KR100500978B1

KR100500978B1 - 에틸렌디아민-n,n'-디숙신산:에틸렌디아민리아제활성을가진단백질및그를암호화하는유전자

Info

Publication number: KR100500978B1
Application number: KR1019970064575A
Authority: KR
Inventors: 와타루 미즈나시
Original assignee: 미쓰비시레이욘 가부시키가이샤
Priority date: 1996-11-29
Filing date: 1997-11-29
Publication date: 2005-11-25
Also published as: KR19980042928A

Abstract

본 발명은 에틸렌디아민-N,N'-디숙신산 : 에틸렌디아민 리아제 활성을 가진 폴리펩티드를 암호화하는 염기배열을 포함하는 DNA로서, 전기 폴리펩티드가 배열번호 1로 표시되는 아미노산 배열 또는 이 아미노산 배열에 있어서 적어도 1개의 아미노산이 결실, 치환 혹은 부가된 아미노산 배열을 가지는 DNA, 이 DNA를 포함하는 재조합 플라스미드, 이 재조합 플라스미드에 의해 형질전환된 숙주, 이 형질전환 숙주를 이용하여 디아미노알킬렌-N,N'-디숙신산을 제조하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 배열번호 1로 표시되는 아미노산 배열 또는 이 아미노산 배열에 있어서 적어도 1개의 아미노산이 결실, 치환 혹은 부가된 아미노산 배열을 가지며, 에틸렌디아민-N,N'-디숙신산 : 에틸렌디아민 리아제 활성을 가진 폴리펩티드에 관한 것이다.

Description

에틸렌디아민-N,N'-디숙신산 : 에틸렌디아민 리아제 활성을 가진 단백질 및 그를 암호화하는 유전자

본 발명은 에틸렌디아민-N,N'-디숙신산 : 에틸렌디아민 리아제(lyase) 활성을 가진 단백질 및 그를 암호화하는 유전자에 관한 것이다.

디아민알킬렌-N,N'-디숙신산은 의·농약 합성 중간체로서 중요한 화합물일 뿐만 아니라, 중금속을 포착하는 특이한 성질을 가진 화합물이다. 또한, 이 화합물의 광학 이성체는 자연계에 방출된 후 쉽게 생분해될 것으로 기대되므로, 킬레이트제나 세제용 빌더 등의 용도가 기대되고 있다.

디아미노알킬렌-N,N'-디숙신산은 유기 합성법에 의해 각종의 아민과 말레산 또는 푸마르산으로부터 용이하게 합성할 수 있다. 그러나, 광학 활성을 갖는 디아미노알킬렌-N,N'-디숙신산의 경우에는 그 유기 합성법의 출발 원료로서 광학 활성 아스파라긴산 등을 필요로 한다. 예를 들면, 광학 활성 디아미노에틸렌-N,N'-디숙신산은 L-아스파라긴산과 디브롬에탄으로부터 제조할 수 있다[John A. Neal et al. Inorganic Chem. 7, 2405(1968)]. 그러나, L-아스파라긴산이나 디브롬에탄으로부터의 제조는, 제조 원료가 비교적 고가이어서, 싼 가격으로 범용성 있는 화합물로서 공급하는 것은 곤란하다.

한편, 디아미노알킬렌-N,N'-디숙신산은 방선균의 배양액으로부터도 분리 동정되어 있다[T. Nishikiori et al. J. Antibiotics 37, 426(1984)]. 그러나, 이 방선균에 의한 생산성은 매우 저조하여, 이러한 방선균을 이용한 디아미노알킬렌-N,N'-디숙신산의 제조방법은 공업적 제법으로 적용될 수 없었다.

이에 대하여, 본 출원인은, 먼저 미생물의 촉매작용을 이용하여 푸마르산 혹은 말레산과 각종 디아민으로부터 효율적으로 광학 활성의 S,S-디아미노알킬렌-N,N'-디숙신산을 합성하는 신규의 방법을 제안하였다(특허공개 평성 9-140390호, 유럽 특허공개 0731171호, 유럽 특허공개 0805211호).

본 발명은 전기 미생물의 촉매작용을 더욱 향상시키는 것을 과제로 한다.

