CN102171328A - 经改进的斯达汀生产 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了用于发酵生产制甲羟酶素、洛伐他汀、普伐他汀或辛伐他汀的方法，所述方法包括培养包含来自Aspergillus trerreus的lovE转录调节子基因的多核苷酸的宿主(优选丝状真菌)。另外，本发明提供了用于生产上述斯达汀的、包含来自Aspergillus terrreus的lovE转录调节子基因的多核苷酸的宿主。
Description
发明领域
本发明涉及斯达汀的发酵方法。
发明背景
斯达汀(statin)类的降胆固醇剂是非常重要的药物，因为它们通过抑制HMG-CoA还原酶降低血中的胆固醇浓度。后一酶催化胆固醇生物合成中的限速步骤，即(3S)-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A(HMG-CoA)到甲羟戊酸的转化。市场上存在若干种类型的斯达汀，其中有阿托伐他汀(atorvastatin)、制甲羟酶素、洛伐他汀(lovastatin)、辛伐他汀(simvastatin)和普伐他汀。阿托伐他汀通过化学合成制造，而上文提到的其它或者通过直接发酵或者通过前体发酵生产。这些(前体)发酵通过Penicillium、Aspergillus和Monascus属的真菌进行。
在异源宿主(即如Penicillium chrysogenum等宿主，其天然不生产斯达汀且其中引入了来自天然斯达汀生产者例如Penicillium citrinum或Aspergillus terreu的完整斯达汀途径基因)中发酵这些化合物时存在常见问题，因为使用的异源菌株的生产力和产率较低。早前公开了若干技术，包括通过UV诱变进行对斯达汀生产菌株的经典改进(J.Gen.Appl.Microbiol.(2004)，Vol.50，p.169-176)。另外，描述了用对应于来自Penicillium citrinum的基因mlcR的多核苷酸对斯达汀生产生物Penicillium citrinum的转化。然而，这两种技术均未导致异源宿主中斯达汀生产的改进。尽管WO 2007/122249中公开了使用以工业水平进行生产的Penicillium chrysogenum菌株的另一途径，但是此种途径的问题在于用于工业生产的微生物不总是可获得的和/或合适的。仍然存在对替代性途径的需要。
发明详述
术语“表达”包括涉及多肽生产的任何步骤，其可包括转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰和分泌。
当核酸构建体含有编码序列在特定宿主生物中表达所需的所有控制序列时，术语“核酸构建体”与术语“表达载体”或“盒”同义。
术语“控制序列”在本文中被定义为包括对多肽的表达来说必需的或有利的所有组件。每种控制序列对编码多肽的核酸而言可以是内源的(native)或外源的(foreign)。这类控制序列可包括，但不限于启动子、前导序列、最适翻译起始序列(如Kozak，1991，J.Biol.Chem.266：19867-19870中所述)、分泌信号序列、前肽序列、多聚腺苷酸化序列、转录终止子。控制序列至少包括启动子以及转录和翻译终止信号。控制序列可以是含有转录控制序列的适当的启动子序列。启动子可以是在细胞中显示转录调控活性的任何核酸序列，包括突变的、截短的和杂交的启动子，它们可得自编码细胞外或细胞内多肽的基因。启动子对细胞或多肽而言可以是同源的或异源的。启动子可以源自供体物种，或源自任何其它来源。控制真核生物中表达水平的一种备选方式是使用内含子。高等真核生物具有由外显子和内含子组成的基因。术语“外显子”在本文中被定义为包括开放读码框(ORF)的所有组件，其被翻译为蛋白质。术语“内含子”在本文中被定义为包括所有不包括于开放读码框中的组件。术语“开放读码框”在本文中被定义为下述多核苷酸，其从甲硫氨酸的密码子序列ATG开始，随后是连续的一串编码所有可能的氨基酸的密码子，在一定数量后被终止密码子打断。