JPH06181786A - アジピン酸アンモニウムの酵素的合成方法 - Google Patents
アジピン酸アンモニウムの酵素的合成方法Info
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- JPH06181786A JPH06181786A JP3339705A JP33970591A JPH06181786A JP H06181786 A JPH06181786 A JP H06181786A JP 3339705 A JP3339705 A JP 3339705A JP 33970591 A JP33970591 A JP 33970591A JP H06181786 A JPH06181786 A JP H06181786A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 アジピン酸アンモニウムの酵素的合成方法に
関する。 【構成】 特定のポリペプチド又はこのポリペプチドを
生成する組換え微生物によるアジパミド及び／又はアン
モニウムアジパメートの加水分解によるアジピン酸アン
モニウムの合成のための酵素的方法に関する。
関する。 【構成】 特定のポリペプチド又はこのポリペプチドを
生成する組換え微生物によるアジパミド及び／又はアン
モニウムアジパメートの加水分解によるアジピン酸アン
モニウムの合成のための酵素的方法に関する。
Description
【０００１】本発明は、アジピン酸アンモニウムの酵素
的合成方法に関する。より詳しくは、本発明は、特定の
酵素触媒によるアジパミド及び／又はアンモニウムアジ
パメートの加水分解によるアジピン酸アンモニウムの合
成方法に関する。
的合成方法に関する。より詳しくは、本発明は、特定の
酵素触媒によるアジパミド及び／又はアンモニウムアジ
パメートの加水分解によるアジピン酸アンモニウムの合
成方法に関する。
【０００２】アジピン酸アンモニウムは、アジピン酸自
体、すなわちナイロンの調製のために広く使用される生
成物に転換され得るので特に価値ある生成物であること
が知られている。
体、すなわちナイロンの調製のために広く使用される生
成物に転換され得るので特に価値ある生成物であること
が知られている。
【０００３】アジパミドの酵素加水分解によるアジピン
酸アンモニウムの合成はすでに知られている。
酸アンモニウムの合成はすでに知られている。
【０００４】従って、この酵素活性の存在を示すことが
可能である微生物の間では、ブレビバクテリウム属及び
特にブレビバクテリウムＲ３１２に属する菌株がより詳
しく言及されている〔これに関しては、ARNAUDなど.,
“Etude de 1' activite amidasique de quelques bact
eries"("Study of the amidase activity of some bact
eria"), Folia Microbiologica, 1976, 21, 178 〜185
ページを参照のこと〕。さらに、酸性塩へのアミドの、
及び特にアジピン酸アンモニウムへのアジパミドの生物
転換のために直接使用され得る、いわゆる“一般的活
性”を有するアミダーゼのブレビバクテリウム内での存
在はまた、示されている（Maestrace ；など．Microbio
logie Aliments-Nutrition, 1986、第４巻、19〜24ペー
ジを参照のこと）。
可能である微生物の間では、ブレビバクテリウム属及び
特にブレビバクテリウムＲ３１２に属する菌株がより詳
しく言及されている〔これに関しては、ARNAUDなど.,
“Etude de 1' activite amidasique de quelques bact
eries"("Study of the amidase activity of some bact
eria"), Folia Microbiologica, 1976, 21, 178 〜185
ページを参照のこと〕。さらに、酸性塩へのアミドの、
及び特にアジピン酸アンモニウムへのアジパミドの生物
転換のために直接使用され得る、いわゆる“一般的活
性”を有するアミダーゼのブレビバクテリウム内での存
在はまた、示されている（Maestrace ；など．Microbio
logie Aliments-Nutrition, 1986、第４巻、19〜24ペー
ジを参照のこと）。
【０００５】しかしながら、ブレビバクテリウムＲ３１
２又は一般的活性を有する上記アミダーゼの酵素活性
は、アジパミドからアジピン酸アンモニウムの高く且つ
効果的な製造を可能にするために不十分であることが見
出される。
２又は一般的活性を有する上記アミダーゼの酵素活性
は、アジパミドからアジピン酸アンモニウムの高く且つ
効果的な製造を可能にするために不十分であることが見
出される。
【０００６】本発明の目的の１つは、改良された収率を
付与するアジピン酸アンモニウムの合成のための酵素的
方法を提供することである。
付与するアジピン酸アンモニウムの合成のための酵素的
方法を提供することである。
【０００７】現在、この目的は、適切に選択された酵
素、たとえば又は好ましくは前記酵素を生成する組換え
微生物の形で使用することによって達成され得ることが
本発明者により見出された。
素、たとえば又は好ましくは前記酵素を生成する組換え
微生物の形で使用することによって達成され得ることが
本発明者により見出された。
【０００８】より詳しくは、アミダーゼ活性を有するポ
リペプチド又は前記ポリペプチドを生成する組換え微生
物によりアジパミド及び／又はアンモニウムアジパメー
トの加水分解によるアジピン酸アンモニウムの合成のた
めの新規方法が提供され、前記方法は： （ｉ）−図８〜１１に示されるブレビバクテリウム（Br
evibacterium) のアミダーゼをコードする配列、−前記
遺伝子コードの縮重に起因するこの配列の相同体、及
び、−これらの配列の１つ又はそのフラグメントとハイ
ブリダイズし、そしてアミダーゼ活性を有するポリペプ
チドをコードするＤＮＡから選択されたＤＮＡ配列をコ
ードするポリペプチド；又は（ii）前記ポリペプチドを
生成する組換え微生物を用いることを含んで成る。
リペプチド又は前記ポリペプチドを生成する組換え微生
物によりアジパミド及び／又はアンモニウムアジパメー
トの加水分解によるアジピン酸アンモニウムの合成のた
めの新規方法が提供され、前記方法は： （ｉ）−図８〜１１に示されるブレビバクテリウム（Br
evibacterium) のアミダーゼをコードする配列、−前記
遺伝子コードの縮重に起因するこの配列の相同体、及
び、−これらの配列の１つ又はそのフラグメントとハイ
ブリダイズし、そしてアミダーゼ活性を有するポリペプ
チドをコードするＤＮＡから選択されたＤＮＡ配列をコ
ードするポリペプチド；又は（ii）前記ポリペプチドを
生成する組換え微生物を用いることを含んで成る。
【０００９】本発明の１つの特別な態様においては、図
１６〜１８に示されるような配列又はこの配列の変異体
をコードするポリペプチド（又はこのポリペプチドを生
成する組換え微生物）が使用される。変異体は、たとえ
ば変異、欠失又は挿入、又は他に遺伝子コードの縮重に
起因する少々の分解にもかかわらず、所期配列の性質を
保存するいづれかの配列を意味するものとして理解され
る。
１６〜１８に示されるような配列又はこの配列の変異体
をコードするポリペプチド（又はこのポリペプチドを生
成する組換え微生物）が使用される。変異体は、たとえ
ば変異、欠失又は挿入、又は他に遺伝子コードの縮重に
起因する少々の分解にもかかわらず、所期配列の性質を
保存するいづれかの配列を意味するものとして理解され
る。
【００１０】下記に示されるように、そのような配列
は、ロドコーカスタイプの株に見出され得る。本発明に
よれば、図１６〜１８に示されるＤＮＡ配列は、図８〜
１１に示されるＤＮＡ配列によりハイブリダイズするも
のとして見なされる。
は、ロドコーカスタイプの株に見出され得る。本発明に
よれば、図１６〜１８に示されるＤＮＡ配列は、図８〜
１１に示されるＤＮＡ配列によりハイブリダイズするも
のとして見なされる。
【００１１】上記に定義されるようなポリペプチド及び
これらのポリペプチドを生成する組換え微生物（本発明
の方法に使用される）は、Rhone-Poulenc Sante の名で
フランス特許第８９１６３３２号にすでに記載されてい
る。従って、それらは、本発明の対象を形成しない。
これらのポリペプチドを生成する組換え微生物（本発明
の方法に使用される）は、Rhone-Poulenc Sante の名で
フランス特許第８９１６３３２号にすでに記載されてい
る。従って、それらは、本発明の対象を形成しない。
【００１２】一般的には、まだ公開されていない前記特
許出願は、いわゆる鏡像選択性アミダーゼ活性を有する
ポリペプチド、それらの発現を可能にするＤＮＡ配列、
それらの調製方法及びＳ形又はＲ形のいづれかでのラセ
ミアミドの酸への鏡像選択性加水分解のための触媒とし
てのそれらの使用に関する。これらのポリペプチド及び
それらの発現を可能にする遺伝子材料は、下記に示され
る例に従って得られる。
許出願は、いわゆる鏡像選択性アミダーゼ活性を有する
ポリペプチド、それらの発現を可能にするＤＮＡ配列、
それらの調製方法及びＳ形又はＲ形のいづれかでのラセ
ミアミドの酸への鏡像選択性加水分解のための触媒とし
てのそれらの使用に関する。これらのポリペプチド及び
それらの発現を可能にする遺伝子材料は、下記に示され
る例に従って得られる。
【００１３】従って、そのようなポリペプチド又はそれ
らの発現を可能にする遺伝子材料、又は前記ポリペプチ
ドを生成する組換え微生物の調製方法は本発明の目的を
形成しないことが示されるであろう。
らの発現を可能にする遺伝子材料、又は前記ポリペプチ
ドを生成する組換え微生物の調製方法は本発明の目的を
形成しないことが示されるであろう。
【００１４】本発明は実際、鏡像的選択性アミダーゼ活
性を有するそのようなポリペプチドがまた、特別に高い
収率でアジピン酸アンモニウムにアジパミド及び／又は
アンモニウムアジパメートを加水分解できる注目できる
性質を有する発見に基づかれている。従って、本発明
は、特定のポリペプチドの新規使用に関する。
性を有するそのようなポリペプチドがまた、特別に高い
収率でアジピン酸アンモニウムにアジパミド及び／又は
アンモニウムアジパメートを加水分解できる注目できる
性質を有する発見に基づかれている。従って、本発明
は、特定のポリペプチドの新規使用に関する。
【００１５】上記に引用されたフランス特許第８９１６
３３２号は、引用により本明細書に完全に包含される
が、その内容及び教授は、現在の開示の目的のために、
特に例が関係している限り、少なくとも部分的に再開発
されるであろう。
３３２号は、引用により本明細書に完全に包含される
が、その内容及び教授は、現在の開示の目的のために、
特に例が関係している限り、少なくとも部分的に再開発
されるであろう。
【００１６】本発明の方法に使用されるポリペプチドを
コードするＤＮＡ配列は、種々の方法で得られる。一般
的な技法は、所望するポリペプチドをコードするゲノム
ＤＮＡフラグメントをクローン化するために、精製され
たポリペプチドから調製されるヌクレオチドプローブを
用いることから成る。種々の方法、たとえばプライマー
拡張、制限、アダプター挿入又はリンカーオリゴヌクレ
オチドによる連結により、所望するＤＮＡ配列を含むヌ
クレオチド挿入体が構成される。前記配列は次に既知技
法によりマッピングされ、そして配列決定され得る。
コードするＤＮＡ配列は、種々の方法で得られる。一般
的な技法は、所望するポリペプチドをコードするゲノム
ＤＮＡフラグメントをクローン化するために、精製され
たポリペプチドから調製されるヌクレオチドプローブを
用いることから成る。種々の方法、たとえばプライマー
拡張、制限、アダプター挿入又はリンカーオリゴヌクレ
オチドによる連結により、所望するＤＮＡ配列を含むヌ
クレオチド挿入体が構成される。前記配列は次に既知技
法によりマッピングされ、そして配列決定され得る。
【００１７】他の技法はまた、たとえばＤＮＡの使用及
び／又は一部又は完全な化学的合成を包含する。これら
の技法は既知であり、そして図１２及び１９に記載され
る構造体は、当業界において既知の手段により、いづれ
かの微生物において、同等の配列単離を可能にする。
び／又は一部又は完全な化学的合成を包含する。これら
の技法は既知であり、そして図１２及び１９に記載され
る構造体は、当業界において既知の手段により、いづれ
