KR100235121B1 - 재조합 내열성 d-아미노산 아미노트랜스퍼라아제 및 이를 이용한 d-아미노산의 제조방법 - Google Patents

재조합 내열성 d-아미노산 아미노트랜스퍼라아제 및 이를 이용한 d-아미노산의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 토양에서 분리된 고온성 미생물 바실러스 스피시즈 KLS-01로부터 내열성 D-아미노산 아미노트랜스 퍼라아제를 코딩하는 유전자를 클로닝한 후, 이 내열성 D-아미노산 아미노트랜스퍼라아제 유전자의 염기서열을 결정한 내용에 관한 것이다. 또한 본 발명은 재조합 내열성 D-아미노산 아미노트랜스퍼라아제 유전자를 함유하는 재조합 플라스미드 pHKLS01로 대장균 XL1BLue를 형질전환한 후, 이 형질전환체 XL1Blue/pHKLS01(KCTC 0394BP)을 배양하여 재조합 내열성 D-아미노산 아미노트랜스퍼라아제를 생산한 후 α-케토산으로부터 D-아미노산을 제조하는 생물촉매 전환공정의 생물촉매로 이용하는 것을 특징으로 하는 D-아미노산 제조법에 관한 것이다.

Description

재조합 내열성 D-아미노산 아미노트랜스퍼라아제 및 이를 이용한 D-아미노산의 제조방법
제1도는 본 발명의 재조합 내열성 D-아미노산 아미노트랜스퍼라아제를 코드하는 유전자의 염기서열이며,
제2도는 본 발명의 재조합 내열성 D-아미노산 아미노트랜스퍼라아제의 아미노산 서열을 나타낸 것이며,
제3도는 본 발명의 내열성 D-아미노산 아미노트랜스퍼라아제를 코드하는 유전자를 포함하는 재조합 플라스미드 벡터를 도시한 것이며,
제4도는 본 발명의 재조합 내열성 D-아미노산 아미노트랜스퍼라아제를 이용한 D-아미노산 제조의 최적 반응 온도를 나타낸 것이다.
본 발명은 한국의 토양에서 분리된 고온성 미생물 유래 내열성 D-아미노산 아미노트랜스퍼라아제 (D-amino acid aminotransferase : EC 2.6.1.21) (이하 D-AAT로 약칭함)에 관한 것으로, 상세하게는 고온성 미생물 바실러스 스피시즈 KLS-01 (KCTC 0302BP) 유래의 신규 내열성 D-AAT를 코드하는 유전자를 클로닝(gene cloning) 한 후, 이 재조합 내열성 D-AAT 유전자와 DNA 염기서열을 결정한 내용에 관한 것이다.
또한 본 발명은 상기의 방법으로 제조된 내열성 D-AAT 유전자를 대장균에 형질전환 시켜서 제조된 재조합 대장균(KCTC 0394BP)을 배양함으로써 재조합 내열성 D-AAT를 대량으로 제조하는 방법 및 이 재조합 효소를 생물 촉매로 사용하여 α-케토산으로부터 고부가가치 유용 D-아미노산의 제조방법에 관한 것이다.
D-아미노산은 단백질에는 포함되어 있지 않으나, 미생물의 세포벽 또는 팹티드계 항생물질의 구성성분으로 자연계에 널리 분포되어 있으며, 산업적으로는 합성감미로, β-락탐계 항생제, 펩티드 호르몬, 살충제 등을 생산하기 위한 중간물질로 식품 및 의약 분야에서 널리 이용되고 있다.
D-아미노산의 제조방법에는 화학적으로 합성하는 방법과 미생물 효소를 이용하는 방법이 알려져 있는데, 화학적 합성법에 의한 아미노산의 제조는 D,L-아미노산이 혼합된 상태(racemic mixture)로 합성되기 때문에, 번잡한 광학적 순수 과정을 거쳐야 하는 어려움이 있다. 반면 생물촉매를 이용한 D-아미노산 제조법은 광학적으로 순수한 D-아미노산만을 직접 생산할 수 있으며, 환경 오염의 주원인이 되는 부산물 생성을 줄일 수 있기 때문에 탈공해 청정기술로써 주목되고 있다.
