CN102131917A - 生产己二酰基-7-adca的菌株 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及在包含己二酸的培养基中培养时能够生产N-己二酰基化的β-内酰胺化合物的突变体微生物菌株，其特征是所述菌株与分突变体亲本菌株相比具有经改进的由来自培养基的己二酸向N-己二酰化的β-内酰胺化合物的并入产率。

Description

生产己二酰基-7-ADCA的菌株
发明领域
本发明涉及生产N-己二酰化的β-内酰胺化合物的微生物菌株，它们的构建方法，以及鉴定与功能性失活涉及己二酸降解的基因和酶的方法。
发明背景
半合成的β-内酰胺抗生素(SSA’s)从β-内酰胺中间产物开始以工业规模生产，例如6-氨基青霉烷酸(6-APA)、7-氨基-去乙酰氧基-头孢烷酸(7-ADCA)、7-氨基头孢烷酸(7-ACA)和7-氨基-3-氯-3-头孢烯-4-羧酸酯/盐(7-ACCA)、7-氨基-3-[(Z/E)-1-丙烯-1-基]-3-头孢烯-4-羧酸酯/盐(7-PACA)、7-氨基去乙酰基头孢烷酸(7-ADAC)、7-氨基-3-氨甲酰基氧甲基-3-头孢烯-4-羧酸(7-ACCCA)等等。
第一代7-ADCA制品衍生自PenG，其中5-元青霉烯环到6-元头孢烯环的扩环和随后苯乙酰基-7-ADCA苯乙酸侧链的切割均使用化学反应进行。下一代7-ADCA制品仍然从PenG获得，但是在化学扩环之后，使用合适的(青霉素)酰基酶酶促切除苯乙酰基-7-ADCA的苯乙酸侧链。已开发出其它方法，其中使用合适的扩环酶体外进行PenG到苯乙酰基-7-ADCA的扩环，但是这些方法仅具有很低的工业重要性。
最近期和最精致的7-ADCA生产方法：包括培养下述Penicillium chrysogenum，所述Penicillium chrysogenum用编码合适扩环酶的基因转化并表达所述基因。该经改造的Penicillium chrysogenum菌株在存在己二酸作为侧链前体时在发酵管中生长时，生产并分泌己二酰基-7-ADCA-见WO93/05158。在该生产过程中，从发酵液中回收己二酰基-7-ADCA，对其进行合适的酰基酶处理，从而切除己二酸侧链，之后进一步纯化、结晶和干燥由此获得的7-ADCA。其它侧链前体已公开于WO95/04148(2-(羧乙基硫代)乙酸和3-(羧甲基硫代)-丙酸)、WO95/04149(2-(羧乙基硫代)丙酸)、WO96/38580(苯乙酸)和WO98/048034和WO98/048035(多种二羧酸)中。扩环酶负责多种N-酰基化青霉烷酸5元环的扩环，从而得到相应的N-酰化去乙酰氧基头孢烷酸。
然而，除了被用作侧链前体以外，己二酸盐可以被降解并在初级代谢中被用作碳源。这由Robin et al.(Appl.Microbiol.Biotechnol.(2001)57，357-362))在使用蔗糖作为主要碳源的分批培养物中证实。耗尽(源自蔗糖的)葡萄糖和果糖后，开始形成己二酰基-6-APA和己二酰基-7-ADCA，并且在这一阶段中，仅至多2％的己二酸被并入β-内酰胺化合物中，而剩余部分被用作碳源。作者提出，由于己二酸和脂肪酸之间的相似性，己二酸降解很可能通过β-氧化而发生。在较晚的研究中，Thykaer et al.(Metabolic Engineering(2002)，4，151-158)以生产己二酰基-7-ADCA的Penicillium chrysogenum菌株的代谢网络分析为基础得出下述结论：己二酸盐降解通过β-氧化酶发生在微体(乙醛酸循环体)中，而不是胞质溶胶或线粒体中。通常(丝状)真菌和酵母中，特别是Penicillium chrysogenum中，在细胞内定位、涉及的酶以及β-氧化途径在微生物总体代谢中的作用方面，β-氧化途径的本质仍然是不清楚的。
为了减少己二酸降解，Thykaer et al.(2002)已提出缺失负责己二酸盐降解的酶，然而没有将任何此类酶指定为合适的候选者。然而迄今为止，没有提供直接或明确的证据表明己二酸实际上通过β-氧化途径被降解。最有可能地，己二酸的降解还涉及其它降解机制，例如所谓的苯甲酸盐降解途径(http://www.genome.ad.jp/dbget- bin/get_pathway？org_name＝sma&mapno＝00362)。在所述途径中，3-氧代己二酸盐在两个步骤中被转化成琥珀酰基-CoA和乙酰基-CoA——与Thykaer et al.(2002)的研究鉴定的产物相同。己二酸盐可以被Penicillium chrysogenum的酶很好地氧化，并且通过所述途径将获得的己二酸盐随后转化进中央碳代谢途径。
为了防止此类降解途径对己二酸的任何损失，人们必须在早期步骤中，优选地在第一步骤中阻断所述途径。然而，所提出的己二酸盐降解途径以及β-内酰胺生物合成途径均以相同的反应开始，即用CoA-连接酶将己二酸活化成己二酰基-CoA。另外，两种途径均被指出位于过氧化物酶体中。因此，通过简单地按照作者的建议和抑制或缺失β-氧化途径的第一个酶，人们最可能还会抑制β-内酰胺生物合成，这是甚至更不利的。
发明详述
本发明在第一方面提供了用于鉴定能够生产N-己二酰化的β-内酰胺化合物的微生物菌株的一个或多个下述基因的方法，所述基因编码涉及己二酸盐降解和/或脂肪酸β-氧化的一种或多种酶，所述方法包括以下步骤：
a.选择涉及己二酸盐降解和/或脂肪酸β-氧化的一个或多个已知基因的核苷酸序列和/或任选地由所述基因编码的一种或多种已知酶的氨基酸序列；
b.使用从步骤(a)中选择的序列作为BLAST搜索中的探针，用于在能够生产N-己二酰化的β-内酰胺化合物的微生物菌株的可获得的核苷酸或氨基酸序列中鉴定同源序列。
涉及脂肪酸β-氧化的酶可选自以下组：
·第I组：CoA连接酶(EC 6.2.1.xx)
·第II组：酰基-CoA脱氢酶(EC 1.3.99.xx)和酰基-CoA氧化酶(EC 1.3.3.xx)
·第III组：烯酰-CoA水合酶(EC 4.2.1.17)
·第IV组：3-羟基酰基-CoA脱氢酶(EC 1.1.1.35)
·第V组：乙酰基-CoA C-酰基转移酶(硫解酶-EC 2.3.1.16)
在一个优选的实施方案中，所选择的序列(探针)是已知的基因的核苷酸序列或已知的酶氨基酸序列(任选地由所述基因编码的)，并且可选自(但不限于)由以下基因和/或氨基酸序列组成的组(见表1)。
表1
Figure BPA00001309760900031
