 융합 단백질로부터 목적 단백질의 회수율을 증가시키기 위한 많은 연구들이 진행되고 있다. 상기 대한민국 특허공고 제 149254호에서는 이런 연구의 일환으로 재조합 IGF-1의 과 발현을 위하여, 기존의 β-갈락토시다제의 일부를 포함하는 융합 단백질을 발현하고, 추후 화학적인 방법으로 IGF-1만을 정제하는 발현 시스템을 확립한 실시예를 개시하고 있다. 그러나, 상기 방법 또한 대사 부담을 확실히 개선한 것은 아니어서, 펩타이드 수준에서 원천적인 대사 부담을 없애면서 외부 단백질을 과 발현할 수 있는 발현 방식의 필요성이 절실히 요구되고 있는 실정이다.

상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여, 본 발명자들은 β-갈락토시다제의 여러 부위를 대상으로 하여 여러 가지 후보 단편을 선정한 뒤, 분자생물학적인 방법으로 여러 목적 단백질의 N-말단 부위에 도입하여, 재조합 단백질을 대량생산할 수 있는 융합 파트너를 찾기 위하여 예의 연구 노력한 결과, β-갈락토시다제의 N-말단 12개의 아미노산 단편을 융합 파트너로 이용한 경우에 있어서, 기존의 β-갈락토시다제의 전체 서열을 융합 파트너로 이용한 발현량에 비하여 5배 이상의 발현량 증가를 나타내며, β-갈락토시다제의 일부 서열(13kDa)을 융합 파트너로 이용한 발현량에 비해서도 약 2배 정도의 발현량 증가를 나타냄을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

결국, 본 발명의 주된 목적은 재조합 단백질을 대량생산할 수 있는, β-갈락토시다제(β-galactosidase)로부터 유래한 융합단편 펩타이드(MTMITDSLAVVL)와 상기 펩타이드를 융합 파트너로 이용하여 목적 단백질을 융합 단백질 형태로 발현하는 재조합 발현벡터 및 상기 발현벡터에 의해 형질전환된 대장균을 배양하여 재조합 단백질을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명은 β-갈락토시다제로부터 유래한 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 융합 단편 펩타이드 및 상기 융합 단편 펩타이드를 융합 파트너로 이용하여 목적 단백질을 융합 단백질 형태로 발현하는 재조합 발현벡터를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 발현벡터에 의해 형질전환된 대장균 및 상기 대장균을 배양함으로써 생산되는 융합 단백질을 제공한다.

아울러, 본 발명의, β-갈락토시다제 유래의 융합 단편 펩타이드를 융합 파트너로 이용하는 재조합 단백질의 제조방법은 (i) 목적 단백질에 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 β-갈락토시다제 유래의 N-말단 단편이 융합된 융합 단백질을 암호화하는 유전자 단편을 얻는 단계; (ii) 상기 유전자 단편을 포함하는 발현벡터를 제조하는 단계; (iii) 상기 발현벡터로 형질전환된 형질전환 미생물을 제조하는 단계; 및, (iv) 상기 형질전환 미생물로부터 목적 단백질을 발현 및 정제하는 단계를 포함한다: 이때, 목적 단백질의 정제를 위하여 폴리히스티딘 서열(6 His-Tag)을 암호화하는 염기 서열을 상기 발현벡터 내에 추가로 삽입할 수 있으며, 융합 파트너의 분리를 위하여 단백질 분해효소의 인식 부위(예를 들어, 트롬빈 인식 부위인 LVPRGS)를 암호화하는 염기서열을 목적 단백질과 융합 파트너를 암호화하는 염기 서열 사이에 삽입할 수도 있다.

바람직한 일 실시예에 있어서, β-갈락토시다제의 N-말단 단편을 융합 파트너로 이용하는 융합 단백질의 발현벡터는 β-갈락토시다제 N-말단 단편에 해당하는 유전자, 6개의 히스티딘(6x His-tag)에 해당하는 유전자, 트롬빈(thrombin)의 인식부위를 암호화하는 유전자 및 목적 단백질의 유전자를 일련의 순서로 포함하고 있다.