D-AAT는 미생물 세포벽의 구성 성분인 D-알라닌, D-글루탐산 등 D-아미노산의 생합성에 관여하는 효소이며, D-알라닌 등의 다양한 D-아미노산으로부터 아미노기를 받아서 피루브산 등의 α-케토산에 전이 시킴으로써 새로운 D-아미노산을 합성하는 기능을 가진 효소이다.[Soda et al.(1974) FEBS Lett. 46. 359-363].
효소를 생물촉매로서 이용하는 생물전환공정에 있어서 생물 촉매의 안정성은 그 공정의 생산성을 결정하는 가장 중요한 요인이다. 미생물 효소 D-AAT를 생물 촉매로 사용하여 α-케토산으로부터 해당 D-아미노산을 제조하는 생물전환 공정에 있어서도 생물촉매 D-AAT의 안정성은 생산성의 증대 등에 매우 중요한 요소로 작용한다.
일반적으로 고온의 생육 환경에 서식하는 고온성 미생물 들은 서식지의 고온 극한 환경의 영향에 의해 열에 안정한 내열성 효소를 가지고 있다. 그리고 이러한 내열성 효소는 열에 안정한 특징 이외에도 유기용매에 대한 안정성, pH에 대한 안정성 및 화학 변성제 등에 대한 안정성도 가지고 있는 것으로 보고되고 있다. 따라서 고온성 미생물에서 유래되는 내열성 D-AAT도 이러한 안정성을 갖고 있기 때문에 D-아미노산의 제조기술 개발에 유용하게 사용될 수 있다.
따라서 본 발명자들은 국내 각지의 토양, 폐수, 두엄, 간헐천 등의 고온균 서식지로부터 분리한 1,300여 종의, 고온성 미생물로부터 내열성 D-AAT를 생산하는 신규 고온성 미생물을 탐색하였다. 그 결과 70℃ 에서도 생육이 가능하고 열 안전성이 매우 높은 내열성 D-AAT를 생산하는 신규 고온성 미생물 바실러스 스피시즈 KLS-01을 분리할 수 있었다.
본 발명은 위와 같이 국내 토양으로부터 탐색. 분리된 고온성 미생물 바실러스 스피시즈 KLS-01(KCTC 0302BP) 유래 내열성 D-AAT를 코드하는 유전자를 클로닝 하고, 이 유전자의 DNA 염기서열을 규명한 내용에 관한 것이다. 또한 본 발명은 상기 D-AAT 유전자를 포함하는 플라스미드 벡터를 대장균에 형질 전환 시켜서 제조된 재조합 대장균으로부터 재조합 내열성 D-AAT를 생산한 후, 이를 α-케토산으로부터 D-아미노산을 제조하는 생물전환 반응의 생물 촉매로 제공하는데 그 목적이 있다.
상기의 목적에 따라, 본 발명에서는 제2도에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 내열성 D-AAT 활성이 있는 폴리펩티드, 제2도의 폴리펩티드를 코드하며 제1도에 나타낸 DNA 염기서열을 갖는 유전자, 제1도에 나타낸 DNA 염기서열의 유전자를 포함하는 플라스키드 벡터 및 이 플라스미드 벡터로 형질전환된 대장균을 제공한다.
본 발명에서는 또한 상기재조합 균주를 배양하고, 배양균체로부터 재조합 내열성 D-AAT를 회수하는 단계를 포함하는 재조합 내열성, D-AAT의 제조방법 및 D-아미노산 및 α-케토산을 포함하는 반응액에 상기 재조합 대장균 균주를 배양하여 얻은 D-AAT 효소액을 가하여 효소 전환 반응 시키는 단계를 포함하는 D-아미노산의 제조 방법을 제공한다.