就本发明的目的而言，使用BLAST算法鉴定同源序列(Altschul，et al.，1990，J.Mol.Biol.215：403-410)。用于进行BLAST分析的软件是公众可以通过National Center for Biotechnology Information(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)获得的。BLAST算法参数W、T和X确定比对的灵敏度和速度。BLAST程序使用下述作为默认：词长(W)11、BLOSUM62评分矩阵(见Henikoff & Henikoff，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：10915(1989))、比对(B)50、预期(E)10、M＝5、N＝-4和并比较两条链。
除了上述本发明的方法以外，可以基于在含有己二酸的培养基中培养亲本菌株时基因的转录水平与在不含己二酸的对照培养基中培养亲本菌株时基因的转录水平的比例(本文中定义为“己二酸盐/对照”比例)，来进一步选择编码涉及将来自培养基的己二酸并入N-己二酰化的β-内酰胺化合物的的一种或多种酶的基因。优选地，此类基因具有大于1，优选地≥2，优选地≥3，优选地≥4，优选地≥5，优选地≥10，优选地≥15，优选地≥20，优选地≥30，优选地≥40，优选地大于≥50，优选地≥60，优选地≥70，优选地≥80，最优选地≥90的“己二酸盐/对照”比例。作为第二对照，可以测定在含有苯乙酸的培养基中培养亲本菌株时基因的转录水平与在不含苯乙酸的对照培养基中培养亲本菌株时基因的转录水平的比例(称作“PAA/对照”比例)。
可以通过用“己二酸盐/对照”比例除以“PAA/对照”比例从而得到“己二酸盐/PAA”比例，来计算第三比例。优选地，本发明的基因具有≥1，优选地≥2，优选地≥3，优选地≥4，优选地≥5，优选地≥10，优选地≥15，优选地≥20，优选地≥30，优选地≥40，优选地大于≥50，优选地≥60，优选地≥70，优选地≥80，最优选地≥90的“己二酸盐/PAA”比例。优选的基因将组合高“己二酸盐/对照”比例与低“PAA/对照”比例。例如，具有50左右“己二酸盐/对照”比例和10左右“PAA/对照”比例(即己二酸盐/PAA为5)的基因比己二酸盐/对照比例在50左右且PAA/对照比例在50左右(即己二酸盐/PAA为1)的基因更加优选。
本发明在第二方面提供了在包含己二酸的培养基中培养时能够生产N-己二酰基化的β-内酰胺化合物的，源自亲本微生物菌株的突变体微生物菌株，其特征是所述突变体微生物菌株具有经改进的由来自培养基的己二酸向N-己二酰化的β-内酰胺化合物的并入产率。并入产率在本文中被定义为相对于消耗的己二酸的总摩尔量而言被并入N-己二酰化的β-内酰胺化合物中的己二酸的摩尔百分比。消耗的己二酸的总量等于添加至发酵过程中的己二酸的总摩尔量减去发酵过程后残余的己二酸的摩尔量。经改进的产率可以被表述为突变体微生物菌株与亲本微生物菌株相比的相对改进。例如，当亲本微生物菌株具有上文定义的5％的并入产率而突变体微生物菌株具有6％的并入产率时，突变体的经改进的并入产率为20％(6/5*100-100)。
优选地，本发明的突变体菌株具有至少5％，更优选地至少7.5％，更优选地至少10％，更优选地至少15％，更优选地至少20％，更优选地至少30％，更优选地至少40％，更优选地至少50％，更优选地至少60％，更优选地至少70％，更优选地至少80％，更优选地至少90％，更优选地至少95％，更优选地至少97％，更优选地至少98％，更优选地至少99％，更优选地至少100％的经改进的并入产率。
能够获得的最大的经改进的并入产率取决于亲本微生物菌株的实际并入产率。当亲本微生物菌株具有5％的并入产率且理论最大并入产率为100％时，则突变体微生物菌株可具有1900％(100/5*100-100)的最大经改进的并入产率。类似地，当亲本微生物菌株已经具有50％的并入产率并且理论最大并入产率为100％时，则突变体微生物菌株可具有100％(100/50*100-100)的最大经改进的并入产率。
在一个实施方案中，本发明提供了源自亲本微生物菌株的突变体微生物菌株，其中编码涉及己二酸的一种或多种降解途径的一种或多种酶的本发明突变体菌株的一个或多个基因已被功能性失活。涉及己二酸的一种或多种降解途径的任何酶的基因可以被功能性失活。优选地，通过使用本发明的方法鉴定的任何突变体微生物菌株的被功能性失活从而导致经改进的并入产率的基因可以与来自任何其它通过使用本发明方法鉴定的突变体微生物菌株的导致经改进的并入产率的其它被功能性失活的基因组合，两种或更多这些被功能性失活的基因的组合可导致被进一步改进的并入产率。在一个特定的实施方案中，可以将三种被功能性失活的基因彼此组合，获得被进一步改进的并入产率。
在一个特定的实施方案中，本发明提供了源自亲本微生物菌株的突变体微生物菌株，其中本发明突变体微生物菌株的编码涉及一种或多种己二酸降解途径的一种或多种酶的一个或多个基因已被功能性失活。另外，此类突变体微生物菌株可含有编码一个或多个涉及来自培养基的己二酸并入N-己二酰化的β-内酰胺化合物的一种或多种酶(优选地CoA-连接酶和/或CoA-转移酶)的一个或多个基因，与其中所述基因未被过表达的亲本微生物菌株相比，所述基因在本发明的突变体微生物菌株中被过表达。一个单一微生物菌株中涉及己二酸降解的基因的功能性失活与涉及己二酸并入N-己二酰化的β-内酰胺化合物的基因的过表达的组合导致进一步改进的并入产率。优选地，编码涉及将来自培养基的己二酸并入N-己二酰化的β-内酰胺化合物的一种或多种酶的基因可选自由编码以下酶的基因组成的组，所述酶能够催化细胞内己二酸转化成己二酰基CoA，例如CoA-连接酶和CoA-转移酶。基因的过表达在本文中被定义为下述基因表达，所述表达会导致突变体微生物菌株中所述基因编码的酶的活性至少是亲本微生物中酶活性的1.5倍；优选地，所述酶的活性是亲本微生物中酶活性的至少2倍，更优选地至少3倍，更优选地至少4倍，更优选地至少5倍，进一步更优选地至少10倍和最优选地至少20倍。
“亲本微生物菌株”可以被定义为能够生产β-内酰胺化合物、优选地N-己二酰化的β-内酰胺化合物的微生物。“突变体微生物菌株”可以被定义为通过遗传工程或经典诱变源自亲本微生物菌株的菌株。
“功能性失活的”在本文中被定义为基因的失活，这导致所编码的酶的残余活性优选地少于50％、更优选地少于40％、更优选地少于30％、更优选地少于20％、更优选地少于10％、更优选地少于5％、更优选地少于2％。“基因的失活”在本文中被定义为修饰基因，从而获得如上文定义的功能性失活的基因。用于修饰基因从而获得功能性失活的基因的方法是本领域已知的，并且可包括：通过导致(过早)终止或读码框位移的碱基对突变使基因失活；突变编码一个或多个关键氨基酸(例如水解酶的催化三联体)的一个或多个碱基；引起酶氨基酸序列中突变的基因突变，这导致酶的半衰期降低；以下述方式修饰mRNA分子，所述方式使得mRNA半衰期降低；插入破坏开放读码框的第二序列(即选择标记物基因)；基因的部分或完全去除；基因启动子的去除/突变；使用反义DNA或可比较的RNA抑制方法降低细胞中mRNA的有效量。最优选地，通过缺失使基因功能性失活，导致编码的多肽和由此造成的酶活性完全不存在。