かの微生物において、同等の配列単離を可能にする。
【００１８】その構造が上記ＤＮＡ配列から推測され、
そしてアミダーゼ活性を有するポリペプチドは、種々の
微生物及び特にブレビバクテリア又はロドコーカス属の
細菌から得られる。さらにより詳しくは、これらのポリ
ペプチドは、抽出及び精製により天然又は組換え微生物
の培養物から調製され、前記精製は、細胞培養物から粗
酵素抽出物を調製し、この抽出物を硫酸アンモニウムに
より分別し、そしてそれを種々のゲルクロマトグラフィ
ー及び濾過方法により精製することから成る一連の段階
により行なわれる。これらの段階の詳細は、例に与えら
れる。
そしてアミダーゼ活性を有するポリペプチドは、種々の
微生物及び特にブレビバクテリア又はロドコーカス属の
細菌から得られる。さらにより詳しくは、これらのポリ
ペプチドは、抽出及び精製により天然又は組換え微生物
の培養物から調製され、前記精製は、細胞培養物から粗
酵素抽出物を調製し、この抽出物を硫酸アンモニウムに
より分別し、そしてそれを種々のゲルクロマトグラフィ
ー及び濾過方法により精製することから成る一連の段階
により行なわれる。これらの段階の詳細は、例に与えら
れる。
【００１９】次に、精製されたポリペプチドは、配列決
定され、そして分子生物学の通常の技法（組換えＤＮＡ
技法）に従ってそれらの遺伝子がクローンされ、そして
種々の組換え微生物（宿主微生物）に発現され得る。よ
り詳しくは、形質転換された微生物は、図８〜１１及び
１６〜１８に示されるようなＤＮＡ配列の発現のための
少なくとも１つのカセットを含み、これらのカセットは
好ましくは、問題の宿主におけるその発現を確保するＤ
ＮＡ配列の依存下で前記ＤＮＡ配列の１つから成る。前
記カセットは、宿主のゲノム中に直接的に組込まれたカ
セット、又は宿主において活性的なプラスミド複製の起
点及び選択手段を含むプラスミド中に挿入されたカセッ
トであり得る。
定され、そして分子生物学の通常の技法（組換えＤＮＡ
技法）に従ってそれらの遺伝子がクローンされ、そして
種々の組換え微生物（宿主微生物）に発現され得る。よ
り詳しくは、形質転換された微生物は、図８〜１１及び
１６〜１８に示されるようなＤＮＡ配列の発現のための
少なくとも１つのカセットを含み、これらのカセットは
好ましくは、問題の宿主におけるその発現を確保するＤ
ＮＡ配列の依存下で前記ＤＮＡ配列の１つから成る。前
記カセットは、宿主のゲノム中に直接的に組込まれたカ
セット、又は宿主において活性的なプラスミド複製の起
点及び選択手段を含むプラスミド中に挿入されたカセッ
トであり得る。
【００２０】前記ＤＮＡ配列の発現を確保するＤＮＡ配
列は好ましくは、転写及び翻訳開始領域を含む。この方
法において、転写及び翻訳開始領域は、プロモーター及
びリボソーム結合部位を含む。これらの領域は、生成さ
れるポリペプチドと相同であり得又は非相同であり得
る。
列は好ましくは、転写及び翻訳開始領域を含む。この方
法において、転写及び翻訳開始領域は、プロモーター及
びリボソーム結合部位を含む。これらの領域は、生成さ
れるポリペプチドと相同であり得又は非相同であり得
る。
【００２１】これらの領域の選択は特に、使用される宿
主に依存する。特に、原核宿主微生物の場合、異種プロ
モーターは、強い細菌プロモーター、たとえばトリプト
ファンオペロンプロモーターＰｔｒｐ、ラクトースオペ
ロンプロモーターＰｌａｃ、ファージλ右プロモーター
ＰR 、ファージλ左プロモーターＰL 、コリネバクテリ
ア（corynebacteria）ファージの強いプロモーター又は
コリネバクテリアの相同プロモーターから選択され得
る。より詳しくは、ファージλ右プロモーターの場合、
熱選択形ＰR ＣＩtsが好ましい。真核微生物、たとえば
酵母の場合、プロモーターは、糖分解酵素遺伝子、たと
えばホスホグリセレートキナーゼ（ＰＧＫ）、グリセル
アルデヒド３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＰ
Ｄ）、ラクターゼ（ＬＡＣ４）及びエノラーゼ（ＥＮ
Ｏ）をコードする遺伝子に由来する。
主に依存する。特に、原核宿主微生物の場合、異種プロ
モーターは、強い細菌プロモーター、たとえばトリプト
ファンオペロンプロモーターＰｔｒｐ、ラクトースオペ
ロンプロモーターＰｌａｃ、ファージλ右プロモーター
ＰR 、ファージλ左プロモーターＰL 、コリネバクテリ
ア（corynebacteria）ファージの強いプロモーター又は
コリネバクテリアの相同プロモーターから選択され得
る。より詳しくは、ファージλ右プロモーターの場合、
熱選択形ＰR ＣＩtsが好ましい。真核微生物、たとえば
酵母の場合、プロモーターは、糖分解酵素遺伝子、たと
えばホスホグリセレートキナーゼ（ＰＧＫ）、グリセル
アルデヒド３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＰ
Ｄ）、ラクターゼ（ＬＡＣ４）及びエノラーゼ（ＥＮ
Ｏ）をコードする遺伝子に由来する。
【００２２】リボソーム結合部位に関しては、λｃII遺
伝子に由来し、そしてコリネバクテリアの相同遺伝子に
由来する部位が、好ましくは、宿主微生物が原核生物で
ある場合、使用される。
伝子に由来し、そしてコリネバクテリアの相同遺伝子に
由来する部位が、好ましくは、宿主微生物が原核生物で
ある場合、使用される。
【００２３】予想される宿主における翻訳及び機能的転
写の終結を可能にする領域は、コード配列の３′末端で
位置する。プラスミドはまた、組換え宿主を選択するた
めに１又は複数のマーカーを含んで成る。好ましいマー
カーは、優性マーカー、すなわち抗生物質、たとえばア
ンピシリン又はストレプトマイシン又は他の毒性生成物
に対して耐性を付与するものである。
写の終結を可能にする領域は、コード配列の３′末端で
位置する。プラスミドはまた、組換え宿主を選択するた
めに１又は複数のマーカーを含んで成る。好ましいマー
カーは、優性マーカー、すなわち抗生物質、たとえばア
ンピシリン又はストレプトマイシン又は他の毒性生成物
に対して耐性を付与するものである。
【００２４】使用される宿主微生物の中には、特に腸内
細菌、たとえばＥ．コリ及びコリネバクテリア、たとえ
ばコリネバクテリウム、ブレビバクテリウム又はロドコ
ーカス属に属する細菌が言及される。もちろん、他の細
胞タイプも、同じ原理に従って使用され得る。
細菌、たとえばＥ．コリ及びコリネバクテリア、たとえ
ばコリネバクテリウム、ブレビバクテリウム又はロドコ
ーカス属に属する細菌が言及される。もちろん、他の細
胞タイプも、同じ原理に従って使用され得る。
【００２５】本発明によれば、アジピン酸アンモニウム
は、ポリペプチド又は上記組換え微生物とアジパミド及
び／又はアンモニウムアジパメート（反応体）とを接触
することによって簡単に調製される。
は、ポリペプチド又は上記組換え微生物とアジパミド及
び／又はアンモニウムアジパメート（反応体）とを接触
することによって簡単に調製される。
【００２６】本発明の１つの特定の態様においては、ポ
リペプチド又はそのポリペプチドを含む組換え微生物が
固体支持体上に又はその中に固定される。次の例は、本
発明の特徴及び利点を例示するものであって、本発明の
範囲を制限するものではない。
リペプチド又はそのポリペプチドを含む組換え微生物が
固体支持体上に又はその中に固定される。次の例は、本
発明の特徴及び利点を例示するものであって、本発明の
範囲を制限するものではない。
【００２７】出発プラスミド プラスミドｐＸＬ５３４を、ＥｃｏＲＶ部位から酵素Ｂ
ａｌ３１による２．１kbのフラグメントの欠失／及びＢ
ａｍＨＩリンカーへの連結によりｐＸＬ２７６（Ｐｔｒ
ｐ−ＲＢＳｃIIΔｔＲＩ−ＨＳＡ：ヨーロッパ特許第８
６４００６１７．６号を含む）から誘導する。
ａｌ３１による２．１kbのフラグメントの欠失／及びＢ
ａｍＨＩリンカーへの連結によりｐＸＬ２７６（Ｐｔｒ
ｐ−ＲＢＳｃIIΔｔＲＩ−ＨＳＡ：ヨーロッパ特許第８
６４００６１７．６号を含む）から誘導する。
【００２８】プラスミドｐＸＬ８２０を、Ｐｔｒｐ及び
ＲＢＳｃIIΔｔＲＩを担持するＥｃｏＲＩ−ＮｄｅＩフ
ラグメントの切り出し、及びプロモーターＰR ＣＩts及
びＲＢＳｃIIΔｔＲＩ部位を含むＥｃｏＲＩ−ＮｄｅＩ
フラグメントの挿入によりプラスミドｐＸＬ５３４から
誘導した。後者を、次の段階によりプラスミドｐＲＫ２
４８ＣＩts（Bernard など.,Gene, 5, 59 〜76）から誘
導する：
ＲＢＳｃIIΔｔＲＩを担持するＥｃｏＲＩ−ＮｄｅＩフ
ラグメントの切り出し、及びプロモーターＰR ＣＩts及
びＲＢＳｃIIΔｔＲＩ部位を含むＥｃｏＲＩ−ＮｄｅＩ
フラグメントの挿入によりプラスミドｐＸＬ５３４から
誘導した。後者を、次の段階によりプラスミドｐＲＫ２
４８ＣＩts（Bernard など.,Gene, 5, 59 〜76）から誘
導する：
【００２９】ＰR ＣＩtsを含むｐＲＫ２４８−ＣＩtsか
らＢｇｌＩ−ＢｇｌＩフラグメントの切り出し；プラス
ミドｐＵＣ１９のＢａｍＨＩ部位での前記フラグメント
の挿入；ＣｌａＩによる前記得られたｐＵＣ１９の線状
化及びクレノウＤＮＡポリマラーゼによる末端のフィル
イン；ＳｍａＩによる追加の消化及び連結；ＰR ＣＩts
を含むＥｃｏＲＩ−ＳａｌＩフラグメントの、この新規
の構造体からの切り出し、そしてこれらの２種の酵素に
より開環されたｐＸＬ５３４中への挿入；及び次にこの
プラスミドからのＥｃｏＲＩ−ＮｄｅＩフラグメントの
切り出し（前記フラグメントはＰR ＣＩts−ＲＢＳｃII
ΔｔＲＩを含む。）
らＢｇｌＩ−ＢｇｌＩフラグメントの切り出し；プラス
ミドｐＵＣ１９のＢａｍＨＩ部位での前記フラグメント
の挿入；ＣｌａＩによる前記得られたｐＵＣ１９の線状
化及びクレノウＤＮＡポリマラーゼによる末端のフィル
イン；ＳｍａＩによる追加の消化及び連結；ＰR ＣＩts
を含むＥｃｏＲＩ−ＳａｌＩフラグメントの、この新規
の構造体からの切り出し、そしてこれらの２種の酵素に
より開環されたｐＸＬ５３４中への挿入；及び次にこの
プラスミドからのＥｃｏＲＩ−ＮｄｅＩフラグメントの
切り出し（前記フラグメントはＰR ＣＩts−ＲＢＳｃII
ΔｔＲＩを含む。）
【００３０】実施例１─ブレビバクテリウム R 312の鏡
像選択性アミラーゼの同定および精製 1.1.─同定 ２−アリールオキシプロピオンアミド誘導体であるＲ，
Ｓ−２−（４−ヒドロキシフェノキシ）プロピオンアミ
ドは、２−アリールプロピオンアミド誘導体、特に２−
フェニルプロピオンアミドおよび２−（３−ベンゾイル
フェニル）プロピオンアミドよりも優れた鏡像選択性ア
ミダーゼ基質である。更に、HPPAmideのＲ鏡像体に対す
るアミダーゼの選択性は、２−アリールプロピオンアミ
ド誘導体のＳ鏡像体に対する選択性を代表する。
像選択性アミラーゼの同定および精製 1.1.─同定 ２−アリールオキシプロピオンアミド誘導体であるＲ，
Ｓ−２−（４−ヒドロキシフェノキシ）プロピオンアミ
ドは、２−アリールプロピオンアミド誘導体、特に２−
フェニルプロピオンアミドおよび２−（３−ベンゾイル
フェニル）プロピオンアミドよりも優れた鏡像選択性ア
ミダーゼ基質である。更に、HPPAmideのＲ鏡像体に対す
るアミダーゼの選択性は、２−アリールプロピオンアミ
ド誘導体のＳ鏡像体に対する選択性を代表する。
【００３１】従って、基質として２−（４−ヒドロキシ
フェノキシ）プロピオンアミド（HPPAmide）を使って鏡
像選択性酵素活性を検出した。ブレビバクテリウム（Br
evibacterium） R 312の存在下で50mMリン酸ナトリウム
緩衝液(pH 7.0)中で攪拌しながら25℃にて反応を行い、
そして0.05M リン酸、アセトニトリルおよび1N HClの55
/40/5 (v/v) 混合物の添加により停止させる。次いで培
養物を遠心し、上清を逆相HPLC (Hibar-Merck RP-18 ;
5 μm)により分析する。0.005Mリン酸とアセトニトリル
の85/15 (v/v) 溶液を用いて溶出せしめ、そして溶出ピ
ークの位置によりHPPAmideとHPPAcid の各濃度を測定
し、標準物と比較する。(R-S)/(R+S) ×100 （ここでＲ
およびＳはHPPAcid のＲおよびＳ鏡像体の各濃度であ
る）として定義される鏡像体過剰量を、旋光分析測定
（589 nmでのナトリウム吸収を使って）またはキラルカ
ラム上でのHPLC分析のいずれかから推測する。
フェノキシ）プロピオンアミド（HPPAmide）を使って鏡