이하에서는 본 발명을 단계별로 상세히 설명한다.
(1) 바실러스 스피시즈 KLS-01로부터 재조합 내열성 D-AAT를 코드하는 유전자의 클로닝
고온성 미생물 바실러스 스피시즈 KLS-01을 1.5% 폴리펩톤(polypeptone), 0.2% 효모추출물(yeast extract), 0.2% 고기추출물(meat extract), 0.2% 글리세롤(glycerol), 0.2% 인산이칼륨(K2HPO4), 0.02% 인산칼륨(KH2PO4), 0.026% 염화암모늄(NH4C1)의 조성을 갖는 MY배지에 접종하고 60℃에서 부유배양(enrichment culture)하였다. 8시간 동안 배양한 후, 이 배양액을 5,000rpm에서 20분간 원심분리하여 균체를 회수한 후, 수득된 미생물 균체를 총 염색체 분리에 이용하였다. 총 염색체 분리는 사이또 등의 방법[Saito, H. and Miura, K. (1963) Biochim. Biophys. Acta 72: 619-629]에 따라 수행하였고, 그 밖의 모든 유전자 조작은 마니아티스 등의 실험서[Maniatis, T. et al. (1989) ＂Molecular cloning ; A Laboratory Manual＂, cold Spring Harbor, New York]에 기술된 방법을 따라 수행 하였다.
상기에서 분리된 총 염색체를 제한 효소 Sau3AI으로 부분 가수 분해한 후에, 원심분리에 의한 수크로스 밀도구배(sucrose density gradient)로 약 3 내지 10kb 크기의 DNA 단편들을 분리해냈다. 이어서 상기 분리한 DNA 단편을 벡터 pBR322와 결합시켜서 재조합 플라스미드를 제조한 후, 일렉트로포레이션(electroporation) 법에 따라 대장균 WM335 [Lugtenberg, E.J.J. et al. (1973) J. Bacteriol. 114 : 499-506]에 형질 전환 시켰다. 형질 전환체 들의 재조합 내열성 D-AAT 활성을 조사하는 선별 과정을 통하여 재조합 내열성 D-AAT 활성을 나타내는 재조합 대장균 1종을 취득 하였다. 이로부터 분리된 재조합 플라스미드(10.6kb)는 6.2kb 크기의 고온균 유래의 염색체 DNA 단편을 포함하고 있었으며, 이하 상기 재조합 플라스미드를 pHKLS01(제3도)로 칭한다.
(2) 내열성 D-AAT를 코드하는 유전자의 염기서열 결정
재조합 플라스미드 pHKLS01을 추출 및 정제한 후, 제한효소 지도를 작성하여 재조합 내열성 D-AAT 유전자가 함유되어 있는 부분을 결정하였다. 재조합 플라스미드 pHKLS01(제3도)의 삽입 DNA 중 불필요한 부분을 적정한 제한 효소로 절단하고, 재조합 D-AAT 유전자 함유 단편을 정제한 후, 플라스미드 벡터 pBluescript (Stratagene, CA, USA)에 서브클로닝(subcloning) 한 후, 생거 등의 방법[Sanger, F. et. al. (1981) Science, 214, 1205-1210]에 따라 DNA 염기서열의 결정을 수행하였다. 결정된 염기서열로부터 바실러스 스피시즈 KLS-01 유래의 내열성 D-AAT 유전자를 코드하는 864 bp 크기의 유전자 서열이 포함되어 있음을 확인 하였다.