바람직한 일 실시예로서, 인슐린 유사 성장인자-1(IGF-1)을 모델 유전자로 선택하여, β-갈락토시다제 N-말단의 12개 아미노산을 암호화하는 유전자 뒤에 6x His-tag, 트롬빈 인식부위 및 IGF-1 유전자가 연결된 발현벡터 pCGI-2를 제조하였다. IGF-1의 염기서열 및 아미노산 서열은 서열번호 2 및 서열번호 3에 기재된 바와 같다.

상기 발현벡터 pCGI-2로 형질전환된 대장균을 배양하고, IPTG(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside)로 발현유도하여, 융합 단백질의 발현량을 조사한 결과, 12개 아미노산으로 구성된 β-갈락토시다제 단편이 융합된 IGF-1이 높은 발현율로 제조됨을 확인하였다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예들은 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예

비교예 1: IGF-1을 직접 발현하는 재조합 발현벡터의 제조

알려진 IGF-1의 염기서열(서열번호 2) 앞에 히스티딘 6잔기 및 트롬빈 인식부위 6잔기(LVPRGS)를 암호화하는 염기서열이 연결된 상보적인 DNA를 화학적으로 합성한 후, NdeI과 XhoI 제한효소 인식부위를 갖도록 프라이머를 제작하고, 이를 PCR(polymerase chain reaction) 방법으로 증폭하였다.

PCR은 DNA 중합효소 반응용 완충용액(50mM KCl; 20mM Tris-HCl(pH 8.0); 2mM MgCl₂)에 0.25mM dNTPs, 주형 DNA 100ng, 프라이머 각 50pmol을 혼합한 후 Taq DNA 중합효소(TaKaRa사 제품)를 이용하여 수행하였다. PCR 반응조건은 95℃에서 5분간 가열하여 변성시킨 후, 95℃, 30초(denaturation), 55℃, 30초(annealing), 72℃, 60초(elongation)의 반응을 30회 반복하고 최종적으로 72℃에서 10분간 증폭하였다. PCR이 종료된 후 증폭된 DNA를 1% 아가로스 겔에 전기영동하여 약 250bp 위치 에서 밴드가 검출되는 것을 확인하였다. 겔로부터 상기 위치의 밴드를 잘라낸 후 겔 추출 키트(Qiagen사 제품)를 이용하여 겔로부터 증폭된 DNA를 정제하였다. 이와같이 준비된 DNA를 제한효소 NdeI과 XhoI으로 각각 처리하여 5' 말단에 NdeI 제한효소 부위와 3' 말단에 XhoI 제한효소 부위를 갖도록 한 후 상기 DNA를 동일한 제한효소로 처리한 pCG 발현벡터에 T4 DNA 연결효소로 연결하여 IGF-1을 직접 발현하는 재조합 발현벡터를 제조하고, 이를 pCGI-1으로 명명하였다.

실시예 1: β-갈락토시다제 유래의 N-말단 12개 아미노산 단편을 융합한 재조합 IGF-1 융합 단백질(lacZ-IGF-1) 발현벡터(pCGI-2)의 제조

알려진 IGF-1의 염기서열(서열번호 2) 앞에 β-갈락토시다제 유래의 N-말단 12개 아미노산 단편(MTMITDSLAVVL), 히스티딘 6잔기 및 트롬빈 절단부위 6잔기(LVPRGS)를 암호화하는 염기서열이 연결된 상보적인 DNA를 화학적으로 합성한 후, NdeI과 XhoI 제한효소 인식부위를 갖도록 프라이머를 제작하고, 이를 상기 실시예 1의 PCR 방법과 동일하게 증폭하고 증폭된 DNA(약 300bp)를 정제하였다.

상기 증폭된 DNA를 NdeI과 XhoI 제한효소를 이용하여 절단한 후 동일한 제한효소로 처리한 pCG 발현벡터에 T4 DNA 연결효소로 연결하여 β-갈락토시다제 유래 12개 아미노산 단편이 융합된 재조합 IGF-1 융합 단백질(lacZ-IGF-1)을 발현하는 재조합 발현벡터를 제조하고, 이를 pCGI-2로 명명하였다(참조: 도 1).