像選択性酵素活性を検出した。ブレビバクテリウム（Br
evibacterium） R 312の存在下で50mMリン酸ナトリウム
緩衝液(pH 7.0)中で攪拌しながら25℃にて反応を行い、
そして0.05M リン酸、アセトニトリルおよび1N HClの55
/40/5 (v/v) 混合物の添加により停止させる。次いで培
養物を遠心し、上清を逆相HPLC (Hibar-Merck RP-18 ;
5 μm)により分析する。0.005Mリン酸とアセトニトリル
の85/15 (v/v) 溶液を用いて溶出せしめ、そして溶出ピ
ークの位置によりHPPAmideとHPPAcid の各濃度を測定
し、標準物と比較する。(R-S)/(R+S) ×100 （ここでＲ
およびＳはHPPAcid のＲおよびＳ鏡像体の各濃度であ
る）として定義される鏡像体過剰量を、旋光分析測定
（589 nmでのナトリウム吸収を使って）またはキラルカ
ラム上でのHPLC分析のいずれかから推測する。
【００３２】全細胞および可溶性抽出物を用いて得られ
た活性は、それぞれ15 U/mg および24 U/mg タンパク質
（1 U ＝１時間あたり１マイクロモルのHPPAcid が形成
される）である。形成されるＲ HPPAcid の鏡像体過剰
量は95％である。それらの結果は、ブレビバクテリウム
（Brevibacterium） R 312が、ラセミ体の２−アリール
プロピオンアミドを対応するＳ酸に加水分解することが
できる鏡像選択性アミダーゼ活性を有することを示す。
これはラセミ体の２−フェニルプロピオンアミドおよび
２−（３−ベンゾイルフェニル）プロピオンアミドの加
水分解により確かめられ、それぞれ93％より高い鏡像体
過剰量で対応するＳ酸を与えた。
た活性は、それぞれ15 U/mg および24 U/mg タンパク質
（1 U ＝１時間あたり１マイクロモルのHPPAcid が形成
される）である。形成されるＲ HPPAcid の鏡像体過剰
量は95％である。それらの結果は、ブレビバクテリウム
（Brevibacterium） R 312が、ラセミ体の２−アリール
プロピオンアミドを対応するＳ酸に加水分解することが
できる鏡像選択性アミダーゼ活性を有することを示す。
これはラセミ体の２−フェニルプロピオンアミドおよび
２−（３−ベンゾイルフェニル）プロピオンアミドの加
水分解により確かめられ、それぞれ93％より高い鏡像体
過剰量で対応するＳ酸を与えた。
【００３３】1.2.─精製 精製は４℃において行う。細胞〔乾燥重量で40 gのブレ
ビバクテリウム（Brevibacterium） R 312〕を解凍し、
300 mlの緩衝液Ａ（50mMリン酸ナトリウム, pH 7, 5mM
β−メルカプトエタノール）中に取り出す。次いで細胞
を超音波処理により破壊し、20,000 gでの30分間の遠心
により膜破片を除去する。攪拌しながら30 ml の上清に
硫酸ストレプトマイシンの10％溶液25 ml をゆっくり添
加する。45分後、上記と同様にして溶液を清澄化し、上
清を硫酸アンモニウムで処理する。30.8％〜56.6％の硫
酸アンモニウム飽和度で沈澱するタンパク質分画を遠心
により回収し、そして35 mlの緩衝液Ａ中に溶解した
後、この同緩衝液に対して長時間透析する。得られた溶
液を20％の硫酸アンモニウム飽和度に調整し、再度遠心
し、そして20％の硫酸アンモニウム飽和度の緩衝液Ａで
平衡化されたフェニル−セファロースCL-4B カラム(Pha
rmacia) に適用する。次いで酵素活性を含むタンパク質
分画を同緩衝液で溶出せしめ、AMICON DIAFLO PM 10 セ
ルを用いた限外濾過により18 ml の容量にまで濃縮す
る。次に濃縮分画に10％グリセロールを添加し、得られ
た溶液を、予め50mM Tris-HCl, pH 7.0, 100mM NaCl で
平衡化されたUltrogel AcA 44 カラム(IBF-biotechnics
France)上に負荷する。最大比活性（カラム上に負荷し
た全活性の約32％）を有するタンパク質分画を収集し、
濃縮し、そして同じゲル上での追加の濾過段階にかけ
る。同様に、最大比活性（カラム上に負荷した全活性の
約32％）を有するタンパク質分画をSDS-PAGEにより分析
し、保存する。こうして精製されたタンパク質の鏡像選
択性も測定した。
ビバクテリウム（Brevibacterium） R 312〕を解凍し、
300 mlの緩衝液Ａ（50mMリン酸ナトリウム, pH 7, 5mM
β−メルカプトエタノール）中に取り出す。次いで細胞
を超音波処理により破壊し、20,000 gでの30分間の遠心
により膜破片を除去する。攪拌しながら30 ml の上清に
硫酸ストレプトマイシンの10％溶液25 ml をゆっくり添
加する。45分後、上記と同様にして溶液を清澄化し、上
清を硫酸アンモニウムで処理する。30.8％〜56.6％の硫
酸アンモニウム飽和度で沈澱するタンパク質分画を遠心
により回収し、そして35 mlの緩衝液Ａ中に溶解した
後、この同緩衝液に対して長時間透析する。得られた溶
液を20％の硫酸アンモニウム飽和度に調整し、再度遠心
し、そして20％の硫酸アンモニウム飽和度の緩衝液Ａで
平衡化されたフェニル−セファロースCL-4B カラム(Pha
rmacia) に適用する。次いで酵素活性を含むタンパク質
分画を同緩衝液で溶出せしめ、AMICON DIAFLO PM 10 セ
ルを用いた限外濾過により18 ml の容量にまで濃縮す
る。次に濃縮分画に10％グリセロールを添加し、得られ
た溶液を、予め50mM Tris-HCl, pH 7.0, 100mM NaCl で
平衡化されたUltrogel AcA 44 カラム(IBF-biotechnics
France)上に負荷する。最大比活性（カラム上に負荷し
た全活性の約32％）を有するタンパク質分画を収集し、
濃縮し、そして同じゲル上での追加の濾過段階にかけ
る。同様に、最大比活性（カラム上に負荷した全活性の
約32％）を有するタンパク質分画をSDS-PAGEにより分析
し、保存する。こうして精製されたタンパク質の鏡像選
択性も測定した。
【００３４】それらの精製工程は、80％よりも高い純度
および815 U/mgの比活性を有する酵素を得ることを可能
にする。この段階で、59±5 KDの見かけ分子量を有する
主バンドがSDS-PAGEで検出される。更に、Ultrogel AcA
44 から溶出されたアミダーゼ活性も63±5 KDの分子量
に相当し、このことは該酵素が明らかに単量体形である
ことを示す。
および815 U/mgの比活性を有する酵素を得ることを可能
にする。この段階で、59±5 KDの見かけ分子量を有する
主バンドがSDS-PAGEで検出される。更に、Ultrogel AcA
44 から溶出されたアミダーゼ活性も63±5 KDの分子量
に相当し、このことは該酵素が明らかに単量体形である
ことを示す。
【００３５】実施例２─ブレビバクテリウム（Brevibac
terium） R 312の鏡像選択性アミダーゼのクローニング 2.1.─タンパク質配列の決定 こうして精製された酵素においてブレビバクテリウム
（Brevibacterium） R 312の鏡像選択性アミダーゼのＮ
末端（27残基）および内部トリプシン断片（21残基）に
相当するペプチド配列を決定した。このために、３ナノ
モルのアミダーゼ調製物を還元およびカルボキシメチル
化する。次いで主タンパク質化合物を脱塩し、逆相HPLC
により均質に精製する。"Applied Biosystems Model 47
0A" 装置を使って、エドマン自動連続分解によりＮ末端
配列を決定する。この手順により図２ａに示した配列が
得られる。もう一方の内部配列を決定するために、同量
のタンパク質をトリプシン分解にかける。次いで還元カ
ルボキシメチル化断片を、次の溶離液を使った逆相HPLC
(2.1 ×10 mm ; 流速 0.2 ml/分) により分離する :
0.07 ％トリフルオロ酢酸中0-50％のアセトニトリル勾
配。十分に分離したピークにおいて溶出したペプチド
（40.8％のアセトニトリルのところ）を配列決定する
（図１ａ）。
terium） R 312の鏡像選択性アミダーゼのクローニング 2.1.─タンパク質配列の決定 こうして精製された酵素においてブレビバクテリウム
（Brevibacterium） R 312の鏡像選択性アミダーゼのＮ
末端（27残基）および内部トリプシン断片（21残基）に
相当するペプチド配列を決定した。このために、３ナノ
モルのアミダーゼ調製物を還元およびカルボキシメチル
化する。次いで主タンパク質化合物を脱塩し、逆相HPLC
により均質に精製する。"Applied Biosystems Model 47
0A" 装置を使って、エドマン自動連続分解によりＮ末端
配列を決定する。この手順により図２ａに示した配列が
得られる。もう一方の内部配列を決定するために、同量
のタンパク質をトリプシン分解にかける。次いで還元カ
ルボキシメチル化断片を、次の溶離液を使った逆相HPLC
(2.1 ×10 mm ; 流速 0.2 ml/分) により分離する :
0.07 ％トリフルオロ酢酸中0-50％のアセトニトリル勾
配。十分に分離したピークにおいて溶出したペプチド
（40.8％のアセトニトリルのところ）を配列決定する
（図１ａ）。
【００３６】2.2.─ヌクレオチドプローブの調製 ヌクレオチドプローブの作製のために２種類の方策を実
行した。第一の方策では、ブレビバクテリウム・ラクト
フェルメンタム（Brevibacterium lactofermentum）の
トリプトファンオペロン（６つのシストロンを含む7.7k
bの配列：Matsuiら、Mol. Gen. Genet. 209, 299, 1987
）におけるコドンの使用を考慮して、そして内部断片
の配列IDGALGSYDV（より低い平均縮重を有する）に従っ
て、29マーのプローブ（最小相同性59％）を作製した。
Ｇ＝Ｔペアリングの相対熱力学的中性を考慮することに
より、そして問題のコドンの平均理論頻度を最大にする
ために（選択したコドン使用に関して88％）２〜３の縮
重を導入することにより、非コード鎖を合成した。この
考慮の結果は、プローブのＧＣ含量を約69％にすること
である。得られたプローブ（sq 762）を図２ｂに与え
る。
行した。第一の方策では、ブレビバクテリウム・ラクト
フェルメンタム（Brevibacterium lactofermentum）の
トリプトファンオペロン（６つのシストロンを含む7.7k
bの配列：Matsuiら、Mol. Gen. Genet. 209, 299, 1987
）におけるコドンの使用を考慮して、そして内部断片
の配列IDGALGSYDV（より低い平均縮重を有する）に従っ
て、29マーのプローブ（最小相同性59％）を作製した。
Ｇ＝Ｔペアリングの相対熱力学的中性を考慮することに
より、そして問題のコドンの平均理論頻度を最大にする
ために（選択したコドン使用に関して88％）２〜３の縮
重を導入することにより、非コード鎖を合成した。この
考慮の結果は、プローブのＧＣ含量を約69％にすること
である。得られたプローブ（sq 762）を図２ｂに与え
る。
【００３７】第二の方策では、Girgesら(Nucleic Acids
Res. 16, 10371, 1988)により記載されたＰＣＲ法を用
いて、高度に縮重するコドンに対応するペプチドから的
確なヌクレオチドプローブを得た。これを行うために、
Ｎ末端ペプチド配列の最初の５個または最後の５個のコ
ドンをクローニングする全ての可能な方法に対応し、そ
してそれらの５′末端に制限部位（それぞれEcoRI とHi
ndIII ）を含む、合成25マーオリゴヌクレオチド（図２
の下線が引かれた配列を参照のこと）を用いて、ブレビ
バクテリウム（Brevibacterium）R 312 のゲノムＤＮＡ
の酵素的増幅を開始させた。30サイクル後、候補断片を
ゲル上で精製し、次いでバクテリオファージM13mp19 の
HindIII 部位とEcoRI 部位との間に挿入した。生成断片
を２つの異なるプライマーハイブリダイゼーション温度
（45℃と48℃）においてクローニングした後、得られた
多数のクローンを配列決定して比較した。その結果を図
３に示す。この図は、プライマーにより導入された縮重
の他に、アミダーゼのＮ末端をコードするＤＮＡ断片
（プライマー間に特有）が実際に増幅されたことを示
す。従って、この内部断片に相当する合成40マーオリゴ
ヌクレオチドを、該アミダーゼのＮ末端の的確なプロー
ブとしてクローニングの残部に使用した。この断片sq 9