该开放读码框可以被翻译为蛋白质。含有分离自基因组的基因的多核苷酸是该基因的所谓的基因组DNA或gDNA序列，其包括所有外显子和内含子。含有通过反转录反应分离自mRNA的基因的多核苷酸是该基因的所谓的拷贝DNA或cDNA序列，其仅包括外显子，而内含子通过细胞机制被切除。后一类型的DNA尤其适用于在原核宿主中表达感兴趣的真核基因。也可以合成制造两种类型DNA的变体，这使得改变内含子的确切核苷酸序列或改变感兴趣的基因中内含子数量成为可能。这也使得向来自原核起源的感兴趣的基因中添加内含子以简化或改进在真核宿主中的表达成为可能。另外，也可以在上述控制序列如启动子、多聚腺苷酸化位点或转录终止子中引入内含子。内含子的存在、不存在、变异或引入是调节真核细胞中基因表达水平的一种手段。
术语“可操作地连接”在本文中被定义为下述构型，其中控制序列被适当地置于与DNA序列的编码序列相关的位置，使得控制序列能指导多肽的生产。
术语“普伐他汀”在本文中被定义为在6′位置上具有α-或β-构象的6′-羟基取代的制甲羟酶素，或α-和β-构象二者的混合物，并包括闭合的结构(带有内酯环)和开放的结构(具有羟基羧酸部件)二者。
在本发明的上下文中，制甲羟酶素、普伐他汀、无锡他汀(wuxistatin)、红曲米素J(monacolin J)、洛伐他汀和/或辛伐他汀(通常称作“斯达汀”)“生物合成基因”或“生物合成途径”包括编码直接涉及斯达汀分子合成的酶的所有基因，编码斯达汀分子的分泌中的酶的所有基因，和编码涉及前两类基因的转录调节的蛋白质的所有基因。此外，还包括能够生产斯达汀的微生物宿主的所有下述基因，所述基因通过过表达或失活引起生产能力的显著改变(即分别导致生产至少增加20％的斯达汀或生产至少减少20％的斯达汀)。特定的基因是(但不限于)：Penicillium citrinum的制甲羟酶素生物合成基因簇(即mlcA、mlcB、mlcC、mlcD、mlcE、mlcF、mlcH、mlcG、mlcR，见Entrez数据库登记号AB072893；Abe Y，Suzuki T，Ono C，Iwamoto K，Hosobuchi M and Yoshikawa H，MoI Genet Genomics 2002，267：636-646)，Aspergillus terreus的洛伐他汀生物合成基因簇(即ORF1、ORF2、lovA、ORF5、lovC、lovD、ORF8、lovE、ORF10、lovF、ORF12、ORF13、ORF14、ORF15、ORF16、细胞色素P450单氧合酶、ORF18；见Entrez数据库登记号AF141924和AF141925；Kennedy J，Auclair K，Kendrew SG，Park C，Vederas JC and Hutchinson CR，Science 1999，284：1368-1372)，Monascus pilosus的红曲米素K生物合成基因簇(即mkA、mkB、mkC、mkD、mkE、mkF、mkG、mkH和mkl；见Entrez数据库登记号DQ17659，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi？db＝nuccore&id＝74275560)，及其源自其它物种的基本同源物。
实际的斯达汀生物合成途径可得自单个供体宿主或得自多于一个宿主，或(部分)由合成的多核苷酸组成。
就本发明的目的而言，两条氨基酸序列之间的同一性程度是指两条序列之间相同的氨基酸的百分比。使用BLAST算法测定同一性程度，所述BLAST在Altschul，et al.(J.Mol.Biol.215：403-410(1990))中描述。用于进行BLAST分析的软件是公众可以通过National Center for Biotechnology Information(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)获得的。BLAST算法参数W、T和X确定比对的灵敏度和速度。BLAST程序使用下述作为默认：词长(W)11、BLOSUM62评分矩阵(见Henikoff&Henikoff，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：10915(1989))、比对(B)50、预期(E)10、M＝5、N＝-4并比较两条链。