실시예 2: 대장균 형질전환체의 제조

비교예 1 및 실시예 1의 재조합 발현벡터 pCGI-1 및 pCGI-2에 의해 형질전환된 대장균을 제조하기 위하여, 상기 벡터를 Hanahan이 기술한 방법(참조: Hanahan D., DNA Cloning, 1, 109-135, IRS press, 1985)에 따라 대장균 DH5α에 형질전환시킨 후, 가나마이신(kanamycin)이 포함된 배지에서 배양하여 상기 발현벡터가 형질전환되어 가나마이신 저항성을 나타내는 콜로니를 선별하고, 각 콜로니를 배양하여 정확한 구성의 발현벡터를 증폭 및 정제하였다. 그 후, 발현을 위한 대장균 JM101에 염화칼슘법으로 형질전환하여 대장균 형질전환체를 준비하였다.

실험예 1: IGF-1 및 IGF-1 융합 단백질의 발현 및 정제

상기 실시예 2에서 수득한 대장균 JM101 형질전환체를 100mg/L 가나마이신이 첨가된 LB 액체 배지에 접종하여 전 배양한 후, 이를 100mg/L 가나마이신이 첨가된 새로운 4L의 LB 액체 배지에 다시 접종하여 37℃에서 600nm에서의 흡광도값이 0.7에 이를 때까지 배양한 후, 1mM IPTG를 이용하여 그 발현을 유도한 뒤 이후 16시간 배양하였다. 발현된 대장균의 배양액 각각을 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE)으로 분석하여 각 배양액의 목적 단백질 발현 정도를 비교하였다(참조: 도 2).

상기 도 2에서 1번은 분자량 마커이며, 2번은 목적 단백질이 포함되지 않은 플라스미드(pCG) 만을 함유하고 있는 경우의 대장균 배양액이고, 3번은 pCGI-1를 함유하고 있는 경우의 대장균 배양액이며, 4번은 pCGI-2를 함유하고 있는 경우의 대장균 배양액이다.

배양액은 원심분리를 통하여 균만을 분리하고, 고압을 이용하여 균을 파쇄하였으며, 상기 파쇄액을 15,000×g에서 20분간 원심분리하여 봉입체(inclusion body) 1g을 분리하였다. 봉입체를 6M 염화구아니딘 완충용액에 녹인 후, 니켈 친화 크로마토그래피로 융합 단백질을 분리하였다. 분리된 융합 단백질을 2M 염화구아니딘 완충용액에서 32시간 방치하여 환원형 IGF-1을 만들고, 이를 50mM 염화 트리스 완충용액에 투석하여 정제된 융합 단백질을 준비하였다.

정제된 융합 단백질은 SDS로 순도를 확인한 뒤, HPLC로 분석을 하였다. 컬럼은 C18 2.5x450 Vydac 300Å을 사용하였으며, 용매는 0.1%의 삼불화초산을 함유하는 물과 아세토니트릴을 사용하여 물: 아세토니트릴의 비율을 20:80에서 0:100이 되도록 50분간 선형 농도구배로 분당 1mL의 유속으로 흘려주어 분석하였다(참조: 도 3).

도 3의 HPLC 프로파일에서 보듯이, 약 40분의 머무름 시간 값을 갖는 물질이 본 발명의 재조합 단백질 제조방법을 사용하여 제조된 IGF-1 융합 단백질이며, 표준품과 비교하여 주 피크에 대한 정성 및 정량 분석을 수행한 결과, 정제된 융합 단백질은 190mg으로 19%의 회수율을 나타내었다. 한편, 비교로 실험한 pCGI-1 벡터를 이용한 IGF-1의 회수율은 약 3%로, IGF-1 융합 단백질에 융합된 β-갈락토시다제 유래의 N-말단 단편(12 a.a.)의 크기를 감안할 때, 약 5배의 회수율 증가를 보임을 알 수 있었다.