본 발명자는 에틸렌디아민-N,N'-디숙신산 : 에틸렌디아민 리아제 유전자의 클로닝을 행하고, 유전자 재조합에 의해 미생물의 균체내에 전기 유전자를 다수 복사하여 존재시킴으로서, 미생물의 촉매 능력을 획기적으로 증대시켜, 미생물 균체에 있어서 디아미노알킬렌-N,N'-디숙신산의 생산량을 개선하는 것에 성공하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

즉, 본 발명은 에틸렌디아민-N,N'-디숙신산 : 에틸렌디아민 리아제 활성을 가진 폴리펩티드를 암호화하는 염기배열을 포함하는 DNA로서, 이 폴리펩티드가 배열번호 1로 표시되는 아미노산 배열 또는 이 아미노산 배열에 있어서 적어도 1개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 배열을 가지는 상기 DNA를 제공한다. 에틸렌디아민-N,N'-디숙신산 : 에틸렌디아민 리아제 활성을 가진 폴리펩티드를 암호화하는 염기배열을 포함하는 DNA는, 배열번호 1로 표시되는 아미노산 배열을 가지는 폴리펩티드를 암호화하는 염기 배열을 포함하는 DNA 또는 유전자 코드의 동의성(同義性)에 유래하는 그의 유사체도 가능하다. 또한, 상기의 폴리펩티드를 암호화하는 염기배열은 배열번호 2에 표시되는 염기배열을 가질 수도 있다.

또한, 다른 견지에서 보면, 본 발명은 배열번호 2에 표시되는 염기배열 또는 그의 단편과 혼성화하며, 에틸렌디아민-N,N'-디숙신산 : 에틸렌디아민 리아제 활성을 가진 폴리펩티드를 암호화하는 염기배열을 포함하는 DNA를 제공한다. 배열번호 2에 표시된 배열의 단편으로서는, 배열번호 2에 표시된 염기배열의 염기번호 176∼501에 해당하는 326개 염기수로 이루어지는 단편이 있다. 혼성화의 조건으로서는 온도 25∼40℃, 포름아미드 농도 10∼50%로 할 수 있다. 또한, 세척조건은 검출의 방법에 맞추어 설정해도 무방하다.

더욱이, 본 발명은 배열번호 4 및 5에 표시되는 염기배열로 이루어진 합성 DNA로 증폭되는 200∼350bp의 DNA 단편도 제공한다. 이러한 DNA 단편은 본 발명에서 말하는, 에틸렌디아민-N,N'-디숙신산 : 에틸렌디아민 리아제와 실질적으로 동일한 유전자를 취득하거나, 혹은 같은지 어떤지를 판단하는 것에 이용할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기의 에틸렌디아민-N,N'-디숙신산 : 에틸렌디아민 리아제 활성을 가진 폴리펩티드를 암호화하는 염기배열을 포함하는 DNA를 함유하는 재조합 플라스미드를 제공한다.

본 발명은 상기의 재조합 플라스미드에 의해 형질전환된 형질전환 숙주를 제공한다. 숙주는 대장균 등의 미생물이 바람직하다. 전기 형질전환 숙주를 이용하여 디아미노알킬렌-N,N'-디숙신산을 제조하는 것이 가능하고, 본 발명은 이러한 형질전환 숙주를 이용하여 디아미노알킬렌-N,N'-디숙신산을 제조하는 방법을 제공한다.

아울러, 본 발명은 배열번호 1로 표시되는 아미노산 배열 또는 이 아미노산 배열에 있어서 적어도 1개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 배열을 가지며, 나아가 에틸렌디아민-N,N'-디숙신산 : 에틸렌디아민 리아제 활성을 가진 폴리펩티드를 제공한다. 아미노산의 결실, 치환 또는 부가는 공지기술인 부위 특이적 돌연변이 유발(예를 들면, Nucleic Acid Research, Vol. 10, No. 20, p. 6487-6500, 1982를 참조할 것)에 의해 실시할 수 있다.