(3) 재조합 대장균으로부터 재조합 내열성 D-AAT의 생산
재조합 내열성 D-AAT 유전자를 포함하는 플라스미드 벡터 pHKLS01로 대장균 균주 XL1Blue를 형질 전환 시킨 뒤, 1.0% 트립톤, 0.5% 효모추출물, 0.5% 염화나트륨 및 0.01% 앰피실린을 포함하는 LB-앰피실린배지에서 24시간 동안 배양하여 재조합 내열성 D-AAT를 생산하고, 배양액 으로부터 재조합 대장균 균체를 회수 및 파쇄하여 재조합 내열성 D-AAT 함유 조효소액을 제조 하였다.
상기의 방법으로 제조한 조효소액의 재조합 D-AAT 활성을 정량한 결과, 단백질 1mg당 약 0.9 유닛(units)의 활성을 나타내어 원균인 바실러스 스피시즈 KLS-01에 비하여 약 70배 증가된 D-AAT 활성을 갖음을 확인 하였다.
(4) 재조합 대장균으로부터 생산된 재조합 내열성 D-AAT를 이용한 다양한 D-아미노산의 제조방법
재조합 대장균 XL1Blue/pHKLS01 (KCTC 0394BP)로부터 제조된 재조합 내열성 D-AAT 함유 조효소액을 D-알라닌(또는 D-아스파트산)과 피루브산, α-케토글루타르산 똔, α-케토이소발레르산 등의 α-케토산을 함유한 반응액에 생물 촉매로 가하고 D-아미노산 합성반응을 수행하여 본 발명의 D-AAT를 여러 가지 D-아미노산의 제조에 적용하고자 하였다. D-아미노산 합성반응을 통하여 생산된 D-아미노산은 아미노산분석기(Amino Acid Analyzer L-8500A, Hitachi, Japan)로 분석하였다. 그 결과 본 발명의 재조합 내열성 D-AAT는 D-알라닌, D-글루탐산, D-아미노부티르산, D-발린 등의 다양한 D-아미노산을 합성하는 효소 활성을 나타내었으며 특히 D-알라닌 및 D-아미노부티르산을 합성하는 활성이 높아서 이 아미노산들을 합성하는 생물 전환 공정에 더욱 유용할 것으로 판단되었다. 더욱 자세한 내용은 실시예 1의 단계 4에 기술하였다.
한편 D-AAT를 생물촉매로 이용하는 D-아미노산 생산 생물촉매 전환 반응에서 아미노기를 공여하는 기질로 사용되는 반응원료 아미노산의 적절한 선택은 이 생물 전환 공정의 산업적 가치 및 경제성에 매우 중요한 요소이다. 따라서 본 발명의 재조합 내열성 D-AAT를 생물촉매로 하는 D-아미노산 생산 생물전환공정에 대한 아미노기 공여체들의 영향을 조사하였다. 그 결과 본 발명의 재조합 내열성 D-AAT는 D-알라닌, D-글루탐산, D-아미노부티르산, D-아스파트산, D-글루타민 등의 아미노산을 아미노기 공여체로 이용하는 매우 넓은 기질 특이성을 나타내었다. 특히 D-아스파트산을 아미노기 공여체로 하는 경우의 반응 생산성은 기존의 D-AAT들에 비하여 상대적으로 높아서 본 발명의 D-AAT가 D-아스파트산을 아미노기 공여체로 하는 생물 전환 반응의 생물 촉매로써 더욱 유리한 것으로 판단되었다.
더욱 자세한 내용은 실시예 1의 단계 4에 기술하였다.
이하, 본 발명의 각 단계를 하기 실시예에서 좀더 상세히 설명하고자 한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.