在一个优选的实施方案中，本发明提供了源自亲本微生物的突变体微生物菌株，其中编码涉及脂肪酸β-氧化的推定酶的基因已被功能性失活。这些基因可以使用前文所述的本发明的方法，使用表1的一种或多种探针鉴定。
由微生物菌株生产的N-己二酰化的β-内酰胺化合物可以是任何N-己二酰化的β-内酰胺，其中所述β-内酰胺片段是青霉烯或头孢烯。优选的N-己二酰化的β-内酰胺化合物是之前所列中间产物的己二酰基衍生物：6-氨基青霉烷酸(6-APA)、7-氨基-去乙酰氧基-头孢烷酸(7-ADCA)、7-氨基头孢烷酸(7-ACA)和7-氨基-3-氯-3-头孢烯-4-羧酸酯/盐(7-ACCA)、7-氨基-3-[(Z/E)-1-丙烯-1-基]-3-头孢烯-4-羧酸酯/盐(7-PACA)、7-氨基去乙酰基头孢烷酸(7-ADAC)、7-氨基-3-氨甲酰基氧甲基-3-头孢烯-4-羧酸(7-ACCCA)等等。最优选的是N-己二酰基化的头孢菌素，最优选的是己二酰基-7-ADCA。
能够生产N-己二酰化的β-内酰胺化合物的微生物菌株可以选自由真菌、细菌或酵母组成的组。优选地，本发明的微生物菌株是真菌，优选地是丝状真菌。一种优选的丝状真菌可选自由Aspergillus、Acremonium、Trichoderma和Penicillium组成的组。更优选地，本发明的突变体微生物菌株属于Penicillium物种，最优选地为Penicillium chrysogenum。一种优选的细菌可以选自由Streptomyces、Nocardia或Flavobacterium组成的组。
在一个优选的实施方案中，能够生产N-己二酰化的β-内酰胺化合物的本发明的突变体微生物菌株属于Penicillium物种，最优选地是Penicillium chrysogenum，所述微生物菌株已用编码扩环酶的基因、优选地用Streptomyces clavuligerus cefE基因转化过，所述编码扩环酶的基因使得菌株在存在前体己二酸时培养时能够生产己二酰基-7-ADCA。
在另一实施方案中，能够生产N-己二酰化的β-内酰胺化合物的本发明的突变体微生物菌株属于Penicillium物种，最优选地是Penicillium chrysogenum，并且除了扩环酶基因(优选Streptomyces clavuligerus cefE基因)以外，用羟化酶基因(优选Streptomyces clavuligerus cefF基因)转化过，所述羟化酶基因的表达产物将己二酰基-7-ADCA的3-甲基侧链转化为3-羟甲基，得到己二酰基-7-氨基去乙酰基头孢烷酸(己二酰基-7-ADAC)。
在另一个实施方案中，能够生产N-己二酰化的β-内酰胺化合物的本发明的突变体微生物菌株属于Penicillium物种，最优选地是Penicillium chrysogenum，并且用扩环酶/羟化酶基因(优选Acremonium chrysogenum cefEF基因)转化过，所述基因的表达产物将己二酰基-7-ADCA的3-甲基侧链转化成3-羟甲基，得到己二酰基-7-氨基去乙酰基头孢烷酸(己二酰基-7-ADAC)。
在另一实施方案中，能够生产N-己二酰化的β-内酰胺化合物的本发明的突变体微生物菌株属于Penicillium物种，最优选地是Penicillium chrysogenum，并且除了编码扩环酶的基因(优选Streptomyces clavuligerus cef基因)和羟化酶基因以外，还用乙酰基转移酶基因(优选Streptomyces clavuligerus cefG基因)转化，所述乙酰基转移酶基因的表达产物(即酰基转移酶)将3-羟甲基侧链转化为3-乙酰氧甲基侧链，得到己二酰基-7-ACA。
在又一个实施方案中，本发明的能够生产N-己二酰化的β-内酰胺化合物的突变体微生物菌株属于Penicillium物种，最优选地是Penicillium chrysogenum，并且用编码扩环酶的基因(优选Streptomyces clavuligerus cefE基因)、编码羧化酶的基因(优选Streptomyces clavuligerus cefF基因)和O-氨甲酰基转移酶的基因(优选Streptomyces clavuligerus cmcH基因)转化过，得到己二酰基-7-氨基-3-氨甲酰基氧甲基-3-头孢烯-4-羧酸。
在另一个实施方案中，本发明的突变体微生物菌株属于Penicillium物种，最优选地为Penicillium chrysogenum，任选地用编码扩环酶、羟化酶、扩环酶/羟化酶、乙酰基转移酶和/或O-氨甲酰基转移酶的一个或多个上述基因转化过，另外还用编码能够提高活化活性和/或己二酸并入N-己二酰化的β-内酰胺化合物的酶的基因转化。此类修饰的优选的例子是(但不限于)：提高的来自培养基的己二酸进入微生物细胞内部的转运，提高的己二酸盐朝向己二酰基-CoA的活化和/或提高的己二酸盐侧链并入β-内酰胺核上。涉及的各种酶可以分别是转运蛋白，CoA-连接酶或CoA-转移酶和酰基-CoA:6-氨基青霉烷酸酰基转移酶。
在又一个实施方案中，本发明的突变体微生物菌株属于Penicillium物种，最优选地为Penicillium chrysogenum，任选地用编码扩环酶、羟化酶、扩环酶/羟化酶、乙酰基转移酶、O-氨甲酰基转移酶的一个或多个上述基因，和/或编码能够提高活化活性和/或己二酸并入N-己二酰化的β-内酰胺的基因转化，另外还用编码能够提高培养基中N-己二酰化的β-内酰胺分泌的酶的基因转化。此类基因的优选的例子是(但不限于)：Acremonium chrysogenum cefT基因或其同源物或Acremonium chrysogenum cefM基因或其同源物。在一个优选的实施方案中，本发明提供了在包含己二酸的培养基中培养时能够生产N-己二酰化的β-内酰胺化合物的源自亲本微生物菌株的突变体微生物菌株，优选地为突变体Penicillium chrysogenum菌株，其中编码涉及脂肪酸β-氧化的一种或多种酶的一个或多个基因已被功能性失活，其中基因的失活如前文定义。高度优选的是其中编码前文定义的第I组、第II组、第III组、第IV组和/或第V组的一种或多种酶的一个或多个基因已被功能性失活的突变体微生物菌株，优选地为突变体Penicillium chrysogenum菌株，其中：