유전자 재조합의 방법으로 에틸렌디아민-N,N'-디숙신산 : 에틸렌디아민 리아제의 유전자를 클론화함으로서, 미생물 균체내에 전기 유전자를 다수 복사하여 존재시키는 것이 가능하게 되었으므로, 미생물의 촉매능력을 획기적으로 증대시켜 디아미노알킬렌-N,N'-디숙신산의 생산량을 향상시킬 수 있다.

이하, 본 발명을 보다 구체적으로 설명하고자 한다.

본 발명의 「에틸렌디아민-N,N'-디숙신산 : 에틸렌디아민 리아제」는 푸마르산과 에틸렌디아민으로부터 에틸렌디아민-N,N'-디숙신산을 가역적으로 생성하는 능력을 가진 효소를 나타내나, 반응의 조건에 따라서는 에틸렌디아민-N-모노숙신산을 생성할 수도 있다. 또한, 본 효소는 에틸렌디아민 이외의 디아민류에도 반응성을 나타내며, 대응하는 디아미노알킬렌-N,N'-디숙신산을 생성한다. 또한, 생성하는 디아미노알킬렌-N,N'-디숙신산은 많은 경우 광학 활성체이지만, 라세미체를 생성하는 효소도 있다.

이러한 반응성을 나타내는 일군의 효소는, 본 발명자들에 의해 자연계로 부터 분리 동정한 복수의 속(屬)에 속하는 세균류에서 발견되고 있고, 이들 세균류는 상기 특허공개 평성9-140390호, 유럽 특허공개 0731171호, 유럽 특허공개 0805211호에 개시되어 있다.

본 발명은 그 중에서도 유럽 특허공개 0805211호에 개시되어 있는 Brevundimonas sp. TN-3 균주 유래의 에틸렌디아민-N,N'-디숙신산 : 에틸렌디아민 리아제 유전자에 관한 것이다.

본 발명의 한가지 실시예를 이하에 설명한다. 또한, 하기의 공정에 있어서, 당업계에서 알려져 있는 어떠한 적당한 방법 및 재료를 이용하여도 무방하다.

(1) TN-3 균주 염색체 DNA의 제조

TN-3 균주로부터 염색체 DNA를 분리, 제조한다.

(2) 정제효소의 제조

TN-3 균주로부터 에틸렌디아민-N,N'-디숙신산 : 에틸렌디아민 리아제의 단백질을 정제한다.

(3) 정제효소의 N말단 아미노산 배열 및 내부 펩티드의 아미노산 배열의 분석

정제된 에틸렌디아민-N,N'-디숙신산 : 에틸렌디아민 리아제 단백질의 N말단 아미노산 배열 및 내부 펩티드의 아미노산 배열을 분석한다.

(4) 프로브의 제조

N말단 아미노산 배열 및 내부 펩티드의 아미노산 배열로부터 염기배열을 추정하여 2종의 합성 DNA를 제작한다. 이 합성 DNA를 프라이머로 하고, TN-3 균주 염색체 DNA를 주형으로 하여, 중합효소에 의한 중합반응을 수행한 다음, 에틸렌디아민-N,N'-디숙신산 : 에틸렌디아민 리아제 유전자의 일부가 증폭된 DNA 단편을 얻는다.

(5) DNA 라이브러리의 제조

염색체 DNA를 제한효소로 절단하고, 플라스미드 벡터 pUC18에 삽입하여 라이브러리로 한다.

(6) 대장균 형질전환체의 제조 및 재조합 DNA의 선별

공정(5)에서 제조한 DNA 라이브러리에 의한 대장균 형질전환체를 제조하고, 공정(4)에서 제작한 DNA 단편을 프로브로 한 콜로니 혼성법에 의해 목적하는 재조합 DNA를 포함하는 형질전환체를 선별한다.

(7) 재조합 플라스미드의 제조

공정(6)에서 선별한 형질전환체로부터 플라스미드를 제조한다.

(8) 제한효소 지도의 작제 및 에틸렌디아민-N,N'-디숙신산 : 에틸렌디아민 리아제 유전자 영역의 특정

공정(7)에서 얻은 재조합 플라스미드에 대하여 제한효소 지도를 작제하여, 프로브가 혼성화되는 영역을 특정한다.