基本同源的多肽可仅含有特定氨基酸序列的一个或多个氨基酸的保守取代，或非必需氨基酸的取代、插入或缺失。因此，非必需的氨基酸是在这些序列之一中可以被改变而不显著改变生物功能的残基。例如，涉及如何制造表型沉默氨基酸取代的指南在Bowie，J.U.et al.(Science 247：1306-1310(1990))中提供，其中作者指出存在两种研究氨基酸序列对改变的耐受的途径。第一种方法依赖于进化过程，其中突变被自然选择接受或拒绝。第二种途径使用基因工程在被克隆的基因的特定位置上引入氨基酸改变，并选择或筛选以鉴定维持功能性的序列。如作者所述，这些研究解释了蛋白质惊人地耐受氨基酸取代。作者还指出在蛋白质的某位置上何种改变可能是允许的。例如，大部分被埋藏的氨基酸残基需要非极性侧链，而表面侧链通常很少有特征是保守的。其它这类表型沉默取代被描述于Bowie et al和其中所引用的参考文献中。
术语“保守取代”旨在表示下述取代，其中氨基酸残基被替换为具有相似侧链的氨基酸残基。这些家族是本领域已知的，并包括具有碱性侧链的氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸和组氨酸)、具有酸性侧链的氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)、具有不带电的极性侧链的氨基酸(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、具有非极性侧链的氨基酸(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、具有β-支链的氨基酸(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和具有芳香族侧链的氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。
本发明的一个目的是提供经改进的斯达汀(如制甲羟酶素、洛伐他汀、普伐他汀、辛伐他汀和无锡他汀)生产方法，从而克服具有转录活化子(如mlcR)的重组斯达汀生产菌株的低斯达汀生产力的问题。
本发明解决了异源微生物(即这样的微生物，其天然不具有斯达汀生物合成途径，但整合了来自其它生物如Aspergillus terreus或Penicillium citrinum的斯达汀生物合成途径)的低斯达汀生产力的问题。如本发明中所述，通过添加被整合的斯达汀途径(如来自Penicillium citrinum的制甲羟酶素途径)的另一转录调节子基因解决了所述问题。优选地，被整合的斯达汀途径(如来自Penicillium citrinum的制甲羟酶素途径)的可能的转录调节子基因与同源的活化子交换，如洛伐他汀转录活化子lovE。本发明公开了：如果用lovE或具有高度同源性的lovE类似物代替原始的转录调节子mlcR，则异源带有Penicillium citrinum斯达汀途径的微生物显示更高的斯达汀生产力。因为lovE自身仅与mlcR中度同源(遗传水平上的同一性为65％，氨基酸水平上的同一性为40％)，所以本发明的有利结果是出人意料地令人惊讶的。
在本发明的第一个方面，提供了包含异源斯达汀生物合成基因转录活化子的真菌菌株。