18の配列は図２に示される。こうして得られた２つのプ
ローブを５′リン酸化法により32Ｐで標識した。
Res. 16, 10371, 1988)により記載されたＰＣＲ法を用
いて、高度に縮重するコドンに対応するペプチドから的
確なヌクレオチドプローブを得た。これを行うために、
Ｎ末端ペプチド配列の最初の５個または最後の５個のコ
ドンをクローニングする全ての可能な方法に対応し、そ
してそれらの５′末端に制限部位（それぞれEcoRI とHi
ndIII ）を含む、合成25マーオリゴヌクレオチド（図２
の下線が引かれた配列を参照のこと）を用いて、ブレビ
バクテリウム（Brevibacterium）R 312 のゲノムＤＮＡ
の酵素的増幅を開始させた。30サイクル後、候補断片を
ゲル上で精製し、次いでバクテリオファージM13mp19 の
HindIII 部位とEcoRI 部位との間に挿入した。生成断片
を２つの異なるプライマーハイブリダイゼーション温度
（45℃と48℃）においてクローニングした後、得られた
多数のクローンを配列決定して比較した。その結果を図
３に示す。この図は、プライマーにより導入された縮重
の他に、アミダーゼのＮ末端をコードするＤＮＡ断片
（プライマー間に特有）が実際に増幅されたことを示
す。従って、この内部断片に相当する合成40マーオリゴ
ヌクレオチドを、該アミダーゼのＮ末端の的確なプロー
ブとしてクローニングの残部に使用した。この断片sq 9
18の配列は図２に示される。こうして得られた２つのプ
ローブを５′リン酸化法により32Ｐで標識した。
【００３８】2.3.─ブレビバクテリウム R 312の鏡像選
択性アミダーゼ遺伝子のクローニング 行った方策は、最初は合成プローブの特異性を確かめそ
してクローニングしようとするゲノムＤＮＡ断片の性質
をサザンブロッティングにより決定することから成っ
た。簡単に言えば、ブレビバクテリウム（Brevibacteri
um）R 312 のゲノムＤＮＡを、クローニングに有用な部
位および特にpUC 系のプラスミドの多重クローニング部
位中に存在する部位に対応する幾つかの制限酵素で消化
した。特にPstI酵素を用いた。アガロースゲル上での電
気泳動およびナイロン膜上への移行の後、種々の消化物
をプローブsq 762およびsq 918とハイブリダイズせしめ
た。図４に与えた結果は、それら２つのプローブがハイ
ブリダイゼーション条件下での十分な特異性により特徴
付けられることを示す（各消化につき多くても１つの断
片がハイブリダイズする）。更に、２つのプローブがほ
ぼ同じハイブリダイゼーションプロフィールを得ること
を可能にする限り、ハイブリダイゼーションシグナルが
所望の遺伝子に非常に特異的であり、そしてトリプシン
加水分解後に得られる内部ペプチドがＮ末端に非常に近
いと考えられ得る。ハイブリダイゼーションブロット
は、特に、２つのプローブと強力にハイブリダイズする
約5.4 kbpのユニークなPstI断片の存在を示す。従っ
て、この断片をクローニングすることを決めた。これを
行うために、PstIでのブレビバクテリウム R 312の全ゲ
ノム消化から生じる約4.6 〜5 kbp および約6 〜6.5 kb
p のサイズの全断片をアガロース上で精製し、電気溶出
せしめ、次いで予めPstIで消化されているベクターpUC1
9 に連結せしめた。大腸菌株 DH5α中に形質転換せしめ
た後、理論上組換え微生物に相当する500 個の白色コロ
ニーをX-gal 培地上で得た。それらのコロニーを個々に
継代培養し、ナイロン膜上に移行し、そして32Ｐ−標識
プローブsq 918とのハイブリダイゼーションにより分析
した。こうして該プローブと強力にハイブリダイズする
ものとして２つのクローンを同定し、単離し、そしてク
ローニングを続けるために保持した。
択性アミダーゼ遺伝子のクローニング 行った方策は、最初は合成プローブの特異性を確かめそ
してクローニングしようとするゲノムＤＮＡ断片の性質
をサザンブロッティングにより決定することから成っ
た。簡単に言えば、ブレビバクテリウム（Brevibacteri
um）R 312 のゲノムＤＮＡを、クローニングに有用な部
位および特にpUC 系のプラスミドの多重クローニング部
位中に存在する部位に対応する幾つかの制限酵素で消化
した。特にPstI酵素を用いた。アガロースゲル上での電
気泳動およびナイロン膜上への移行の後、種々の消化物
をプローブsq 762およびsq 918とハイブリダイズせしめ
た。図４に与えた結果は、それら２つのプローブがハイ
ブリダイゼーション条件下での十分な特異性により特徴
付けられることを示す（各消化につき多くても１つの断
片がハイブリダイズする）。更に、２つのプローブがほ
ぼ同じハイブリダイゼーションプロフィールを得ること
を可能にする限り、ハイブリダイゼーションシグナルが
所望の遺伝子に非常に特異的であり、そしてトリプシン
加水分解後に得られる内部ペプチドがＮ末端に非常に近
いと考えられ得る。ハイブリダイゼーションブロット
は、特に、２つのプローブと強力にハイブリダイズする
約5.4 kbpのユニークなPstI断片の存在を示す。従っ
て、この断片をクローニングすることを決めた。これを
行うために、PstIでのブレビバクテリウム R 312の全ゲ
ノム消化から生じる約4.6 〜5 kbp および約6 〜6.5 kb
p のサイズの全断片をアガロース上で精製し、電気溶出
せしめ、次いで予めPstIで消化されているベクターpUC1
9 に連結せしめた。大腸菌株 DH5α中に形質転換せしめ
た後、理論上組換え微生物に相当する500 個の白色コロ
ニーをX-gal 培地上で得た。それらのコロニーを個々に
継代培養し、ナイロン膜上に移行し、そして32Ｐ−標識
プローブsq 918とのハイブリダイゼーションにより分析
した。こうして該プローブと強力にハイブリダイズする
ものとして２つのクローンを同定し、単離し、そしてク
ローニングを続けるために保持した。
【００３９】それらの２つのクローンから単離された２
つの組換えプラスミドpXL1650 とpXL1651 を種々の方
法、即ち制限マッピング、配列決定用プライマーとして
該プローブを使った部分配列決定、およびサザンブロッ
ティングにより分析した。図４に示した結果は、２つの
プラスミドが両方向で約5.4 kbp の同じPstI挿入断片を
含むことを示す。図５はこの断片の制限地図を示す。そ
れらの２つのプラスミドは実際に、特徴付けられたペプ
チドをコードする断片を含み、トリプシン断片はＮ末端
の隣にくる（図８〜１１）。更に、それらの結果は、ブ
レビバクテリウムR 312の鏡像選択性アミダーゼをコー
ドする遺伝子が約2.4 kbp のBamHI-PstI断片上に存在
し、BamHI からPstI方向に向いていることを示す。コー
ド配列の５′末端の位置を仮定すればそして該酵素が多
くても2 kbp （評価法によって57〜63KD の単量体）に
よりコードされるという所見において、完全遺伝子がBa
mHI-PstI断片上に含まれることは確かであり、従って該
断片の配列決定を行った。
つの組換えプラスミドpXL1650 とpXL1651 を種々の方
法、即ち制限マッピング、配列決定用プライマーとして
該プローブを使った部分配列決定、およびサザンブロッ
ティングにより分析した。図４に示した結果は、２つの
プラスミドが両方向で約5.4 kbp の同じPstI挿入断片を
含むことを示す。図５はこの断片の制限地図を示す。そ
れらの２つのプラスミドは実際に、特徴付けられたペプ
チドをコードする断片を含み、トリプシン断片はＮ末端
の隣にくる（図８〜１１）。更に、それらの結果は、ブ
レビバクテリウムR 312の鏡像選択性アミダーゼをコー
ドする遺伝子が約2.4 kbp のBamHI-PstI断片上に存在
し、BamHI からPstI方向に向いていることを示す。コー
ド配列の５′末端の位置を仮定すればそして該酵素が多
くても2 kbp （評価法によって57〜63KD の単量体）に
よりコードされるという所見において、完全遺伝子がBa
mHI-PstI断片上に含まれることは確かであり、従って該
断片の配列決定を行った。
【００４０】実施例３─ブレビバクテリウム R 312の鏡
像選択性アミダーゼ遺伝子を含むBamHI-PstI断片の配列BamH I-PstI断片についての配列決定方法を図６に示す。
種々の配列は全て、小断片を含む組換えM13 の一本鎖鋳
型上で、またはプラスミドpXL1650 上で直接に、チェー
ンターミネーション法〔７−デアザdGTPの存在下でのシ
ークエナーゼキット； (35S)dATP〕により得られた。こ
のために幾つかの特異的ぷらいまーを合成した。得られ
た配列の平均ＧＣ含量は61.5％である。得られた転写解
読枠の分析を図７に示す。この図は、アミダーゼのＮ末
端に相当する転写解読枠が54,671の分子量に相当する51
2 アミノ酸をコードすることを示す。この転写解読枠に
おいては、ＧＣ含量が１番目、２番目および３番目のコ
ドンの位置においてそれぞれ65.8、52.5および70％であ
ることが認められ、これはＧＣ含量に富む微生物のコー
ド配列において特徴的な分布である。BamHI-PstI断片の
完全配列を図８〜１１に与える。
像選択性アミダーゼ遺伝子を含むBamHI-PstI断片の配列BamH I-PstI断片についての配列決定方法を図６に示す。
種々の配列は全て、小断片を含む組換えM13 の一本鎖鋳
型上で、またはプラスミドpXL1650 上で直接に、チェー
ンターミネーション法〔７−デアザdGTPの存在下でのシ
ークエナーゼキット； (35S)dATP〕により得られた。こ
のために幾つかの特異的ぷらいまーを合成した。得られ
た配列の平均ＧＣ含量は61.5％である。得られた転写解
読枠の分析を図７に示す。この図は、アミダーゼのＮ末
端に相当する転写解読枠が54,671の分子量に相当する51
2 アミノ酸をコードすることを示す。この転写解読枠に
おいては、ＧＣ含量が１番目、２番目および３番目のコ
ドンの位置においてそれぞれ65.8、52.5および70％であ
ることが認められ、これはＧＣ含量に富む微生物のコー
ド配列において特徴的な分布である。BamHI-PstI断片の
完全配列を図８〜１１に与える。
【００４１】実施例４─大腸菌（E.coli）中でのブレビ
バクテリウム R 312の鏡像選択性アミダーゼ遺伝子の発
現 4.1.─プラスミドの作製 ラムダファージcII 遺伝子と相同であるかまたはそれに
由来するリボソーム結合部位を含むアミダーゼ構造遺伝
子が、本来のプロモーター、トリプトファンオペロンプ
ロモーターまたは熱感受性ラムダファージ右プロモータ
ーの支配下に置かれている幾つかの構成物を調製した。
ブレビバクテリウム（Brevibacterium）R 312 の全ゲノ
ムＤＮＡのPstI消化から生じる5.4 kbp 断片をプラスミ
ドpUC19のユニークPstI部位に挿入することにより、プ
ラスミドpXL1650 （図４）を得た。従って、このプラス
ミドはラクトースオペロンプロモーターPlac、次にリボ
ソーム結合部位およびブレビバクテリウム（Brevibacte
rium）R 312 の鏡像選択性アミダーゼ構造遺伝子、並び
にアンピシリン耐性遺伝子を含む。
バクテリウム R 312の鏡像選択性アミダーゼ遺伝子の発
現 4.1.─プラスミドの作製 ラムダファージcII 遺伝子と相同であるかまたはそれに
由来するリボソーム結合部位を含むアミダーゼ構造遺伝
子が、本来のプロモーター、トリプトファンオペロンプ
ロモーターまたは熱感受性ラムダファージ右プロモータ
ーの支配下に置かれている幾つかの構成物を調製した。
ブレビバクテリウム（Brevibacterium）R 312 の全ゲノ
ムＤＮＡのPstI消化から生じる5.4 kbp 断片をプラスミ
ドpUC19のユニークPstI部位に挿入することにより、プ
ラスミドpXL1650 （図４）を得た。従って、このプラス
ミドはラクトースオペロンプロモーターPlac、次にリボ
ソーム結合部位およびブレビバクテリウム（Brevibacte
rium）R 312 の鏡像選択性アミダーゼ構造遺伝子、並び
にアンピシリン耐性遺伝子を含む。
【００４２】プラスミドpXL1724 （図１２）は、BamHI
酵素での5.4 kbp 断片の処理により切除された2.26 kbp
BamHI-PstI断片を、トリプトファンオペロンプロモー
ターを含むベクター中に挿入することにより得た。この
断片は、リボソーム結合部位を担持しているＡＴＧコド
ンの上流の58塩基対によって前置きされているブレビバ