(9) 염기배열의 결정

공정(8)에서 특정된 영역 주변의 염기배열을 결정한다.

(10) 에틸렌디아민-N,N'-디숙신산의 제조

공정(7)에서 제조한 재조합 플라스미드로부터, 에틸렌디아민-N,N'-디숙신산 : 에틸렌디아민 리아제 유전자를 포함하는 영역을 절단해 내고, 이것을 대장균 벡터pUC119에 삽입한다. 이러한 재조합 플라스미드를 대장균 JM109에 도입하고, 그 형질전환 대장균을 적당한 배지에서 적당한 배양조건하에 배양한다. 얻어진 배양액으로부터 균체를 분리하고, 푸마르산과 에틸렌디아민을 원료로 하여 반응시켜, 생성한 에틸렌디아민-N,N'-디숙신산을 분리·정제한다.

또한, TN-3 균주는 Brevundimonas sp. TN-3(FERM BP-5886)로 명명되어, 1996년 4월 11일자로 공업기술원 생명공학공업기술연구소에 기탁되어 있고, 그 균학적 성질은 하기와 같다.

< TN-3 균주의 균학적 성질 >

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 설명하기 위한 것으로, 이들 실시예에 의해 본 발명의 범위가 한정되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 분야에서 통상의 지식을 가진 자들에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1:

(1) TN-3 균주 염색체 DNA의 제조

TN-3 균주를 100ml의 EDDS배지(0.2% 에틸렌디아민-N,N'-디숙신산, 0.2% 글루코스, 0.1% 박토 효모추출물, 0.05% 폴리펩톤, 0.1% 황산 마그네슘·7H₂O, 2.5%(v/v) 인산 완충액(1M, pH 7.0), 0.5%(v/v) 금속염 혼합물 용액(황산 나트륨 56g, 염화 마그네슘·6H₂O 8g, 염화 칼슘 0.8g, 황산 망간·4H₂O 0.6g, 염화제2철·6H₂O 0.12g, 황산 아연 0.06g/100ml)에서, 30℃로 4일간 진탕배양한 후, 집균하여 이 균체를 Saline-EDTA용액(0.1M EDTA, 15M NaCl, pH 8.0) 4ml에 현탁하고, 리소자임 8mg을 가하여 37℃에서 1시간 진탕하고 동결하였다. 이어, 10ml의 Tris-SDS액(1% SDS, 0.1M NaCl, 0.1M Tris, pH 9.0)을 천천히 진탕하면서 혼합하고, 다시 프로테아제 K(Merk사)(최종농도 1mg)을 가하여 37℃에서 1시간 진탕하였다. 다음으로, 같은 양의 TE포화 페놀을 가하여 교반한 후(TE: 10mM Tris, 1mM EDTA, pH 8.0) 원심하고, 상층을 수득하여 2배량의 에탄올을 가한 다음, 유리 막대로 DNA를 감아내어, 90%, 80%, 70%의 에탄올로 페놀을 순차적으로 제거하였다. 그런 다음, DNA를 3ml의 TE완충액에 용해시켜, 리보뉴클레아제 A용액(100℃, 15분간의 열처리후)을 10mg/ml가 되도록 가하고 37℃에서 30분간 진탕하였다. 또한, 프로테아제 K를 가하여 37℃에서 30분간 진탕한 후, 같은 양의 TE포화 페놀을 가하고 원심하여 상층과 하층으로 분리시켰다. 상층에 대하여 이 조작을 2회 반복한 후, 동량의 클로로포름(4% 이소아밀알콜 함유)을 가하여 같은 추출 조작을 반복하였다(이후, 이 조작을 '페놀 처리'라 한다). 그 다음, 상층에 2배량의 에탄올을 가하고 유리막대로 DNA를 감아내 회수하여, 염색체 DNA를 얻었다.

