JPH10509043A - 工業用酵素 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、セファロスポリンＣまたはこれらの誘導体を、７−アミノセファロスポラン酸またはこれらの対応する誘導体に一段階で変換する酵素方法に関する。この一段階変換は、Ｐseudomonas vesicularis Ｂ965 から、または何れかのセファロスポリンＣアミドヒドロラーゼを産生するか、或いは潜在的に産生するこれらの継代物から、または Ｐseudomonas vesicularis Ｂ965、若しくは何れかのセファロスポリンＣアミドヒドロラーゼを産生するか、或いは潜在的に産生するこれらの継代物から誘導されるＤＮＡの発現から誘導されるセファロスポリンＣアミドヒドロラーゼを用いて行われる。

Description

【発明の詳細な説明】 工業用酵素 本発明は、セファロスポリンＣまたはこれらの誘導体を７−アミノセファロス ポラン酸またはこれらの対応する誘導体へ一段階で変換するための酵素法に関す る。該一段階変換は、Ｐseudomonas vesicularis Ｂ965 から、または何れかの セファロスポリンＣアミドヒドロラーゼを産生するか、或いは潜在的に産生する これらの継代物から、またはＤＮＡ、特に本明細書で開示される Ｐseudomonas vesicularis Ｂ965、若しくは何れかのセファロスポリンＣアミドヒドロラーゼ を産生するか、或いは潜在的に産生するこれらの継代物から誘導されるＤＮＡの 何れかの発現から誘導されるセファロスポリンＣアミドヒドロラーゼ酵素を用い て行われる。 セファロスポリンはＣ、セファロスポリン生合成経路の発酵産物であり、これ 自身抗生物質としてグラム陰性菌に対して幾つかの活性を有することが示されて いるが、セファロスポリンＣの主要な商業的利用は、他のセファロスポリン様抗 生物質の基礎単位としての利用である。特に、Ｄ−α−アミノアジピル側鎖を除 去し、非常に有用な中間体７−アミノセファロスポラン酸（７−ＡＣＡ）を得る ことができる。これは、セファロチン、セファロリジンおよびセフロキシムを含 む広範囲の半合成セファロスポリン抗体の前駆体となる。 セファロスポリンＣから７−ＡＣＡを製造するための現在の工業的方法は、Ｄ −α−アミノアジピル側鎖の化学的開裂である。使用に際しては幾つかの異なっ た方法がある（例えば、Ａ Ｓmithの、"Ｃomprehensive Ｂiotechnolgy: the Ｐ rin-ciples,Ａpplications and Ｒegulations of Ｂiotechnolgy in Ｉndustry, Ａgriculture and Ｍedicine"第３巻、（"Ｔhe Ｐractice of Ｂiotechnolgy: Ｃurrent Ｃommodity Products"）、ＨＷＢlanch et al. 編、esp.pp.163-185、 Ｐergamon Ｐress,Ｏxford,ＵＫ，1985参照）が、これらはすべて、基本的には 、アミノ基およびカルボキシル基の適切な保護を用いたイミノ−ハライド法であ る。例えば、Ｍorin et al(Ｊ.Ａm.Ｃhem.Ｓoc.,84,3400(1962)）によって開発 されたニトロシルクロライド開 裂は、現在Ｃiba Ｇeigy（Ｆechtig et al,Ｈelv.Ｃhim.Ａcta,51,1108(1968)） によって開発されたイミノエステル法に取って代わられている。 これらの化学的方法は、保護および開裂のための化学薬品のコスト、要求され る低い操作温度（例えば−２０℃）を得るための費用、複雑な、時として多段階 のプラントのコスト、毒性の化学薬品（例えば、トリメチルシリルクロライド、 五塩化リンおよび塩化クロロアセチル）を含有することを測定するためのコスト 、および非常に不純なセファロスポリンＣ（又は誘導体）出発物質を精製する必 要性を含めた幾つかの不利益を有する。 従って、安価で、簡単な技術を含み、環境に優しく、安全である、セファロス ポリンＣ（またはその誘導体）を７−ＡＣＡ（または対応するその誘導体）に変 換する方法を提供する必要性がある。このような基準により、ここで酵素方法が 用いられることにつながる。 セファロスポリンＣ（またはその誘導体）を７−ＡＣＡ（またはその対応する 誘導体）に変換するための効果的な生物学的方法または酵素方法をサーチするこ とは、たいてい失敗に終わっている。セファロスポリンＣを７−ＡＣＡに変換す るための二段階酵素方法に関する文献がある。これらは、最初に、Ｄ−アミノ酸 のオキシダーゼを用いてセファロスポリンＣをグルタリル−７−ＡＣＡに変換し （例えば米国特許第３６５８６４９または３８０１４５８を参照）、次いでグル タリル側鎖を開裂して７−ＡＣＡを得ることが必要である。二段階酵素方法は、 例えばＳhibuya et al,Ａgric.Ｂiol.Ｃhem.,45,1561-1567(1981)に開示されて いるが、これらは全て、一段階方法に比べて効率が低下し、複雑さが増加すると いう不利益がある。 低活性の一段階酵素反応の報告もある。例えば、ＥＰ０２８３２１８、ＥＰ０ ３２２０３２、およびＥＰ０４０５８４６には、Ａrthrobacter viscosus、Ｂac il-lus Ｍegaterium、および他のバシルス種からそれぞれ誘導される酵素を用い るセファロスポリンＣの７−ＡＣＡへの一段階変換が開示されている。ＥＰ０４ ７４６５２には、Ｐseudomonas diminuta から誘導されるセファロスポリンＣの ７−ＡＣＡへの一段階変換に使用しうる酵素が開示されている。この分野の広範 囲の研究にもかかわらず、先に開示されたような単離された酵素が商業的に適切 な量 の７−ＡＣＡを製造するのに使用できることは、まだ示されていない。 従って、我々が、セファロスポリンＣ（またはその誘導体）を７−ＡＣＡ（ま たはその対応する誘導体）に一段階で変換することができるアミドヒドロラーゼ （アミダーゼまたはアシラーゼとしても知られる）酵素を産生するＰseudomo-na s vesicularis の菌株を単離したことは特に予想されていない。観測されるこの 酵素の活性は、野生型の菌株では非常に弱いが、以下の部分的な酵素の精製で有 用な活性が得られる。更に、アミノヒドロラーゼ酵素活性をコードする遺伝子も 単離され、配列決定され（配列識別番号１）、増加した量の酵素を生産するため にＥ．coli のような組換えホスト中で発現された。加えて、単離されたアミノ ヒドロラーゼ酵素は、これを固定化しうるが、有意に酵素活性を維持するのに十 分丈夫であることが本発明の特徴である。酵素の固定化は、７−ＡＣＡの大規模 発酵合成で使用するための酵素の適合に特に重要なステップである。発酵におい て遊離の酵素に比べて固定化された酵素を使用することは、酵素に対する要求を 有意に減少し、引き続いて７−ＡＣＡの製造のコストを減少する明確な利益を有 する。 従って、本発明の第一の側面では、セファロスポリンＣまたはその誘導体を、 ７−アミノセファロスポラン酸またはその対応する誘導体に変換する一段階変換 方法であって、前記セファロスポリンＣまたはその誘導体を、Ｐseudomonas ves icularis Ｂ965、または、何れかのセファロスポリンＣアミドヒドロラーゼを産 生するか、或いは潜在的に産生するこれらの継代物、またはＤＮＡ、特に前記Ｐ seudomonas vesicularis Ｂ965、または何れかのセファロスポリンＣアミドヒド ロラーゼを産生するか、或いは潜在的に産生するこれらの継代物のＤＮＡを含有 する組換えＤＮＡ分子の何れかの発現から誘導されるセファロスポリンＣアミド ヒドロラーゼで処理することを具備した方法を提供する。 本発明の他の側面では、セファロスポリンＣまたは式（Ｉ）のこれらの誘導体 を、 但し、 Ｒ¹は、−ＣＯ（ＣＨ₂）₃ＣＨ（ＮＨＲ⁵）ＣＯ₂Ｒ⁴、−ＣＯ（ＣＨ₂）₃Ｃ Ｏ₂Ｒ⁴または−ＣＯ（ＣＨ₂）₂ＣＯ₂Ｒ⁴から選択される基を表す。 Ｒ²は、カルボン酸またはカルボキシレート基または塩、エステルまたは これらの保護された誘導体を表す。 Ｒ³は、水素原子または−ＣＨ₂ＯＣ（Ｏ）ＣＨ₃、−ＣＨ₂ＯＨ、−ＣＨ₃ 、−ＣＨ₂ＯＣ（Ｏ）ＮＨ₂またはピリジニウムメチル基から選択される基を表す 。 Ｒ⁴は、水素原子またはカルボキシル保護基を表す。 Ｒ⁵は、水素原子、ベンゾイル基又はアミノ保護基を表す。 ７−アミノセファロスポラン酸または式（II）の対応するこれらの誘導体へ一段 階で変換するのための方法であって、 但し、Ｒ²およびＲ³は先に定義したとおりである。 