·编码第I组酶的基因可具有选自由以下组成的组的核苷酸序列：SEQ ID NO 1，SEQ ID NO 2，SEQ ID NO 3，SEQ ID NO 4，SEQ ID NO 5，SEQ ID NO 6，SEQ ID NO 7，SEQ ID NO 8，SEQ ID NO 9，SEQ ID NO 10，SEQ ID NO 11，SEQ ID NO 12，SEQ ID NO 13，SEQ ID NO 14，SEQ ID NO 15，SEQ ID NO 16，SEQ ID NO 17，SEQ ID NO 18，SEQ ID NO 19，SEQ ID NO 20，SEQ ID NO 21，SEQ ID NO 22，SEQ ID NO 23，SEQ ID NO 24，SEQ ID NO 25以及与任何所列序列基本同源的核苷酸序列。
·编码第II组酶的基因可具有选自由以下组成的组的核苷酸序列：SEQ ID No.51，SEQ ID No.52，SEQ ID No.53，SEQ ID No.54，SEQ ID No.55，SEQ ID No.56，SEQ ID No.57，SEQ ID No.58，SEQ ID No.59，SEQ ID No.60，SEQ ID No.61，SEQ ID No.62，SEQ ID No.63，SEQ ID No.64，SEQ ID No.65，SEQ ID No.66，SEQ ID No.67，SEQ ID No.68，SEQ ID No.69，SEQ ID No.135以及与任何所列序列基本同源的核苷酸序列。
·编码第III组酶的基因可具有选自由以下组成的组的核苷酸序列：SEQ ID No.89，SEQ ID No.90，SEQ ID No.91，SEQ ID No.92，SEQ ID No.93，SEQ ID No.94以及与任何所列序列基本同源的核苷酸序列。
·编码第IV组酶的基因可具有选自由以下组成的组的核苷酸序列：SEQ ID No.92，SEQ ID No.93，SEQ ID No.101，SEQ ID No.102，SEQ ID No.103，SEQ ID No.104，SEQ ID No.105，SEQ ID No.106，SEQ ID No.107，SEQ ID No.108以及与任何所列序列基本同源的核苷酸序列。
·编码第V组酶的基因可具有选自由以下组成的组的核苷酸序列：SEQ ID No.117，SEQ ID No.118，SEQ ID No.119和SEQ ID No.120以及与任何所列序列基本同源的核苷酸序列。
当序列1具有与序列2至少75％，优选地至少80％，优选地至少85％，优选地至少90％，优选地至少95％，仍然更优选地至少96％，仍然更优选地至少97％，仍然更优选地至少98％和最优选地至少99％的同一性程度时，在本文中定义为一条序列(序列1)与另一序列(序列2)“基本同源”。“基本同源”的所述定义适用于核苷酸序列以及氨基酸序列。
就本发明的目的而言，两条核苷酸序列之间的同源性是指两条序列之间相同的碱基的百分比。与特定的DNA序列相关并通过遗传密码子简并性获得的DNA序列也是本发明的一部分。同源物也可以包括全长序列的具有生物活性的片段。
基本同源的多肽包括可由于天然等位基因变异或株系内变异而存在于来自不同种群的细胞中或存在于种群中的多态现象。基本同源的多肽可还衍生自并非所述特定的氨基酸和/或DNA序列的来源真菌的其它真菌，或者可以由人工设计和合成的DNA序列编码。
基本同源的多肽可仅含有特定氨基酸序列的一个或多个氨基酸的保守取代，或非必需氨基酸的取代、插入或缺失。因此，非必需的氨基酸是在这些序列之一中可以被改变而不显著改变生物功能的残基。例如，涉及如何制造表型沉默氨基酸取代的指南在Bowie，J.U.et al.，Science 247：1306-1310(1990)中提供，其中作者指出存在两种研究氨基酸序列对改变的耐受的途径。第一种方法依赖于进化过程，其中突变被自然选择接受或拒绝。第二种途径使用基因工程在被克隆的基因的特定位置上引入氨基酸改变，并选择或筛选以鉴定维持功能性的序列。如作者所述，这些研究解释了蛋白质惊人地耐受氨基酸取代。作者还指出在蛋白质的某位置上何种改变可能是允许的。例如，大部分被埋藏的氨基酸残基需要非极性侧链，而表面侧链通常很少有特征是保守的。其它这类表型沉默取代被描述于Bowie et al和其中所引用的参考文献中。
术语“保守取代”旨在表示下述取代，其中氨基酸残基被替换为具有相似侧链的氨基酸残基。这些家族是本领域已知的，并包括具有碱性侧链的氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸和组氨酸)、具有酸性侧链的氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)、具有不带电的极性侧链的氨基酸(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、具有非极性侧链的氨基酸(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、具有β-支链的氨基酸(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和具有芳香族侧链的氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。
本发明在第三方面提供了用于构建本发明的突变体微生物菌株的方法，所述方法包括使编码涉及己二酸降解的酶的基因功能性失活和/或使编码涉及脂肪酸β-氧化的酶的基因失活。为了在亲本微生物菌株中缺失此类基因以获得此类突变体微生物菌株，可以使用若干方法。一种手段是使用反义分子或RNAi分子的临时性方法(Kamath et al.2003.Nature 421：231-237)。另一种手段是使用可调节的启动子系统，所述系统可以使用外部引发剂如四环素来关闭(见Park and Morschhauser，2005，Eukaryot Cell.4：1328-1342)。还有一种手段是应用化学抑制剂或蛋白质抑制剂或物理抑制剂(见Tour et al.2003.Nat Biotech 21：1505-1508)。最优选的解决方案是去除编码己二酸盐降解活性的基因的部分或全部。为了获得此类突变体，人们可以应用本领域技术水平方法如单交叉重组(Single Cross-Over Recombination)或双同源重组(Double Homologous Recombination)。为此人们需要构建整合性克隆载体，所述载体可在宿主细胞染色体中预定的靶基因座处整合。在本发明的一个优选的实施方案中，整合性克隆载体包含与宿主细胞基因组中预定的靶基因座中的DNA序列同源的DNA片段，用于将所述克隆载体整合进所述预定的基因座中。为了促进定向整合，优选地在转化宿主细胞之前将克隆载体线性化。优选地以下述方式进行线性化，使得克隆载体的至少一端但优选地两端侧翼是与靶基因座同源的序列。靶基因座侧翼的同源序列的长度优选地为至少0.1kb，进一步优选地至少0.2kb，更优选地至少0.5kb，进一步更优选地至少1kb，最优选地至少2kb。最终最适合实验的长度取决于生物、靶DNA的序列和长度。
