KR100327881B1

KR100327881B1 - 3-(카르복시에틸티오)프로피오닐-7-adca를경유하여7-adca를제조하는효율적인방법

Info

Publication number: KR100327881B1
Application number: KR1019960700485A
Authority: KR
Inventors: 아리 란스 보벤베르그 로엘로프; 피에테르 코에크만 베르투스; 회케마 안드레아스; 메트스케 반 데르 란 잔; 베르베이 잔; 데 브롬 에릭
Original assignee: 한스 발터 라벤; 디에스엠 기스트 베.파우.
Priority date: 1993-07-30
Filing date: 1994-07-29
Publication date: 2002-07-02
Also published as: JP3574453B2; HU9600195D0; CZ15796A3; PL312747A1; WO1995004149A1; CA2168004A1; BR9407104A; CN1128545A; HU219265B; US5795733A; CN1087780C; ATE234926T1; KR960704048A; SK282617B6; PT711348E; PL180565B1; EP0711348A1; CZ285622B6; EP0711348B1; HUT75367A

Abstract

아실트랜스피라제와 함께 엑스판다제를 발현하는 Penicillium chrysogenum 형질전환체 균주를 사용하여, 3-(카르복시에틸티오) 프로피오닐-7-ADCA를 경유하여 7-아미노데스아세톡시세팔로스포란산(7-ADCA)을 제조 및 회수하는 전체적으로 효율적인 방법이 제공된다.

Description

3-(카르복시에틸티오)프로피오닐-7-ADCA를 경유하여 7-ADCA를 제조하는 효율적인 방법

제 1도는 플라스미드 pMcTNE의 기능 지도,

제 2도는 플라스미드 pMcTSE의 기능 지도,

제 3도는 플라스미드 pMcTNde 의 기능 지도,

제 4도는 플라스미드 pGNETA의 기능 지도,

제 5도는 플라스미드 pGSETA의 기능 지도,

제 6도는 플라스미드 pANETA의 기능 지도,

제 7도는 플라스미드 pASETA의 기능 지도이고,

제 8도는 PCR 생산물 1의 서열 (윗줄) 과 함께 정렬된 노카디아 락탐듀란스(Nocardia lactamdurans) cefE (Coque et al., supra)의 DNA서열 (아랫줄)이다.

발명의 분야 그래고 종래기술의 간단한 설명

본 발명은 7-아미노데스아세톡시세팔로스포란산(7-ADCA)의 생합성 제조방법 및 회수에 관한 것이다.

β - 락탐 항생제는 항생제합물중에서 가장 중요한 군을 구성하며, 오랜기간동안 임상적으로 사용되어 왔다. 이들 군중에서, 우수한 것은 페니실린 및 세팔로스포린이다. 이들 화합물들은 사상균류 페4실리움 크리소제눔(Penicillium chrysogenum) 및 아크레모니움 크리 소제눔(Acremonium chrysogenum) 각각에 의해 천연적으로 생산된다.

고전적인 균주개량기술의 덕택으로, 페니실리움 크리소제눔(Penicillium chrysogenum) 및 아크레모니움 크리소제눔(Acremonium chrysogenum)에서 항생제를 생산하는 수준이 과거 수십년동안 놀랄만큼 증가되었다. 페니실린 및 세팔로스포린에 이르는 생합성 경로에 관한 지식이 증가되고 재조합 DNA 기술이 도래함에 따라, 생산균주의 개량 및 화합물의 생체내 유도를 위한 새로운 기구들이 이용가능하게 되었다.

Ingolia 및 Queener, Med. Res. Rev. 9 (1989), 245-264 (biosynthesis route and enzymes), 및 Aharonowitz, Cohen, 및 Martin, Ann. Rev. Microbiol. 46 (1992), 461-495(gene cloing)에서 알 수 있는 바와 같이, β - 락탐 생합성에 관련된 대부분의 효소는 동정되었고 그것들에 상응하는 유전자가 클로닝되었다.

페니실리움 크리소제눔(P. chrysogenum)에서 페니실린을 생합성하는 단계중 처음 두 단계는 3개의 아미노산 L-5-아미노-5- 카르복시펜타노산(L- α - 아미노아디프산)(A), L-시스테인(C) 및 L-발린(V) 을 축합하여 트리펩티드 LLD-ACV를 만들고, 이어서 이러한 트리펩티드률 고리화하여 이소페니실린 N을 형성케 하는 것이다.

세번째 단계는 효소 아실트란스퍼라제(AT)의 작용에 의해 L-5-아미노-5- 카르복시펜타노산의 친수성 측쇄를 소수성 측쇄로 교환하는 것에 관련된다. 페니실린 G 생산을 위한 산업적 방법에서 선택된 측쇄는 페닐아세트산(PA)이다. EP-A-O532341에 아디페이트 (5-카르복시펜타노에이트) 공급원료(feedstock) 의 이용이 개시되어 있다. 이 기질의 혼합은 5-카르복시펜타노일 측쇄를 갖는 페니실린 유도체, 즉 5-카르복시펜타노일-6- 아미노페니실란산의 형성을 초래한다. 이 혼합은 아실트랜스퍼라제가 증명된 광범위한 기질 특이성을 갖는다는 사실에 기인한 것이다(Behrens et al., J. Biol. Chem, 175(l948), 751-809; Cole, Process, Biochem. 1 (1966), 334-318; Ballio et al., Nature 185(1960), 97-99)EP-A-0448180에 기재되어진 바와 같이, AT에 의해 중재되는 효소적 교환반응은 세포소기관, 마이크로바디(microbody) 안에서 일어난다.

세팔로스포린은 페니실린보다 훨씬 더 비싸다. 어떤 세팔로스포린 (예. 세팔렉신) 은 수많은 화학적 전환에 의해 페니실린으로부터 만들어진다는 것이 하나의 이유이다. 다른 이유는 지금까지 단지 D-5-아미노-5- 카르복시펜타노일 측쇄를 갖는 세팔로스포린만이 발효될 수 있기 때문이다. 이점에서 단연코 가장 중요한 출발물질인 세팔로스포린 C는 어떤 pH의 물에서도 매우 잘 용해될 수 있으므로, 성가시고 값비싼 컬럼 기술을 사용하는 길고 비싼 분리방법을 필연적으로 수반한다. 이러한 방법에서 얻어진 세팔로스포린 C는 수많은 화학적 및 효소적 전환에 의해 치료에 사용되는 세팔로스포린으로 전환되어져야 한다.

현재, 중간 생산물 7-ADCA는 페닐실린 G의 화학적 유도에 의해 생산된다. 7-ADCA를 생산하는데 필요한 화학적 단계는 5-원 페니실린 고리 구조를 6-원 세팔로스포린 고리 구조로 확장하는 것에 관련된다. 그러나, 사상(filamentous) 박테리아 스트렙토미세스 클라불리제루스(Streptomyces clavuligerus)로 부터의 엑스판다제(expandase) 효소는 그러한 고리 확장을 수행할 수 있다. Cantwell et al., Proc. R. Soc. Lond, B. 248 (1992), 283-289; 및 EP-A-0532341 및 EP-A-0540210에 기재된 바와 같이, 페니실리움 크리소제눔(P, chrysogenum)으로 도입될 때, 그것은 페니실린 고리구조를 세팔로스포린 고리구조로 전환할 수 있다. 엑스판다제 효소에 관하여는 생화학적으로와 기능적으로 모두 특성이 잘 기술되어 있으며(EP-A-0366354), 그것의 상응하는 유전자도 마찬가지다. cefE 유전자(EP-A-0233715)의 물리적 지도 및 DNA 서열 그리고 페니실리움 크리소제눔(P. chrysogenum)에서의 cefE에 의한 형질전환연구가 기재되어 있다.