式（Ｉ）の化合物を、Ｐseudomonas vesicularis Ｂ965、または、何れかのセフ ァロスポリンＣアミドヒドロラーゼを産生するか、或いは潜在的に産生するこれ らの継代物、またはＤＮＡ、特に前記 Ｐseudomonas vesicularis Ｂ965、また は何れかのセファロスポリンＣアミドヒドロラーゼを産生するか、或いは潜在的 に産生するこれらの継代物のＤＮＡを含有する組換えＤＮＡ分子の何れかの発現 から誘導されるセファロスポリンＣアミドヒドロラーゼで処理で処理することを 具備 した方法を提供する。 本発明の好ましい側面では、式（Ｉ）の化合物は、セファロスポリンＣ（即ち 、Ｒ¹が−ＣＯ（ＣＨ₂）₃ＣＨ（ＮＨ₂）ＣＯ₂Ｈ基であり、Ｒ²がカルボン酸基で あり、Ｒ₃が-ＣＨ₂ＯＣ（Ｏ）ＣＨ₃である。）であり、式（II）の化合物は７− アミノセファロスポラン酸（即ち、Ｒ²がカルボン酸基であり、Ｒ³が−ＣＨ₂Ｏ Ｃ（Ｏ）ＣＨ₃である。）である。 本発明の更なる側面では、真核生物または原核生物ホスト内でＤＮＡ配列をク ローニングするのに使用される組換えＤＮＡ分子であって、前記組換えＤＮＡ分 子が、セファロスポリンＣアミドヒドロラーゼ酵素の発現をコードする配列識別 番号１に示されるＤＮＡ配列、またはセファロスポリンＣアミドヒドロラーゼ酵 素の発現をコードする配列識別番号１に示されたＤＮＡ配列の機能変異から得た ＤＮＡ配列から選択されるＤＮＡ配列を含有するものを提供する。 本発明の更に好ましい側面では、ＤＮＡまたは組換えＤＮＡは配列識別番号１ に記載のＤＮＡ配列またはこれらの機能的変異の一部または全部から選択される ＤＮＡ配列を含む。 本発明の他の側面では、真核生物または原核生物ホスト内でＤＮＡ配列をクロ ーニングするのに使用される組換えＤＮＡであって、前記組換えＤＮＡ配列が本 発明の配列識別番号１に記載のＤＮＡ配列、またはセファロスポリンＣアミドヒ ドロラーゼ酵素の生物学的活性を有するポリペプチドの発現をコードする配列識 別番号１に記載のＤＮＡ配列の機能的変異を含有するものを提供する。 本発明の更に他の側面では、配列識別番号１に記載のＤＮＡ配列にハイブリダ イズするか、または突然変異によって配列識別番号に記載のＤＮＡ配列に関連さ れたＤＮＡ配列を含有する組換えＤＮＡ分子を提供する。 ここで使用される「配列識別番号１に記載のＤＮＡ配列の機能的変異」の語は 、 （ｉ）配列識別番号１に記載のＤＮＡ配列の対立変異であるＤＮＡ配列； （ii）上記配列（ｉ）または配列識別番号１に記載のＤＮＡ配列とハイブリダイ ズするＤＮＡ配列； （iii）上記配列（ｉ）および（ii）、または配列識別番号１に記載のＤＮＡ配 列に対する遺伝コードの結果として変性されたＤＮＡ配列 から選択されるＤＮＡ配列を含有する。 好ましくは、「配列識別番号１に記載のＤＮＡ配列の機能的変異」は、Ｐseu- domonas vesicularis Ｂ965 に見出される天然のセファロスポリンＣアミノヒド ロラーゼの配列（配列識別番号１）に実質的に対応するアミノ酸配列を含有する か、または１以上の欠失、置換、挿入、逆位または対立遺伝子に由来するもの（ allelicorigin）の付加等を含めたポリペプチドをコードするであろう。生じた ポリペプチドは、天然のセファロスポリンＣアミドヒドロラーゼ酵素の配列と少 なくとも８０％、好ましくは９０％の相同性を有し、ここで定義した幾つかのセ ファロスポリンＣアミドヒドロラーゼ活性を本質的に維持するか、または好まし くは増強された活性またはセファロスポリンＣ基質の存在下で、例えばその基質 に対する酵素の親和性を増強する（即ち、Ｋ_mの減少）ことによって、または反 応の速度を増加する（即ち、Ｋ_catを増加する）することによって増加した酵素 動力学を示すであろう。 本発明のセファロスポリンＣアミドヒドロラーゼをコードする組換えＤＮＡ配 列は、セファロスポリンＣアミドヒドロラーゼをコードする組換えＤＮＡ配列の 発現を制御する、外科的に結合された転写および翻訳活性化配列を含有すること が認識されるであろう。組換えＤＮＡ発現に使用するためのこのような活性化配 列は、当分野で周知である。 特に、セファロスポリンＣアミドヒドロラーゼをコードする組換えＤＮＡ配列 とＧＴＧ、ＣＴＧまたは最も好ましくはＡＴＧのような開始コドンを従来の方法 によって組み合わせることを望むことも認識されるであろう。 更に、本発明のセファロスポリンＣアミドヒドロラーゼをコードする組換えＤ ＮＡ配列は、終止コドン、ＴＡＧ、ＴＡＡおよびＴＧＡのようなコード配列の３ ’末端での調節シグナル、およびｍＲＮＡポリアデニル化およびプロセッシング シグナルを含有しうる。 本発明のセファロスポリンＣアミドヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドは 、本発明のセファロスポリンＣアミドヒドロラーゼをコードする組換えＤＮＡ配 列が遺伝子融合を用いる融合タンパク質として発現されうる（この場合、これら のリーディングフレームは、位相を同じにするように他のタンパクに対するコー ド 配列に結合される。）ことが認識されるであろう。このような遺伝子融合は、セ ファロスポリンＣアミドヒドロラーゼ活性をシグナルペプチドにリンクさせ、形 質転換細胞によるその分泌を可能にするように構成される。この技術の他の使用 は、セファロスポリンＣアミドヒドロラーゼをコードする組換えＤＮＡ配列を実 際にプロモータに隣接配置する必要がなく、正しいリーディングフレーム内のプ ロモーター配列の後ろのセファロスポリンＣアミドヒドロラーゼをコードするＤ ＮＡ配列のスプライシングを可能にしうる。この技術の他の使用は、親和性タグ をセファロスポリンＣアミドヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドに加えるこ とができ、ポリペプチドのアッセイを促進するであろう。 「セファロスポリンＣアミドヒドロラーゼをコードする組換えＤＮＡ配列」の 語は、単一または複数の塩基の置換、欠失、挿入または逆位を含めた変異のよう な１以上の修飾を含み、本明細書で定義したセファロスポリンＣアミドヒドロラ ーゼ活性を有するポリペプチドの発現をコードするこれらの配列を含ませる頃を 意図している。修飾されたＤＮＡ配列を使用する場合、これらは、Ｐseudomonas vesicularis Ｂ695 に見出される天然のセファロスポリンＣアミドヒドロラー ゼ酵素にアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドの発現をコー ドする遺伝子コードにより変性されたこれらの組換えＤＮＡ配列である。 この他には、上記の修飾を含めたセファロスポリンＣアミドヒドロラーゼをコ ードする組換えＤＮＡ配列は、本明細書で定義したセファロスポリンＣアミドヒ ドロラーゼ活性を有するポリペプチドの発現をコードしうる。この場合、１以上 の欠失、置換、挿入、逆位または対立遺伝子に由来するものの付加等が、例えば その基質に対する親和性を増加する（即ちＫ_mの減少）ことによって、または反 応速度を増加する（即ち、Ｋ_catの増加）によって改善された触媒活性を有する 酵素の発現を改善させる。 本発明のセファロスポリンＣアミドヒドロラーゼをコードする組換えＤＮＡ配 列は、他の組換えＤＮＡ配列と組み合わされうる。 例えば、本発明のセファロスポリンＣアミドヒドロラーゼ酵素は、基質として グルタリル−７−ＡＣＡを受け入れ、これによってセファロスポリンＣアミドヒ ドロラーゼをコードする組換えＤＮＡ配列がＤ−アミノ酸オキシダーゼをコード する組換えＤＮＡ配列と組み合わされうる。この他には、本発明のセファロスポ リンＣアミドヒドロラーゼ酵素は、通常、基質としてセファロスポリンＣを受け 入れ、これによってセファロスポリンＣアミドヒドロラーゼをコードする組換え ＤＮＡ配列がＤＡＣアセチルトランスフェラーゼをコードする組換えＤＮＡ配列 と組み合わされうる。 本発明の組換えＤＮＡ配列は、これらがそのまま使用されうる何れの場合にも 、抗生物質を産生する微生物のゲノムに直接に導入されうる。この他には、本発 明の組換えＤＮＡ配列は、組換えＤＮＡ発現ベクターを使用して当分野で公知の 標準的技術で導入されうる。この方法で導入する場合、ベクターは一般に、プロ モーターおよび／または翻訳活性化配列を更に含有し、セファロスポリンＣアミ ドヒドロラーゼをコードする組換えＤＮＡ配列に外科的に結合され、好ましくは 更に形質転換されるホストを同定するための、例えば本明細書中で以下に説明す る選択マーカーシステムを用いることが認識されるであろう。 従って、本発明の更なる側面では、本発明の組換えＤＮＡ配列を含有し、更に セファロスポリンＣアミドヒドロラーゼをコードする組換えＤＮＡ配列に外科的 に結合されたプロモーターおよび翻訳活性化配列を含有する組換えＤＮＡ発現ベ クターを提供する。 