优选地通过宿主细胞增强的同源重组能力提高通过同源重组将核酸构建体定向整合进宿主细胞基因组(即在预定的靶基因座中整合)中的效率。此类细胞表型优选地涉及如WO 05/95624中所述的缺陷型hdfA或hdfB基因。WO 05/95624公开了一种优选的方法，所述方法通过预防DNA片段非同源随机整合进基因组中来获得包含提高的定向整合效率的丝状真菌细胞。载体系统可以是单个载体或质粒或两种或更多载体或质粒，它们在一起含有要引入宿主细胞基因组中的总DNA。使用第二和/或致死选择标记物的替代性方法描述于WO2007115886和WO2007115887中。
可以通过原生质体形成、原生质体转化和细胞壁的再生来转化真菌细胞。转化真菌宿主细胞的合适步骤描述于EP238023和Yelton et al.(1984.Proc.Nat.Acad.Sci.USA 81：1470-1474)中。使用Agrobacterium tumefaciens转化丝状真菌宿主细胞的合适步骤由Groot M.J.et al.(1998.Nat.Biotechnol.16：839-842.Erratum in：Nat.Biotechnol.1998.16：1074)描述。也可以使用针对Neurospora crassa描述的其它方法如电穿孔。
使用共转化(即与感兴趣的基因一起还转化可选择标记物基因)转染真菌细胞。其可以与感兴趣的基因物理连接(即在质粒上)，或位于独立的片段上。转染后，针对该选择标记物基因的存在筛选转化体，并随后分析优选的预定基因组基因座上的整合。可选择的标记物是提供针对杀生物剂或病毒的抗性、针对重金属的抗性、针对营养缺陷型的原养型等等的产物。有用的可选择标记物包括但不限于amdS(乙酰胺酶)、argB(鸟氨酸氨甲酰基转移酶)、bar(膦丝菌素酰基转移酶)、hygB(潮霉素磷酸转移酶)、niaD(硝酸盐还原酶)、pyrG(乳清苷-5’-磷酸盐脱羧酶)、sC或sutB(硫酸盐腺嘌呤基转移酶)、trpC(邻氨基苯甲酸合酶)、ble(腐草霉素抗性蛋白质)或其等价物。最优选的情形是提供包含第一DNA片段的DNA分子，所述第一DNA片段包含想要的替换序列(即选择标记物基因)，替换序列5’和3’侧翼是与靶序列侧翼的染色体DNA序列基本同源的DNA序列。可以通过第一DNA片段的可选择标记物的存在，选择其中染色体DNA序列中的靶序列被想要的替换序列替换的细胞。为了提高选择正确突变体微生物菌株的相对频率，可以将包含表达盒的第二DNA片段与上述片段可操作地连接(即靶基因座的5’侧翼+选择标记物基因+靶基因座的3’侧翼)，所述表达盒包含编码选择标记物的基因和在真核细胞中有功能的调节序列，并可通过第一DNA片段的可选择标记物的存在和第二选择标记物基因的不存在，选择其中染色体DNA序列中的靶序列被想要的替换序列替换的细胞。靶基因座的5’和3’侧翼可以例如是基因的启动子和终止子，或是基因的5’和3’端，或这些的任何组合。
本发明中包括的作为对方法的说明提供的例子使用基因的启动子作为5’侧翼，使用基因作为3’侧翼，在启动子和基因之间插入选择标记物，从而破坏(即失活)基因转录。上文给出的基因序列可被用于制造类似的基因缺失。所述基因可以被一分为二，得到5’侧翼和3’侧翼，但是所述基因也可以被用于克隆含有基因启动子和终止子区的更大段基因组DNA，所述启动子和终止子区随后可发挥5’侧翼和3’侧翼的作用。
本发明在第四方面提供了生产N-己二酰化的β-内酰胺化合物的方法，所述方法包括在包含己二酸的发酵培养基中培养本发明的突变体菌株。
图1展示了涉及缺失Penicillium chrysogenum基因Pc20g07920的步骤。图例：实心箭头，Pc20g07920启动子；空心箭头，Pc20g07920ORF；阴影框，trpC终止子；虚线框，ccdA基因；实心框，lox位点；交叉，重组事件；向下的箭头，过程中的先后步骤；REKR和KRAM，重叠无功能amdS选择标记物片段；REKRAM，功能性amdS选择标记物基因。
数字指示寡核苷酸的SEQ ID NO。“标签”指示可用于突变体鉴定的特异性核苷酸序列的存在。
图2展示了涉及验证Penicillium chrysogenum基因Pc20g07920实际缺失的步骤。图例：实心箭头，Pc20g07920启动子；空心箭头，Pc20g07920ORF；阴影框，trpC终止子；实心框，lox位点；REKRAM，功能性amdS选择标记物基因。数字指出所示三个PCR反应的寡核苷酸的SEQ ID NO(见表7)。
一般方法
BLAST算法被用于鉴定同源序列(Altschul，et al.，1990，J.Mol.Biol.215：403-410)。公众可通过National Center for Biotechnology Information(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)获得进行BLAST分析的软件。BLAST算法参数W、T和X决定算法的灵敏度和速度。BLAST程序使用下述作为默认：词长(W)11、BLOSUM62评分矩阵(见Henikoff & Henikoff，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：10915(1989))、比对(B)50、预期(E)10、M＝5、N＝-4和并比较两条链。
如别处所述进行标准步骤(Sambrook，J.et al.(1989)，Molecular cloning：a laboratory manual，2nd Ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York)。根据制造商的流程使用校正读码聚合酶Turbo-Pfu-Polymerase(Stratagene，荷兰)或Phusion(Finnzymes)进行DNA扩增，但是构建好的菌株和质粒的验证通过使用Taq聚合酶实现。限制性酶来自Invitrogen或New England Biolabs。对常规克隆而言，使用Escherichia coli菌株Top10和DH10B(Invitrogen)。构建好的质粒的验证通过限制性分析和随后的测序进行。
实施例
实施例1
鉴定编码推定的己二酸盐降解酶和/或β-氧化酶的Penicillium chrysogenum基因
1.CoA连接酶(EC 6.2.1.xx)
使用探针A、探针B、探针C和探针D(见上下文)搜索Penicillium chrysogenum菌株Wisconsin54-1255的基因组，随后的注解揭示了编码推定的CoA-连接酶活性(EC 6.2.1.xx)的25个基因；见表2。所示百分比是使用blastP算法获得的局部同源性评分。