在一个实施方案中提供了生产斯达汀的菌株，所述菌株不是Aspergillus terreus，其含有斯达汀生物合成所需的所有基因，并含有来自Aspergillus terreus的lovE基因。优选地，本发明提供了源自生产菌株(例如WO 2007/122249中所述的Penicillium chrysogenum)的生产制甲羟酶素的宿主细胞。所述生物经历若干轮经典的菌株改进和随后的适应和改进过程，以实现目前的高效价青霉素G发酵过程。生物的DNA中大量的改变不仅导致针对产物青霉素G的提高的通量和产量，而且还导致针对150,000-升发酵管中苛刻条件(即氧限制、剪切力、葡萄糖限制等等)的形态学改变和适应。通过缺失β-内酰胺生物合成机制，获得了下述菌株，所述菌株缺乏β-内酰胺生产能力，但是仍然保持所有下述突变，所述突变导致工业规模上的良好性能，例如剪切力抗性、适合按比例放大、针对代谢产物的高代谢通量、适应确定的培养基、工业顺流加工(down stream processing)和低粘度模式(即形态学、调节和代谢突变)。在本发明的Penicillin chrysogenum菌株中，至少编码异青霉素N合酶的β-内酰胺生物合成基因pcbC被失活。优选地，其它β-内酰胺生物合成基因也被失活，所述基因是编码L-(α-氨基己二酰基)-L-半胱氨酰-D-缬氨酸合成酶的pcbAB和/或编码酰基-辅酶A：异青霉素N酰基转移酶的penDE。更优选地，通过去除基因的部分来失活基因。最优选的是完全去除基因序列。因为这些基因的完全去除产生下述Penicillium chrysogenum菌株，所述菌株缺乏任何β-内酰胺生物合成能力并因此是非常适合于生产所有种类产物的菌株。尽管事实上工业生物可能是非常难以操作的，但是该Penicillium chrysogenum菌株惊人地易于转化，并能够以比天然生产宿主高得多的效价生产斯达汀。
尽管不是本发明所必需的，但是优选地从能够在工业环境中生产的生物获得Penicillium chrysogenum突变体。这类生物典型地可被定义为：具有高生产力和/或基于消耗的碳源的高产物产率和/或基于产生的生物质数量的高产物产率和/或高生产力率和/或高产物效价。这类生物极其适合于转化为制甲羟酶素宿主细胞。对生产青霉素G的Penicillium chrysogenum菌株而言，这类高效价是高于1.5g/L青霉素G，优选地高于2g/L青霉素G，更优选地高于3g/L青霉素G，最优选地高于4g/L青霉素G的效价。前述数值应用于在复合发酵培养基(每升含有：乳糖，40g/L；玉米浸渍固体；20g/L；CaCO3，10g/L；KH2PO4，7g/L；苯乙酸，0.5g/L；pH 6.0)中96小时后的发酵效价。合适的工业菌株是实验部分(一般方法)中提到的菌株。
Penicillium chrysogenum的所有工业菌株系经历了多轮经典的菌株改进，导致三种常见的突变类型：
(i)直接扩增生物合成基因，导致青霉素代谢产物途径的酶活性提高
(ii)修饰初级代谢基因，最后导致多种适应的代谢重排，均引起针对终产物的更高通量。例子：增加的氨基酸构建块合成，减少的苯乙酸的消耗等等。
(iii)细胞结构修饰，导致形态学、膜组成、细胞器组织的改变，从而“有助于”高代谢通量和以工业规模发酵。例子：增加的过氧化物酶体数，其为青霉素合成的“装配线”之一。
与第(ii)和(iii)类相比，在(i)类突变类型中DNA水平有显著不同。尽管后两类主要是碱基对水平上经分离的突变、缺失、重复和/或改变，但是(i)类中的突变是非常不同的60到100kb区的扩增，其导致基因组中若干直接的和反向的重复。这有时候导致显著的遗传不稳定性，得到不稳定和可变的群体。事实上，这表示在给定的青霉素生产菌株中，(ii)和(iii)类的所有突变是固定的，但是(i)类中突变的精确拷贝数可以波动。使用该原则和本领域技术人员已知的技术，可以获得稳定的分离株，其中仅一个拷贝的青霉素生物合成基因仍然存在。取决于初始菌株的拷贝数，可以在一、二、三或若干轮筛选和选择中获得该状况。就该特定的特征而言，然后分离株可与物种的模式株(type strain)NRRL1951及经典菌株改进后其第一代后代直到Wisconsin 54-1255相比，所有菌株均含有一个拷贝的青霉素生物合成基因。主要的差异是来自高生产菌株的一拷贝分离株仍然含有(ii)和(iii)类的所有其它突变，使其与从NRRL1951到Wisconsin 54-1255的菌株相比成为工业高生产菌株。随后，可以使用本领域工艺水平(state-of-the-art)重组技术缺失最后一组青霉素生物合成基因。这些步骤的详细综述在实施例中给出，并概括于以下的步骤中：