この他の側面では、本発明の組換えＤＮＡ配列を、抗生物質を産生しない微生 物、例えば Ｅscherichia coli に、直接にまたは組換えＤＮＡ発現ベクターの 一部として導入し、in vitro での抗生物質の産生、または抗生物質の産生に使 用するための前駆体の in vitro での調製を触媒するのに有効なセファロスポリ ンＣアミドヒドロラーゼ活性を有する酵素の発現および単離を行う。セファロス ポリンＣアミドヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドの発現が Ｅ.coli で意 図されない場合でさえも、適切な組換えＤＮＡ発現ベクターを、Ｅ.coli のよう な原核生物ホスト中で複製でき、更なる遺伝子操作を容易にすることが好ましい 。 従って、本発明の他の側面に従えば、本発明のセファロスポリンＣアミドヒド ロラーゼをコードする組換えＤＮＡ配列を含有する組換えＤＮＡ発現ベクターで 形質転換された真核生物または原核生物ホストを提供する。 好ましいホストには、Ａcremonium spp または Ｐenicillium spp のような繊 維 状菌の種、ストレプトマイセスの種、またはＥ.coliまたはＢacillus sppのよう な他のバクテリアが含まれる。特に好ましいホストは、Ａcremonium chryso-gen umまたはＥ.coliである。 本発明の更なる側面では、真核生物または原核生物ホスト内でセファロスポリ ンＣアミドヒドロラーゼ活性を発現する方法であって、 ａ）ホスト細胞を、（ｉ）ホスト細胞内で機能する発現コントロール配列、およ び（ii）発現コントロール配列に外科的に結合されたセファロスポリンＣアミド ヒドロラーゼをコードする組換えＤＮＡ配列を含有する組換えＤＮＡ発現ベクタ ーで形質転換すること、 ｂ）ステップ（ａ）で形質転換されたホスト細胞を、セファロスポリンＣアミド ヒドロラーゼ活性の発現を可能にする条件下で培養すること、 を具備した方法を提供する。 ここで開示された組換えＤＮＡ配列は、セファロスポリンＣアミドヒドロラー ゼの発現をコードしない所定長さの組換えＤＮＡを含有する。これらの非コード 配列は、全組換えＤＮＡ配列の有用性を少しも損なわないが、組換えＤＮＡ配列 から誘導されるより小さな制限フラグメントを使用することが便利でありるか、 または望まれうる。制限フラグメントは、例えば当分野で周知の方法で、適切な 制限エンドヌクレアーゼ酵素または特異的エキソヌクレアーゼ酵素を用いて開裂 することによって得ることができる。 本発明の更に他の側面では、配列識別番号１に記載のアミノ酸配列またはこれ らの対立若しくは機能的に同等な他の変異を有するセファロスポリンＣアミドヒ ドロラーゼポリペプチドの発現をコードする遺伝子を含有した組換えＤＮＡ発現 ベクターであって、１以上のアミノ酸が本明細書で開示された酵素活性試験にお いて実質的にセファロスポリンＣアミドヒドロラーゼ活性に影響を与えることな く、付加、置換または削除されているものを提供する。 適切な組換えＤＮＡ発現ベクターは、染色体、非染色体および公知のバクテリ アプラスミド、例えば ＣoＩＥ1 のような「天然」プラスミドまたは pＢＲ322 、pＡＴ153、pＵＣ18、pＵＣ19、pＡＣＹＣ184 または pＭＢ9 のような「人工 」プラスミド、または酵母プラスミド、例えば２μの誘導体のような合成ＤＮＡ を包含しう る。 他の適切なベクターは、ファージＤＮＡ、例えば Ｍ13 の誘導体、またはバク テリオファージラムダ（λ）、または ＹＩp、ＹＥp または ＹＲp の誘導体の ような酵母ベクターでありうる。 組換えＤＮＡ配列または本明細書で定義されるこれらから誘導される制限フラ グメントを含有することを除けば、組換えＤＮＡ発現ベクターも選択されたホス ト細胞を機能化するだけでなく、外科的に結合された（このことは、これが正し い方向および位置に配置され、セファロスポリンＣアミドヒドロラーゼをコード する組換えＤＮＡ配列の発現を制御することを意味する。）プロモーターおよび 翻訳活性化配列を含有しうる。もちろんこのような活性化配列は、本明細書で開 示される完全な長さの組換えＤＮＡ分子に見出されうる。 本発明の組換えＤＮＡ発現ベクターに使用されうる有用なプロモーターの例に は、例えば Ａcremonium spp または Ｐenicillium spp から得られるイソペニ シリンＮシンセターゼ（ＩＰＮＳ）のpcbＣプロモーター、Ａcremonium spp か ら得られるエキスパンダーゼ／ヒドロキシラーゼ（ＤＡＯＣＳ／ＤＡＣＳ）の c ef ＥＦプロモーター、Ｐenicillium spp から得られるアシルＣoＡ： ６ＡＰＡ アシルトランスフェラーゼの penＤＥ プロモーター、および pgk、gpdＡ、pki 、amdＳ、argＢ、trpＣ、alcＡ、aldＤ、およびniaＤ プロモーター配列を含め た Ａspergillus spp から得られる多数のプロモーター配列が含まれる。 本発明の組換えＤＮＡに使用されうる有用なプロモーター配列の更なる例には 、酵母の糖分解プロモーター（例えば、３−ホスホグリセレートキナーゼ、ＰＫ Ｇのプロモーター）、酵母酸ホスファターゼ（例えば、Ｐｈｏ５）またはアルコ ールデヒドロゲナーゼ−２（alcＡ）のプロモーターまたはグルコアミラーゼプ ロモーターが含まれる。発現が Ｅ.coli のようなバクテリアホストで行われる 場合、本発明の組換えＤＮＡ発現ベクターに使用されうる有用なプロモーターは 、当分野で周知であり、これらにはλＰＬ／Ｃ_l８５７システム、並びにtac、la c 、trpＥおよびrecＡのような他の一般のプロモーターが含まれる。他の適切な 発現系は、Ｔ７ポリメラーゼ系である。 加えて、このような組換えＤＮＡ発現ベクターは、本発明のセファロスポリン Ｃアミドヒドロラーゼをコードする組換えＤＮＡ配列の挿入のための種々の部位 を有する。これらの部位は、これらを開裂する特異的な制限エンドヌクレアーゼ によって特徴づけられる。幾つかの開裂部位は当業者に十分認識されている。 発現ベクター、特に選択された組換えＤＮＡフラグメントを挿入し、発現をコ ントロールする配列にこれを外科的に結合するためにこれら内で選択される部位 は、与えられた制限酵素に影響されやすい多くの部位、発現されるタンパク質の 大きさ、ホスト細胞タンパク質によって発現されるタンパク質（これは精製で除 くことが困難でありうる。）の混入または結合、および当業者に認識された他の 因子を含めた種々の因子で決定される。従って、ベクターの選択および組換えＤ ＮＡ配列の挿入部位はこれらの因子のバランスによって決定されるが、全ての選 択が与えられたケースに対して等しく効果的ではない。同様に、全てのホスト／ ベクターの組み合わせが、本発明の組換えＤＮＡ配列の発現に等しく影響するよ うに機能することはないであろう。選択は、ホストおよびベクターの適合性、所 望のタンパク質の回収の容易さ、および／または組換えＤＮＡおよびこれらに外 科的に結合された発現コントロール配列の発現の特徴を含めた種々の因子、また は所望のタンパク質の何れかの必要な発現後の修飾に依存して行われる。 組換えＤＮＡ発現ベクターは、形質転換体に対する選択されたホストのスクリ ーニングを促進する選択マーカーも含有する。真菌の形質転換に使用するための 適切なマーカーは当分野で周知であり、これらには、唯一の窒素源としてアセト アミドを使用する能力を形質転換体に付与するアセトアミド（amdＳ）遺伝子、 抗生物質耐性、例えば、Ｇ４１８、ヒグロマイシンＢ（hygromycin Ｂ）および フレオマイシン（Ｐhleomycin）のようなアミノグリコシド抗生物質に対する耐 性、または変性されたチュービュリン遺伝子を用いた形質転換によるベノミルに 対する耐性を形質転換体に付与するホスホトランスフェラーゼ遺伝子が含まれる 。他の有用なマーカーは、唯一の窒素源としてナイトレートを利用する能力をナ イトレートリダクターゼ不全突然変異体に付与するナイトレートリダクターゼ（nia Ｄ）遺伝子である。繊維状菌に対する他のマーカー系には、argＢ 遺伝子を 用いるアルギニン栄養要求性、trpＣ 遺伝子を用いるトリプトファンＣ栄養要求 性、およびpyr-４またはpyrＧ遺伝子を用いたウラシル栄養要求性の復帰変異が 含まれる。 本発明のセファロスポリンＣアミドヒドロラーゼ遺伝子および選択されるマー カー遺伝子は、同じプラスミドの一部であることが都合よく、この他としては、 これらは、ホストが当分野で周知の何れかの適切な技術を用いて共同形質転換（ co-transformation）されなければならない何れの場合でも異なったプラスミド に存在することができる。 