[실시예 1]
(단계 1) 바실러스 스피시즈 KLS-01로부터 내열성 D-AAT를 코드하는 유전자의 클로닝
토양으로부터 분리된 고온성 미생물 바실러스 스피시즈 KLS-01을 100㎖의 MY 배지에 접종하고 60℃에서 8시간 동안 배양한 후, 원심분리하여 균체를 회수 하였다. 회수한 균체를 SE(0.15M NaC1, 0.1M EDTA (pH8.0)로 세척하고 ST(0.1M NaC1, 0.01M EDTA, 0.1M 트리스-HC1(pH9.0)) 10㎖에 현탁시킨 후, 그 현탁액에, 라이소자임 5-10mg, TS (0.14M NaC1, 0.001M EDTA, 0.02M 트리스-HC1(pH7.5) 및 5% SDS) 2.5㎖ 및 프로티아제 12mg를 첨가하여, 37℃에서 3시간 방치 하였다. 다음에 페놀 12.5㎖을 첨가하여 실온에서 15분간 방치하고 원심분리 했다. 이로부터 상등액을 조심스럽게 분리한 후, 2배 부피의 에탄올을 가하여 유리막대로 염색체 DNA를 분리 하였다. 이 총 염색체 DNA를 TE(0.01M 트리스-HC1, 0.1mM EDTA (pH 7.5))와 에탄올(v/v)을 3:7, 2:8, 1:9로 혼합한 용액으로 각각 세척하고 SSC(0.1M NaC1, 0.15M 구연산 나트륨)에 녹였다. 이 용액에 RNase A를 가하여 37℃에서 30분 내지 1시간 동안 방치한 후, 페놀을 동량 첨가하여 원심분리하고 상등액을 조심스럽게 분리하여 2배량의 에탄올을 가한 후 유리막대로 총 염색체 DNA를 회수하였다. 이를 TE에 녹인 후, 100배량의 TE에 하룻밤 동안 투석하여 조염색체 DNA 2㎖을 얻었다.
이 조염색체 DNA는 제한효소 Sau3AI으로 부분 가수분해한 후, 원심분리에 의한 수크로스 밀도구배(sucrose density gradients)로 약 3 내지 10 kb 크기의 DNA 단편들을 분리 하였다. 분리된 DNA 단편은 제한 효소 BamHI으로 가수분해하고 5'-말단의 인산을 제거한 후, BamHI으로 가수분해된 벡터 pBR322(입수처 : 파마시아사, 스웨덴)와 혼합하여, 16℃에서 16시간 동안 T4 DNA 리가제(ligase)와 반응시켜서 재조합 플라스미드가 생성되도록 하였다. 이 재조합 플라스미드를 pHKLS01이라 명명하고, 이 재조합 플라스미드를 일렉트로포레이션(electroporation)법에 따라 대장균 WM335의 형질 전환에 이용하였다.
대장균 WM335는 미생물 세포벽을 구성하는 D-글루탐산을 합성하는 기능을 상실하여 D-글루탐산이 첨가되지 않은 배지에서는 생육할 수 없는 D-글루탐산 요구성 돌연변이 균주이다[Lugtenberg, E.J.J. et al. (1973) J. Bacteriol. 114 : 499-506]. 따라서 상기 형질전환된 재조합 대장균들을 앰피실린을 함유한 LB 평판배지에서 배양하면 고온성 바실러스 스피시즈 KLS-01로부터 유래하는 재조합 D-AAT 유전자를 보유하여 D-글루탐산을 합성하는 기능을 갖게 된 재조합 대장균만이 D-글루탐산을 함유하지 않은 배지에서도 생육 가능하게 된다. 이와 같은 선별 과정을 통하여 재조합 내열성 D-AAT 활성을 보유하여 D-글루탐산을 첨가하지 않은 배지에서도 생육할 수 있는 재조합 대장균 균주 1종을 분리 하였다.
본 발명에 따라 수득된 재조합 대장균을 XL1Blue/pHKLS01이라 명명하고, 이를 1997년 10월 13일자로 한국 과학기술 연구원 부설 생명공학 연구소 유전자은행(KCTC, KRIBB)에 KCTC 0394BP 번호로 부다패스트 조약하에 기탁을 완료 하였다.