(a)从Penicillium菌株分离分离株，其具有单个基因组拷贝的青霉素基因簇
(b)从步骤(a)中获得的分离株中缺失基因pcbC
(c)从步骤(a)或(b)中获得的分离株中任选地缺失基因pcbAB和/或penDE。
基因可以被部分失活。更优选地，基因序列被完全去除。因为这些基因的完全去除产生下述Penicillium chrysogenum菌株，所述菌株缺乏任何β-内酰胺生物合成能力并因此是非常适合于生产所有种类产物的菌株。可以使用的重组技术是本领域技术人员公知的(即单交叉或双同源重组(Single Cross Over or Double Homologous Recombination))。
缺失和置换的一个优选的策略是EP 357,127中描述的基因置换技术。如EP 635,574所述，优选地使用amdS基因作为选择标记物，进行对基因和/或启动子序列的特定缺失。借助于在氟乙酰胺培养基(EP 635,574)上的反选择，得到的菌株是不含选择标记物的，并可用于进一步的基因修饰。或者可以使用，或与其它提到的技术组合使用基于Escherichia coli中粘粒体内重组的技术，如Chaveroche et al.(2000，Nucl Acids Res，28，E97)所述。该技术适用于其它丝状真菌，例如Penicillium chrysogenum。此外，用于去除扩增的基因组片段的相同原则也可用于其它工业生产物种中，其中经典的菌株改进程序已经诱导了基因和基因组重复。另外，此处，(ii)和(iii)类的额外突变是固定的，并确保该菌株能够在工业发酵过程中茁壮生长。
这类Penicillium chrysogenum细胞可以用下述基因装备，所述基因编码制甲羟酶素生物合成必需的所有蛋白质和酶。这可以是一个或多个斯达汀生物合成基因，例如被描述为涉及制甲羟酶素生物合成的八个Penicillium citrinum基因(Abe et al.，2002，MoI Genet Genomics 267：636-646；Abe et al.，2002，MoI Genet Genomics 268：130-137)：编码聚酮化合物合酶的mlcA；编码聚酮化合物合酶的mlcB；编码P450单加氧酶的mlcC；编码HMG-CoA还原酶的mlcD；编码流出泵的mlcE；编码氧化还原酶的mlcF；编码脱氢酶的mlcG；编码转酯酶的mlcH。Abe et al.还描述了转录调节子mlcR，其对于制甲羟酶素生物合成是关键性的，并且添加至细胞时也可以提高Penicillium citrinum菌株的制甲羟酶素水平。还可以使用展示类似活性的任何同源基因。
在本发明中公开了转录调节子基因mlcR可以被来自Aspergillus terreus的lovE代替。LovE转录调节子蛋白质与来自Penicillium citrinum的转录活化子MlcR共享40％的序列同一性。因此未预期lovE能够取代mlcR的功能。然而令人惊讶的是，LovE转录调节子蛋白质不仅能够代替来自Penicillium citrinum的转录活化子MlcR的功能，其甚至导致提高的生产力。或者，与lovE基因同源的基因可以被用于改进异源宿主细胞中的斯达汀生产。优选地，所述基因应当与lovE基因70％同源；更优选地，所述基因应当与lovE基因80％同源；进一步更优选地，所述基因应当与lovE基因90％同源。同样的原则可被用于得到其它真核物种(非Aspergillus terreus)的合适的制甲羟酶素生产宿主细胞，及其工业衍生物，例如但不限于：Aspergillus niger、Penicillium brevicompactum、Penicillium citrinum、Aspergillus oryzae、Trichoderma reesei、Chrysosporium lucknowense、Saccharomyces cerevis iae、Kluyveromyceslactis、Monascus ruber、Monascus paxii、Mucor hiemalis、Pichia ciferrii和Pichia pastoris。这些物种的工业衍生物经历若干轮的经典诱变，随后是针对改进的工业生产特性的筛选和选择，这使得它们特别适用于本发明。通过去除(即缺失)不想要的产物的部分或全部途径，该菌株保留其期望的工业发酵特性和朝向代谢产物(包括酶)的高通量。