組換えＤＮＡ発現ベクターはまた、任意に、染色体若しくはミトコンドリアＤ ＮＡのフラグメント、好ましくは形質転換されるものと同じ種から誘導される自 律性複製配列（ars）によって特徴づけられる。 例えば Ｅ.coliのようなバクテリア発現系では、選択マーカーは当分野で非常 によく確立されている。特殊な使用の中には、例えばテトラサイクリンまたはク ロラムフェニコールに対する抗生物質耐性を付与するマーカーがある。 セファロスポリンＣアミドヒドロラーゼが全体として純粋である必要がないこ と、および当分野で周知の技術によって実質的な精製が行われ、セファロスポリ ンＣアミドヒドロラーゼ活性を有する酵素組成物を提供するべきであることが認 識されるであろう。 従って、本発明の更なる側面では、セファロスポリンＣまたはこれらの誘導体 を７−アミノセファロスポラン酸またはこれらの対応する誘導体に一段階で変換 することができるセファロスポリンＣアミドヒドロラーゼを含有する酵素組成物 であって、前記酵素組成物が Ｐseudomonas vesicularis Ｂ965、または、何れ かのセファロスポリンＣアミドヒドロラーゼを産生するか、或いは潜在的に産生 するこれらの継代物から、または前記 Ｐseudomonas vesicularis Ｂ965、また は何れかのセファロスポリンＣアミドヒドロラーゼを産生するか、或いは潜在的 に産生するこれらの継代物の遺伝子物質の何れかの発現から誘導されるものを提 供する。 アミノ基およびカルボキシル基の保護で本明細書中で参照される文献は、例え ば Ｔheodora Ｇreene および Ｐeter Ｗuts の「有機合成における保護基（Ｐr otective Ｇroups in Ｏrganic Ｓynthesis）」（第２版）（Ｊohn Ｗiley and Ｓons Inc.1991）に開示された従来の保護基を使用するときに参照されるもので ある保護基を使用する場合の原則は十分に確立されている。ＧreeneおよびＷuts は 有用な保護基に対して以下のような多くの基準を提案している。 ・ これは、好収率で選択的に反応し、計画した反応に安定な保護された物質を 与えなければならない。 ・ これは、容易に利用しうる、好ましくは非毒性の反応剤であって、再生され た官能基を攻撃しないものにより好収率で選択的に除去されなければならない。 ・ これは、その形成または開裂に関連した副生成物から容易に分離できる結晶 性誘導体を（新たなステレオジェン中心を生じることなく）形成するべきである 。 ・ これは、所定部位の更なる反応を防止するために最小限の追加の機能性を有 するべきである。 適切な保護基は、当業者によって容易に認識されるであろう。 式（Ｉ）および（II）の化合物の塩にはアルカリ金属塩（例えばナトリウムま たはカリウム塩）のような無機塩が含まれる。 式（Ｉ）および（II）の化合物のエステルは、生理学的に許容しうることが好 ましく、これらには、アシルオキシアルキルエステル、例えばアセトキシメチル 、アセトキシエチルまたはピバロイルオキシメチルエステルのような低級アルカ ノイルオキシメチル若しくは−エチルエステル、およびアルコキシカルボニルオ キシエチルエステル、例えばエトキシカルボニルオキシエチルエステルのような 低級アルコキシカルボニルオキシエチルエステルが含まれる。 先に述べたように、本発明の方法は、セファロスポリンＣまたはこれらの誘導 体を本発明のセファロスポリンＣアミドヒドロラーゼで処理することを具備する 。このような状況では、「処理する」という語は、基質に酵素を接触する何れか の従来の方法を意味する。 従って、例えば、組成のセファロスポリンＣまたはこれらの誘導体の部分的に 精製された溶液または細胞を含まない肉汁を、本発明のセファロスポリンＣアミ ドヒドロラーゼ酵素組成物を用いてバッチごとにまたは連続法で処理される供給 流れとして使用しうる。このような方法は、基質または酵素を任意に予め精製す るか、または精製せずに行なうことができる。 この他には、本発明のセファロスポリンＣアミドヒドロラーゼは固定化され、 例えば撹拌されたタンク反応器中で使用されうるか、またはセファロスポリンＣ 若しくはこれらの誘導体を通す酵素カラムとして使用されうる。このような固定 化された形態のセファロスポリンＣアミドヒドロラーゼ酵素組成物は、更に本発 明の更なる側面を構成する。 酵素の固定化法は、当分野で公知である（例えば、「バイオテクノロジー」； ７ａ巻、酵素技術（ＪＦＫennedy編）、第７章、347-404頁、ＶＣＨ Ｐublisher s、Ｃambrige、ＵＫ、1987 参照）。酵素は、例えば原子価、イオンまたは疎水 性相互作用によって支持体に結合されるか、この他には、ゲル若しくは繊維にト ラップするか、或いはミクロカプセル化することによる物理的吸着によって支持 体に結合される。 適切な支持体物質には、セルロース、澱粉、デキストラン、アガロース、アル ギネート及び蛋白質のような天然ポリマー、ポリアクリルアミド、ポリアクリレ ートおよびポリメタクリレート、およびスチレンベンゼンコポリマーのような合 成ポリマー、またはシリカ、ベントナイト、ガラスおよび金属のような鉱物が含 まれる。 固定化の特に好ましい方法は、臭化シアン若しくはグルタルアルデヒドのよう な活性化試薬を用いて酵素を支持体に原子価結合すること、またはオキシラン、 ヒドラジン、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、カルボニルジイミダゾールまたは ピリジルジチオプロピルのような反応性基で酵素と支持体を原子価結合すること によるものである。特に好ましい支持体には、架橋したポリアクリルアミド、ア ガロースおよびシリカが含まれる。 基質を酵素と接触するための他の方法には、膜反応器の使用、即ち、Ｐseudo- monas vesicularis Ｂ965 またはセファロスポリンＣアミドヒドロラーゼを産生 するか、若しくは潜在的に産生するこれらの継代物と、セファロスポリンＣ（ま たは誘導体）を産生する繊維状菌を同時に培養することによるものである。 本明細書中で使用される「セファロスポリンＣアミドヒドロラーゼを産生する か、若しくは潜在的に産生するこれらの継代物」の語は、自発的または誘導され た突然変異によって生じうる Ｐseudomonas vesicularis Ｂ965 の全ての突然変 異体であって、これら以外のものがセファロスポリンＣアミドヒドロラーゼを産 生しないものを包含することを意図している。しかし、これらの遺伝物質が、ま だ、 標準の組換えＤＮＡ技術を適用してセファロスポリンＣアミドヒドロラーゼを発 現することができるという事実から、幾つかの非産生物がなお、「潜在的に産生 する継代物」となるであろうことに注意するべきである。 菌株の改良の手段としての突然変異誘発の方法は、当分野で周知である。最新 の組換え技術は、例えば、他の微生物、例えばＥ.coliのような他の微生物にお いて Ｐseudomonas vesicularis Ｂ965 の遺伝物質の全てまたは一部の発現を含 む菌株の改良のより直接的手段を提供する。セファロスポリンＣアミドヒドロラ ーゼの発現をコードする組換え遺伝子を Ｐseudomonas の親株に再導入しても、 またはしなくてもよい。当分野で周知の他の発現系を使用して、大量の本発明に 従った使用のためのセファロスポリンＣアミドヒドロラーゼを産生する。Ｐseud omo-nas vesicularis Ｂ965 の全て若しくは部分的な遺伝物質の発現、または何 れかのセファロスポリンＣアミドヒドロラーゼを産生するか、または潜在的に産 生するこれらの継代物は本発明の更なる側面を構成する。 本発明の更なる理解を助けるために含まれる以下の制限を意味しない例には、 以下の略号を使用した。 