(단계 2) 재조합 내열성 D-AAT를 코드하는 DNA 염기서열의 결정
선별된 재조합 내열성 D-AAT 활성보유 재조합 대장균으로부터 10.6kb 크기인 재조합 플라스미드 pHKLS01을 추출 및 정제한 후, 제한 효소 지도를 작성하여 재조합 내열성 D-AAT가 함유되어 있는 부분을 결정하였다. 재조합 플라스미드 pHKLS01은 6.2kb 크기인 바실러스 스피시즈 KLS-01 유래의 염색체 DNA 단편을 함유하고 있었다. 6.2kb의 삽입 DNA 중 D-AAT와 무관한 불필요한 부분을 제한 효소로 절단하여, 약 1.9kb 크기인 Hind III - Sac I DNA 단편을 수득하였다. 이 DNA 단편을 플라스미드 벡터 pBluescript (Stratagene, CA, USA)에 서브클로닝(subcloning)한 후, 생거 등의 방법[Sanger, F. et al. (1981) Science, 214, 1205-1210]에 따라 DNA 염기서열의 결정을 수행하였다. 결정된 DNA 염기서열로부터 D-AAT를 코드하는 864 bp 크기의 유전자를 확인하였다. 본 발명의 제 1도는 본 발명의 재조합 내열성 D-AAT를 코드하는 유전자의 염기서열을 나타낸 것이다.
(단계 3) 재조합 대장균으로부터 재조합 내열성 D-AAT의 생산
재조합 내열성 D-AAT 유전자를 포함하는 플라스미드 벡터 pHKLS01을 새로운 숙주 대장균 균주 XL1Blue에 형질 전환 시킨 후 1.0% 트립톤, 0.5% 효모추출물, 0.5% 염화나트륨 및 0.01% 앰피실린을 함유하는 LB-앰피실린 배지에서 24시간 동안 배양하여 재조합 내열성 D-AAT의 생산을 수행한 후, 배양액으로부터 균체를 회수하고 파쇄하여 재조합 내열성 D-AAT 함유 조효소액을 제조 하였다.
제조된 조효소액의 재조합 D-AAT 활성은 0.1M 트리스완충액(pH 8.5) 0.2㎖에 각각 10mM의 D-알라닌 및 α-케토글루타르산, D-AAT의 보효소(cofactor)인 0.1mM의 피리독살인산(pyridoxal-5'-phosphate), 그리고 배양액 0.01㎖에 해당하는 조효소액을 포함하도록 조제된 반응액을 장시간 사용시에도 효소 안정액이 유지될 수 있는 55℃에서 1시간 동안 정치 반응 시킨 후, D-AAT 반응에 의하여 생성된 피루브산의 양을 정량함으로써 수행되었다. 생성된 피루브산의 양은 반응액에 0.2㎖의 60% 수산칼륨염 용액과 2% 살리실알데히드(salicylaldehyde) 0.1㎖를 가한 후 37℃에서 30분간 정치 반응 시켜서 발색시킨 후, 물로 2배 희석하고 480nm에서 흡광도를 측정하는 방법에 의해 결정하였다[Berntsson S. (1955) Anal. Chem. 27, 1659-1660].
제조합 대장균 XL1Blue/pHKLS01로부터 제조된 조효소액의 재조합 D-AAT 활성을 원균인 바실러스 스피시스 KLS-01의 경우와 비교한 결과는 표 1에 나타낸 바와 같다.