(2) 정제효소의 제조

TN-3 균주를 2L의 EDDS배지에서 30℃로 4일간 진탕배양한 후, 집균하여 10mM 인산나트륨 완충액(pH 8.0, 1mM DTT(dithiothreitol) 함유) 100ml에 현탁하여, 초음파 파쇄기로 균체를 파쇄하고, 12,000rpm으로 20분간 원심 분리하였다. 얻어진 상층에 30% 포화가 되도록 황산 암모늄을 첨가하여, 4℃에서 30분간 정치 후, 원심분리하였다. 얻어진 상층에 60% 포화가 되도록 황산 암모늄을 첨가하여, 4℃에서 30분간 정치 후, 원심분리하였다. 얻은 침전을 10ml의 10mM 인산나트륨 완충액(pH 8,0, 1mM DTT 함유)에 용해하여, 부분 정제 효소액으로 하였다. 이 부분 정제 효소액을 이온 교환 크로마토그래피로 다시 정제하였다. 즉, 1mM DTT을 포함하는 10mM 인산나트륨 완충액(pH 8.0)으로 완충화된 DEAE-sephacryl(Pharmacia사)이 충진된 칼럼(Φ10mm x 20cm)에, 부분 정제 효소액을 주입하여 흡착시켰다. 40ml의 동 완충액으로 칼럼을 세척한 후, 0∼0.6M KCl의 직선 구배로 본 효소를 용출시켜, 2ml씩 분획하였다. 에틸렌디아민-N,N'-디숙신산 : 에틸렌디아민 리아제 활성이 있는 획분을 모아 정제효소액으로 하였다. 이 획분을 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 분석한 경우, 분자량 약 6만의 거의 균일한 한 개의 밴드가 검출되었다.

(2)의 공정에서 얻어진 정제효소를 직접, 혹은 트립신으로 소화후, SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동으로 폴리펩티드를 분획하여, PVDF막(Immobilon Psq(Millipore 사)에 일렉트로브롯팅하였다. 브롯팅한 막을 쿠마시 브릴리언 트블루로 염색하고, 염색된 밴드를 절단해 내어 아미노산 배열의 분석에 이용하였다. 아미노산 배열의 분석은 시마즈 세이사쿠쇼의 PSQS-1형 아미노산 분석장치에 의해 행하였다. 결과는 이하에 나타내었다.

a) 무처리효소의 N 말단 아미노산 배열: (분자량 약 6만);

(Met-)Thr-Pro-His-Asn-Pro-Asp-Ala

h) 트립신 부분 분해물: (분자량 약 5만);

Glu-lle-Gly-Ser-Val-Gly-Lys-Met-Glu-lle-Gly-Arg-Xaa-Ala-Asn-Asp-Leu-Arg-Asn-Arg

c) 트립신 부분 분해물: (분자량 약 1만);

Ala-Ser-Gly-Ala-Lys-Ala-Pro-Glu-Phe-Gln-Glu-Leu-Tyr-Asp-Phe-Glu-Ala-Ala-Xaa-Leu-Xaa-Leu

[( )안은 분획한 펩티드의 분자량을 나타내며, Xaa는 분석상 특정할 수 없었던 아미노산을 나타낸다].

(4) 프로브의 제조

(3)의 공정에서 얻은 아미노산 배열 정보를 기초로 배열 번호 4 및 5에 표시된 합성 DNA를 작성하고, 그를 프라이머(#1 및 #2)로 하며, (1)의 공정에서 얻어진 TN-3 균주의 염색체 DNA를 주형으로 하여, 중합효소연쇄반응을 수행하였다.

즉, TN-3 균주 염색체 DNA 1μl, 10배 농도의 반응 완충액 10μl, 10mM dNTP 4μl, 프라이머#1, #2 각각의 1μl(100pmol 농도에 상당), ExTaq(다까라주조 주식회사) 1μl를 가하여 100μl로 하였다. 이 용액에 대하여, 95℃, 30초간 (변성 스텝), 55℃, 30초간(아닐린 스텝), 72℃, 2분간(연장 스텝)의 인큐베이션을 30회 행하였다. 반응 종료 후, 클로로포름 추출을 3회 하고, 에탄올 침전으로 증폭된 DNA를 회수하였다. 이것을 1.0% 아가로스 전기영동으로 분리한 후, TN-3 균주의 에틸렌디아민-N,N'-디숙신산 : 에틸렌디아민 리아제를 암호화한다고 여겨지는 약 300bp의 DNA단편을 얻었다. 이렇게 하여 얻어진 DNA 단편을 DIG DNA Labeling kit(베링거 맨하임 주식회사)를 이용하여 표지하고, 프로브로 하였다.