적합한 고리 확장 효소를 위한 다른 공급원은 사상박테리아 노카디아 락탐듀란스(Nocardia lactamdurans) (전에는 스트렙토미세스 락탐듀란스(Streptomyces lactamdurans))이다. 효소의 생화학적 성질 그리고 유전자의 DNA서열 양자가 기재되어 있다(et al., J. Gen. Microbiol. 133 (1987), 3165-3174; 및 Corqe et al., Mol. Gen. Genet. 236 (1993), 453-458, 각각).

더욱 구체적으로, EP-A-0532341은 페니실리움 크리소제눔(P. chrysogenum)에서 아실트랜스퍼라제 효소의 기질로서 사용되는 공급원료로서의 5-카르복시펜타노일 측쇄와 함께, 페니실리움 크리소제눔(P. chrysogenum)에서의 엑스판다제 효소의 생체내 사용을 교시한다. 이것은 5-카르복시펜타노일-6-APA의 형성을 이끌고, 이는 페니실리움 크리소제눔(P. chrysogenum) 균주로 도입되어진 엑스판다제 효소에 의해 전환되어 5-카르복시펜타노일-7-ADCA가 생성된다. 최종적으로, 5-카르복시펜타노일 측쇄가 제거되도록 하여, 최종 생산물로서 7-ADCA가 생성된다. 특허출원 EP-A-0540210은 ADCA 고리의 3-메틸 측쇄를 ACA의 3-아세톡시메틸 측쇄로 전환하는 부가적인 단계를 포함하는, 유사한 7-ACA의 제조방법을 기술한다. 그러나, 무엇보다도, 아실트랜스퍼라제 효소의 발현과 동시에 일어나도록 적당한 매에 세포내에서 엑스판다제 효소의 발현이 일어나도록 하는 문제를 인식하지 못했기 때문에, 상기 특허출원은 효율적인 그리고 경제적으로 효과적인 방법을 교시하지 못한다.

대조적으로, 본 발명은 엑스판다제 및 아실트랜스퍼라제가 동시에 발현되도록 하는 효율적인 7-ADCA의 생산 방법을 제공한다.

추가로, 새로운 측쇄 전구물질, 즉 3,3'-티오디프로피온산의 이용이 본 발명에 의해 교시된다. 이 전구물질은 페니실리움 크리소제눔(P. chrysogenum)에 의해 상응하는 페니실린에 매우 효율적으로 통합되며, 그 페니실린은 엑스판다제 효소의 후속적인 작용에 의해 확장될 것이다.

더욱이, 지금까지 탈아실화전에 발효배양액으로부터 7-ADCA유도체를 회수하기 위한 어떠한 효율적인 방법도 기재되어 있지 않다. 본 발명은 7-ADCA 유도체의 회수를 위한 효과적인 용매추출절차를 제공한다.

본 발명에 의해, 지금까지 종래의 당업계에서 개시되거나 제시되지 않은 반응단계로 이루어진, 실제로 효율적인 7-ADCA의 제조방법 전과정이 제공된다.

또한, 본 발명 및 유사물을 EP-A-0540210에 주어진 기재에 따라 적용함으로써, 이러한 방식의 효율적인 전과정의 방법에 의해 7-ACA가 제조될 수 있다.

서열 목록의 간략한 기술

서열 ID Nos. 1 내지 13: 스트렙토미세스 클라불리제루스(Streptomyces clavuligerus) 및 노카디아 락탐듀란스(Nocardia lactamdurans) cefE 유전자를 위한 페니실리움 크리소제눔(P. chrysogenum) 발현 카세트의 구성에 사용되는 올리고뉴클레오티드.

서열 ID No. 14. 노카디아 락탐듀란스(Nocardia lactamdurans) cefE의 DNA 서열(Cosue et al., supra).

발명의 개요

따라서 본 발명은 a) 사상균류 발현신호의 전사 및 해독 조절하에서, 엑스판다제 유전자를 갖도록 페니실리움 크리소제눔(Penicillium chrysogenum) 균주를 형질전환시키는 단계;

b) 배양 배지내에서 상기 균주를 발효시키고 상기 배양 배지에 적합한 3,3'-티오디프로피온산이나 그것의 염 또는 에스테르를 첨가하여 3-(카르복시에틸티오) 프로피오닐-6-아미노페니실란산(3-(카르복시에틸티오) 프로피오닐-6-APA) 를 생성하도록 하며, 이것이 원 위치(in situ) 확장되어 3-(카르복시에틸티오) 프로피오닐-7- ADCA를 형성하도록 하는 단계;

c) 발효배양액으로부터 3-(카르복시에틸티오) 프로피오닐-7- ADCA를 회수하는 단계;

d) 상기 3-(카르복시에틸티오) 프로피오닐-7- ADCA를 탈아실화시키는 단계; 그리고

e) 결정형의 7-ADCA를 회수하는 단계에 의한 7-아미노데스아세톡시세팔로스포란산(7-ADCA)의 제조 및 회수방법을 제공한다.

바람직하게는, 단계(e) 는 여과단계이다.

바람직하게는, 엑스판다제 유전자의 발현이 AT-유전자의 각각의 조절요소의 전사 및 해독조절하에 있도록 하여, 상기 유전자의 발현의 동시적인 타이밍을 제공한다.

바람직하게는, 약 4.5 보다 낮은 pH에서 물과 혼합될 수 없는 유기용매로 배양액 여과물을 추출하고 그것을 4와 10사이의 pH에서 물로 역추출함으로써 3-(카르복시에틸티오) 프로피오닐-7- ADCA가 발효배양액으로부터 회수된다.

게다가, 페니실리움 크리소제눔(P. chrysogenum)의 AT-유전자 또는 아크레모니움 니둘란스(A. nidulans) gpdA유전자의 전사 및 해독조절요소에 작동하게 연결된, 엑스판다제를 암호화하는 DNA로 이루어진 재조합 DNA 벡터 그리고 그것에 의해 형질전환된 숙주세포가 제공된다.

[발명의 상세한 설명]

본 발명은 세팔로스포린 생합성에서의 주요 중간생산물의 유도체, 7-아미노데스아세톡시세팔로스포란산 또는 7-ADCA를 형성하기 위하여, 생합성효소를 위한 새로운 기질의 사용과 함께, 페니실린 고리구조를 생체내 확장을 위한 페니실리움 크리소제눔(P. chrysogenum)내에서의 기능적 유전자 구조체의 사용에 관한 것이다. 본 유도체는 효율적인 용매 추출을 허용하도록 하는 화학적 조성을 가지므로, 경제적으로 매력적인 회수방법을 제공한다.