クテリウム（Brevibacterium）R 312 の鏡像選択性アミ
ダーゼの完全遺伝子を含む。ブレビバクテリウム（Brev
ibacterium）R 312 の鏡像選択性アミダーゼ構造遺伝子
が異種プロモーターと異種リボソーム結合部位の支配下
に置かれている別の２つの構成物を調製した。それらの
プラスミド（pXL1751 とpXL1752 ）は次のようにして調
製した。
酵素での5.4 kbp 断片の処理により切除された2.26 kbp
BamHI-PstI断片を、トリプトファンオペロンプロモー
ターを含むベクター中に挿入することにより得た。この
断片は、リボソーム結合部位を担持しているＡＴＧコド
ンの上流の58塩基対によって前置きされているブレビバ
クテリウム（Brevibacterium）R 312 の鏡像選択性アミ
ダーゼの完全遺伝子を含む。ブレビバクテリウム（Brev
ibacterium）R 312 の鏡像選択性アミダーゼ構造遺伝子
が異種プロモーターと異種リボソーム結合部位の支配下
に置かれている別の２つの構成物を調製した。それらの
プラスミド（pXL1751 とpXL1752 ）は次のようにして調
製した。
【００４３】該アミダーゼ構造遺伝子の上流に位置する
ＡＴＧコドンの代わりにNdeI開裂部位CATATGを導入する
ために、ＰＣＲ法によりプラスミドpXL1724 を突然変異
誘発せしめた。ＡＴＧ開始コドンとハイブリダイズする
NdeI開裂部位に相当するプライマー、およびＡＴＧコド
ンの数塩基対下流にあるXhoI開裂部位に相当するプライ
マーを使って、増幅を行った。次いで２種の酵素NdeIお
よびXhoIでの開裂により、増幅断片を切り出した。
ＡＴＧコドンの代わりにNdeI開裂部位CATATGを導入する
ために、ＰＣＲ法によりプラスミドpXL1724 を突然変異
誘発せしめた。ＡＴＧ開始コドンとハイブリダイズする
NdeI開裂部位に相当するプライマー、およびＡＴＧコド
ンの数塩基対下流にあるXhoI開裂部位に相当するプライ
マーを使って、増幅を行った。次いで２種の酵素NdeIお
よびXhoIでの開裂により、増幅断片を切り出した。
【００４４】プロモーターPtrpの使用：プロモーターPt
rpとラムダcII 遺伝子のリボソーム結合部位を含み、タ
ーミネーター配列tR1 およびアミダーゼ構造遺伝子の
５′領域を含まないEcoRI-NdeI断片を、EcoRI とXhoIで
開環したプラスミドpXL1724 中に挿入し、プラスミド p
XL1751（図１３）を作製した。 プロモーター PR cItsの使用：同じ方策を使ったが、こ
の場合にはプロモーター PR cItsとラムダcII 遺伝子の
リボソーム結合部位を含むプラスミドpXL820のEcoRI-Nd
eI断片を用いた。プラスミド pXL1752（図１４）を得
た。
rpとラムダcII 遺伝子のリボソーム結合部位を含み、タ
ーミネーター配列tR1 およびアミダーゼ構造遺伝子の
５′領域を含まないEcoRI-NdeI断片を、EcoRI とXhoIで
開環したプラスミドpXL1724 中に挿入し、プラスミド p
XL1751（図１３）を作製した。 プロモーター PR cItsの使用：同じ方策を使ったが、こ
の場合にはプロモーター PR cItsとラムダcII 遺伝子の
リボソーム結合部位を含むプラスミドpXL820のEcoRI-Nd
eI断片を用いた。プラスミド pXL1752（図１４）を得
た。
【００４５】4.2.─coli BおよびE103S 中でのブレビバ
クテリウム R 312アミダーゼの発現 プラスミド pXL1751および pXL1752を用いて、塩化カル
シウム法によりcoli BおよびE103S 株をそれぞれ形質転
換せしめた。アンピシリン培地上で組換え微生物を選択
した。ブレビバクテリウム（Brevibacterium）R 312 の
鏡像選択性アミダーゼの発現は、細胞の超音波処理後、
粗分画のSDS-PAGEにより、または遠心分離後の残渣と上
清のSDS-PAGEにより、測定した。結果は図13に与えら
れ、これは全タンパク質の20％までを表すアミダーゼの
高レベル発現を示す。
クテリウム R 312アミダーゼの発現 プラスミド pXL1751および pXL1752を用いて、塩化カル
シウム法によりcoli BおよびE103S 株をそれぞれ形質転
換せしめた。アンピシリン培地上で組換え微生物を選択
した。ブレビバクテリウム（Brevibacterium）R 312 の
鏡像選択性アミダーゼの発現は、細胞の超音波処理後、
粗分画のSDS-PAGEにより、または遠心分離後の残渣と上
清のSDS-PAGEにより、測定した。結果は図13に与えら
れ、これは全タンパク質の20％までを表すアミダーゼの
高レベル発現を示す。
【００４６】実施例５─ロドコッカス（rhodococcus ）
の鏡像選択性アミダーゼの精製 Ｉ．酵素活性のアッセイ 活性を有する分画を、5mM DTT と18.1mM ２−フェニル
プロピオンアミドを含む0.1M Tris/HCl 緩衝液(pH 7.5)
500μl 中で30℃にて30分間インキュベートする。イン
キュベーション後、2 mlのアセトニトリル／1N HCl混合
物(90/10) 、次いで2 mlの50mM H3PO4/CH3CN混合物(75/
25) をインキュベーション混合物に添加する。5,000 g
で10分間遠心した後、反応生成物のアッセイのため上清
のアリコートをHPLC装置に注入する。 ──カラム : Nucleosil 5-C18 25cm ──溶離液 : 50mM H3PO4/CH3CN 混合物(75/25) ──注入量 : 10 μl ──流速 : 1 ml/分 １活性単位は、１時間あたり１μモルの２−フェニルプ
ロピオンアミドを加水分解するのに必要とする酵素の量
として定義される。
の鏡像選択性アミダーゼの精製 Ｉ．酵素活性のアッセイ 活性を有する分画を、5mM DTT と18.1mM ２−フェニル
プロピオンアミドを含む0.1M Tris/HCl 緩衝液(pH 7.5)
500μl 中で30℃にて30分間インキュベートする。イン
キュベーション後、2 mlのアセトニトリル／1N HCl混合
物(90/10) 、次いで2 mlの50mM H3PO4/CH3CN混合物(75/
25) をインキュベーション混合物に添加する。5,000 g
で10分間遠心した後、反応生成物のアッセイのため上清
のアリコートをHPLC装置に注入する。 ──カラム : Nucleosil 5-C18 25cm ──溶離液 : 50mM H3PO4/CH3CN 混合物(75/25) ──注入量 : 10 μl ──流速 : 1 ml/分 １活性単位は、１時間あたり１μモルの２−フェニルプ
ロピオンアミドを加水分解するのに必要とする酵素の量
として定義される。
【００４７】II. 精製プロトコール １．酵素抽出物の調製 15 ml の0.1M Tris/HCl 緩衝液(pH 7.5), 5mM DTT 中に
7 g の細胞を懸濁し、４℃にて15分間超音波処理により
破壊する。50,000 gで１時間の遠心により粗酵素抽出物
を回収する。
7 g の細胞を懸濁し、４℃にて15分間超音波処理により
破壊する。50,000 gで１時間の遠心により粗酵素抽出物
を回収する。
【００４８】２．第一のイオン交換クロマトグラフィー この粗抽出物（20ml）に20 ml の緩衝液Ａ（25mM Tris/
HCl, pH 7.5, 5mM DTT）を添加する。緩衝液Ａで平衡化
されたMono Q HR 10/10 カラム(Pharmacia) に3 ml/ 分
の流速で試料を注入する。カラムを洗浄した後、１時間
に渡る直線KCl勾配(0-1 M) によりタンパク質を 3 ml/
分において溶出せしめる。6 mlの分画を収集する。アミ
ダーゼは約0.3M KClのところで18 ml に渡り溶出する。
HCl, pH 7.5, 5mM DTT）を添加する。緩衝液Ａで平衡化
されたMono Q HR 10/10 カラム(Pharmacia) に3 ml/ 分
の流速で試料を注入する。カラムを洗浄した後、１時間
に渡る直線KCl勾配(0-1 M) によりタンパク質を 3 ml/
分において溶出せしめる。6 mlの分画を収集する。アミ
ダーゼは約0.3M KClのところで18 ml に渡り溶出する。
【００４９】３．第二のイオン交換クロマトグラフィー 活性を有する分画をプールし、Centriprep限外濾過装置
(Amicon)を使って2 mlに濃縮する。6 mlの緩衝液Ａで希
釈した後、この試料4 mlを緩衝液Ａで平衡化されたMono
Q HR 5/5 カラム上に 1 ml/分で注入する。緩衝液Ａ中
の直線KCl 勾配(0-0.5 M) によりタンパク質を溶出せし
める。分画をプールし、そして試料を15％（容量／容
量）グリセロール濃度に調整し、最後に上述したように
して1 mlに濃縮する。
(Amicon)を使って2 mlに濃縮する。6 mlの緩衝液Ａで希
釈した後、この試料4 mlを緩衝液Ａで平衡化されたMono
Q HR 5/5 カラム上に 1 ml/分で注入する。緩衝液Ａ中
の直線KCl 勾配(0-0.5 M) によりタンパク質を溶出せし
める。分画をプールし、そして試料を15％（容量／容
量）グリセロール濃度に調整し、最後に上述したように
して1 mlに濃縮する。
【００５０】４．疎水性クロマトグラフィー 試料に1 mlの緩衝液 0.1M Tris/HCl, pH 7.5, 0.5mM DT
T, 1.7M (NH4)2SO4 （緩衝液Ｂ）を添加し、次いでこれ
を0.25 ml/分の速度でフェニル-Superose HR 5/5カラム
(Pharmacia) 上に注入する（２回に分けて）。25 ml に
渡り減少する直線(NH4)2SO4 勾配(1.7M-0M) により 0.5
ml/分にてタンパク質を溶出せしめる。0.5 mlの分画を
収集する。活性分画を15％グリセロール濃度に調整し、
次いで1mlの緩衝液Ａで希釈する。
T, 1.7M (NH4)2SO4 （緩衝液Ｂ）を添加し、次いでこれ
を0.25 ml/分の速度でフェニル-Superose HR 5/5カラム
(Pharmacia) 上に注入する（２回に分けて）。25 ml に
渡り減少する直線(NH4)2SO4 勾配(1.7M-0M) により 0.5
ml/分にてタンパク質を溶出せしめる。0.5 mlの分画を
収集する。活性分画を15％グリセロール濃度に調整し、
次いで1mlの緩衝液Ａで希釈する。
【００５１】５．ヒドロキシアパタイト上でのクロマト
グラフィー 緩衝液 85mM Tris/HCl, pH 7.5, 0.5mM DTT, 10 μM Ca
Cl2, 15%グリセロール（緩衝液Ｃ）で平衡化されたBio-
Gel HPHTカラム(Bio-Rad) 上に 0.5 ml/分の速度で試料
を注入する。20分間に渡る緩衝液Ｃ中 0−100 ％の緩衝
液 0.35Mリン酸カリウム, pH 7.5, 0.5mM DTT, 10 μM
CaCl2, 15%グリセロールの直線勾配により、 0.5 ml/分
の速度でアミダーゼを溶出せしめる。
グラフィー 緩衝液 85mM Tris/HCl, pH 7.5, 0.5mM DTT, 10 μM Ca
Cl2, 15%グリセロール（緩衝液Ｃ）で平衡化されたBio-
Gel HPHTカラム(Bio-Rad) 上に 0.5 ml/分の速度で試料
を注入する。20分間に渡る緩衝液Ｃ中 0−100 ％の緩衝
液 0.35Mリン酸カリウム, pH 7.5, 0.5mM DTT, 10 μM
CaCl2, 15%グリセロールの直線勾配により、 0.5 ml/分
の速度でアミダーゼを溶出せしめる。
【００５２】それらの種々の工程は、988 U/mgタンパク
質の比活性を有する均質に精製された酵素を得ることを
可能にする。ブレビバクテリウム（Brevibacterium）R
312 と同様に、得られた酵素は53 KD ±2 KDの見かけ分
子量を有する同一サブユニットの二量体のようにふるま
う。
質の比活性を有する均質に精製された酵素を得ることを
可能にする。ブレビバクテリウム（Brevibacterium）R
312 と同様に、得られた酵素は53 KD ±2 KDの見かけ分
子量を有する同一サブユニットの二量体のようにふるま
う。
【００５３】実施例６−例５で得られたアミダーゼの遺
伝子のクローニング ＴＳＫ−Ｇ３０００ＳＷ上での追加の精製段階の後、酵
素を配列決定操作にゆだねた。Ｎ−末端はエドマンの化
学に許容されないので、トリプシンによる完全な加水分
解を実施し、そして加水分解物の３種のＨＰＬＣ画分−