(5) DNA 라이브러리의 제조

TN-3 균주 염색체 DNA 10μl에 10배 농도의 제한효소 반응용 완충액 5μl, 멸균수 33μl ,제한효소 KpnI 2μl를 가하여, 37℃에서 16시간 반응시킨 후 에탄올 침전에 의해 DNA를 회수하였다. 아가로스 전기영동하여, 6.5Kb부터 5.5Kb까지의 DNA단편을 겔로부터 절단해 내고, DNA PREP(주식회사 다이야토론)을 이용하여 회수하였다. 이 DNA단편을 라이게이션 키트(다까라주조주식회사)을 이용하여 대장균 벡터 pUC18의 KpnI부위에 삽입함으로써 재조합 DNA 라이브러리를 작제하였다.

라이게이션에 이용된 pUC18 단편은 다음과 같이 제작하였다. pUC18 보존액 2μl에 대하여, 10배 농도의 제한효소용 완충액 5μl, 멸균수 40μl, 제한효소 KpnI 3μl를 가하여, 37℃에서 2시간 반응시킨 후, 페놀 처리 및 에탄올 침전시키고, 건조하여 50μl의 멸균수에 용해시켰다. 더욱이, 알카리포스파타제(다까라주조 주식회사) 1μl, 10배 농도의 완충액 10μl, 멸균수 39μl를 가하여 65℃에서 반응시킨 후, 페놀 처리 및 에탄올 침전하고 건조하여 멸균수에 용해시켰다.

(6) 대장균 형질전환제의 제조 및 재조합 DNA의 선별

대장균 JM109주를 LB배지(1% 박토트립톤, 0.5% 박토 효모추출물, 0.5% NaCl) 1ml에 접종하여 37℃, 5시간 호기적으로 전배양하고, 이 배양물 100ml를 SOB배지 40ml(2% 박토트립톤, 0.5% 박토 효모추출물, 10mM NaCl, 2.5mM KCl, 1mM MgSO₄, 1mM MgCl₂)에 가하여, 18℃에서 20시간 배양하였다. 이 배양물을 원심분리에 의해 집균한 후, 차가운 TF용액(20mM PIPES-KOH(pH 6.0), 200mM KCl, 10mM CaCl₂, 40mM MnCl₂) 13ml를 가하여, 0℃에서 10분간 방치 후, 다시 원심하여, 상층을 제거하고 침전한 대장균을 차가운 TF용액 3.2ml에 현탁하여, 0.22ml 디메틸술폭시드를 가하고 0℃에서 10분간 방치하였다. 이렇게 하여 제작한 형질전환 가능 세포(competent cell) 200μl에, 공정(5)에서 제조한 재조합 플라스미드를 함유하는 용액(DNA 라이브러리) 10μl를 가하여, 0℃에서 30분 방치한 다음, 42℃에서 30초간 열충격을 부여하여 0℃에서 2분간 냉각 후, SOS배지(20mM 글루코스, 2% 박토트립톤, 0.5% 박토 효모추출물, 10mM NaCl, 2.5mM KCl, 1mM MgSO₄, 1mM MgCl₂) 1ml을 첨가하여 37℃에서 1시간 진탕배양하였다. 이것을 200μl씩 암피실린 100μg/ml 함유의 LB 한천배지에 도말하여, 37℃에서 배양하였다. 한천배지상에 생육한 형질전환체 콜로니에 대하여 콜로니 혼성법으로 에틸렌디아민-N,N'-디숙신산 : 에틸렌디아민 리아제 유전자를 가진 형질전환체를 선별하였다. 즉, 한천배지상에 생육한 형질전환체를 나일론 막(BIODYNE A; Pall Biosupport) 위에 이동시키고, 균체를 용해시켜 DNA를 고정시킨 후, 이것을 공정(4)에서 제작한 프로브(약 300bp)에 처리하고, DIG Luminescent Detection kit(베링거 멘하임 주식회사)를 이용하여, 목적하는 재조합 DNA를 가지는 콜로니를 선택하였다.