원칙적으로, 페니실리움 크리소제눔(P. chrysogenum)의 형질전환은 PEG-Ca 중재에 의한 원형질 섭취, 일렉트로포레이션(electroporation) 또는 입자 건(gun) 기술과 같은 여러가지의 DNA 전달수단 그리고 형질전환체의 선택에 의해 성취될 수 있다. 예로서 Van den Hondel en Punt, Gene Transfer and Vector Development for Filamentous Fungi, in: Applied Molecular Genetics of Fungi (Peberdy, Laten, Ogdcn, Bennctt, eds.), Cambridge Univcrsity Press (1991) 를 참조하라. 우성 및 열성 선택표지인자(selection marker)의 이용이 기재되어 있다(Van den Hondel, supra). 상동 (페니실리움 크리소제눔(P. chrysogenum) 유래) 및 비상동 (비- 페니실리움 크리소제눔(P. chrysogenum) 유래) 기원의 선택표지인자가기재되어 있다.

형질전환체의 선택에 있어서, 비- 선택성 DNA에 물리적으로 연결되거나 연결되지 않은, 벡터 서열의 존재 또는 부재에서, 상동 또는 비상동인 여러가지의 형질전환체 선택 표지인자의 이용이 잘 알려졌다.

바람직하게는, 페니실리움 크리소제눔(P. chrysogenm)의 형질전환체를 선택하기 위하여 상동 선택표지인자를 사용하여 페니실리움 크리소제눔(P. chrysogenum)에 도입되는 비상동 DNA의 양을 제한한다. 가장 바람직하게는, 형질전환된 균주로부터 선택적으로 제거될 수 있는 우성 선택표지인자, 예. 아크레모니움 니둘란스(A. nidulans) 또는 다른 사상균류의 amdS 유전자 (유럽특허출원 제94201896.1호)가 사용된다. 어떠한 항생제 내성 표지인자도 본 방법에 관련되지 않거나 주위에 도입되지 않을 것이기 때문에 페니실리움 크리소제눔(P. chysogenum) 형질전환체 선택표지인자의 이들 바람직한 특성은 방법 및 생산물 등록절차에서 매우 이롭다.

가장 바람직한 구체예, 즉 균주로부터 선택적으로 제거될 수 있는 amdS 선택표지인자는 되풀이하여 동일한 우성 선택을 사용하여 형질전환의 반복된 라운드를 가능하게 한다. 신규한 엑스판다제를 발현하는 페니실리움 크리소제눔(P. chysogenum) 균주의 선택표지인자가 없는 특징은 산업상의 균주개량프로그램에서 고- 생산성 균주의 빠른 증식에 중요하다.

고리- 확장 반응은 페니실리움 크리소제눔(P. chrysogenum) 예컨대 균주 Wisconsin 54-1255로 도입되고 그곳에서이러한 방식으로 발현되는 엑스판다제 효소에 의해 매개된다. 또한, 이러한 고리 확장반응은 개선된 β - 락탐 수율을 갖는 그것의 돌연변이체에서도 행해진다. 그러한 경우에, 효율적인 성장을 얻기 위하여 배지조건을 약간 변형시키는 것이 당연할 것이다.

더욱이, 바람직하게는 페니실리움 크리소제눔(P. chrysogenum) 아실트란스퍼라제(AT) 유전자로부터 유래된 각각의사상균류유전자 조절요소의 전사 및 해독 조절하에 cefE유전자가 놓여져서, 아실트랜스퍼라제 효소 그 자체의 작용과 동시에 최적시간 프레임내에서 cefE유전자의 발현이 일어날 수 있도록 한다. 이들 조처는 페니실린 분자상의 고리- 확장반응의 효과에 중요하다.

엑스판다제 및 아실트랜스퍼라제를 코드화하는 유전자의 동시적인 발현에 추가하여, 마이크로바디내에 아실트랜스퍼라제와 함께 엑스판다제 효소 일부의 세포내 공-배치(intracelluar co-localisation) (아실트랜스퍼라제의 세포내 위치) 가 경제적인 생산방법의 개발에 유리할 수도 있다. 이들 바람직한 구체예는 7-ADCA 최종 생산물에 있어서 등록당국에 의해 허용되지 않는 페니실린 부산물의 양을 감소시키는데 크게 공헌할 것이다.

요약하면, 본 발명은 페니실리움 크리소제눔(P. chrysogenum)으로 도입된 엑스판다제 효소의 활성이 동시적인 발현의 관점에서 어떻게 페니실린 고리의 고리확장에 공헌할 수 있는지를 교시한다.

본 발명에 따르면 β - 락탐 중간생산물 3-(카르복시에틸티오) 프로피오닐-7- ADCA는 3,3'- 티오디프로피온산이나 그것의 염 또는 에스테르를 첨가함으로써 페니실리움 크리소제눔(P. chrysogenum)에서생산된다. 적합한 염은 예컨대 나트륨 또는 칼륨의 것들이다. 동일한 것이 단순용매 추출을 통해 배지로부터 효율적으로 회수되며, 예를 들면 다음과 같다.

배양액을 여과하고 물과 혼합될 수 없는 유기용매를 여과물에 첨가한다. 수층으로부터 세팔로스포린을 추출하기 위하여 pH를 조정한다. pH 범위는 4.5보다 낮아야 하고; 바람직하게는 4와 1 사이, 더욱 바람직하게는 2와 1 사이이어야 한다. 이러한 방식으로 발효 배양액에 존재하는 많은 다른 불순물로부터 세팔로스포린이 분리된다. 바람직하게는 적은 양의 유기용매가 사용되어, 세팔로스포린의 농축용액을 만들며, 따라서 체적 유량(volumetric flow rate)의 감소를 성취한다. 두번째 가능성은 4 이하의 pH에서의 전체 배양액 추출이다. 바람직하게는 물과 혼합될 수 없는 유기용매로 4와 1 사이에서 배양액이 추출된다.

세팔로스포린 분자를 간섭하지 않는 어떠한 용매든 사용될 수 있다. 적합한 용매는 예를들면, 부틸아세테이트, 에틸아세테이트, 메틸이소부틸케톤, 부탄을 같은 알콜 등이다. 바람직하게는, 1-부탄올 또는 이소부탄올이 사용된다.

그 후 세팔로스포린이 4와 10 사이, 바람직하게는 6과 9사이의 pH에서 물로 역추출된다. 다시 최종 부피가 급격하게 감소된다. 회수는 0과 50℃ 사이의 온도, 바람직하게는 주위 온도에서 실행될 수 있다.

3-(카르복시에틸티오) 프로피오닐 측쇄를 제거하고 원하는 7-ADCA를 얻기 위하여, 그렇게 얻어진 세팔로스포린 수용액을 적합한 효소로 처리한다.