2.酰基-CoA脱氢酶(EC 1.3.99.xx)或酰基-CoA氧化酶(EC 1.3.3.xx)
使用探针E和探针F(见上下文)，搜索Penicillium chrysogenum菌株Wisconsin54-1255的基因组，随后的注解揭示了19个编码推定的酰基-CoA脱氢酶(EC 1.3.99.xx)和/或酰基-CoA氧化酶(1.3.3.6)的基因-见表3。指出的百分比是使用blastP算法获得的局部同源性(＝相似性)评分。
3.烯酰基-CoA水合酶(EC 4.2.1.17)
使用探针G、探针H、探针I、探针J和探针K(见上下文)搜索Penicillium chrysogenum菌株Wisconsin54-1255的基因组，随后的注解揭示了6个编码推定的烯酰基-CoA水合酶(EC 4.2.1.17)的基因-见表4。指出的百分比是使用blastP算法获得的局部同源性(＝相似性)评分。
4.3-羟基酰基-CoA脱氢酶(EC 1.1.1.35)
使用探针L和探针M(见上下文)搜索Penicillium chrysogenum菌株Wisconsin54-1255的基因组，随后的注解揭示了10个编码推定的3-羟基酰基-CoA脱氢酶(EC 1.1.1.35)的基因-见表5。指出的百分比是使用blastP算法获得的局部同源性(＝相似性)评分。
5.乙酰基-CoA C-酰基转移酶(EC 2.3.1.16)
使用探针N搜索Penicillium chrysogenum菌株Wisconsin54-1255的基因组，随后的注解揭示了4个编码推定的3-乙酰基-CoA C-酰基转移酶(EC 2.3.1.16)的基因-见表6。指出的百分比是使用blastP算法获得的局部同源性(＝相似性)评分。
实施例2
编码推定的己二酸盐降解酶的Penicillium chrysogenum基因的微阵列分析
为了鉴定在实施例1中鉴定的65个中哪些是用于修饰以预防或降低己二酸盐降解但不破坏β-合成的侧链活化的合适候选者，进行了微阵列研究。此处如下文所述测定每个基因的“己二酸盐/对照”比例、“PAA/对照”比例和“己二酸盐/PAA”比例。
将含有或不含有编码扩环酶的Streptomyces clavuligerus cefE基因的P.chrysogenum菌株接种于含有25ml β-内酰胺生产培养基(如US20020039758中所述)的100ml摇瓶中，所述培养基含有10g/l己二酸盐，3g/l苯乙酸(PAA)或不含前体(对照)。将培养物在25℃下孵育，每分钟旋转280次。90小时后对总发酵液取样并迅速冷却。洗涤细胞并将细胞沉淀物冷冻于液氮中。随后通过用研钵和研杵研磨冷冻的沉淀物来破碎细胞，并使用Trizol分离RNA。在Bioanalyzer(Agilent)上常规检查总RNA的品质和数量。使用20微克总RNA进行标准cDNA合成和标记反应(根据Affymetrix说明书)。根据供应商的说明书(Affymetrix，Santa Clara，USA)进行GeneChips
Figure BPA00001309760900171
的杂交。使用Affymetrix GeneChip
Figure BPA00001309760900172
Operating Software(GCOS，Affymetrix，Santa Clara，USA)扫描和分析经杂交的阵列。所有实验一式三份完成，并采取三次测量的平均作为转录本的相对水平。
表2-5展示了实施例1中鉴定的65个基因的多种比例。65个基因中的9个具有≥4的“己酸盐/PAA”比例。65个基因中14个具有≥3的“己二酸盐/PAA”比例。此类基因的转录可以被修饰以限制或预防己二酸盐的降解。
Figure BPA00001309760900181
Figure BPA00001309760900191
Figure BPA00001309760900201
Figure BPA00001309760900211
实施例3
缺失编码推定的己二酸代谢酶的Penicillium chrysogenum基因Pc20g07920
编码推定的酰基-CoA脱氢酶(EC 1.3.99)的基因Pc20g07920被鉴定为“己二酸盐/对照”比例为6.1且“己二酸盐/PAA”比例为4.1的基因(见表3)。为了防止所述基因转录，在启动子和开放读码框(ORF)之间插入选择标记物基因。为此，分别使用寡核苷酸SEQ ID NO.125加126和SEQ ID NO.127加128，对启动子和ORF进行PCR扩增。使用Phusion Hot-Start Polymerase(Finnzymes)扩增所述片段。扩增得到的两条片段长度均为1500个碱基对(bp)(SEQ ID NO.129和SEQ ID NO.130)，并且含有适合所谓的STABY克隆方法(Eurogentec)的14bp尾。
从标准STABY载体pSTC1.3获得两种衍生物。一种pSTamdSL被用于克隆PCR扩增得到的Pc20g07920启动子。另一种pSTamdSR被用于克隆PCR扩增得到的Pc20g07920终止子。通过插入amdS选择标记物基因的无活性部分(见例如WO04106347中pHELY-A1的PgpdA-amdS盒)构建pSTamdSL(SEQ ID NO.137)，所述插入通过PCR扩增基因(amdS)的最后2/3并将其克隆进pSTC1.3的HindIII-BamHI位点来实现。通过插入amdS选择标记物基因的无活性部分(见例如WO04106347中pHELY-A1的PgpdA-amdS盒)构建pSTamdSR(SEQ ID NO.138)，所述插入通过PCR扩增基因的PgpdA启动子和最初2/3(其中去除了EcoRV位点)并将其克隆进pSTC1.3的HindIII-PmeI位点来实现。还在PgpdA-amdS之前插入强终止子；PCR扩增并通过PgpdA-amdS片段的SbfI-NotI位点引入trpC终止子。这两种载体均含有真菌选择标记物基因amdS的重叠但是非功能性的片段，编码乙酰胺酶并且允许将这两种片段重组成功能性选择标记物的受体细胞在含有乙酰胺作为唯一氮源的琼脂培养基上生长(EP 635,574；WO97/06261；Tilburn et al.，1983，Gene 26：205-221)。根据STABY-方案(Eurogentec)，使用T4连接酶(Invitrogen)在16℃下将PCR片段过夜连接进载体中，并转化至化学感受态CYS21细胞(Eurogentec)。分离氨苄西林抗性克隆并用于PCR扩增与非功能性的amdS片段融合的被克隆的片段(见图1)。这使用寡核苷酸SEQ ID NO.131和132完成。合并由此获得的PCR片段(SEQ ID NO.133和134)，并用于转化其中缺失了hdfA基因的P.chrysogenum菌株(WO05095624)。在所述菌株中非同源性的末端接合途径(end-joining pathway)被破坏，因此DNA的随机整合被大幅减少。因为合并的PCR片段自身也能够重组形成功能性amdS选择标记物基因(即所谓的二分(bipartite)标记物方法或分裂(split)标记物方法)，所以正确靶向的整合体应当经历了三重同源重组事件(见图1)。