Ｃｅｐ Ｃ セファロスポリンＣ ７ＡＣＡ ７−アミノセファロスポラン酸 ＧＬ−７ＡＣＡ ７−β−（４−カルボキシブタナミド）−セファロスポ ラン酸（グルタリル７−ＡＣＡ） ｋｂ キロベース ＤＴＴ ジチオトレイトール ＥＤＴＡ エチレンジアミン四酢酸 ＭＯＰＳ ３−［Ｎ−モルホリノ］プロパンスルホン酸 ＳＤＳ ラウリル硫酸ナトリウム ＳＤＳ ＰＡＧＥ ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動 Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ トリス（ヒドロキシメチル）アミノエタン塩酸塩 ＴＳＢ トリプトン大豆肉汁（tryptone soya broth） ＤＭＡＢ ｐ−ジメチルアミノベンズアルデヒド ２ＭＥ ２−メルカプトエタノール ＰＶＤＦ ポリビニリデンジフルオライド ｇａｃ ＧＬ−７ＡＣＡおよびＣｅｐｈ Ｃアミノヒドロラーゼ コード遺伝子調製例１：Ｐseudomonas vesicularis から得られたアミノヒドロラーゼ酵素活 性体の取り出しとアッセイ （ａ）天然単離物のスクリーニング系 微生物単離物を、ＬＲ Ｈawker ＆ Ａ Ｈ Ｌinton,"Ｍicro-Ｏrganisms: Ｆun ction,Ｆorm and Ｅnviroment",(Ｅdward Ａrnold Ｐubs.1971)；ＲＧ Ｂoard ＆ Ｄ Ｗ Ｌove-lock，"Ｓampling-Ｍicrobiological Ｍonitoring of Ｅnviron ments"，(Ａcademic Ｐress,1973)；Ｊ Ｍ Ｌynch ＆ Ｎ Ｊ Ｐoole,"Ｍicrobia l Ｅcology:Ａ Ｃonceptual Ａp-proach",(Ｂlackwell Ｓcientific,1979)；お よび"Ｔhe Ｏxoid Ｍanual,5th Ｅdition",(Ｏxoid Ｌimited,Ｗade Ｒoad,Ｂas ingstoke,Ｈants,ＲＧ24 0ＰＷ)で典型化された標準の微生物学的方法を使用し て広範囲の周囲のサンプルから取り出した。 天然から得られる１０５，０００以上の単離物を、アミドヒドロラーゼ活性の スクリーニングで、およそ２６０，０００のアッセイを含むアッセイ系にかけた 。このアッセイ系では、単離物を、酵素基質混合物に接種源を供給するために、 寒天で固化させた複合媒体で成長させる。初期のスクリーニングの間に酵素基質 混合物は、典型的には１００ｍＭ のリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）；３ｍg/ ｍl のＣｅｐｈ Ｃ；３ｍg/ｍl のＧＬ−７ＡＣＡ；１３．５ｍg/ｍl のクロキ サシリンを含有する。新たに成長させた細胞のサンプルを１６から２４時間酵素 基質混合物中で培養した。産生された７ＡＣＡをＤＭＡＢと反応させ、次いで Ｂalsingham et al(Ｂiochim.Ｂiophys.Ａcta,276,250-256)の方法で検出した。 この初期スクリーニングから、３８の単離物がＧＬ−７ＡＣＡに対してアミド ヒドロラーゼ活性を有すると同定された。更なる試験を、以下に説明する調製１ （ｄ）および１（ｅ）の方法を用いて行い、Ｃｅｐｈ Ｃに対してアミドヒドロ ラーゼ活性を同定した。ＧＬ−７ＡＣＡアミドヒドロラーゼ活性を３８の単離物 のうち、１種類の菌株のみ（単一の散布から誘導された４種類の娘単離物に存在 する。）がＣｅｐｈ Ｃとのアミドヒドロラーゼ酵素活性を有していた。 （ｂ）菌株Ｂ９６５ Ｐseudomonas vesicularis 株 Ｂ965 の細菌学的特徴は以下の通りである。 １． 形態学 １．１ コロニーの色（栄養寒天またはＴＳＢ寒天で成長されたもの）−卵黄の 黄色、半透明 １．２ コロニーの形態学−３０℃で３日後、丸く、規則正しく、均質な、凸面 状の、平坦な光沢のある０．５ｍｍ直径 １．３ 細胞タイプ−桿菌、約１．５μｍ長 １．４ グラム−陰性 １．５ 運動性−陽性 １．６ 胞子−陰性 １．７ 成長温度−最適３０℃、３７℃＋；４１℃− ２． 生化学的特徴 （ｃ）培養条件 菌株を、寒天プレート上での単一の単離されたコロニーの二次培養によって維 持した。多くの複合寒天培地、特にトリプトン大豆肉汁（ＴＳＢ；オキソイドＣ Ｍ１２９）＋２．０％ｗ／ｖ寒天が良好な成長を持続させた。この培地は、７． ３±０．２のｐＨ、および以下の組成を有する。 成 分 ｇ／Ｌ カゼインの膵臓消化物 １７．０ 大豆ミールのパパイン消化物 ３．０ 塩化ナトリウム ５．０ 二塩基性リン酸カリウム ２．５ デキストロース ２．５ 寒天パウダー ２０．０ 細胞を、寒天プレートの表面でストリークし、２７．５℃で２〜６日インキュ ベートした。寒天プレートを４℃で保存した場合、コロニーは数週間生存能力を 維持した。 長期間の保存のためには、寒天プレートから得た単一コロニーを１０ｍl の液 体培地に接種する。バクテリアの成長のためにデザインされたほとんどの複合培 地は安定であり、特にＬ−肉汁を使用することができる。これは以下の組成を有 する。 成 分 ｇ／Ｌ バクトトリプトン（Ｂacto tryptone） １０．０ 酵母抽出物（oxoid L21） ５．０ 塩化ナトリウム １０．０ 接種された肉汁を、２２０rpm で振蘯しながら２７．５℃でインキュベートし た。２４時間後、この肉汁を遠心した。細胞ペレットを、１ｍl の５％グリセロ ール水溶液に再懸濁し、アリコートとして−２０℃で保存した。 （ｄ）酵素活性試験 基質バッファーは、１３．５ｍg/ｍl のクロキサシリンおよびＧＬ−７ＡＣＡ （３ｍg/ｍl）またはセファロスポリンＣ（１０ｍg/ｍl）を含有する５０ｍＭの リン酸ナトリウムバッファーｐＨ７．０よりなる。細胞懸濁物または半精製酵素 サンプルを基質バッファー中、３７℃で２４時間までインキュベートした。適切 なときに、１００μｌのサンプルを採取し、８００μｌの１Ｍクエン酸塩−リン 酸塩バッファー（ｐＨ４．２）と混合した。次に、フルラム試薬（fluram reage nt）の１００μｌのアリコートを加えて混合し、サンプルを室温で１時間インキ ュベートした。フルラム試薬は、フルオレスカミン（fluorescamine）（Ｓigma Ｃhemical Ｃo）が乾燥アセトン中に１ｍg/ｍl で存在するものである。反応混 合物中の７ＡＣＡの存在は、遊離の一級アミン基の誘導体化の後、キャリアー流 体として１０％アセトン水溶液を用いるフローインジェクションアッセイ系で、 ３７ ８ｎｍの波長で励起し、４９５ｎｍの放出光を検出する蛍光スペクトル法を用い て検出される。 加えて、７ＡＣＡの産生もＨＰＬＣシステムで示された。酵素反応混合物を上 記のように誘導体化し、２０μｌのサンプルを、 ＨＰＬＣグレードの水中に３ ５％アセトニトリル、０．１％トリフルオロ酢酸を含む移動相で、１．５ｍl/分 の流速を用いて３２℃において１５cmのハイパージルＯＤＳ５μカラムにかけた 。蛍光スペクトル法による検出は上記の通りである。このシステムでは、基準と なる真正の７ＡＣＡは、１０．５分にマイナーな分解物ピークを伴った、６．７ 分の保持時間を有する。 これらの条件を用いた典型的な実験で、１０μｌの接種用ループを満たすのに 十分なＢ９６５細胞が、基質としてＧＬ−７ＡＣＡを用いる１８時間のインキュ ベートで３２０μｇ／ｍlの７ＡＣＡを産生した。 （ｅ）酵素の取り出し Ｂ９６５細胞は、基本的に調製例１（ｂ）の方法によってＴＳＢ寒天プレート 上で培養された。該細胞を酵素バッファに採集し、洗浄し、最後に１０ｍl の冷 却した酵素バッファに再懸濁した。酵素バッファーは、１ｍＭのＤＴＴおよび１ ｍＭのベンズアミジンを含有する１００ｍＭのリン酸バッファー（ｐＨ７．０） である。細胞を、６５０Ｗの出力のソニケーター（モデルＷ−３８０、Ｈeat Ｓ ystem Ｕltrasonics Ｉnc,1938 Ｎew Ｈighway,Ｆramingdale,ＮＹ 11735,ＵＳ Ａ）を用い、パワーセッティング２〜３、５０％サイクルで１２分間超音波処理 して溶解した。抽出物を１８，０００ｇにおいて、４℃で１５分間遠心して不純 物を除去した。上清を取り出し、酵素バッファーで１０ｍl 容積に調節し、次い で固体硫酸アンモニウムを、４℃で穏やかに混合しながら３０％の飽和度までゆ っくり加えた。この溶液を上記のように遠心して不純物を除き、上清を上記のよ うに固体の硫酸アンモニウムをゆっくり加えることによって６０％の飽和度に調 節した。沈殿した物質を上記のような遠心で採集し、飽和硫酸アンモニウム上に 保存した。 アミドヒドロラーゼの更なる精製を、酵素の性質を同定するためのＦＰＬＣシ ステム（Ｐharmacia ＬＫＢ Ｂiotechnology,Ｓ-751 82 Ｕppsala,Ｓweden）を 用いて 行った。 ３０〜６０％飽和度硫酸アンモニウム沈殿物から取り出された物質をＭＯＰＳ バッファ（１０ｍＭＭＯＰＳ ｐＨ８．０；１ｍＭＤＴＴ；１ｍＭ ベンズアミ ジン）に再懸濁した。この溶液を短時間の遠心、ついで０．２ミクロンのフィル ターを通す濾過によって不純物を除いた。酵素混合物の５ｍl のアリコートを、 ＭＯＰＳバッファーで予め平衡にされたＨＲ５／５ＭｏｎｏＱカラムにかけた。 アミドヒドロラーゼ活性体が、導入の後、２〜４ｍl の間の溶出物中に取り出さ れた。このフラクションを硫酸アンモニウムの３０％飽和度に調節し、ＨＲ１０ ／３０フェニルスフェロースカラムに導入した。タンパク質の溶出を、１００ｍ Ｍ リン酸ナトリウムｐＨ７．０、１ｍＭＤＴＴよりなるランニングバッファー を用いて、硫酸アンモニウムの３０％〜０％飽和度で変化する塩勾配を用いて行 った。アミドヒドロラーゼ活性体を、これらの条件下で１８．５％〜１５．０％ の間の飽和度の硫酸アンモニウムで取り出した。 