바람직하게는, 반복적으로 효소를 사용할 수 있도록 하기 위하여, 고정된 효소가 사용된다. 그러한 입자의 제조 그리고 효소의 고정화를 위한 방법론이 EP-A0222462에 광범위하게 기재되어 있다. 수용액의 pH는 예컨대 pH 4내지 pH 9의 값을 갖는데, 이 pH에서 세팔로스 포린의 분해 반응이 최소화되고 효소에 의한 원하는 전환이 최적화된다. 따라서, 예컨대 칼륨수산화물 용액과 같은 무기염기를 첨가하거나 양이온교환수지를 이용함으로써 적당한 수준의 pH를 유지하는 동안 효소가 세팔로스포린 수용액에 첨가된다. 반응이 완료되면, 고정된 효소는 여과에 의해 제거된다. 다른 가능성은 고정된 또는 유동층 컬럼에서 고정화된 효소의 이용, 또는 용액내의 효소의 사용 및 막여과에 의한 생산물의 제거이다. 후속적으로, 반응혼합물은 물과 혼합될 수 없는 유기용매의 존재하에서 산성화된다.

적합한 효소는, 예컨대, 62, 177, 178 및 179 위치들의 하나 또는 그이상에서 돌연변이를 갖는 슈도모나스(Pseudomonas) SY77 미생물로부터 유래된다. 또한 다른 슈도모나스(Pseudomonas) 미생물, 바람직하게는 슈도모나스(Pseudomonas) SY77의 62, 177, 178 및 179 위치들에 상응하는 위치들의 하나 또는 그이상에서 선택적으로 돌연변이를 갖는 슈도모나스(Pseudomonas) SE83으로부터의 효소가 사용될 수도 있다.

pH를 약 0.1 내지 1.5로 조정한 후, 층들을 분리하고 수층의 pH를 2 내지 5로 조정한다. 그다음 결정형의 7-ADCA를 여과한다.

또한, 10℃ 미만의 온도에서 포스포러스펜타클로라이드를 첨가하고 후속적으로 주위 온도 또는 그보다 낮은 온도에서 이소부탄올을 첨가함으로써, 탈아실화가 종래의 기술에서 알려진 바와같이, 예컨대, 이미노클로라이드 측쇄의 형성을 경유하여 화학적으로 실행될 수 있다.

다음의 실시예는 설명을 위하여 제공된 것이며 제한을 위하여 제공된 것은 아니다.

실시예

실시예 1

페니실리움 크리소제눔(Penicillium chrysogenum) 내에서의 스트렙토미세스(Streptomyces) 및 노카디아(Nocardia) cefE 유전자의 발현

a. 일반적인 유전자클로닝 및 유전자형질전환 절차

유전자클로닝 절차에서 사용되는 통상의 기술을 본 출원에서 사용한다. 이들 기술에는 중합효소연쇄반응(PCR), 합성 올리고뉴클레오티드의 합성, DNA의 뉴클레오티드 서열분석, DNA의 효소적 리게이션 및 제한, E. coli 벡터 서브클로닝, 형질전환 및 형질전환체의 선택, DNA의 단리 및 정제, 서던 블로트(southern blot)분석에 의한 DNA의 특성화 그리고³²P 표지 탐침, 임의의 프라이밍(priming) 에 의한 DNA 의³²P 표지화가 포함된다. 이들 기술들은 당업계에서 매우 잘 알려졌고 많은 문헌에 충분히 기재되어 있다. 예컨대, Sambrook et al., Molecular Cloning, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, U.S.A. (1989), Innes et al., PCR Protocols, a Guide to Methods 및 Applications, Academic Press (1990), 및 McPherson et al., PCR, a Practical Approach, IRL Press (1991)을 참조하라.

사상균류의 형질전환 및 형질전환체의 선택에 사용되는 일반적인 방법은 균류 원형질체의 제조, DNA 전이(transfer) 및 원형질체 재생조건, 형질전환체의 정제 및 특성화를 포함한다. 이들 방법은 당업계에서 전부 알려졌고 다음의 문헌에 매우 잘 기재되어 있다: Finkelstein 및 Ball (eds.), Biotechnology of Filamentous Fuugi, technology and Product, Butterworth-Heinemann (1992); Bennett 및 Lasure (eds.), More Gene Manipulatios in Fungi, Academic Press (1991), Turner, in: Puhler (ed.), Biotechnology, second cmopletely revised edition, VCH (1992).

페니실리움 크리소제눔(Penicillium chrysogenum)에 대한 유전자클로닝 및 유전자형질전환기술에 관한 더욱 구체적인 응용들이 Bennett 및 Lasure (supra) 및 Finkelsten 및 Ball (supra) 에 매우 잘 기재되어 있다.

- 제조자의 설명서에 따라 상업용 DNA 합성기(Applied Biosystem, CA, U.S.A.)를 사용하여 합성 DNA 올리고뉴클레오티드를 합성한다.

- 제조자의 설명서에 따라 상업용 자동 PCR 장치(Perkin Elmer, U.S.A.) 및 Ultma DNA 중합효소(Perkin Elmer)를 사용하여 PCR을 실행한다.

- 노카디아 락탐듀란스(N. lactamdurans) 및 스트렙토미세스 클라불리제루스(S. clavuligerus)의 염색체 DNA의 cefE 코딩영역을 증폭할 수 있도록 하기 위하여, hGC PCR 프로토콜(Dutton et al, Nucleic acids Res. 21(NO.12)(1993) 2953-2954)을 사용하였다.

- 제한효소 및 그밖의 DNA 변형효소는 BRL (MD, U.S.A.)로부터 구입하고 제조자의 설명서에 따라 사용한다.

- E. coli 벡터 pBluescript은 Stratagene (CA, U.S.A.)로부터 구입한다.

-사용되어진 그밖의 화학제품은 전부 다양한 공급자로부터 구입된 분석품위이다.

- 제조자의 설명서에 따라 서열- 특이적 형광성 표지의 검출에 기한 자동 DNA서열분석장치(Applied Biosystems)를 사용하여 DNA뉴클레오티드 서열 분석을 실행한다.

b. 미생물의 배양

스트렙토미세스 클라불리제루스(Streptomyces clavuligerus) ATCC 27064를 또한 트립토판으로 처리된 콩(soy) 배양액(Difco)에서 배양한다. 이 균주의 염색체 DNA는 cefE 유전자를 분리하는데 사용된다(Kovacevic et al., J. Bacteriol, (1989), 754-760).

노카디아 락탐듀란스(Nocadia lactamdurans) ATCC 27382를 또한 트립토판으로 처리된 콩 배양액(Difco)에서 배양한다. 이 균주의 염색체 DNA는 cefE유전자를 분리하는데 사용된다(Coque et al., supra).

페니실리움 크리소제눔(Penicillium chrysogenum) Wisconsin 54-1255 (ATCC 28089) 를 완전한 YPD 배니 (YPD: 1%효모 추출물, 2% 펩톤, 2% 클루코즈) 에서 배양한다. 이 균주의 염색체 DNA는 cefE 유전자 발현에 요구되는 penDE 유전자 5' 및 3' 조절영역을 분리하는데 사용된다. 페니실리움 크리소제눔(Penicillium chrysogenum) ATCC 28089 또한 cefE 유전자 형질전환 실험의 숙주로서 사용된다. 개선된 β - 락탐 수율을 갖는, 균주 Wisconsin 54-1255의 돌연변이체를 포함하여, 페니실리움 크리소제눔(Penicillium chrysogenum)의 다른 균주들도 또한 적합하다. 사용되어진 형질전환체 선택표지인자에 따라, pyrG, niaD 또는 facA 유전자의 돌연변이를 함유하는 페니실리움 크리소제눔(P. chrysogenum) 균주들이 사용될 수도 있다. 이들 돌연변이체 균주들은 당업계에서 잘 알려진 방법에 의해 얻어질 수 있다(Cantoral, Bio/Technol. 5 (1987), 494-497; Gouka et al., J, Biotechn, 20(1991), 189-200; 및 Gouka et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. (1993), 514-519).