[표 1]
재조합 대장균으로부터 생산된 재조합 내열성 D-아미노산 아미노트랜스퍼라아제의 활성
Figure kpo00002
(단계 4) 재조합 대장균으로부터 생산된 재조합 내열성 D-AAT를 이용한 다양한 D-아미노산의 제조방법
재조합 대장균 XL1Blue/pHKLS01 (KCTC 0394BP)을 LB배지에서 24시간동안 배양하여 수득된 재조합 대장균으로부터 제조한 재조합 내열성 D-AAT 함유 조효소액을 D-알라닌 (D-알라닌 합성반응의 경우에는 D-글루탐산), α-케토산 및 0.1mM의 피리독살인산을 함유한 반응액에 생물촉매로 가하고 55℃에서 D-아미노산 합성 반응을 수행하여, 본 발명의 재조합 D-AAT를 여러 가지 D-아미노산의 합상반응에 적용하고자 하였다. 상기 D-아미노산 합성반응은 1시간 동안 수행하였으며, 반응 후 제조된 D-아미노산 양을 아미노산분석기(L-8500A, Hitachi, Japan)로 분석하였다. 본 발명의 재조합 내역성 D-AAT는 다양한 D-아미노산 중에서도 표 2에 나타낸 D-알라닌, D-글루탐산, D-아미노부티르산의 3종류의 D-아미노산을 합성하는 반응에서 높은 반응 속도를 나타내어 이 아미노산들의 제조에 적합하다고 판단되었다. 표 2는 재조합 내열성 D-아미노산 아미노트랜스퍼라아제를 이용한 D-아미노산 생산 생물 촉매 전환 반응의 적용예로 합성된 D-글루탐산의 합성반응 속도를 100%로 하여 상대적으로 측정된 값이다.
[표 2]
재조합 내열성 D-아미노산 아미노트랜스퍼라아제를 이용한 D-아미노산 생산 생물촉매 전환 반응의 적용
Figure kpo00003
한편 D-AAT를 생물촉매로 이용하는 D-아미노산 제조법에서 아미노기를 공여하는 기질로 사용되는 반응원료 아미노산의 적절한 선택은 이 생물전환공정의 산업적 가치 및 경제성에 매우 중요한 요소이다. 따라서 본 발명의 재조합 내열성 D-AAT를 생물촉매로 하는 D-아미노산 제조 생물전환 공정에 대한 아미노기 공여체의 영향을 조사하였다. 표 3에 나타낸 바와 같이 본 발명의 D-AAT는 다양한 D-아미노산의 아미노기를 기질로 이용하는 폭넓은 기질 특이성을 나타내었으며, 특히 D-아스파트산을 기질로 이용하는 경우의 반응 생산성이 D-알라닌을 기질로 이용하는 경우의 약 70% 이상으로 나타나 다른 종류의 D-아미노산들에 비하여 상대적으로 높았다. 이 결과는 본 발명의 D-AAT가 D-아스파트산을 아미노기 공여체로 하여 D-알라닌을 합성하는 생물전환 반응의 생물촉매로써 매우 유용한 것임을 보여준다.
[표 3]
재조합 내열성 D-아미노산 아미노트랜스퍼라아제를 이용한 D-아미노산 제조에 대한 아미노기 공여체의 영향
[실시예 2]
본 발명의 재조합 대장균으로부터 생산된 바실러스 스피시즈 KLS-01 유래의 재조합 내열성 D-AAT는 높은 열안정성을 가지고 있으므로, 고온에서도 D-아미노산 합성용 생물 촉매로 유용하게 사용될 수 있다. 본 발명에서 D-알라닌, α-케토글루타르산 및 0.1mM 피리독살인산을 포함한 반응액에 재조합 내열성 D-AAT를 생물 촉매로 첨가하고 반응 온도를 달리하면서 D-아미노산 합성반응을 수행한 결과, 제 4도에 나타낸 바와 같이 65℃에서 최대활성을 나타내었으며, 70℃ 이상의 고온에서도 높은 D-아미노산 합성활성을 나타내어 고온에서의 생물전환 반응에 매우 유용한 생물촉매인 것으로 확인 되었다.