これらの精製ステップに続いて、以下の典型的な値のアミドヒドロラーゼ活性 体を調製例１（ｃ）の方法を用いて得た。 （ｆ）セファロスポリンＣアミドヒドロラーゼ酵素の特性 物理的特性 １．ゲル濾過による見かけ上の分子量：７００００±４０００ ２．ＳＤＳ−Ｐａｇｅによるサブユニット分子量：α３０，０００、β６０，０ ００ ３．見かけ上の化学量論量：α１β１ ４．等電点：ｐｌ １０．５±０．２ ５．疎水度：ブチル−、ヘキサニル−、オクチル−またはデシル−誘導体化アガ ロ ースに結合せず、６５０〜８００ｍＭ 硫酸アンモニウムでの溶出でフェニル誘 導化アガロースと結合する。 ６．１ｍＭＤＴＴの存在下で安定である。 ７．５０％若しくはこれ以上の飽和度の硫酸アンモニウム溶液から沈殿する。動力学 １．最適ｐＨ：８（効果的な範囲７〜９） ２．最適温度：４０℃（４５℃まで安定） ３．Ｋ_m：１．２〜７．２ｍＭでのＧＬ−７ＡＣＡ基質、Ｋ_m＝２〜４ｍＭ； ０．５〜１．５ｍＭでのＣｅｐｈ Ｃ基質、Ｋ_m＝０．０１２ｍＭ ３．６ｍＭ〜１３２ｍＭでのＣｅｐｈ Ｃ基質、Ｋ_m＝６０〜１００ｍ Ｍ ４．阻害剤：硫酸アンモニウム＞６％ｗ／ｖ ５．最大特異活性 Ｃｅｐｈ Ｃ基質を使用した場合、０．１４１μmol ７Ａ ＣＡ／分／ｍｇ酵素 調製例２：アミドヒドロラーゼをコードする遺伝子のクローニング及び同定 （ａ）Ｐ.vesicularisゲノムＤＮＡの単離 微生物を、１００ｍl のＬ−肉汁中、２８℃で後期対数相（late-log phase） で成長させた。この細胞を遠心（４０００ｇ、１０分）によりペレット化し、５ ｍlのＴＮＥＳバッファー（２００ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）；２５ ０ｍＭＥＤＴＡ；０．５％ＳＤＳ）に再懸濁した。３７℃で１時間後、プロテイ ナーゼＫを５０μｇ／ｍl まで加え、３７℃で１時間インキュベートを続けた。 ＴＮＥＳバッファで飽和された、フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコ ール（５０；４０：１）を等容量加え、懸濁物を１５秒間ボルテックスした。室 温で１０分後、層を遠心（１５，０００ｇ、１０分）で分離した。２容量の無水 エタノールをゆっくり上清に加え、高分子量のＤＮＡをガラス棒に巻いた。この ＤＮＡをＴＥバッファー（１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ，１ｍＭＥＤＴＡ，ｐＨ８ ．０）に溶解した。 （ｂ）Ｐ.vesicularis遺伝子ライブラリーの構築 約１５０μｇのＰ.vesicularisＤＮＡを９００μｌ反応物中で５ユニットのＳ au 3Ａl で１５分間消化した。このＤＮＡをエタノールを用いて沈殿させ、５０ ０μｌのバッファーに再懸濁し、１ＭＮａＣｌ、２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐ Ｈ８．０）、５ｍＭＥＤＴＡ中で作成された３８ｍl の１０〜４０％蔗糖グラデ ィエントに導入した。一夜遠心（ＳＷ28 ローター、Ｂeckman Ｌ８-Ｍ 超遠心機 中２６０００rpm、１５℃）した後、５００μｌのフラクションを得、ＤＮＡを エタノールで沈殿させ、アガロースゲル電気泳動で分析した。 約２００ngの脱ホスホリル化されたＢamＨＩ消化されたpＳＵ18ベクターを標 準的な方法で調製した。プラスミドpＳＵ18を Ｄr Ｆ de la Ｃruz（Ｄepartmen to deＢiologio Ｍolecular,Ｕniversidad de Ｃantabria,39001Ｓatander,Ｓpa in）から得、pＳＵ2173（Ｍartinez et al,Ｇene,68(1988)p159-162）から誘導 した。調製した ベクターを、約５００ngサイズの分別されたＰ.vesicularisＤＮＡと結紮した。 結紮を、１４℃で一夜、２０μｌの容積で１Ｕ Ｔ４ ＤＮＡ リガーゼを用いて 行った。結紮混合物は、広く利用可能なＥ.coli株 ＮＭ522 に形質転換を起こさ せる。形質転換体をＬ寒天プラスクロマムフェニコール（３０μｇ／ｍl）で選 別した。 （ｃ）アミドヒドロラーゼをコードするクローンの同定 単一のコロニーを、３０μｇ／ｌのクロラムフェニコールを含有するＬ寒天プ レートに散布し、２７．５℃で２〜４日成長させた。培養物のアリコートを１０ μｌの接種用ループを用いて取り出し、次いで０．５ｍl の基質バッファーに再 懸濁し、更に調製例１（ｃ）の手順に従って処理した。アミドヒドロラーゼ活性 を有する単離物をこれらの方法によって同定した。 （ｄ）クローンのアミドヒドロラーゼ活性 調製例２（ｃ）の方法によって同定されたクローンは組換えプラスミド上に活 性な gac 遺伝子を有する。更なる誘導体プラスミドは、標準的方法によってpＳ Ｕ18にgac 遺伝子を導入するために８．１ｋｂＰstl フラグメントをクローニン グすることによって構築される。このプラスミドを pＶＳ42 と命名した。pＶＳ 42のＰ.vesicularisＤＮＡ部分の制限マップを図１（ａ）に示した。ＧＬ−７Ａ ＣＡまたはセファロスポリンＣを基質として使用したアミドヒドロラーゼ活性は 、Ｅ.coli/pＶＳ42と、調製例１（ｃ）の方法によって全細胞を用いた元のＰ.ve sicularis単離物との間でほぼ等しい。 Ｅ.Ｃoli Ｂ1113を、調製例１（b）の方法に従ってＴＳＢ寒天プレートで成長 させた。集塊した細胞成長物を、基本的に調製例１（ｄ）の手順に従ったアミド ヒドロラーゼを取り出すために、抽出物が細胞を含まなくなる段階まで加工した 。 アミドヒドロラーゼ活性体を、該細胞を含まない抽出物をＤＥ５２セルロース カラム（Ｗhatman Ltd,Ｍaidstone,Ｋent ＭＥ14 2ＬＥ）にかけることによって 更に精製した。抽出物内の大量のタンパク質はマトリクッスに結合し、アミドヒ ドロラーゼ活性体は保持されない。 この精製ステップに従って、以下の典型的な値のアミドヒドロラーゼ活性体を調製例１（ｃ）の方法を用いて得た。 更に、サブクローンを、pＶＳ42 プラスミドＤＮＡを制限酵素 Ｋpnl で部分 的に消化し、得られた反応生成物の混合物を結紮し、標準的な方法で Ｅ.coil 株ＮＭ522 に形質転換を起こさせることによって誘導した。調製例１（ｂ）及び １（ｃ）の手順を用いる、得られた単離物のスクリーニングでセファロスポリン Ｃアミドヒドロラーゼ活性の増強された多数のクローンを同定した。このような 単離物の１つが、pＶＳ44 と命名されたプラスミドを含有することが見出された 。pＶＳ44のＰ.vesicularisＤＮＡ部分の制限マップを図１（ｂ）に示した。 セファロスポリンＣアミドヒドロラーゼ酵素活性体を、調製例１（ｂ）および １（ｃ）の手順を用い、次いで上述のようなＤＥセルロースのカラムによって、 抽出物に細胞が含まれなくなる段階まで ＮＭ５22/pＶＳ44 細胞から取り出した 。調製例１（ｃ）を用いた典型的なアッセイでは、１０μｌの抽出物は、５０ｍ g/ｍlのセファロスポリンＣを用いた２７℃、３時間のインキュベートから１２ μｇ／ｍl の７ＡＣＡを産生した。これは、Ｂ1113 株抽出物を用いて得られる 等しい段階の精製で Ｂ1113 株を用いて得られる活性のレベルを超えて約３０倍 改善されることを示している。 （ｅ）アミドヒドロラーゼ活性を改善するための追加のサブクローニング pＶＳ44の活性なgac をコードするＰ.vesicularis由来のＤＮＡフラグメント のサイズを、進行性エンドヌクレアーゼIII酵素消化によって小さくした。方法 論は、Ｈenikoff("Ｍethods in Ｅnzymology",155(1987)156-165)によって開示 されたとおりである。pＶＳ44のＰ.vesicularisＤＮＡ部分への一方向性の欠失 を、ＸhoＩ部位で開始したが、pＳＵ18ＤＮＡ部分は、Ｐ.vesicularisとＥ.coli 由来のＤＮＡとの間の境界を形成するＰstＩ部位で切断することによってエキソ ヌクレアーゼIIIの攻撃から保護した。これらの部位は図１に示されている。酵 素処理および Ｈenikoff（上記引用文献中）の方法を用いた反応生成物の自己結紮に続いて、 Ｅ.coliの形質転換は異なったサイズの欠失を有する変異プラスミドが導入され たコロニーの集団を産生する。該集団を調製例１（ｃ）の方法によってアミドヒ ドロラーゼ活性についてスクリーニングした。全細胞アッセイをスクリーニング に使用した。２日間、２７．５℃で成長させた細胞を満たした１０μｌの接種ル ープを１ｍl の基質バッファー（１０ｍg/ｍl セファロスポリンＣ）に懸濁し、 ３７℃で一夜インキュベートした。