형질전환에서 사용되는 원형질체의 생산을 위한 페니실리움 크리소제눔(P. chrysogenum)의 배양은 YPD-배지에서도 또한 실시된다.

사용되어진 페니실리움 크리소제눔(Penicillium chrysogenum)의 특정 균주 그리고 이용되는 형질전환체 선택절차에 따라 원형질화 및 재생 절차가 약간 다를 수도 있다.

표준 E. coli 배양 배지(Sambrook, supra) 를 사용함으로써, E. coli WK6 (Zell 및 Fritz, EMBO J. 6 (1987), 1809-1815), XLI-Blue (Stratagene) 및 HB101 (Boyer 및 Roulland-Dussoix, J. Mol. Biol. 41 (1969), 459; Bolivar 및 Backman, Messages Enzymol. 68 (1979), 2040)이 유지되고 배양된다.

c. cdfE 발현 카세트의 구성

cefE 발현 카세트는 표 I에 기재되어 있으며, 이 표는 또한 이들 플라스미드에 대하여 사용되어진 학명을 설명해준다.

표 I

구성되어진 cefE 발현 카세트의 목록

설명:

¹tac = trp-lac 혼성 프로모터

²gpd = 아크레모니움 니둘란스(A, nidulans) gpdA 유전자의 5'-말단

³AT = 페니실리움 크리소제눔(P. chrysogenum) penDE 유전자의 3'-말단

⁴AT = 페니실리움 크리소제눔(P. Chrysogenum) penDE 유전자의 5'-말단

스트렙토미세스 클라불리제루스(S. clavuligerus) cefE 유전자(Kovacevic, supra); 노카디아 락탐듀란스(N. lactamdurans) cefE 유전자(Coque, supre), 아크레모니움 니둘란스(A. nidulans) gpdA 유전자(Punt et al., Gene 69(1988), 49-57); 및 페니실리움 크리소제눔(P. chrysogenum) penDE 유전자(Barredo et al., Gene 83 (1989), 291-300; Diez et al., Mol. Gen. Genet. 218(l989), 572-576)의 공개된 뉴클레오티드 서열은 표 II에 기재된 합성 올리고뉴클레오티드를 고안하기 위하여 사용되어져 왔다.

표 II

노카디아 락탐듀란스(N. lactamdurans) 및 스트렙토미세스 클라불리제루스(S. clavuligerus) cefE 유전자를 위한 페니실리움 크리소제눔(P.chrysogenum) 발현카세트의 구성에 사용되는 올리고뉴클레오티드

cl. E. coli cefE 발현플라스미드 pMCTSE 및 pMCTNE의 구성

PCR, 1: 노카디아 락 탐듀란스(N. lactamdurans) cefE

노카디아 락탐듀란스(N. lactamdurans) 의 염색체 DNA 그리고 올리고뉴클레오티드 1 및 2를 사용한 첫 번째 PCR에서, 5'-말단에 단일 NdeI 제한부위 그리고 3'-말단에 단일 XbaI 부위를 함유하는 0.9kb PCR 생산물로서 노카디아 락탐듀란스(N lactamdurans) cefE 개방 리딩프레임(open reading frame)을 얻었다.

PCR, 2: 스트렙토미세스 클라불리제루스(S. clavuligerus) cefE

스트렙토미세스 클라불리제루스(S. clavuligerus) 의 염색체 DNA 그리고 올리고뉴클레오티드 3 및 4를 사용하는 두번째PCR 에서, 5'-말단에 단일 Ndel 제한 부위 그리고 3'-말단에 단일 XbaI 제한부위를 함유하는 0.9kb PCR 생산물로서 스트렙토미세스 클라불리제루스(S. clavuligerus) cefE 개방리딩프레임을 얻었다.

E. coli 에서 cefE 유전자를 발현시킬 목적으로 그리고 DNA 서열분석에 의한 PCR 생산물의 특성화 목적으로, PCR 생산물 1 및 2를 pMC-5의 유도체인 벡터 pMCTNde로 클로닝하였다(Stanssens et al., Nucleic Acids Res. 17 (1989), 4441). RBS 부위 및 NdeI 클로닝 부위가 뒤따르는 tac 프로모터를 암호화하는 단편을 삽입함으로써, 플라스미드 pMCTNde을 pMC5-8 (유럽특허출원 제 0351029) 로부터 유도했다 (제 3 도).

PCR 생산물 1 및 2를 NdeI 및 XbaI으로 분해하였고 NdeI-XbaI으로 분해된 벡터 pMCTNde에 리게이션시켰다. 리게이션혼합물을 E. coli WK6을 형질전환하기 위하여 사용하였다. 형질전환체를 클로람페니콜에 대한 내성에 의해 선택하였다. 이들 형질전환체들은 플라스미드 DNA를 분리하기 위하여 사용한다. 먼저, 제한단편을 예정대로 생성케하는 제한효소 분해에 의해 cefE 발현카세트삽입체를 분석한다. 예정된 제한효소부위를 함유하는 플라스미드를 자동 DNA서열분석에 의해 최종적으로 분석한다.

플라스미드 pMCTSE(제 2도) 내의 스트렙토미세스 클라불리제루스(S. clavuligerus)cefE 개방리딩프레임의 DNA서열은 공개된 서열(Kovacevic, supra)과 100% 동일하였다.

노카디아 락탐듀란스(N. lactamdurans) cefE 개방리딩프레임을 함유하는, 분석되어진 모든 클론의 DNA서열(제 8도) 은 공개된 서열과 차이가 있었다(Coque, supra).

공개된 노카디아 락탐듀란스(N. lactamdurans) cefE 유전자의 유도된 아미노산 서열은 아미노산 위치41에 프롤린을 갖는다(Seq. ID No. 14 참조), 이 프롤린은 PCR 1에서 얻어진 클론에는 없다. 이러한 플라스미드는 pMCTNE (제 1도) 로 불리운다.

c2. 페니실리움 크리소제눔(P. chrysogenum) cefE 발현플라스미드의 구성

PCR, 3: gpdA 프로모터

아크레모니움 니둘란스(A. nidulans) gpdA 프로모터의 조절하의 E. coli hph 유전자를 함유하는 pAN7-1플라스미드 DNA (Punt et al , Gene 56 (1987), 117-124), 그리고 올리고뉴클레오티드 5 및 6을 사용하는 이러한 세번째 PCR에서, 5'-말단에 단일 EcoRI 제한 부위 그리고 3'-말단에 단일 Ndel 부위를 함유하는 0.9kb PCR 생산물로서 gpdA 프로모터를 얻었다.

PCR, 4: AT 프로모터

네번째 PCR에서, 5'-말단에 단일 EcoRI 제한 부위 그리고 3'-말단에 단일NdeI 부위를 또한 함유하는 1.5kb의 AT 프로모터를 얻기 위하여, 페니실리움 크리소제눔(P. chrysogenum)의 염색체 DNA 그리고 올리고뉴클레오티드 7 및 8을 사용하였다.