[실시예 3]
본 발명의 재조합 내열성 D-AAT는 D-아스파트산을 아미노기 공여체로 이용하는 활성이 높으므로(표 3), D-아스파트산과 피루브산을 기질로 이용하여 D-알라닌을 생산하는 생물촉매 전환 공정의 생물촉매로써 유용하게 사용될 수 있다. 한편 D-아스파트산의 아미노기를 피루브산에 전이하여 생성되는 옥살아세트산은 수용액에서 매우 불안정하여 자연스럽게 탈탄산반응을 겪게 되므로, 본 연구의 재조합 내열성 D-아미노산 아미노트랜스퍼라아제를 이용하는 D-알라닌 제조 생물촉매 전환공정에 D-아스파트산을 아미노기 공여체로 사용하게 되면, 소모되는 D-아스파트산의 양에 비례하여 이 반응의 아미노기 수여체인 피루브산이 생산되게 된다. 따라서 상기 생물전환 공정에는 적절한 양의 D-아스파트산과 반응 초기에 아미노기를 수용하기 위하여 필요한 최소량의 피루브산만 공급하여도 반응이 계속 진행될 수 있다. 본 발명에서는 0.2M D-아스파트산, 0.02M 피루브산 및 0.1mM 피리독살인산을 포함한 0.1M 트리스 완충액 (pH 8.5)에 D-AAT의 조효소액을 1유닛(unit)/㎖ 농도로 가하고 55℃에서 12시간 동안 D-알라닌 생산 반응을 수행한 결과, 97.7%의 고수율로 D-알라닌을 제조하였다.
[실시예 4]
실시예 3의 아미노기 공여체 D-아스파트산을 대신하여 D,L-아스파트 산의 라세미 혼합물을 아미노기 공여체로 사용하여 D-알라닌을 제조하였다. 0.2M D,L-아스파트산, 0.02M 피루브산 및 0.1mM 피리독살인산을 포함한 0.1M 트리스 완충액(pH 8.5)에 D-AAT의 조효소액을 1유닛(unit)/㎖로 가하고 55℃에서 12시간 동안 d-알라닌의 제조를 수행한 경우, 공급된 D-아스파트산의 98.6% 이상이 D-알라닌으로 전환되었으며, L-아스파트산은 전량이 반응액에 잔여하였다. 반응액 중의 L-아스파트산과 D-알라닌은 두물질의 등전점이 매우 다르므로 분별침전법에 의하여 쉽게 분리되어질 수 있다.

Claims (7)

  1. 하기의 아미노산 서열을 갖고 내열성 D-아미노산 아미노트랜스퍼리아제 활성이 있는 폴리펩티드:
    Figure kpo00005
  2. 제 1항에 정의된 폴리펩티드를 코드화 하며, 하기의 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 유전자:
    Figure kpo00006
  3. 아미노기 공여체 D-아미노산 및 아미노기 수여체 α-케토산을 포함하는 반응액에 제 2항에 정의된 유전자를 포함하는 재조합 플라스미드 pHKLS01에 의해 형질전환된 재조합 대장균 XL1Blue/pHKLS01(KCTC 0394BP)을 배양하여 얻은 미생물 균체를 직접 또는 조효소액인 상태로 가하여 반응 시키는 단계를 포함하는 D-아미노산의 제조방법.
  4. 제 3항에 있어서, 아미노기 공여체로 사용된 아미노산이 D-알라닌, D-글루탐산, D-아미노부티르산 및 D-아스파트산 중에서 선택된 1종 이상인 방법.
  5. 제 3항에 있어서, 아미노기 수여체로 사용된 α-케토산이 피루브산, α-케토글루타르산 및 α-케토이소발레르산 중에서 선택된 1종 이상인 방법.
  6. 제 4항 또는 제 5항에 있어서, D-아스파트산을 아미노기 공여체로, 피루브산을 아미노기 수여체로 사용하여 D-알라닌을 제조하는 방법.
  7. 제 6항에 있어서 D-아스파트산 대신에 D- 및 L-아스파트산의 라세미 혼합물을 아미노기 공여체로 사용하는 방법.
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