このスクリーニングから取り出されたアミド ヒドロラーゼ活性の増強された１つの単離物はプラスミドpＶＳ4461を有してい た。pＶＳ4461のＰ.vesicularis由来の部分は図１（ｃ）に示されている。 pＶＳ4461のＰ.vesicularis部分は、Ｐ.vesicularisＤＮＡが元々挿入されて いたpＳＵ18多重クローニング領域から誘導される制限部位を用いてＥcoＲＩ-Ｈ ind IIIフラグメントとして取り出される。このＥcoＲI-ＨindIIIフラグメント（ 約２．８ｋｂのもの）を、商業的に利用可能なファジミドベクターpＴＺ18Ｒ（ Ｐharmacia Ｐ-Ｌ Ｂiochemicals Ｉnc,Ｍilwaukee,Ｗisconsin 53202,ＵＳＡ） のＥcoＲＩ部位とＨindIII部位の間でクローニングし、pＴＺ1861 と命名された ファジミドを得た。pＴＺ1861のＤＮＡを、β−ラクタマーゼ遺伝子の範囲内の 単一のＳcaＩ部位で切断した。広く利用可能なベクターpＡＣＹＣ184 のプラス ミド誘導体を、テトラサイクリン耐性遺伝子をコードするＤＮＡフラグメントの 起源として使用した。このフラグメントを、鈍端に変換し、単離し、ＳcaＩ部位 で切断され標準的な方法に従ってホスホリル化された pＴＺ1861ＤＮＡに結紮し た。形質転換に続いて、テトラサイクリン耐性に基づいて選別された単離物をア ミドヒドロラーゼ活性についてスクリーニングした。このような活性なテトラサ イクリン耐性単離物が１つ選別され、取り出されたファジミドをpＴＴ1861と命 名した。pＴＴ1861のＰ.vesicularis由来の部分はpＶＳ4461のものと同一であり 、図１（ｃ）に示した。 種々のアミドヒドロラーゼプラスミドを有するＥ.coli株を、５０ｍg/ｍlＣｅ ｐｈ Ｃを含有する基質バッファーに懸濁された、よく成長させた細胞を満たし た１０μｌの接種ループを用いて調製例１（ｃ）の方法によってアミドヒドロラ ーゼ活性についてスクリーニングした。 Ｃｅｐｈ Ｃアミドヒドロラーゼ活性は、２７．５℃で３時間インキュベート した後に評価した。比較試験として、開示したプラスミドおよびファジミドを導 入した単離物の相対活性は以下の通りである。 （ｆ）アミドヒドロラーゼ遺伝子配列 gac 遺伝子のＤＮＡ配列を標準のジデオキシヌクレオチド取り込み法によって 得た。プラスミド pＶＳ42、pＶＳ44 およびこれらのサブクローンのＤＮＡをシ ーケンシング反応のテンプレートとして使用した。シーケンシングを、プラスミ ドのlacＺ'部分にアニーリングする、商業的に利用可能なオリゴヌクレオチドプ ライマーから、またはgac 遺伝子の範囲内にアニーリングするためにデザインさ れたオリゴヌクレオチドから開始した。二本鎖ＤＮＡを、製造者の仕様書に従っ て、Ｓ-400 Ｓpun Ｃolunms を用いて精製し、次いでプライマーと混合し、１／ ５vol の１ＮＮａＯＨを用いて３７℃で１０分間処理した。調製物を１ＮＨＣｌ で中和し、標準の方法論（Ｓequenase Ｖersion 2.0 Ｋit;ＵＳ Ｂiochemical Ｃorp）に従ったシーケンシング反応に使用した。幾つかの高度にＧＣに富んだ 領域は、配列圧縮または早期反応停止を介してシーケンシング人工産物を出現さ せた。これらは、製造者の推奨する手順（ＵＳ Ｂiochemical Ｃorp）および Ｆ awcett および Ｂartlett（Ｂio Ｔechniques,9,46-49(1990)）の方法に従って 、デオキシグアノシン三リン酸の代わりにデオキシイノシン三リン酸を用いるこ と、およびＰＡＧＥによって解析する前に末端デオキシヌクレオチジルトランス フェラーゼでシーケンシング産物を更に反応することを組み合わせて解析された 。幾つかの配列は、欠失サブクローンから誘導された。欠失を、Ｈanikoff（上 記参照文献中）の方法に従ったエキソヌクレアーゼIII消化を用いて構築した。 誘導されたＤＮＡ配列およびこれら由来のアミノ酸配列を配列識別番号に示した 。 （ｇ）アミドヒドロラーゼアミノ酸配列 pＴＴ1861 プラスミドによってコードされるgac 遺伝子により特徴づけられる アミドヒドロラーゼ酵素をアミノ酸配列分析のために同質になるまで精製した。 Ｅ.coli 株 ＮＭ522/pＴＴ1861 を、１０μｇ／ｍl のテトラサイクリンを補充 し、１．５％w/v 寒天で固定化したＴＳＢ培地上で成長させた。成長を３７℃で １８時間行った。寒天表面から削り取ることによって取り出した約１ｇの細胞ペ ーストを洗浄し、４ｍl の氷冷したリーシスバッファ（１０ｍＭＭＯＰＳ ｐＨ ８．０；１ｍＭＤＴＴ；１ｍＭ ベンズアミジン）に再懸濁した。細胞を超音波 処理（６５０Ｗ出力のソニケーター、パワーセッティング２で２分間のパルスを ４回；氷で冷却されたサンプル）して溶解した。溶解物を１５，０００rpm で３ ０分遠心して不純物を除去した。酵素精製を、Ｐharmacia ＦＰＬＣ システムを 用いて行った。約１００ｍg の可溶性タンパク質を含有する不純物の除去された 溶解物を、リーシスバッファーで予め平衡にされたＨＲ５／５ＭｏｎｏＱイオン 交換カラムにかけた。アミドヒドロラーゼ活性体は、導入後２〜４ｍl の間の溶 出フラクション中に取り出された。この物質を硫酸アンモニウムで３０％飽和度 に調節し、ＨＲ１０／３０フェニルスペロース疎水性相互作用カラムにかけた。 タンパク質の溶出を、１ｍＭＤＴＴを含有する１０ｍＭ リン酸ナトリウムバッ ファー中、硫酸アンモニウムの３０％から０％まで変化する飽和度の非直線性グ ラディエントを用いて行った。アミドヒドロラーゼ活性体は、分子量７０，００ ０±４０００のタンパク質と等価なフラクションに取り出された。この段階で、 ３種類のタンパク質のバンドがＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｐharmacia Ｐhastsystem） で存在していた。アミドヒドロラーゼ活性体を含有する溶出フラクションを遠心 膜フィルター装置（Ｃentricon 30 Ｍicroconcentrator,Ａmicon Ｄivision of Ｗ Ｒ Ｇrace,Ｄanvers ＭＡ 01923,ＵＳＡ）を用いて濃縮した。約３ｍg のタ ンパク質をこの手順で取り出した。タンパク質のアリコートを、ＳＤＳおよび２ ＭＥで処理し、Ｈames および Ｒickwood により"Ｇel Ｅlectrophoresis of Ｐ roteins:Ａ Ｐractical Ａpproach"（ＩＲＬ Ｐress）に開示された標準的な方 法に従って超純度の試薬を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥにより解析した。約３０，０ ００と６０，０００の分子量の主要なペプチド種を、ＰＶＤＦ膜（Ｐ Ｍatsudai ra,Ｊ Ｂiol Ｃhem.,262,10035-10038(1987)）にブロッティングする ことによって取り出した。この物質を、アップライドバイオシステムズ４７７Ａ タンパク質シーケンサー（Ａpplied Ｂiosystems Ｉnc.，ＦosterＣity，ＣＡ 9 4404,ＵＳＡ）中でエドマン分解によって自動アミノ酸分析にかけた。 以下のＮ−末端アミノ酸配列が得られた。 α−ペプチド（３０，０００の分子量） β−ペプチド（６０，０００の分子量） これらの配列が同定され、これらは配列識別番号１内に存在する。アミノ酸シ ーケンシングによって同定されたα−ペプチド配列は、プラスミドベクターpＴ Ｔ1861 から誘導されたlac Ｚα−ペプチドのＮ−末端と、Ｐ.vesicularis gac 遺伝子から誘導されたα−ペプチドの開始部分との間の融合タンパク質を表す。Iac Ｚ -gac 融合の正確な結合は、図３に詳述されている。結合は、ＤＮＡ配列のＫpnl 部位での正確なインフレーム融合として２つのペプチド配列を結びつける 。このＫpnl 部位が配列内の gac 遺伝子の境界を形成するので、調製例２（ｄ ）および２（ｅ）で概説した構築方法からは、構築物 pＶＳ44 並びに pＶ4461 およびpＴＴ1861 を含めた全ての誘導体が同様な Iac Ｚ-gac 融合を示しすこと になる。このような構築物の全てにおけるアミドヒドロラーゼ活性の発現は天然 のＰ.vesicularis gac プロモーター以外の組換え系に利用できる。調製例３： アミドヒドロラーゼの固定化 （ａ）アミドヒドロラーゼの精製 Ｅ.coli株 ＮＭ522/pＶＳ44 を、１０μｇ／ｍl のクロマムフェニコールを補 充し、１．５％w/v 寒天で固定化されたＴＳＢ培地上で成長させた。成長を、２ ７．５℃で２日間行った。細胞のペーストを、寒天表面を削り取ることによって 取り出し、再懸濁し、リーシスバッファー（１０ｍＭＭＯＰＳ ｐＨ８．