PCR, 5: AT 터미네이터 그리고 노카디아 락탐듀란스(N. lactamdurans) cefE 유전자의 3`-말단

다섯번째 PCR에서, 페니실리움 크리소제눔(P. chrysogenum)의 염색체 DNA 그리고 올리고뉴클레오티드 9 및 10, 그리고 11 및 10을 각각 사용하여 0.5kb penDE (AT) 터미네이터 영역을 얻었다. 따라서, 이들 PCR 생산물은 C-말단 아미노산 서열 ARL로 구성되는, 마이크로 바디 타게팅신호를 갖거나 갖지 않는 cefE 유전자의 3'-말단 서열을 함유한다 (et al., Biochimica et Biophysica Acta 1116 (1992), 210-213).

단일 BspEI 부위가 PCR 생산물의 5'-말단에 도입되고 단일 SpeI 부위가 PCR 생산물의 3' - 말단에 도입되는 방식으로 올리고뉴클레오티드를 고안한다.

PCR, 6: AT 터미네이터 및 스트렙트미세스 클라불리제루스(S. clavuligerus) cefE 유전자의 3'-말단

여섯번째 PCR에서, 페니실리움 크리소제눔(P. chrysogenum)의 염색체 DNA 그리고 올리고뉴클레오티드 12 및 10,그리고 13 및 10을 각각 사용하여 0.5kb penDE (AT) 터미네이터 영역을 얻었다. 따라서, 이들 PCR 생산물은 C-말단 아미노산 서열 SKL로 이루어진, 마이크로바디 표적신호를 갖거나 갖지 않는 스트렙토미세스 클라불리제루스(S. clavuligerus) cefE 유전자의 3'-말단서열을 함유한다(De Hoop et al., Biochem. J. 286 (1992), 657-669).

PCR 생산물의 5'-말단에 단일 BglI 제한부위가 도입되고 PCR 생산물의 3'-말단에 단일 SpeI 부위가 도입되는 방식으로 올리고뉴클레오티드를 고안한다.

페니실리움 크리소제눔(P. chrysogenum)에서 cefE 유전자를 발현시킬 목적으로, gpdA 프로모터 및 AT 프로모터 단편을 플라스미드 pMCTNE 및 pMCTSE로부터의 cefE 단편에 리게이션시켰다. 이들 리게이션된 단편을 벡터 pBluescript II KS 에서 클로닝하였다.

PCR 3 을 EcoRI 및 NdsI을 사용하여 분해하였다. pMCTNE 및 pMCTSE를 NdeI 및 XbaI을 사용하여 분해하였다. 제한단편을 아가로즈 겔 전기영동에 의해 분리하였다. 0.9kb cefE 코팅 단편을 아가로즈 겔로부터 정제하였다. EcoRI-NdeI 프로모터단편을 NdeI-XbaI cefE 단편과 함께 EcoRI- XbaI에 의해 분해된 벡터 pBluescript II KS 에 리게이션시켰다. 따라서 다음의 플라스미드가 얻어졌다: pGSE및 pGNE.

페니실리움 크리소제눔(P. chrysogenum)에서 cefE 유전자를 최적으로 발현시키기 위하여, 우리는 상기된 페니실리움(Penicillium)발현플라스미드내의 cefE 유전자 뒤의 AT 종결신호 서열을 클로닝하기로 결정하였다.

pGNETA-pGNEWA

PCR 5 산물을 BspEI 및 SpeI을 사용하여 분해하였고 BspEI 및 SpeI에 의해 분해된 벡터 pGNE에 리게이션시켰다. E. coli HB101을 형질전환하기 위하여 리게이션혼합물을 사용하였다. 앰피실린에 대한 내성에 기인하여 형질전환체를 선택하였다. 이들 형질전환체로부터 분리된 플라스미드들을 제한단편분석 그리고 그후의 DNA 서열분석에 의해 특성을 결정하였다. 따라서 다음의 플라스미드들이 얻어졌다: pGNEWA 및 pGNETA (제 4도)

pGSETA-pGSEWA

PCR 6 생산물을 BglI 및 SpeI을 사용하여 분해하였고 BglI 및 SpeI에 의해 분해된 벡터 pGSE에 리게이션시켰다. E. coli HB101을 형질전환하기 위하여 리게이션혼합물을 사용하였다. 앰피실린에 대한 내성에 기인하여 형질전환체를 선택하였다. 이들 형질전환체로부터 분리된 플라스미드들도 또한 제한단편분석 및 그후의 DNA 서열 분석에 의해 특성을 결정하였다. 따라서 다음의 플라스미드들이 얻어졌다: pGSEWA 및 pGSETA (제 5도).

pANETA, pANEWA, pASETA 및 pASEWA

플라스미드 pGNETA, pGNEWA, pGSETA및 pGSEWA를 EcoRI 및 NdeI을 사용하여 분해하였다. 제한단편을 아가로즈 겔 전기영동에 의해 분리하였고 4.5kb 단편을 겔로부터 정제하였다.

PCR 4 생산물을 EcoRI 및 NdeI을 사용하여 분해하였고 상기된 정제된 단편에 리게이션시켰다. E. coli HB101을 결합혼합물에 의해 형질전환시킨 후, 앰피실린 저항성에 기인하여 형질전환체를 선택하였다.

형질전환체를 성장시켰고 그것들의 플라스미드들을 분리하였고 제한단편분석 및 최종적인 DNA 서열분석에 의해 특성을 결정하였다. 따라서 원하는 구성체, 즉pANETA (제 6도), pANEWA, pASETA (제 7도) 및 pASEWA를 얻었다.

d. 페니실리움 크리소제눔(P. chrysogenum)의 형질전환

Ca-PEG에 의해 조정된 원형질체 형질전환을 사용한다.

Cantoral (vide supra), Gouka et al. (J. Biotechn., vide supra) 및 Gouka et al. (Appl Microbiol. Biotechnol. vide supra)에 기재되어 있는 절차에 따라, 전체 플라스미드 또는 정제된 cefE 발현카세트 (E. coli 벡터 서열이 결핍되어 있음) 을 사용하여 pyrG, niaD, facA 또는 amdS (Beri et al., Curr, Genet. 11 (1987), 639-641) 유전자를 선택표지인자로서 각기 가지고 있는 페니실리움 크리소제눔(P. chrysogenum)의 균주를 형질전환시켰다.

상동 pyrG, niaD 또는 facA 선택표지인자의 정제된 형태를 사용함으로써, E. coli 벡터 서열이 결핍되고, 박테리아 내성유전자를 함유하지 않는 페니실리움 크리소제눔(P. chrysogenum) 균주가 얻어졌다.

유럽특허출원 제 94201896.1 호에는 선택표지인자 유전자가 없는 재조합체 균주를 얻는 방법이 기재되어 있다. 이 방법은 우성 선택표지인자로서 아크레모니움 니둘란스(A. nidulans) amdS를 함유하는 페니실리움 크리소제눔(P. chrysogenum) 형질 전환체에 성공적으로 사용되었다.