또한, β-갈락토시다제 전체서열(38kDa)을 융합 파트너로 사용한 경우(대한민국 특허공고 제 1992-3787호)는 IGF-1의 회수율이 2.5%였으며, β-갈락토시다제 부분서열(13kDa)을 융합 파트너로 사용한 경우(대한민국 특허공고 제 149254호)는 IGF-1의 회수율이 11%이었다. 본 발명의 β-갈락토시다제 유래의 N-말단 단편이 융합된 IGF-1 융합 단백질은 상기 공지의 융합 파트너로 제조된 IGF-1 융합 단백질의 회수율보다 약 1.5 내지 5배 정도 높을 뿐 아니라, 하기 실험예 2에서 보듯이, 융합 파트너를 단백질 분해효소로 분해하지 않은 융합 단백질 자체로도 활성을 나타내고 있어, 저비용으로 유용한 단백질을 대량생산할 수 있는 이점이 있다.

실험예 2: 정제된 재조합 IGF-1 융합 단백질(lacZ-IGF-1)의 활성 측정

정제된 lacZ-IGF-1을 0.22㎛ 필터를 이용하여 필터한 후, 농도에 따른 마우스의 섬유 아세포의 증식효과를 알아보기 위하여 NIH3T3 세포를 2,000/well이 되도록 96 멀티 플레이트에 분주하였다. 그리고, 48시간 동안 배양한 다음 페놀레드 프리배지(phenol red free media)에 24시간 동안 스타베이션(starvation)시켰다. 그 후, 새로운 배지로 바꾼 다음 IGF-1을 각각 농도별로 처리하여 48시간 후에 세포 성장효과를 알아보았다. LacZ-IGF-1(0~100ng/mL)을 NIH3T3 세포에 처리했을 때의 표피세포의 증식효과를 나타낸 결과를 도 4에 도시하였다.

도 4에 도시된 바와 같이, 첨가된 LacZ-IGF-1의 농도에 비례하여 NIH3T3 세 포가 성장됨을 확인할 수 있었으며, IGF-1 단백질에 β-갈락토시다제 유래의 융합 단편 펩타이드가 결합되어 있더라도 활성에는 차이가 없음을 알 수 있었다.

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명은 β-갈락토시다제 유래의 N-말단 아미노산 단편을 융합 파트너로 이용함으로써 재조합 인슐린 유사 성장인자-1을 형질전환 미생물로부터 높은 수득율로 발현시키는 제조방법을 제공한다. 본 발명의 재조합 발현벡터를 이용하여 발현한 β-갈락토시다제 N-말단의 12개 아미노산이 융합된 인슐린 유사 성장인자-1(IGF-1) 융합 단백질의 회수율은 종래의 융합 파트너를 사용하지 않은 발현벡터 및 β-갈락토시다제의 전체서열(38kDa) 또는 부분서열(13kDa)을 융합 파트너로 사용하는 발현벡터로 발현한 IGF-1의 회수율보다 약 1.5 내지 5배 정도 높기 때문에, 대장균에서 발현이 잘 되지 않는 재조합 단백질의 대량생산을 위한 방법으로 널리 이용될 수 있다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims (8)

1. 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 융합 단편 펩타이드.
2. 제 1항에 있어서,

   상기 융합 단편 펩타이드는 β-갈락토시다제로부터 유래한 것인 융합단편 펩타이드.
3. 제 1항에 따른 융합 단편 펩타이드를 코딩하는 유전자.
4. 제 3항의 융합 단편 펩타이드를 코딩하는 유전자 및 목적 단백질 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터.
5. 제 4항에 있어서,

   상기 목적 단백질은 인슐린 유사 성장인자-1인 것을 특징으로 하는 재조합 발현벡터.
6. 제 4항의 재조합 발현벡터에 의해 형질전환된 대장균.
7. (i) 목적 단백질에 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 β-갈락토시다제 유래의 N-말단 단편이 융합된 융합 단백질을 암호화하는 유전자 단편을 얻는 단계; (ii) 상기 유전자 단편을 포함하는 발현벡터를 제조하는 단계; (iii) 상기 발현벡터로 형질전환된 형질전환 미생물을 제조하는 단계; 및, (iv) 상기 형질전환 미생물로부터 목적 단백질을 발현 및 정제하는 단계를 포함하는, β-갈락토시다제 유래의 N-말단 단편을 융합 파트너로 이용하는 재조합 단백질의 제조방법.
8. 제 7항에 있어서,

   단계 (i)의 목적 단백질은 인슐린 유사 성장인자-1인 것을 특징으로 하는 제조방법.

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