１２３，１２４及び１６２が、明白な配列を獲得を可能
にするペプチドを付与した。８〜１６個のオリゴヌクレ
オチドの混合物に対応する次の３種の３２−マ−ヌクレ
オチドプローブ（個々は少なくとも３層の劣化位置に７
個のイノシンを含む）を、これらのデータに基づいて合
成した：
伝子のクローニング ＴＳＫ−Ｇ３０００ＳＷ上での追加の精製段階の後、酵
素を配列決定操作にゆだねた。Ｎ−末端はエドマンの化
学に許容されないので、トリプシンによる完全な加水分
解を実施し、そして加水分解物の３種のＨＰＬＣ画分−
１２３，１２４及び１６２が、明白な配列を獲得を可能
にするペプチドを付与した。８〜１６個のオリゴヌクレ
オチドの混合物に対応する次の３種の３２−マ−ヌクレ
オチドプローブ（個々は少なくとも３層の劣化位置に７
個のイノシンを含む）を、これらのデータに基づいて合
成した：
【配列表１】
【配列表２】
【配列表３】
【００５４】次に、５′末端で32Ｐ−ラベルされたこれ
らのプローブの効能を、次の制限酵素：ＳｓｔＩ，Ｓｐ
ｈＩ，ＳｍａＩ，ＰｓｔＩ，ＫｐｎＩ，ＥｃｏＲＩ，Ｓ
ａｌＩ及びＢａｍＨＩの１つにより前もって消化された
ロドコーカスのゲノムＤＮＡ上へのサザントランスファ
ーにより試験した。実験条件は次の通りであった：ハイ
ブリダイゼーション緩衝液：５×ＳＳＣ，５×Ｄｅｎｈ
ａｒｄｔ，０．１％ＳＤＳ，５０mMのＮａ3 ＰＯ4 ，pH
６．５，２５０μｇ／mlのｓｓＤＮＡ；ハイブリダイゼ
ーション温度：５０又は５５℃（２回の実験）；洗浄条
件：１時間、６×ＳＳＣ、室温及び５分、２×ＳＳＣ，
０．１％ＳＤＳ，５０℃。
らのプローブの効能を、次の制限酵素：ＳｓｔＩ，Ｓｐ
ｈＩ，ＳｍａＩ，ＰｓｔＩ，ＫｐｎＩ，ＥｃｏＲＩ，Ｓ
ａｌＩ及びＢａｍＨＩの１つにより前もって消化された
ロドコーカスのゲノムＤＮＡ上へのサザントランスファ
ーにより試験した。実験条件は次の通りであった：ハイ
ブリダイゼーション緩衝液：５×ＳＳＣ，５×Ｄｅｎｈ
ａｒｄｔ，０．１％ＳＤＳ，５０mMのＮａ3 ＰＯ4 ，pH
６．５，２５０μｇ／mlのｓｓＤＮＡ；ハイブリダイゼ
ーション温度：５０又は５５℃（２回の実験）；洗浄条
件：１時間、６×ＳＳＣ、室温及び５分、２×ＳＳＣ，
０．１％ＳＤＳ，５０℃。
【００５５】これらの条件下で、プローブＡは、強く且
つ明白なシグナルの獲得を可能にし；特に、ＢａｍＨ
Ｉ，ＫｐｎＩ，ＳｐｈＩ，ＳｓｔＩ，ＳｍａＩ，Ｓａｌ
Ｉ及びＰｓｔＩによる消化の場合、約３．２kbのＰｓｔ
Ｉゲムノフラグメントに対応する、Ａと強くハイブリダ
イズした単一ゲノムバンドが見出された。
つ明白なシグナルの獲得を可能にし；特に、ＢａｍＨ
Ｉ，ＫｐｎＩ，ＳｐｈＩ，ＳｓｔＩ，ＳｍａＩ，Ｓａｌ
Ｉ及びＰｓｔＩによる消化の場合、約３．２kbのＰｓｔ
Ｉゲムノフラグメントに対応する、Ａと強くハイブリダ
イズした単一ゲノムバンドが見出された。
【００５６】ゲノムＤＮＡのＰｓｔＩ消化からの３〜４
kbのフラグメントを、アガロース上での分離用電気泳動
及びエレクトロエリューションにより精製し、そして次
に、ＰｓｔＩによりそれ自体消化されたプラスミドｐＵ
Ｃ１９に連結した。ＤＨ５α株における形質転換の後、
ＬＢＡｍｐＸ−ｇａｌ上での６００個の白色クローンを
個々に継代培養し、そしてサザン分析に使用される条件
に類似する緊縮条件下でプローブＡとのコロニーハイブ
リダイゼーションによりプローブした。次に、特に強い
ハイブリダイゼーションを付与する９個のクローンを、
プラスミドＤＮＡの制限分析にゆだねた。両方向に同じ
約３．２kbのフラグメントを明確に挿入したこれらのク
ローンの６個のうち、両方向のそれぞれを示す２つのク
ローン（ｐＸＬ１８３５及びｐＸＬ１８３６）を、より
詳細に分析し（詳細な地図、サザン分析）、従って、所
望するフラグメント実際得られたことを確証した。
kbのフラグメントを、アガロース上での分離用電気泳動
及びエレクトロエリューションにより精製し、そして次
に、ＰｓｔＩによりそれ自体消化されたプラスミドｐＵ
Ｃ１９に連結した。ＤＨ５α株における形質転換の後、
ＬＢＡｍｐＸ−ｇａｌ上での６００個の白色クローンを
個々に継代培養し、そしてサザン分析に使用される条件
に類似する緊縮条件下でプローブＡとのコロニーハイブ
リダイゼーションによりプローブした。次に、特に強い
ハイブリダイゼーションを付与する９個のクローンを、
プラスミドＤＮＡの制限分析にゆだねた。両方向に同じ
約３．２kbのフラグメントを明確に挿入したこれらのク
ローンの６個のうち、両方向のそれぞれを示す２つのク
ローン（ｐＸＬ１８３５及びｐＸＬ１８３６）を、より
詳細に分析し（詳細な地図、サザン分析）、従って、所
望するフラグメント実際得られたことを確証した。
【００５７】実施例７−３．２kbのＰｓｔＩフラグメン
トの配列 ３．２kbのＰｓｔＩフラグメントの完全なヌクレオチド
配列を、両鎖上で決定した（図１６〜１８を参照のこ
と）。このフラグメントのＧＣ含有率は６２．４％であ
り、すなわちそれは、Ｒ３１２の場合に観察される含有
率と同じ程度である（約６２％）。得られた配列の分析
は、トリプシンフラグメントを配列決定することによっ
て得られた３種のペプチド配列を含む４６２残基のポリ
ペプチド（ｍｗ４８，５５４）をコードする１３８６個
のヌクレオチド（位置２１０〜１５９５）の読み取り枠
の特徴化を可能にした。
トの配列 ３．２kbのＰｓｔＩフラグメントの完全なヌクレオチド
配列を、両鎖上で決定した（図１６〜１８を参照のこ
と）。このフラグメントのＧＣ含有率は６２．４％であ
り、すなわちそれは、Ｒ３１２の場合に観察される含有
率と同じ程度である（約６２％）。得られた配列の分析
は、トリプシンフラグメントを配列決定することによっ
て得られた３種のペプチド配列を含む４６２残基のポリ
ペプチド（ｍｗ４８，５５４）をコードする１３８６個
のヌクレオチド（位置２１０〜１５９５）の読み取り枠
の特徴化を可能にした。
【００５８】この読み取り枠は、所望する鏡像選択性ア
ミダーゼの構造遺伝子を表わす。実施例８ −種々のアミダーゼ間の相同：アミダーゼ活性
の特徴的配列の同定
ミダーゼの構造遺伝子を表わす。実施例８ −種々のアミダーゼ間の相同：アミダーゼ活性
の特徴的配列の同定
【００５９】まず最初に、Ｒ３１２の鏡像選択性アミダ
ーゼのペプチド配列と図１６〜１８に示される配列とを
比較した。図２０は、２種のタンパク質が、Ｒ３１２の
残基１５０〜３００の間で、配列の２／３で特に相同で
ある（５０％の正確な同一性）ことを示し、その相同性
は１５８〜２１５領域で６７％である。
ーゼのペプチド配列と図１６〜１８に示される配列とを
比較した。図２０は、２種のタンパク質が、Ｒ３１２の
残基１５０〜３００の間で、配列の２／３で特に相同で
ある（５０％の正確な同一性）ことを示し、その相同性
は１５８〜２１５領域で６７％である。
【００６０】ＧＥＮＰＲＯバンクにおける相同配列につ
いての調査をまた行なった。この調査は、アスペルギラ
ス ニジランス（Aspergillus nidulans）のアセトアミ
ダーゼ、ペソイドモナス シリンガエ（Pseudomonas sy
ringae）及びブラジリヒゾビウム ジポニカム（Bradyr
hizobium zaponicum）のインドールアセトアミドヒドロ
ラーゼ、アグロバクテリウム ツメファシエンス（Agro
bacterium tumefaciens)のタンパク質ｔｍｓ２及びフラ
ボバクテリウムｓｐ．（Flavobacterium sp.）Ｋ１７２
及びプソイドモナスｓｐ．ＮＫ８７の６−アミノヘキサ
ノエート環状二量体ヒドロ塩基（ＡＣＤＨ）の配列との
１５０〜２００領域における実質的な相同性を示す（特
に図２１を参照のこと）。
いての調査をまた行なった。この調査は、アスペルギラ
ス ニジランス（Aspergillus nidulans）のアセトアミ
ダーゼ、ペソイドモナス シリンガエ（Pseudomonas sy
ringae）及びブラジリヒゾビウム ジポニカム（Bradyr
hizobium zaponicum）のインドールアセトアミドヒドロ
ラーゼ、アグロバクテリウム ツメファシエンス（Agro
bacterium tumefaciens)のタンパク質ｔｍｓ２及びフラ
ボバクテリウムｓｐ．（Flavobacterium sp.）Ｋ１７２
及びプソイドモナスｓｐ．ＮＫ８７の６−アミノヘキサ
ノエート環状二量体ヒドロ塩基（ＡＣＤＨ）の配列との
１５０〜２００領域における実質的な相同性を示す（特
に図２１を参照のこと）。
【００６１】これらの他の酵素のそれぞれの部位と本発
明に記載されるアミダーゼのペプチド１３７−１９３と
の相同性（アミノ酸の％同一性）が、下記に与えられ
る： 高い保存性であるこの領域は、たぶんこれらの酵素の活
性を担当する。
明に記載されるアミダーゼのペプチド１３７−１９３と
の相同性（アミノ酸の％同一性）が、下記に与えられ
る： 高い保存性であるこの領域は、たぶんこれらの酵素の活
性を担当する。
【００６２】実施例９−Ｅ．コリにおける鏡像選択性ア
ミダーゼの発現 鏡像選択性アミダーゼをコードする読み取り枠の同定を
確証するために、ＮｄｅＩ部位（ＣＡＴＡＴＧ）を、位
置２１０における推定上のＡＴＧでＰＣＲ方法により創
造し（図１９）、そしてアミダーゼをフードする部分の
みを含む、前記部位とＳａｌＩ部位（位置１６８３）と
の間のフラグメントを、Ｅ．コリにおいて転写（プロモ
ーターＰｔｒｐ又はＰR ）及び翻訳（ＲＢＳｃII）を開
始するための効果的なシグナルの制御下に配置した。得
られたベクター、ｐＸＬ１８９３（Ｐｔｒｐ）及びｐＸ
Ｌ１８９４（ＰR ＣＩts）は、上記ベクターｐＸＬ１７
５２及びｐＸＬ１７５１に類似し、Ｒ３１２のアミダー
ゼを発現する。これらの発現ベクターの一般的な構造
は、図２２に反復されている。プラスミドｐＸＬ１８９
３及びｐＸＬ１８９４からの発現を、それぞれＥ．コリ
株Ｂ及びＫ１２ Ｅ１０３Ｓにおいて研究した。ｐＸＬ
１８９４の場合において得られた結果が、図２４に示さ
れている。精製されたアミダーゼと同時移動するタンパ
ク質が、プラスミドｐＸＬ１８９４の存在下で４２℃で
特異的に生成される。
ミダーゼの発現 鏡像選択性アミダーゼをコードする読み取り枠の同定を
確証するために、ＮｄｅＩ部位（ＣＡＴＡＴＧ）を、位
置２１０における推定上のＡＴＧでＰＣＲ方法により創
造し（図１９）、そしてアミダーゼをフードする部分の
みを含む、前記部位とＳａｌＩ部位（位置１６８３）と
の間のフラグメントを、Ｅ．コリにおいて転写（プロモ
ーターＰｔｒｐ又はＰR ）及び翻訳（ＲＢＳｃII）を開
始するための効果的なシグナルの制御下に配置した。得
られたベクター、ｐＸＬ１８９３（Ｐｔｒｐ）及びｐＸ
Ｌ１８９４（ＰR ＣＩts）は、上記ベクターｐＸＬ１７
５２及びｐＸＬ１７５１に類似し、Ｒ３１２のアミダー
ゼを発現する。これらの発現ベクターの一般的な構造
は、図２２に反復されている。プラスミドｐＸＬ１８９
３及びｐＸＬ１８９４からの発現を、それぞれＥ．コリ
株Ｂ及びＫ１２ Ｅ１０３Ｓにおいて研究した。ｐＸＬ
１８９４の場合において得られた結果が、図２４に示さ
れている。精製されたアミダーゼと同時移動するタンパ
ク質が、プラスミドｐＸＬ１８９４の存在下で４２℃で
特異的に生成される。
【００６３】実施例１０−コリネバクテリアにおけるア
ミダーゼの発現 Ａ）発現ベクターの構成 これらのベクターは、コリネバクテリアにおけるベクタ
ーの複製から調製され、そして −Ｅ．コリのレプリコン、 −コリネバクテリウムのレプリコン、 −選択マーカー及び −Ａｍｄ配列 を含んで成る。 ・ベクターｐＳＶ７３（図１９）：このプラスミドは、
Ｅ．コリのレプリコン及びトランポソンＴｎ９０３に起
因する耐カナマイシン遺伝子を含むプラスミドｐＵＣ８
のフラグメントの挿入により、Ｃ．グルタミカム（C.gl
utamicum) のベクターｐＳＲ１（Yoshihama など.,J.Ba
cteriol., 162, 591(1985)) から誘導される。
ミダーゼの発現 Ａ）発現ベクターの構成 これらのベクターは、コリネバクテリアにおけるベクタ
ーの複製から調製され、そして −Ｅ．コリのレプリコン、 −コリネバクテリウムのレプリコン、 −選択マーカー及び −Ａｍｄ配列 を含んで成る。 ・ベクターｐＳＶ７３（図１９）：このプラスミドは、
Ｅ．コリのレプリコン及びトランポソンＴｎ９０３に起
因する耐カナマイシン遺伝子を含むプラスミドｐＵＣ８
のフラグメントの挿入により、Ｃ．グルタミカム（C.gl
utamicum) のベクターｐＳＲ１（Yoshihama など.,J.Ba