在含有乙酰胺的琼脂(EP 635,574；WO97/06261)上获得超过20个转化体，随后将它们转移至第二乙酰胺选择平板上以诱导孢子形成。在含有己二酸或PAA作为侧链前体的β-内酰胺生产培养基(US20020039758)上测试由此获得的菌株，与不含任何侧链前体的对照情况相比。
所应用的基因缺失方法可以被单独或组合地用于通过本发明鉴定的每个基因，以获得具有来自培养基的己二酸向N-己二酰化的β-内酰胺化合物的最高并入的最佳突变体微生物菌株。
也可以如下鉴定具有更低己二酸盐降解的突变体微生物菌株：在己二酸盐作为生物质形成的碳源的情况下，比较此类突变体微生物菌株与亲本微生物菌株的生长。在这种情况下，US20020039758中所述的P.chrysogenum培养基中的乳糖和葡萄糖应当被0.0-1.0g/L葡萄糖和1-80g/L己二酸盐代替。具有更慢生长或不生长的突变体微生物菌株具有降低的己二酸盐降解，因此可具有提高的来自培养基的己二酸向N-己二酰化的β-内酰胺化合物的并入。
实施例4
缺失编码推定的己二酸代谢酶的Penicillium chrysogenum基因Pc20g01800和Pc20g15640
对基因Pc20g01800和Pc20g15640进行如实施例3中所述相同的方法，所述两种基因均具有≥3的己二酸盐/PAA比例，分别为3.0和6.4。分别使用针对基因Pc20g01800的特异性片段的寡核苷酸SEQ ID NO.139加SEQ ID NO.140和针对基因Pc20g16540的特异性片段的SEQ ID NO.141加SEQ ID NO.142，通过PCR扩增获得要克隆的特定基因片段(启动子和ORF)。将这些片段STABY克隆，并如实施例3中所述获得用于Penicillium chrysogenum转化的片段。
对两种基因缺失而言均获得若干消耗乙酰胺的转化体。
实施例5
Penicillium chrysogenum基因Pc20g07920，Pc20g01800和Pc20g15640的缺失均是正确的
对实施例3和4中获得的突变体进行菌落纯化，并用于进一步表征：通过PCR验证实际的基因缺失。
为了分离具有正确品质(即使得能够进行多达9kb的PCR扩增)的染色体DNA，使用三种经分离的突变体的孢子接种24-孔MTP平板中3ml培养基，并在550rpm、25℃和80％湿度下培养2-3天。洗涤细胞并使用标准缓冲液将其原生质体化(见Swinkels，B.W.，Selten，G.C.M.，Bakhuis，J.G.，Bovenberg，R.A.L.，Vollebregt，A.W.1997.The use of homologous amdS genes as selectable markers.WO9706261)。原生质体化使用10mg/ml的Glucanex在24-孔板中于37℃下进行2小时。再次洗涤细胞(原生质体和残余菌丝体)，并根据供应商的说明书，使用Puragen DNA分离试剂盒(Gentra)分离DNA。将DNA晾干并溶于100ul水中。以50μl的终体积进行PCR反应，所述终体积具有以下组成：
5μl         DNA模板(从样品制剂5x稀释而来)
21.5μl      水
10μl        GC缓冲液(Finnzymes)
1μl         dNTP(10mM储存溶液)
2μl         DMSO
5μl         正向寡核苷酸(2μM储存溶液)
5μl         反向寡核苷酸(2μM储存溶液)
0.5μl       Phusion Polymerase(Finnzymes)
为了验证正确的缺失，进行3种PCR反应(见图2)。第一种PCR反应是为了证实左侧翼的正确整合，针对三种不同的基因座使用三种特异性正向反向寡核苷酸(见表7)，这在基因Pc20g20270的情况下是SEQ ID NO.143的寡核苷酸和SEQ ID NO.144的寡核苷酸作为反向引物；前者对所述基因的基因座是特异性的，并且紧挨着用于基因靶向的片段上游选择，后者在amdS选择标记物中退火，其可以被用于验证所有个体基因突变。第二种PCR反应是为了证实右侧翼的正确整合，对基因Pc20g20270的基因座而言使用SEQ ID NO.146的特异性反向寡核苷酸和SEQ ID NO.145的正向寡核苷酸；前者对所述基因的基因座是特异性的，并且紧挨着用于基因靶向的片段下游选择，后者在amdS选择标记物中退火，其可以被用于验证所有个体基因突变。第三种PCR反应是为了证实WT片段的不存在和所述基因的基因座处的正确整合；为此可以合并前两种PCR反应的两种基因座特异性寡核苷酸，即在基因Pc20g20270的基因座的情况下合并SEQ ID NO.143的正向寡核苷酸和SEQ ID NO.146的反向寡核苷酸；如果基因靶向是正确的，则这产生比WT情况下大得多的条件(见表2)。
使用以下程序在Biorad的Tetrad机器中进行PCR扩增：
步骤1：98℃30秒
步骤2：98℃10秒
步骤3：55℃30秒
步骤4：72℃1.5-4.5分钟
(通过使用0.5分钟/待扩增的kb来设置实际的延伸时间)
步骤5：将步骤2-4重复35个循环
步骤6：72℃下10分钟
表7.在基因座Pcg20g07920、Pc20g01800和Pc20g16540的三种分离的突变体中预期和观察到的PCR片段(也见图2)。
Figure BPA00001309760900251
  2   右侧翼   145   146   3.4kb   无条带   ～3.4kb
  3   基因座   143   146   8.5kb   4.6kb   ～8.5kb
  Pc20g01800   1   左侧翼   147   144   2.0kb   无条带   ～2.0kb
  2   右侧翼   145   148   3.4kb   无条带   ～3.4kb
  3   基因座   147   148   8.4kb   4.6kb   ～8.5kb
  Pc20g15640   1   左侧翼   149   144   2.1kb   无条带   n.t.
  2   右侧翼   145   150   3.4kb   无条带   n.t.
  3   基因座   149   150   8.5kb   4.6kb   n.t.