０；１ ｍＭＤＴＴ；１ｍＭベンズアミジン）で洗浄した。約６５ｇの細胞ペーストを、 ３５０ ｍl の氷冷したバッファー中で超音波処理（６５０Ｗ出力、パワーセッティング ４、３５ｍl／分で連続的フローヘッドに５回通した；氷で冷却されたサンプル ）して溶解した。溶解物を１５，０００rpm で３０分遠心して不純物を除去し、 ３１２０ｍg の可溶性タンパク質を得た。この物質を、予め平衡にされたＤＥ５ ２セルロースの３００ｍl カラムに通した。導入後１００ｍl〜５００ｍl の間 に溶出されたフラクションには、全体で３９８ｍg タンパク質のアミドヒドロラ ーゼ活性体が含まれていた。このタンパク質を、遠心膜装置（Ｃentriprep 30 c oncentrator,Ａmi-con）を用いて濃縮した。 （ｂ）酵素固定化 濃縮された抽出物（３００ｍg タンパク質、１２．５４ｍl）を、１００ｍＭ リン酸バッファーｐＨ８．０：１ｍＭＤＴＴ；１ｍＭ ベンズアミジンに調節し 、３．０ｇ（乾燥重量）のオキシラン結合されたポリアクリルマトリクッス（Ｅ upergitＣ:Ｒohm Ｐharma ＧmbH,Ｄ-6100 Ｄarmstadt Ｇermany）と混合した。 固定化（これは、液相から除去されるタンパク質によってモニターされる。）は １１６時間で完了した。約１２０ｍg のタンパク質が基質に原子価結合された。 過剰のタンパク質をリン酸バッファーで洗浄することによって除去した。 （ｃ）固定化された酵素の活性 固定化されたアミドヒドロラーゼの活性を、設定点で反応のｐＨを検出し、維 持するようにセットされた自動制御システム（ｐＨ安定システム）を用いて酵素 触媒反応を起こさせることによってモニターした。ｐＨのモニターは、設定点か らのｐＨの低下が蠕動ポンプを起動し、アルカリ滴定剤の投入量の調節が可能と なるように設定した。 水中に５０ｍg/ｍl の基質（ＧＬ−７ＡＣＡまたはＣｅｐｈ Ｃ）を含有する ５０ｍl の容量の反応物を２５℃に維持した。反応を開始するために約３ｇの乾 燥重量（１２ｇの湿潤重量）の固定化された酵素を加える前に、反応混合物を滴 定剤として２ＭＮａＯＨを用いてｐＨ８．０に調節した。この懸濁物をオーバー ヘッドパドルタイプの撹拌器を使用して撹拌した。反応の進行を、滴定剤の添加 速度 およびインターバルのときのサンプリングによってモニターした。サンプルを、 調製例１（ａ）と同様のＤＭＡＢ方によって７ＡＣＡについてアッセイした。こ の方法によって以下の活性を測定した。 セファロスポリンＣでの最大変換（２２時間）は１．７％であり、基質として ＧＬ−７ＡＣＡでは９．０％の変換が達成された。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:38） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/80 Ｃ１２Ｒ 1:19） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，Ｕ Ｇ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，Ｂ Ｙ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ， ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，Ｍ Ｄ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ， ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 ラムズデン、 マーティン イギリス国、エルエー12・９ディーアー ル、カンブリア、ウルバーストン、ノー ス・ロンズデイル・ロード（番地なし）、 グラクソ・オペレーションズ・ユーケー・ リミテッド内 (72)発明者 イリング、 グラハム・ティモシー イギリス国、ディーディー10・８イービ ー、スコットランド、モントローズ、コブ デン・ストリート（番地なし）、グラク ソ・オペレーションズ・ユーケー・リミテ ッド内 (72)発明者 ハリソン、 レスリー・アン イギリス国、エルエー12・９ディーアー ル、カンブリア、ウルバーストン、ノー ス・ロンズデイル・ロード（番地なし）、 グラクソ・オペレーションズ・ユーケー・ リミテッド内 (72)発明者 マイシュマン、 ニコラス・ジョン イギリス国、ビーアール３・３ビーエス、 ケント、ベッケンハム、サウス・エデン・ パーク・ロード、ラングレイ・コート（番 地なし）、グラクソ・ウェルカム・ピーエ ルシー内 (72)発明者 スペンス、 デイビッド・ウイルソン イギリス国、エルエー12・９ディーアー ル、カンブリア、ウルバーストン、ノー ス・ロンズデイル・ロード（番地なし）、 グラクソ・オペレーションズ・ユーケー・ リミテッド内 (72)発明者 スレイド、 アンドリュー イギリス国、エルエー12・９ディーアー ル、カンブリア、ウルバーストン、ノー ス・ロンズデイル・ロード（番地なし）、 グラクソ・オペレーションズ・ユーケー・ リミテッド内

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． セファロスポリンＣまたはその誘導体を、７−アミノセファロスポラン 酸またはその対応する誘導体に変換する一段階変換方法であって、前記セファロ スポリンＣまたはその誘導体を、Ｐseudomonas vesicularis Ｂ965、または、何 れかのセファロスポリンＣアミドヒドロラーゼを産生するか、或いは潜在的に産 生するこれらの継代物から誘導されるセファロスポリンＣアミドヒドロラーゼで 処理することを具備した方法。 ２． セファロスポリンＣまたはその誘導体を、７−アミノセファロスポラン 酸またはその対応する誘導体に変換する一段階変換方法であって、前記セファロ スポリンＣまたはその誘導体を、Ｐseudomonas vesicularis Ｂ965、または、何 れかのセファロスポリンＣアミドヒドロラーゼを産生するか、或いは潜在的に産 生するこれらの継代物のＤＮＡの発現から誘導されるセファロスポリンＣアミド ヒドロラーゼで処理することを具備した方法。 ３． セファロスポリンＣまたはその誘導体を、７−アミノセファロスポラン 酸またはその対応する誘導体に変換する一段階変換方法であって、前記セファロ スポリンＣまたはその誘導体を、配列識別番号１のＤＮＡ配列の一部または全部 を含有するＤＮＡ；またはこれらの遺伝コードまたは対立または機能性変異の結 果として生じるＤＮＡ配列変性体の発現から誘導されるセファロスポリンＣアミ ドヒドロラーゼで処理することを具備した方法。 ４． 請求の範囲第３項または４項に記載の方法であって、セファロスポリン Ｃアミドヒドロラーゼが、配列識別番号１の配列の一部または全部を含有する組 換えＤＮＡ分子；またはこれらの遺伝コードまたは対立または機能性変異の結果 として生じるＤＮＡ配列変性体の発現から誘導される方法。 ５． 請求の範囲第１項から第４項の何れかで調製された７−アミノセファロ スポラン酸を用いた、セファロチン、セファロリジンおよびセフロキシンを含有 する群から選択される半合成セファロスポリンの製造方法。 ６． 請求の範囲第１項から第４項の何れかに記載の方法であって、セファロ スポリンＣアミドヒドロラーゼが固定化されている方法。 ７． 真核生物または原核生物ホスト内でセファロスポリンＣアミドヒドロラ ーゼを発現する方法であって、 ａ）ホスト細胞を、 （ｉ）ホスト細胞内で機能する発現コントロール配列、および （ii）発現コントロール配列に外科的に結合されたセファロスポリンＣアミ ドヒドロラーゼをコードする組換えＤＮＡ配列 を含有する組換えＤＮＡ発現ベクターで形質転換すること、 ｂ）ステップａ）で形質転換されたホスト細胞を、セファロスポリンＣアミドヒ ドロラーゼ活性の発現を可能にする条件下で培養すること、 を具備した方法。 ８． 真核生物または原核生物ホスト内でセファロスポリンＣアミドヒドロラ ーゼを発現する方法であって、組換えＤＮＡ配列が、配列識別番号１またはこれ らの対立変異若しくは他の機能的に等価なこれらの変異のアミノ酸配列を有する セファロスポリンＣアミドヒドロラーゼポリペプチドをコードする方法。 ９． 実質的に精製された形態で、Ｐseudomonas vesicularis Ｂ965 から誘 導されるセファロスポリンＣアミドヒドロラーゼ。 １０． 固定化された請求の範囲第９項に記載のセファロスポリンＣアミドヒ ドロラーゼ。 １１． ７−アミノセファロスポラン酸の製造方法における請求の範囲第９項 または第１０項に記載のセファロスポリンＣアミドヒドロラーゼの使用。