cteriol., 162, 591(1985)) から誘導される。
【００６４】このプラスミドを用いて、図１６〜１８及
び１９に与えられるＡｍｄ配列のための下記の種々のベ
クターを構成した： ・ベクターｐＹＧ８１１Ａ及びＢ（図２５）：これらの
ベクターは、図１４に与えられるＡｍｄ配列の両方向で
のＳａｌＩ部位でのクローニングによりベクターｐＳＶ
７３から誘導される； ・ベクターｐＹＧ８１７Ａ及びＢ（図２５）：これらの
ベクターは、図１６〜１８に与えられるＡｍｄ配列の両
方向でのＢｇｌII部位でのクローニングによりベクター
ｐＳＶ７３から誘導される； ・ベクターｐＹＧ８２２（図２０）：このベクターは、
図１６〜１８のＡｍｄ配列及びバクテリオファージλプ
ロモーターＰｔｒｐを含む発現カセットのＳａｌＩ−Ｂ
ｇｌII部位でのクローニングによりｐＳＶ７３から誘導
される。
び１９に与えられるＡｍｄ配列のための下記の種々のベ
クターを構成した： ・ベクターｐＹＧ８１１Ａ及びＢ（図２５）：これらの
ベクターは、図１４に与えられるＡｍｄ配列の両方向で
のＳａｌＩ部位でのクローニングによりベクターｐＳＶ
７３から誘導される； ・ベクターｐＹＧ８１７Ａ及びＢ（図２５）：これらの
ベクターは、図１６〜１８に与えられるＡｍｄ配列の両
方向でのＢｇｌII部位でのクローニングによりベクター
ｐＳＶ７３から誘導される； ・ベクターｐＹＧ８２２（図２０）：このベクターは、
図１６〜１８のＡｍｄ配列及びバクテリオファージλプ
ロモーターＰｔｒｐを含む発現カセットのＳａｌＩ−Ｂ
ｇｌII部位でのクローニングによりｐＳＶ７３から誘導
される。
【００６５】コリネバクテリアの他の隠れたプラスミド
をまた用いて、コリネバクタリアにおいてＡｍｄ配列の
発現のためのベクターを構成した。特に、Ｂ．ラクトフ
ェルメンタム（B.lactofermentum) から単離されたプラ
スミドｐＸ１８（Yoshihamaなど., op.cit.) が、シャ
トルベクターｐＹＧ８２０Ａ（この制限地図は図２４に
与えられる）の構成を可能にした。
をまた用いて、コリネバクタリアにおいてＡｍｄ配列の
発現のためのベクターを構成した。特に、Ｂ．ラクトフ
ェルメンタム（B.lactofermentum) から単離されたプラ
スミドｐＸ１８（Yoshihamaなど., op.cit.) が、シャ
トルベクターｐＹＧ８２０Ａ（この制限地図は図２４に
与えられる）の構成を可能にした。
【００６６】Ｂ）コリネバクテリアの形質転換 当業者に知られているすべての技法、特にYoshihama な
ど., op.cit.により記載されるプロトプラスト化−再生
技法が使用され得る。しかしながら、前記出願は、エレ
クトロポレーション技法が、形質転換頻度の１０００倍
までの上昇を可能にするので、ひじょうに好都合である
ことを示している。音波処理され、そして遠心分離され
た培養物の上清液のポリアクリルアミド−ＳＤＳにおけ
る分析は、形質転換体の存在を示す。
ど., op.cit.により記載されるプロトプラスト化−再生
技法が使用され得る。しかしながら、前記出願は、エレ
クトロポレーション技法が、形質転換頻度の１０００倍
までの上昇を可能にするので、ひじょうに好都合である
ことを示している。音波処理され、そして遠心分離され
た培養物の上清液のポリアクリルアミド−ＳＤＳにおけ
る分析は、形質転換体の存在を示す。
【００６７】実施例１１−酵素的分析 この例は、アジパミド又はアンモニウムアジパメートの
加水分解によるアジピン酸アンモニウムの合成におい
て、前記例で調製されたポリペプチド又は組換え微生物
の本発明に従っての使用を例示する。
加水分解によるアジピン酸アンモニウムの合成におい
て、前記例で調製されたポリペプチド又は組換え微生物
の本発明に従っての使用を例示する。
【００６８】Ａ）使用される菌株のための培養培地 １−天然の菌株のための； 培地１：ブレビバクテリウムＲ３１２のための ・グルコース １０ｇ／
Ｌ ・（ＮＨ4 ）2 ＳＯ4 ５ｇ／
Ｌ ・ＫＨ2 ＰＯ4 １．０１ｇ／
Ｌ ・Ｎａ2 ＨＰＯ4 ・１２Ｈ2 Ｏ １．６４ｇ／
Ｌ ・Ｋ2 ＨＰＯ4 ０．８２ｇ／
Ｌ ・ＣａＣｌ2 ・２Ｈ2 Ｏ ０．０１２ｇ／
Ｌ ・ＺｎＣｌ2 ０．００１２ｇ／
Ｌ ・ＦｅＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ ０．００１２ｇ／
Ｌ ・ＭｎＳＯ4 ・Ｈ2 Ｏ ０．００１２ｇ／
Ｌ ・ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ ０．５ｇ／
Ｌ ・チアミン塩酸塩 ０．００２ｇ／
Ｌ ・蒸留水
Ｌ ・（ＮＨ4 ）2 ＳＯ4 ５ｇ／
Ｌ ・ＫＨ2 ＰＯ4 １．０１ｇ／
Ｌ ・Ｎａ2 ＨＰＯ4 ・１２Ｈ2 Ｏ １．６４ｇ／
Ｌ ・Ｋ2 ＨＰＯ4 ０．８２ｇ／
Ｌ ・ＣａＣｌ2 ・２Ｈ2 Ｏ ０．０１２ｇ／
Ｌ ・ＺｎＣｌ2 ０．００１２ｇ／
Ｌ ・ＦｅＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ ０．００１２ｇ／
Ｌ ・ＭｎＳＯ4 ・Ｈ2 Ｏ ０．００１２ｇ／
Ｌ ・ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ ０．５ｇ／
Ｌ ・チアミン塩酸塩 ０．００２ｇ／
Ｌ ・蒸留水
【００６９】培地２：ロドコーカスのための ・グリセロール ５ｇ／
Ｌ ・酵母抽出物（Ｄｉｆｃｏ） １ｇ／
Ｌ ・牛肉抽出物（Ｄｉｆｃｏ） １ｇ／
Ｌ ・Ｋ2 ＨＰＯ4 ２ｇ／
Ｌ ・ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ ０．５ｇ／
Ｌ ・ＦｅＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ ２０mg／
Ｌ ・ＭｎＳＯ4 ・Ｈ2 Ｏ ２０mg／
Ｌ ・ＮａＣｌ １０mg／
Ｌ ・無機溶液* １０mg／
Ｌ ・ＮａＯＨ ｑ．ｓ．pH７．２ ・イソブチロニトリル ５ｇ／
Ｌ ＊無機溶液： ・ＣａＣｌ2 ・２Ｈ2 Ｏ ２００mg／
Ｌ ・Ｎａ2 ＭｏＯ4 ・２Ｈ2 Ｏ １５mg／
Ｌ ・ＺｎＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ ４mg／
Ｌ ・ＣｕＳＯ4 ・５Ｈ2 Ｏ ０．４mg／
Ｌ ・ＣｏＣｌ2 ・４Ｈ2 Ｏ ０．４mg／
Ｌ ・Ｈ2 ＢＯ3 ２０mg／
Ｌ ・ＫＩ １０mg／
Ｌ ・ＨＣｌ １０％ １０mg／
Ｌ
Ｌ ・酵母抽出物（Ｄｉｆｃｏ） １ｇ／
Ｌ ・牛肉抽出物（Ｄｉｆｃｏ） １ｇ／
Ｌ ・Ｋ2 ＨＰＯ4 ２ｇ／
Ｌ ・ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ ０．５ｇ／
Ｌ ・ＦｅＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ ２０mg／
Ｌ ・ＭｎＳＯ4 ・Ｈ2 Ｏ ２０mg／
Ｌ ・ＮａＣｌ １０mg／
Ｌ ・無機溶液* １０mg／
Ｌ ・ＮａＯＨ ｑ．ｓ．pH７．２ ・イソブチロニトリル ５ｇ／
Ｌ ＊無機溶液： ・ＣａＣｌ2 ・２Ｈ2 Ｏ ２００mg／
Ｌ ・Ｎａ2 ＭｏＯ4 ・２Ｈ2 Ｏ １５mg／
Ｌ ・ＺｎＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ ４mg／
Ｌ ・ＣｕＳＯ4 ・５Ｈ2 Ｏ ０．４mg／
Ｌ ・ＣｏＣｌ2 ・４Ｈ2 Ｏ ０．４mg／
Ｌ ・Ｈ2 ＢＯ3 ２０mg／
Ｌ ・ＫＩ １０mg／
Ｌ ・ＨＣｌ １０％ １０mg／
Ｌ
【００７０】２−組換え株のための： 培地３： ・ＮａＣｌ ５ｇ／
Ｌ ・Ｂａｃｔｏ−トリプトン １０ｇ／
Ｌ ・酵母抽出物 ５ｇ／
Ｌ ・イソブチロニトリル ５ｇ／
Ｌ ・カナマイシン １ｇ／
Ｌ
Ｌ ・Ｂａｃｔｏ−トリプトン １０ｇ／
Ｌ ・酵母抽出物 ５ｇ／
Ｌ ・イソブチロニトリル ５ｇ／
Ｌ ・カナマイシン １ｇ／
Ｌ
【００７１】培地４： ・ＮａＣｌ ５ｇ／
Ｌ ・Ｂａｃｔｏ−トリプトン １０ｇ／
Ｌ ・酵母抽出物 ５ｇ／
Ｌ ・イソブチロニトリル ２．５ｇ／
Ｌ ・イソブチルアミド ２．５ｇ／
Ｌ ・カナマイシン ２０mg／
Ｌ
Ｌ ・Ｂａｃｔｏ−トリプトン １０ｇ／
Ｌ ・酵母抽出物 ５ｇ／
Ｌ ・イソブチロニトリル ２．５ｇ／
Ｌ ・イソブチルアミド ２．５ｇ／
Ｌ ・カナマイシン ２０mg／
Ｌ
【００７２】培地５： ・Ｎａ2 ＨＰＯ4 ７ｇ／
Ｌ ・ＫＨ2 ＰＯ4 ３ｇ／
Ｌ ・ＮａＣｌ ０．５ｇ／
Ｌ ・ＮＨ4 Ｃｌ １ｇ／
Ｌ ・チアミン塩酸塩 ０．０１ｇ／
Ｌ ・グルコース ４ｇ／
Ｌ ・ＭｇＳＯ4 １mM ・ＣａＣｌ2 ０．１mM ・アンピシリン １００μｇ
／mL
Ｌ ・ＫＨ2 ＰＯ4 ３ｇ／
Ｌ ・ＮａＣｌ ０．５ｇ／
Ｌ ・ＮＨ4 Ｃｌ １ｇ／
Ｌ ・チアミン塩酸塩 ０．０１ｇ／
Ｌ ・グルコース ４ｇ／
Ｌ ・ＭｇＳＯ4 １mM ・ＣａＣｌ2 ０．１mM ・アンピシリン １００μｇ
／mL
【００７３】培地６： ・培地５ ・トリプトファン ４０mg／
Ｌ
Ｌ
【００７４】Ｂ）細胞残留物の調製 種々の菌株の培養を、培地６００mlを充填された２Ｌの
円錐フラスコ中で３０℃で、振盪台（１５０の振動／
分）上で行なう。培養が終った場合、細胞を収穫し、等
張溶液により洗浄し、Eppendorf 管に分け、そして使用
されるまで−１８℃で維持する。培地及び試験される培
養物の特徴が下記表１に示される。
円錐フラスコ中で３０℃で、振盪台（１５０の振動／
分）上で行なう。培養が終った場合、細胞を収穫し、等
張溶液により洗浄し、Eppendorf 管に分け、そして使用
されるまで−１８℃で維持する。培地及び試験される培
養物の特徴が下記表１に示される。
【００７５】Ｃ）アミダーゼ活性の測定 方法は次の通りである：アジパミド又はアンモニウムア
ジパメート、細胞懸濁液及び５０mMのリン酸カリウム緩
衝液（pH７．０）を、攪拌器を備えたフラスコ中に導入
する。
ジパメート、細胞懸濁液及び５０mMのリン酸カリウム緩
衝液（pH７．０）を、攪拌器を備えたフラスコ中に導入
する。
【００７６】栓をされたフラスコを、２５℃で温度調節
された結晶皿に置き、そしてその反応を十分に攪拌す
る。次に、反応媒体を、０．１Ｎの塩酸により希釈す
る。細菌及び細胞残骸を、遠心分離、続く濾過（０．４
５μｍ）により除去する。
された結晶皿に置き、そしてその反応を十分に攪拌す
る。次に、反応媒体を、０．１Ｎの塩酸により希釈す
る。細菌及び細胞残骸を、遠心分離、続く濾過（０．４
５μｍ）により除去する。
【００７７】アジピン酸、アジパミド及び／又はアジポ
アミド酸の点での組成を、ＨＰＬＣにより決定する。得
られる結果及び使用される量は下記表２に示される。 下記表における略語： Ｗ＝完全な細胞 Ｓ＝音波処理された細胞 ＩＢＮ＝イソブチロニトリル ＩＢＡｍ＝イソブチルアミド ＮＭＡ＝Ｎ−メチルアセトアミド Ｔｈｐ＝トリプトファン −＝ナシ
アミド酸の点での組成を、ＨＰＬＣにより決定する。得
られる結果及び使用される量は下記表２に示される。 下記表における略語： Ｗ＝完全な細胞 Ｓ＝音波処理された細胞 ＩＢＮ＝イソブチロニトリル ＩＢＡｍ＝イソブチルアミド ＮＭＡ＝Ｎ−メチルアセトアミド Ｔｈｐ＝トリプトファン −＝ナシ
【００７８】
【表１】
【００７９】
【表２】
【００８０】
【表３】
【００８１】さらに、ブレビバクテリウムＲ３１２の鏡
像選択性アミダーゼの精製の種々の段階を下記表３に示
す：
像選択性アミダーゼの精製の種々の段階を下記表３に示
す：
【表４】 ａ−ストレプトマイシンスルフェートによる沈殿の後、
湿潤細胞４０ｇから。ｂ−１単位（Ｕ）は、下記条件下
で１時間当たりに形成されるＨＰＰＡｃｉｄ／μモルに
等しい。
湿潤細胞４０ｇから。ｂ−１単位（Ｕ）は、下記条件下
で１時間当たりに形成されるＨＰＰＡｃｉｄ／μモルに
等しい。
【図１】（ａ）ブレビバクテリウムＲ３１２の精製溶液
から得られたペプチド配列（Ｎ−末端及び内部）を示
す。 （ｂ）内部フラグメントから生成されたオリゴヌクレオ
チドプローブを示す。
から得られたペプチド配列（Ｎ−末端及び内部）を示
す。 （ｂ）内部フラグメントから生成されたオリゴヌクレオ
チドプローブを示す。
【図２】（ａ）Ｎ−末端フラグメントからのプローブｓ
ｑ９１８の調製手段を示す。 （ｂ）得られたプローブｓｑ９１８を示す。
ｑ９１８の調製手段を示す。 （ｂ）得られたプローブｓｑ９１８を示す。
【図３】（ａ）酵素ＥｃｏＲＩ，ＨｉｎｄIII ，Ｋｐｎ
Ｉ，ＰｓｔＩ及びＳｐｈＩにより消化されたブレビバク