表7中所示结果清楚地证明突变体Pc20g07920和Pc20g01800被正确靶向，并且不存在WT。相同的步骤可适用于根据本发明鉴定和获得的所有突变体；在所有情况下SEQ ID NO 144和145的寡核苷酸保持相同，但是其它寡核苷酸是基因特异性的。
实施例6
缺失Penicillium chrysogenum基因Pc20g07920、Pc20g01800和Pc20g15640导致与非突变体的亲本菌株相比提高的由来自培养基的己二酸进入N-己二酰化的β-内酰胺化合物的并入产率。
如实施例2中所述，将藉此证明是基因座Pc20g07920和Pc20g01800的正确突变体的孢子接种于100ml摇瓶中包含己二酸作为侧链前体的25ml培养基中，并在25℃和280rpm下孵育168小时。作为对照菌株，接种在2008年4月15日以保藏号CBS 122850保藏于荷兰，Utrecht，the Centraalbureau voor Schimmelcultures的P.chrysogenum菌株DS17690(S917)，并以相同方式培养。随后通过离心去除细胞，并使用1ml上清液进行NMR分析。在Bruker Avance 600波谱仪上于600MHz下进行定量1H NMR实验。在冻干之前，向已知量的滤液中添加已知量的溶于磷酸盐缓冲液中的内标(例如顺丁烯二酸)。将残余物溶于D2O中并于300°K下测量。扫描之间的延迟(30s)大于所有化合物T1的5倍，使得感兴趣的化合物的总体与内标总体之间的比例是青霉素、中间产物(6-APA和异青霉素N)、降解产物(8-HPA)剩余糖和剩余侧链(己二酸盐)的数量的精确度量。
表8.与非突变体的亲本菌株相比，突变体微生物菌株(即缺失突变体)由来自培养基的己二酸进入N-己二酰化的β-内酰胺化合物的相对并入产率。
Figure BPA00001309760900271
与DS17690菌株相比，突变体微生物菌株将来自培养基的己二酸并入N-己二酰化的β-内酰胺化合物的并入产率被显著提高。
Figure IPA00001309760500011
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Claims (15)

1.用于鉴定能够生产N-己二酰化的β-内酰胺化合物的微生物菌株的一个或多个下述基因的方法，所述基因编码涉及己二酸盐降解和/或脂肪酸β-氧化的一种或多种酶，所述方法包括以下步骤：
a.选择涉及己二酸盐降解和/或脂肪酸β-氧化的一个或多个已知基因的核苷酸序列和/或任选地由所述基因编码的一种或多种已知酶的氨基酸序列；
b.使用从步骤(a)中选择的序列作为BLAST搜索中的探针，用于在能够生产N-己二酰化的β-内酰胺化合物的微生物菌株的可获得的核苷酸或氨基酸序列中鉴定同源序列。
2.根据权利要求1的方法，其中所述涉及脂肪酸β-氧化的酶选自下述组：
a.第I组：CoA连接酶(EC 6.2.1.xx)
b.第II组：酰基-CoA脱氢酶(EC 1.3.99.xx)和酰基-CoA氧化酶(EC 1.3.3.xx)
c.第III组：烯酰-CoA水合酶(EC 4.2.1.17)
d.第IV组：3-羟基酰基-CoA脱氢酶(EC 1.1.1.35)
e.第V组：乙酰基-CoA C-酰基转移酶(硫解酶-EC 2.3.1.16)。
3.根据前述权利要求中任一项的方法，其中编码涉及将来自培养基的己二酸并入N-己二酰化的β-内酰胺化合物的一种或多种酶的基因具有大于1的“己二酸盐/对照”比，其中所述“己二酸盐/对照”比是亲本菌株在含有己二酸的培养基中培养时所述基因的转录本水平与亲本菌株在不含己二酸的对照培养基中培养时所述基因的转录本水平的比例。
4.在包含己二酸的培养基中培养时能够生产N-己二酰基化的β-内酰胺化合物的突变体微生物菌株，其特征是所述菌株与非突变体亲本菌株相比，具有经改进的由来自培养基的己二酸向N-己二酰化的β-内酰胺化合物的并入产率。
5.根据权利要求4的菌株，其特征是所述经改进的己二酸盐并入产率为至少5％。
6.前述权利要求中任一项的菌株，其中编码涉及己二酸降解并且可通过权利要求1-3中任一项的方法鉴定的基因是功能性失活的。
7.前述权利要求中任一项的菌株，其中所述涉及己二酸降解的酶选自由以下组成的组：CoA连接酶(EC 6.2.1.xx)，酰基-CoA脱氢酶(EC 1.3.99.xx)和酰基-CoA氧化酶(EC 1.3.3.xx)，烯酰基-CoA水合酶(EC 4.2.1.17)，3-羟基酰基-CoA脱氢酶(EC 1.1.1.35)，乙酰基-CoA C-酰基转移酶(硫解酶-EC 2.3.1.16)。
8.前述权利要求中任一项的菌株，其中所述编码涉及己二酸降解的所述酶的基因选自由以下组成的组：SEQ ID NO 1，SEQ ID NO 2，SEQ ID NO 3，SEQ ID NO 4，SEQ ID NO 5，SEQ ID NO 6，SEQ ID NO 7，SEQ ID NO 8，SEQ ID NO 9，SEQ ID NO 10，SEQ ID NO 11，SEQ ID NO 12，SEQ ID NO 13，SEQ ID NO 14，SEQ ID NO 15，SEQ ID NO 16，SEQ ID NO 17，SEQ ID NO 18，SEQ ID NO 19，SEQ ID NO 20，SEQ ID NO 21，SEQ ID NO 22，SEQ ID NO 23，SEQ ID NO 24，SEQ ID NO 25，SEQ ID No.51，SEQ ID No.52，SEQ ID No.53，SEQ ID No.54，SEQ ID No.55，SEQ ID No.56，SEQ ID No.57，SEQ ID No.58，SEQ ID No.59，SEQ ID No.60，SEQ ID No.61，SEQ ID No.62，SEQ ID No.63，SEQ ID No.64，SEQ ID No.65，SEQ ID No.66，SEQ ID No.67，SEQ ID No.68，SEQ ID No.69，SEQ ID No.89，SEQ ID No.90，SEQ ID No.91，SEQ ID No.92，SEQ ID No.93，SEQ ID No.94，SEQ ID No.92，SEQ ID No.93，SEQ ID No.101，SEQ ID No.102，SEQ ID No.103，SEQ ID No.104，SEQ ID No.105，SEQ ID No.106，SEQ ID No.107，SEQ ID No.108，SEQ ID No.117，SEQ ID No.118，SEQ ID No.119，SEQ ID No.120，SEQ ID No.135以及与所列出的任何序列基本同源的核苷酸序列。
9.根据前述权利要求中任一项的菌株，其中所述N-己二酰化的β-内酰胺化合物选自由以下组成的组：己二酰基-6-APA，己二酰基-7-ADCA，己二酰基-7-ACA，己二酰基-7-ACCA，己二酰基-7-PACA，己二酰基-7-ADAC，己二酰基-7-ACCCA组成的组。
10.根据前述权利要求中任一项的菌株，其中所述菌株是真菌、细菌或酵母。
11.根据前述权利要求中任一项的菌株，其中所述真菌属于Penicillium物种。
12.根据前述权利要求中任一项的菌株，其中所述真菌是Penicillium chrysogenum，其优选地用编码扩环酶或扩环酶/水解酶的基因转化过，并表达编码扩环酶或扩环酶/水解酶的基因。
13.用于构建在权利要求1-9中任一项中定义的突变体菌株的方法，所述方法包括使编码涉及己二酸降解的酶的基因功能性失活。
14.根据权利要求13的方法，其中所述涉及己二酸降解的所述酶选自由以下组成的组：CoA-连接酶，酰基-CoA脱氢酶，酰基-氧化酶，烯酰基-CoA水合酶，3-羟基酰基-CoA脱氢酶和乙酰基-CoA C-酰基转移酶(硫解酶)，并且所述基因选自权利要求5中定义的组。
15.用于生产N-己二酰化的β-内酰胺化合物的方法，所述方法包括在包含己二酸的发酵培养基中培养根据权利要求1-9中任一项定义的菌株。
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CN113652440A (zh) * 2021-08-05 2021-11-16 昆明理工大学 3-酮脂酰辅酶a硫解酶基因rkacaa1-2及其应用
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