(7) 재조합 플라스미드의 제조

공정(6)에서 선택한 형질전환체를 100ml의 LB배지에서 37℃에서 하룻밤 배양하고, 집균후 멸균수로 세척하여, 용액I(2mM 글루코스, 10mM EDTA, 25mM Tris-HCl(pH 8.0))을 5ml, 리소자임을 25mg 가하고 0℃에서 30분간 방치하였다. 용액II(1N-NaOH, 5% SDS)를 10ml 가하여 0℃에서 5분간 방치하고, 용액 III(3M 초산 나트륨(pH4.8))을 7.5ml 가하여 0℃에서 30분간 방치하였다. 이것을 원심하고, 그 상층에 50ml의 에탄올을 가하여 다시 원심한 다음, 상층을 제거하고 5ml의 용액 IV(10mM 초산 나트륨, 50mM Tris-HCl(pH 8.0))과 리보뉴클레아제 A용액(10mg/ml) 2.5μl를 가하여 실온에서 20분간 방치하였다. 이것에 12ml의 에탄올을 가하여, 원심에 의해 플라스미드를 회수, 70% 에탄올로 세척하여, 건조후 0.4ml의 멸균수에 용해하였다. 이렇게 하여 얻은 재조합 플라스미드를 pEDS001이라 명명하였다.

(8) 제한효소지도의 제작 및 에틸렌디아민-N,N'-디숙신산 : 에틸렌디아민 리아제 유전자 영역의 특정

공정(7)에서 얻은 플라스미드 pEDS001을 수종의 제한효소로 절단하여 제한효소 지도를 제작하였다(제 1도). 또한, 통상적으로 행해지는 서브클로닝을 하였다. 즉, pEDS001을 제한효소 Kpnl과 BamH1로 절단하여, pUC18을 동 제한 효소로 절단한 것과 라이게이션하여, 대장균 JM109주를 형질전환시킴으로써, 약 3.9Kb의 단편이 삽입된 플라스미드(pEDS002)(제 2도)와 약 2.6Kb의 단편이 삽입된 플라스미드(pEDS003)(제 3도)을 얻었다. 각각의 플라스미드에 대하여 제한효소 BamHI, EcoRI, Sacl, SaII 등으로 절단한 후, 아가로스 전기영동하여, 서던 혼성법에 의해 프로브가 혼성화되는 단편을 특정하였다.

(9) 염기 배열의 결정

공정(8)에서 특정된 영역 주변의 염기배열을 Pharmacia사 형광 Sequencer ALFII를 이용하여 결정하였다. 그 결과, 배열번호 2로 표시되는 염기배열이 얻어져, 배열번호 1로 표시되는 아미노산 배열을 가지는 개방해독틀(open reading frame)이 발견되었다. 아미노산 배열 데이타 베이스 NBRF(National Biomedical Research Foundation)과의 비교 결과, 본 유전자는 델타-크리스탈린(delta-crystallin) 혹은 알기니노숙신산 리아제(argininosuccinate lyase)와 20∼30%의 상동성을 가지고 있고, 양 효소에는 동시에 푸마르산과 아민(아미노산)의 축합 또는 분해반응을 촉매하는 활성이 있는 것으로 알려져 있다. 또한, 이 개방해독틀의 염기배열을 배열번호 3에 표시하였다.

실시예 2:

실시예 1(공정(7))에서 얻은 에틸렌디아민-N,N'-디숙신산 : 에틸렌디아민 리아제 유전자를 가진 재조합 플라스미드 pEDS003 2μl에 대하여, 10배 농도의 제한효소용 완충액 2μl, 멸균수 15μl, 제한효소 Kpnl 1μl를 첨가하여, 37℃에서 2시간 반응시켰다. 에탄올 침전에 의해 플라스미드를 회수하여, 건조후 멸균수 17μl, 10배 농도의 제한효소 완충액 2μl, 제한 효소 BamH1 1μl를 첨가하여 37℃에서 2시간 반응시켰다. 이 반응액에서 아가로스 전기영동에 의해 약 2.6Kb의 단편을 제조하여, 대장균 벡터 pUC119에 삽입하였다. 제작한 라이게이션 용액을 이용하여 대장균 JM109를 형질전환시키고 목적하는 플라스미드를 얻었다. 이때, 제작한 플라스미드를 pEDS020로, 형질전환체를 JM109/pEDS020으로 명명하였다.