그다음, 비상동 성질의 유일한 요소는 0.9kb cefE 암호영역 및 선택적인 0.9kb gpdA 프로모터 영역이다.

e. 형질전환체의 분석

페니실리움 크리소제눔(P. chrysogenum)을 선택배지에서 반복하여 배양함으로써 정제한다. 단일의 안정한 클로니를 사용하여, 포자를 생산하고 cefE 발현카세트를 함유하는 형질 전환체를 스크린하기 위한 한천사면을 제조한다. PCR 기술을 사용한 cefE 유전자의 존재에 기인하여 수백개의 형질전환체를 효율적으로 스크린하기에 충분한 주형 DNA를 얻기 위하여 한천평판상의 형질전환체로부터 갓 생긴 균사체의 단편을 끓였다(Seth, Fungal Genetics Conference, Asilomar (1991), abstract in Fungal Genetics Newsletter 38, 55.). 그렇게 함으로써 형질전환의 효율을 측정하였다.

또한 생물학적 분석법을 사용하여 형질전환체의 스크린을 하였다. 선택된 측쇄전구체를 함유하는 한천배지에서 형질전환체를 성장시켰다. 당업계에서 잘 알려지고 예컨대et al., Mol. Gen. Genet. 225 (1991), 56-64에기재된 방법에 따라 페니실린과 세팔로스포린 생산을 식별할 수 있도록 Bacto 페나제를 또한 함유하는 E. coli ESS2231을 인디케이터 박테리아로서 사용하였다.

포자를 사용하여 섹션 d.에 기재된 바와 같은 페니실리움 크리소제눔(P. chrysogenum) 배양배지에 접종한다. 72시간 동안의 배양 (25℃에서) 후, 염색체 DNA를 균사체로부터 단리한다. 본 DNA를 EcoRI 또는 PstI과 유사한 6bp 인식서열을 갖는 제한효소를 사용하여 분해한다.

본 DNA 단편들을 아가로즈 겔 전기영동에 의해 분리하고 유전자 스크린 나일론막(New England Nuclear) 에 블로팅한다. 서던 블로트를 cefE 유전자 서열의 프로브로 기능하는³²P 표지된 PCR 2 생산물과 혼성화한다. α³²P dCTP의 존재하에서상업용 표지화 장비(Boehrnger Mannheim)를 사용하여 임의의 프라이밍 표지화를 함으로써 정제된 PCR 2 생산물의³²P 표지화가 성취된다.

여기서는 엑스판다제 활성으로 칭해지는, cefE 유전자 생산물의 발현에 관하여 cefE 코팅 서열을 함유하는 형질전환체를 시험한다.

선택된 형질전환체를 페닐실린 생산배지에서 배양한다 (실시예 2 참조).

시간- 경과 실험에서, 48, 72 및 96시간 동안의 발효후 균사체 샘플을 취한다. 균사체를 추출하고 가공하지 않은 추출물에서 엑스판다제 활성을 결정하며, 이는 Rollins et al., Can. J. Microbiol. 34 (1988), 1196-1202에 기재된 바와 실질적으로 같다. Alvarez et al., Antimicrob. Agent Chem. 31 (1987), 1675-1682에 기재된 방법을 사용하여 아실트랜스퍼라제 활성에 관하여 엑스판다제 효소를 갖는 형질전환체를 시험한다.

이들 분석으로부터, 7-ADCA 유도체의 발효적 생산을 위하여, 다른 수준의 아실트랜스퍼라제 및 엑스판다제 효소 활성을 갖는 형질전환체를 선택한다.

실시예 2

3-(카르복시에틸티오) 프로피오닐-7-ADCA의 발효적 생산 및 그것의 분리

페니실리움 크리소제눔(P. chrysogenum) 균주 Wisconsin 54-1255 (ATCC 28089)을 실시예 1에 기재된 것과 같은 DNA 구성체들 중의 어느하나에 의해 형질전환시키고 글루코즈, 30g/ℓ; (NH₄)₂SO₄10g/ℓ; KH₂PO₄; 10g/ℓ; 미량원소용액 I (MgSO₄·7H₂O, 25g/ℓ; FeSO₄·7H₂O, 10g/ℓ; CuSO₄·5H₂O, 0.5g/ℓ; ZnSO₄·7H₂O,2g/ℓ; Na₂SO₄, 50g/ℓ; MnSO₄·H₂O, 2g/ℓ; CaCl₂·2H₂O, 5g/ℓ), 10㎖/ℓ (살균전 pH 6.5)로 이루어진 종자(seed)배지에 2 x 10⁶분생자(conidia)/㎖를 접종한다.

종자 배양물을 48-72시간 동안 25-30℃에서 배양하고 후속적으로 락토즈, 80g/ℓ, 말토즈, 20g/ℓ ; CaSO₄, 4g/ℓ ; 요소, 3g/ℓ , MgSO₄·7H₂O, 2g/ℓ, KH₂PO₄, 7g/ℓ ; NaCl, 0.5g/ℓ ; (NH₄)₂SO₄, 6g/ℓ ; FeSO₄·7H₂O, 0.1g/ℓ ; 3,3'- 티오디프로피온산, 5g /ℓ ; 미량원소용액 II (CuSO₄·5H₂O, 0.5g/ℓ ; ZnSO₄·7H₂O, 2g/ℓ, MnSO₄·H₂O, 2g /ℓ ; Na₂SO₄, 50g/ℓ), 10㎖/ℓ (살균전 pH 5.5-6.0)을 함유하는 생산배지의 10-20분량을 접종하는데 사용한다. 그다음, 배양을 또다시 96-120시간 동안 계속한다.

발효적 생산의 말렵에, 균사체를 원심분리 또는 여과에 의해 제거하고 3-(카르복시에틸티오) 프로피오닐-7- ADCA을 역상 컬럼에서 고성능액체크로마토그래피(HPLC)에 의해 분석한다. 사용되어진 HPLC는 모델 126 프로그램성 용매시스템, 모델 507 자동샘플러, 모델 168 다이오드- 배열검출기 및 System Gold 자료시스템(5.10)으로 구성되어진 Beckman System Gold이다. 정지상(Stationary phase)에서 처럼, 연속하여 2개의 (2) Chromspher C18 카트리지 컬럼(100 × 3mm, Chrompack)을 사용한다. 이동상은 0.5㎖/ 분의 유속에서 15분 동안의 100% 0.07M 포스페이트 완충액 pH 4.8 내지 25% 아세토니트릴 및 75% 포스페이트 완충액 pH 4.8로부터의 직선 구배로 구성된다. 기준물질로서 합성 3-(카르복시에틸티오) 프로피오닐-7- ADCA를 사용하여 260nm에서 3- (카르복시에틸티오) 프로피오닐-7-ADCA의 생산을 정량한다.

피크 동일성을 온- 라인(on-line) UV및 NMR 스펙트럼을 비교함으로써 확인한다.

배양액을 여과한 후, 1-부탄올의 약 0.1 분량을 여과물에 첨가한다. pH 값을 희석된 염화수소산을 사용하여 2로 조정하고 혼합물을 5분동안 상온에서 교반한다. 분리후, 유기층을 증발시키고 화학적 탈아실화 (실시예 3) 에서 더 사용하거나 유기층을 pH 8의 물의 0.33 분량으로 역추출하고 효소적 탈아실화 (실시예 4및 5)에서 더 사용한다.