テリウムＲ３１２の全体のゲノムＤＮＡとのプローブｓ
ｑ９１８のハイブリダイゼーションプロフィールを示
し、図面に代わる写真である。 （ｂ)(ａ）と同じ酵素により消化されたブレビバクテリ
ウムＲ３１２の全体のゲノムＤＮＡとのプローブｓｑ７
６２のハイブリダイゼーションプロフィールを示し、図
面に代わる写真である。
Ｉ，ＰｓｔＩ及びＳｐｈＩにより消化されたブレビバク
テリウムＲ３１２の全体のゲノムＤＮＡとのプローブｓ
ｑ９１８のハイブリダイゼーションプロフィールを示
し、図面に代わる写真である。 （ｂ)(ａ）と同じ酵素により消化されたブレビバクテリ
ウムＲ３１２の全体のゲノムＤＮＡとのプローブｓｑ７
６２のハイブリダイゼーションプロフィールを示し、図
面に代わる写真である。
【図４】プラスミドｐＸＬ１６５０及びｐＸＬ１６５１
の制限地図を示す。
の制限地図を示す。
【図５】ブレビバクテリウムＲ３１２の鏡像選択性アミ
ダーゼの遺伝子を含む５．４kbのＰｓｔＩフラグメント
の制限地図を示す。
ダーゼの遺伝子を含む５．４kbのＰｓｔＩフラグメント
の制限地図を示す。
【図６】ブレビバクテリウムＲ３１２の鏡像選択性アミ
ダーゼの遺伝子を含むＢａｍＨＩ−ＰｓｔＩフラグメン
トのための配列決定手段を示す。
ダーゼの遺伝子を含むＢａｍＨＩ−ＰｓｔＩフラグメン
トのための配列決定手段を示す。
【図７】配列決定されたフラグメントの読み取り枠の分
析を示す。
析を示す。
【図８】ブレビバクテリウムＲ３１２の鏡像選択性アミ
ダーゼのヌクレオチド及びペプチド配列を示す（Ａ−
１）。
ダーゼのヌクレオチド及びペプチド配列を示す（Ａ−
１）。
【図９】Ａ−１に続くヌクレオチド及びペプチド配列を
示す（Ａ−２）。
示す（Ａ−２）。
【図１０】Ａ−２に続くヌクレオチド及びペプチド配列
を示す（Ａ−３）。
を示す（Ａ−３）。
【図１１】Ａ−３に続くヌクレオチド及びペプチド配列
を示す（Ａ−４）。
を示す（Ａ−４）。
【図１２】プラスミドｐＸＬ１７２４の制限地図を示
す。
す。
【図１３】プラスミドｐＸＬ１７５１の制限地図を示
す。
す。
【図１４】プラスミドｐＸＬ１７５２の制限地図を示
す。
す。
【図１５】菌株コリＢ及びＥ１０３Ｓからのブレビバク
テリウムＲ３１２の鏡像選択性アミダーゼの発現を示
す、クーマシーブルによる染色後の１２．５％でのポリ
アクリルアミド−ＳＤＳゲルを示し、図面に代わる写真
である。個々のレーンは、６１０nmで２．１（Ｅ１０３
Ｓ）及び０．７（コリＢ）の光学密度での培養物６０μ
ｌに相当するタンパク質の量に対応する。Ｔ）、音波処
理された画分；Ｓ）、可溶性画分；Ｃ）、不溶性画分。
対照のプラスミド（ｐＸＬ１０２９及びｐＸＬ９０６）
は、それぞれプロモーターＰR ＣＩts及びＰｔｒｐの制
御下でＩＬ１ｂｅｔａ遺伝子を含む。
テリウムＲ３１２の鏡像選択性アミダーゼの発現を示
す、クーマシーブルによる染色後の１２．５％でのポリ
アクリルアミド−ＳＤＳゲルを示し、図面に代わる写真
である。個々のレーンは、６１０nmで２．１（Ｅ１０３
Ｓ）及び０．７（コリＢ）の光学密度での培養物６０μ
ｌに相当するタンパク質の量に対応する。Ｔ）、音波処
理された画分；Ｓ）、可溶性画分；Ｃ）、不溶性画分。
対照のプラスミド（ｐＸＬ１０２９及びｐＸＬ９０６）
は、それぞれプロモーターＰR ＣＩts及びＰｔｒｐの制
御下でＩＬ１ｂｅｔａ遺伝子を含む。
【図１６】ロドコーカスの鏡像選択性アミダーゼのヌク
レオチド及びペプチド配列を示す（Ａ−１）。
レオチド及びペプチド配列を示す（Ａ−１）。
【図１７】Ａ−１に続くヌクレオチド及びペプチド配列
を示す（Ａ−２）。
を示す（Ａ−２）。
【図１８】Ａ−２に続くヌクレオチド及びペプチド配列
を示す（Ａ−３）。
を示す（Ａ−３）。
【図１９】１５０−２００領域のヌクレオチド及びペプ
チド配列を示す。
チド配列を示す。
【図２０】配列相同性の研究：活性部位についての調査
を示す。
を示す。
【図２１】配列相同性の研究：活性部位についての調査
を示す。
を示す。
【図２２】図１６〜１８及び２２に示されるＡｍｄ配列
のＥ．コリにおける発現のためのベクターを示す。
のＥ．コリにおける発現のためのベクターを示す。
【図２３】プラスミドｐＸＬ１８９４によた形質転換さ
れたＥ．コリ株Ｅ１０３Ｓによる発現の結果を示し、図
面に代わる写真である。
れたＥ．コリ株Ｅ１０３Ｓによる発現の結果を示し、図
面に代わる写真である。
【図２４】図１６〜１８及び２２に示されるＡｍｄ配列
のコリネバクテリアにおける発現のためのベクターを示
す。
のコリネバクテリアにおける発現のためのベクターを示
す。
【図２５】図１６〜１８及び２２に示されるＡｍｄ配列
のコリネバクテリアにおける発現のためのベクターを示
す。
のコリネバクテリアにおける発現のためのベクターを示
す。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成５年９月１０日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図面の簡単な説明
【補正方法】変更
【補正内容】
【図面の簡単な説明】
【図１】（ａ）ブレビバクテリウムＲ３１２の精製溶液
から得られたペプチド配列（Ｎ−末端及び内部）を示
す。 （ｂ）内部フラグメントから生成されたオリゴヌクレオ
チドプローブを示す。
から得られたペプチド配列（Ｎ−末端及び内部）を示
す。 （ｂ）内部フラグメントから生成されたオリゴヌクレオ
チドプローブを示す。
【図２】（ａ）Ｎ−末端フラグメントからのプローブｓ
ｑ９１８の調製手段を示す。 （ｂ）得られたプローブｓｑ９１８を示す。
ｑ９１８の調製手段を示す。 （ｂ）得られたプローブｓｑ９１８を示す。
【図３】酵素ＥｃｏＲＩ，ＨｉｎｄIII ，ＫｐｎＩ，Ｐ
ｓｔＩ及びＳｐｈＩにより消化されたブレビバクテリウ
ムＲ３１２の全体のゲノムＤＮＡとのプローブｓｑ９１
８及びｓｑ７６２のハイブリダイゼーションプロフィー
ルを示し、図面に代わる電気泳動の写真である。
ｓｔＩ及びＳｐｈＩにより消化されたブレビバクテリウ
ムＲ３１２の全体のゲノムＤＮＡとのプローブｓｑ９１
８及びｓｑ７６２のハイブリダイゼーションプロフィー
ルを示し、図面に代わる電気泳動の写真である。
【図４】プラスミドｐＸＬ１６５０及びｐＸＬ１６５１
の制限地図を示す。
の制限地図を示す。
【図５】ブレビバクテリウムＲ３１２の鏡像選択性アミ
ダーゼの遺伝子を含む５．４kbのＰｓｔＩフラグメント
の制限地図を示す。
ダーゼの遺伝子を含む５．４kbのＰｓｔＩフラグメント
の制限地図を示す。
【図６】ブレビバクテリウムＲ３１２の鏡像選択性アミ
ダーゼの遺伝子を含むＢａｍＨＩ−ＰｓｔＩフラグメン
トのための配列決定手段を示す。
ダーゼの遺伝子を含むＢａｍＨＩ−ＰｓｔＩフラグメン
トのための配列決定手段を示す。
【図７】配列決定されたフラグメントの読み取り枠の分
析を示す。
析を示す。
【図８】ブレビバクテリウムＲ３１２の鏡像選択性アミ
ダーゼのヌクレオチド及びペプチド配列を示す（Ａ−
１）。
ダーゼのヌクレオチド及びペプチド配列を示す（Ａ−
１）。
【図９】Ａ−１に続くヌクレオチド及びペプチド配列を
示す（Ａ−２）。
示す（Ａ−２）。
【図１０】Ａ−２に続くヌクレオチド及びペプチド配列
を示す（Ａ−３）。
を示す（Ａ−３）。
【図１１】Ａ−３に続くヌクレオチド及びペプチド配列
を示す（Ａ−４）。
を示す（Ａ−４）。
【図１２】プラスミドｐＸＬ１７２４の制限地図を示
す。
す。
【図１３】プラスミドｐＸＬ１７５１の制限地図を示
す。
す。
【図１４】プラスミドｐＸＬ１７５２の制限地図を示
す。
す。
【図１５】菌株コリＢ及びＥ１０３Ｓからのブレビバク
テリウムＲ３１２の鏡像選択性アミダーゼの発現を示
す、クーマシーブルによる染色後の１２．５％でのポリ
アクリルアミド−ＳＤＳゲルを示し、図面に代わる電気
泳動の写真である。個々のレーンは、６１０nmで２．１
（Ｅ１０３Ｓ）及び０．７（コリＢ）の光学密度での培
養物６０μｌに相当するタンパク質の量に対応する。
Ｔ）、音波処理された画分；Ｓ）、可溶性画分；Ｃ）、
不溶性画分。対照のプラスミド（ｐＸＬ１０２９及びｐ
ＸＬ９０６）は、それぞれプロモーターＰR ＣＩts及び
Ｐｔｒｐの制御下でＩＬ１ｂｅｔａ遺伝子を含む。
テリウムＲ３１２の鏡像選択性アミダーゼの発現を示
す、クーマシーブルによる染色後の１２．５％でのポリ
アクリルアミド−ＳＤＳゲルを示し、図面に代わる電気
泳動の写真である。個々のレーンは、６１０nmで２．１
（Ｅ１０３Ｓ）及び０．７（コリＢ）の光学密度での培
養物６０μｌに相当するタンパク質の量に対応する。
Ｔ）、音波処理された画分；Ｓ）、可溶性画分；Ｃ）、
不溶性画分。対照のプラスミド（ｐＸＬ１０２９及びｐ
ＸＬ９０６）は、それぞれプロモーターＰR ＣＩts及び
Ｐｔｒｐの制御下でＩＬ１ｂｅｔａ遺伝子を含む。
【図１６】ロドコーカスの鏡像選択性アミダーゼのヌク
レオチド及びペプチド配列を示す（Ａ−１）。
レオチド及びペプチド配列を示す（Ａ−１）。
【図１７】Ａ−１に続くヌクレオチド及びペプチド配列
を示す（Ａ−２）。
を示す（Ａ−２）。
【図１８】Ａ−２に続くヌクレオチド及びペプチド配列
を示す（Ａ−３）。
を示す（Ａ−３）。
【図１９】１５０−２００領域のヌクレオチド及びペプ
チド配列を示す。
チド配列を示す。
【図２０】配列相同性の研究：活性部位についての調査
を示す。
を示す。
【図２１】配列相同性の研究：活性部位についての調査
を示す。
を示す。
【図２２】図１６〜１８及び２２に示されるＡｍｄ配列
のＥ．コリにおける発現のためのベクターを示す。
のＥ．コリにおける発現のためのベクターを示す。
【図２３】プラスミドｐＸＬ１８９４によた形質転換さ
れたＥ．コリ株Ｅ１０３Ｓによる発現の結果を示し、図
面に代わる電気泳動の写真である。
れたＥ．コリ株Ｅ１０３Ｓによる発現の結果を示し、図
面に代わる電気泳動の写真である。
【図２４】図１６〜１８及び２２に示されるＡｍｄ配列
のコリネバクテリアにおける発現のためのベクターを示
す。
のコリネバクテリアにおける発現のためのベクターを示
す。
【図２５】図１６〜１８及び２２に示されるＡｍｄ配列
のコリネバクテリアにおける発現のためのベクターを示
す。
のコリネバクテリアにおける発現のためのベクターを示
す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｎ 15/57 Ｃ１２Ｒ 1:13） (72)発明者 エディト セルベロ フランス国，69005 リヨン，リュ ジョ リオ キュリー 101 (72)発明者 ドミニク ペトル フランス国，69006 リヨン，リュ デュ ケスン 45
Claims (7)
- 【請求項１】 アジターゼ活性を有するポリペプチド又
は前記ポリペプチドを生成する組換え微生物によるアジ
パミド及び／又はアンモニウムアジパメートの加水分解
によるアジピン酸アンモニウムの合成方法であって； （ｉ）−図８〜１１に示される ブレビバクテリウム
（Brevibacterium) のアミダーゼをコードする配列、 −前記遺伝子コードの縮重に起因するこの配列の相同
体、及び、 −これらの配列の１つ又はそのフラグメントとハイブリ
ダイズし、そしてアミダーゼ活性を有するポリペプチド
をコードするＤＮＡから選択されたＤＮＡ配列をコード
するポリペプチド；又は（ii）前記ポリペプチドを生成
する組換え微生物を用いることを特徴とする方法。 - 【請求項２】 前記ハイブリダイズするＤＮＡが図１６
〜１８に示される配列を含む請求項１記載の方法。 - 【請求項３】 前記宿主微生物が腸内細菌である請求項
１又は２記載の方法。 - 【請求項４】 前記腸内細菌がＥ．コリ（E.Coli）であ
る請求項３記載の方法。 - 【請求項５】 前記宿主微生物がコリネバクテリウムで
ある請求項１又は２記載の方法。 - 【請求項６】 前記細菌がコリネバクテリウム（Coryne
bacterium ）、ブレビバクテリウム（Brevibacterium）
又はロドコーカス（Rhodococcus ）属に属する請求項５
記載の方法。 - 【請求項７】 前記ポリペプチド又は組換え微生物が固
体支持体上に及び／又はその中に固定される請求項１〜
６のいづれか１項記載の方法。
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| JP2603777B2 JP2603777B2 (ja) | 1997-04-23 |
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