JM109/pEDS020을 암피실린 50mg/L 함유의 LB배지 1ml에 접종하여 37℃에서 8시간 진탕배양후, 40ml의 LB배지(50mg/L 암피실린, 1mM isopropyl-β-thiogalactoside를 함유)에서 37℃에서 30시간 배양하였다. 얻은 배양물을 10ml 인산나트륨 완충액(pH 8.0)으로 세척후, 2ml의 동 완충액에 현탁하였다. 얻은 균체 현탁액의 일부를 342mM 푸마르산과 171mM 에틸랜디아민을 포함하는 pH 8.0의 수용액 50ml에 현탁하여 24시간 반응시켰다. 반응액으로부터 균체를 원심분리에 의해 제거한 후, HPLC를 이용하여 에틸렌디아민-N,N'-디숙신산의 존재를 확인하였다(WAKOSIL 5C8 (와코 준약)[용출액: 10mM 수산화테트라-n-부틸암모늄과 0.4mM CuSO₄를 포함하는 50mM 인산(pH 2)]. 그 결과, 50mM의 S,S-에틸렌디아민 -N,N'-디숙신산이 생성되는 것을 알았다.

또한, 에틸렌디아민-N,N'-디숙신산 : 에틸렌디아민 리아제 유전자를 포함하는 플라스미드(pEDS020)(제 4도)는 그를 함유하는 형질전환체 E. coli JM109/pEDS020(FERM BP-6161)로서, 1996년 11월 27일자로 공업기술원 생명공학 공업기술연구소에 기탁되어 있다.

제 1도는 플라스미드(pEDS001)의 제한효소 지도이다.

제 2도는 플라스미드(pEDS001)을 제한효소 Kpn1 및 BamH1로 절단하여 얻은 약 3.9kb의 단편을 pUC18에 삽입하여 제조한 플라스미드(pEDS002)의 제한효소 지도이다.

제 3도는 플라스미드(pEDS001)을 제한효소 Kpn1 및 BamH1로 절단하여 얻은 약 2.6kb의 단편을 pUC18에 삽입하여 제조한 플라스미드(pEDS003)의 제한효소 지도이다.

제 4도는 플라스미드(pEDS003)을 제한효소 Kpn1 및 BamH1로 절단하여 얻은 약 2.6kb의 단편을 pUC119에 삽입하여 제조한 플라스미드(pEDS020)의 제한효소 지도이다.

Claims

배열번호 1로 표시되는 아미노산 배열을 가지면서, 에틸렌디아민-N,N'-디숙신산 : 에틸렌디아민 리아제의 활성을 가지는 폴리펩티드를 암호화하는 염기배열로 구성되는 DNA.
제 1항에 있어서,

배열번호 1로 표시되는 아미노산 배열을 가지는 폴리펩티드를 암호화하는 염기배열로 구성되는 DNA 또는 유전자 코드의 동의성(同義性)에 유래하는 그의 유사체인 것을 특징으로 하는 DNA.
제 1항에 있어서,

폴리펩티드를 암호화하는 염기배열은 배열번호 2에 표시되는 염기배열을 가지는 것을 특징으로 하는 DNA.
제 1항 내지 제 3항 중의 어느 한 항에 기재된 DNA를 포함하는 재조합 플라스미드.
제 4항의 재조합 플라스미드로 형질전환된 형질전환 숙주.
제 5항에 있어서,

숙주는 미생물인 것을 특징으로 하는

형질전환 숙주.
제 5항 또는 제 6항의 형질전환 숙주를 이용하여 디아미노알킬렌-N,N'-디숙신산을 제조하는 방법.
배열번호 1로 표시되는 아미노산 배열을 가지며, 에틸렌디아민-N,N'-디숙신산 : 에틸렌디아민 리아제의 활성을 가지는 폴리펩티드.