실시예 3

3-(카르복시에틸티오) 프로피오닐-7-ADCA의 탈아실화

3g(8mmol) 3-(카르복시에틸티오)프로피오닐-7- ADCA의 혼합물에, N,N-디메틸아닐린의3.5㎖(36mmol), 메틸렌염화물의 13㎖, 및 트리메틸클로로실란의 2.6㎖(21mmol)을 주위온도에서 첨가한다. 30분 동안 교반한 후, 반응혼합물을 약 -50℃ 까지 냉각하고 포스포러스펜타클로라이드의 1.8g(8.5mmol) 을 즉시 첨가한다. 온도를 2시간 동안 -40℃에서 유지하고 후속적으로 반응혼합물을 -65℃ 까지 냉각한다. 그다음 그것을 온도가 -40℃ 이상 오르지 않도록 하는 속도로 12㎖의 이소부탄올(137mmol) 로 처리한다. 2시간 동안의 추가적인 교반후, 그 용액을 15㎖의 물에 붓고, 그후 4.5N 암모니아의 5㎖를 즉시 첨가한다. 고형암모늄비카르보네이트를 천천히 첨가함으로써 pH를 4로 조정한다. 5℃ 까지 냉각한 후 본 혼합물을 여과하고, 결정형의 7-ADCA를 5㎖의 수성 아세톤(1:1) 으로 세척하고 분리한다.

실시예 4

돌연변이형 슈도모나스(Pseudomonas) SY77 아실라제를 사용한 3-(카르복시에틸티오) 프로피오닐-7-ADCA의 효소적 탈아실화

3-(카르복시에틸티오) 프로피오닐-7- ADCA의 전환을 영역지정 돌연변이에 의해 얻어진 슈도모나스(Pseudomonas) SY77 아실라제로부터 유도된 특이적인 아실라제를 사용하여 단일 효소 단계에서 실행한다. 3-(카르복시에틸티오) 프로피오닐 측쇄에 대한 개선된 활성을 갖는 돌연변이형 슈도모나스(Pseudomonas) SY77 아실라제의 구성 및 동정은 EP-A-0453048에 기재되어 있다. 돌연변이형에서, 슈도모나스(Pseudomonas) SY77 아실라제의 α - 소단위 내의 위치 178에 존재하는 티로신은 히스티딘에 의해 교체되었다. 돌연변이형 아실라제를 E. coli에서 생산한다. 세포들을 원심분리에 의해 수확하고 140nm NaCℓ을 함유하는 10mM 포스페이트 완충액 pH 7.4에서 재현탁한다. 후속적으로 세포들을 고주파분해(sonification)에 의해 분쇄한다. 세포 찌꺼기를 제거한 후, 아실라제 활성을 함유하는 상청액을 모운다. 더욱 아실라제의 정제를 일련의 크로마토그래피 단게: (1) pH 8.8에서 Q-세파로즈 빠른- 흐름(fast-flow) 의 이온교환 크로마토그래피, (2) 페닐- 세파로즈상의 소수성 상호작용 크로마토그래피; 및 (3) 세파크릴 S200HR 컬럼상의 겔투과 크로마토그래피에 의해 수행한다.

정제된 아실라제를 젤라틴 및 키토산의 혼합물로 구성된 입자에 고정시킨다. 효소를 첨가하기 바로 전에, 그 입자들을 글루타르알데히드로 처리한다.

3-(카르복시에틸티오) 프로피오닐-7- ADCA의 전환을 교반 탱크 반응기내에서 실행한다. 먼저 세팔로스포린 수용액을 반응기에 첨가한다. 후속적으로 일정한 교반하에 용액의 온도를 30℃가 되게 하고 pH를 칼륨수산화물을 사용하여 8에서 고정한다. 그다음 고정된 효소를 첨가하면 전환이 시작된다. 전환동안 반응기내의 pH를 계속적으로 기록하고 8에서 유지한다. 반응동안에 유리된 3,3'-티오디프로피온산을 KOH로 적정한다. 첨가된 KOH의 양은 평대(flatbed) 기록계에 표시되고 기록된다. 실시예 2에 기재된 바와 같은 HPLC에 의해 3-(카르복시에틸티오) 프로피오닐-7- ADCA 및 7-ADCA에 관하여 분석되는 반응기로부터 샘플을 모음으로써 전환이 모니터된다.

반응이 완료되면 고정화된 효소를 여과에 의해 제거하고 여과물이 부틸아세테이트로 이루어지고 있는 동안 여과물의 pH를 1이 되게 한다. 층들을 분리하고 7-ADCA를 함유하는 수성상의 pH를 3으로 조정한다. 그다음 결정형의 7-ADCA를 여과하여 제거한다.

실시예 5

슈도모나스(Pseudomonas) SE83 아실라제를 사용한 3-(카르복시에틸티오) 프로피오닐-7-ADCA의 효소적 탈아실화

아실라제로서 슈도모나스(Pseudomonas) SE83 아실라제를 이용하는 점을 제외하고는 실시예 4에서와 같이, 3-(카르복시에틸티오) 프로피오닐-7- ADCA의 전환을 실행하여, 같은 결과를 낳게한다.

Claims

a) 사상균류 발현신호의 전사 및 해독 조절하에서, 엑스판다제 유전자로 페니실리움 크리소제눔 (Penicillium chrysogenum) 균주를 형질전환시키는 단계;

b) 배양 배지내에서 상기 균주를 발효시키고 상기 배양 배지에, 적합한 3,3'-티오디프로피온산이나 그것의 염 또는 에스테르를 첨가하여 3-(카르복시에틸티오)프로피오닐-6-아미노페니실란산(3-(카르복시에틸티오)프로피오닐-6-APA]를 생성하도록 하며, 이것이 원 위치(in situ) 확장되어 3-(카르복시에틸티오)프로피오닐-7-ADCA를 형성하도록 하는 단계;

c) 발효 배양액으로부터 3-(카르복시에틸티오)프로피오닐-7-ADCA를 회수하는 단계;

d) 상기 3-(카르복시에틸티오)프로피오닐-7-ADCA를 탈아실화시키는 단계; 그리고

e) 결정형의 7-ADCA를 회수하는 단계에 의한 7-아미노데스아세톡시세팔로스포란산(7-ADCA)의 제조 및 회수방법.
제 1항에 있어서, AT 유전자의 발현신호의 전사 및 해독조절하에서, 엑스판다제 유전자로 상기 페니실리움 크리소제눔(Penicillium chrysogenum) 균주를 형질전환시키는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, 단계 (e)가 여과단계인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항에 있어서, 단계 (c)가 여과단계이고, 4.5보다 낮은 pH에서 물과 혼합될 수 없는 유기용매로 배양액 여과물을 추출하고 그것을 4와 10사이의 pH에서 물로 역추출하는 단계인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항에 있어서, 엑스판다제 유전자가 스트렙토미세스 클라불리제루스(Streptomyces clavuligerus) 또는 노카디아 락탐듀란스 (Nocardia lactamdurans)로부터 유래된 것을 특징으로 하는 방법.