可以通过使用具有改进的动力学特性的同源蛋白质来改进制甲羟酶素的生产。这类“同源物”或“同源序列”被定义为编码下述多肽的DNA序列，所述多肽显示由分离自供体物种的原始DNA序列编码的多肽的至少一种活性，并具有下述氨基酸序列，所述氨基酸序列与特定的DNA序列编码的蛋白质的氨基酸序列具有一定程度的同一性。具有对制甲羟酶素生物合成基因“基本同源”的氨基酸序列的多肽被定义为具有下述氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列与特定的氨基酸序列具有至少25％、更优选地至少30％、更优选地至少40％、更优选地至少50％、进一步更优选地至少60％、进一步更优选地至少70％、进一步更优选地至少80％、进一步更优选地至少90％、进一步更优选地至少98％和最优选地至少99％的同一性程度，该基本同源的肽展示朝向制甲羟酶素和/或制甲羟酶素前体合成的活性。使用该途径可以获得多种优点，例如克服反馈抑制、促进分泌和减少副产物形成。同源序列可包括下述多态性，所述多态性由于天然的等位基因变异或菌株内(intra-strain)变异而存在于来自不同种群或一个种群的细胞中。同源物还可来源于除特定的DNA序列来自的物种之外的物种，或可以是人工设计和合成的。与特定的DNA序列相关的和通过密码子简并获得的DNA序列也是本发明的部分。同源物也可包括全长序列的生物活性片段。
尤其感兴趣的是通过合成手段分离的同源序列。通过该方法可以在计算机芯片上设计要被引入制甲羟酶素生产宿主细胞中的基因的所有可能的变体。这带来了下述机会：适应基因的密码子使用以便于它们在制甲羟酶素生产宿主细胞中被最优表达；去除和引入限制性酶和/或位点特异重组酶的相关序列和制造基因的不同组合。
另外，可以使用下述生物合成基因簇，其不是同源的，但是遵循用于抑制素合成的相同的生物合成构建原则。
本发明的核酸构建体，例如表达构建体，含有至少一个感兴趣的基因，但是通常含有若干个感兴趣的基因；每个基因与一条或多条控制序列可操作地连接，所述控制序列指导编码的多肽在制甲羟酶素生产宿主细胞中的表达。核酸构建体可以在一条DNA片段上或在多条独立的片段上。这些核酸构建体也可以被整合在一个染色体基因座上或若干个染色体基因座上。为了获得可能的最高生产力，所有感兴趣的基因的平衡表达是关键性的。因此，一系列启动子可以是有用的。丝状真菌细胞如Penicillium chrysogenum应用的优选的启动子是本领域已知的，并可以是例如来自Penicillium citrinum的基因的启动子；葡萄糖-6-磷酸脱氢酶gpdA启动子；Penicillium chrysogenum pcbAB、pcbC和penDE启动子；蛋白酶启动子如pepA，pepB，pepC；葡萄糖淀粉酶glaA启动子；淀粉酶amyA，amyB启动子；过氧化氢酶catR或catA启动子；葡萄糖氧化酶goxC启动子；β-半乳糖苷酶lacA启动子；α-葡萄糖苷酶aglA启动子；翻译延长因子tefA启动子；木聚糖酶启动子如xlnA，xlnB，xlnC，xlnD；纤维素酶启动子如eglA，eglB，cbhA；转录调节子的启动子如areA，creA，xlnR，pacC，prtT，alcR或任何其它。所述启动子可尤其由技术人员在NCBI网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/)上容易地发现。在来自除丝状真菌物种外其它的制甲羟酶素生产宿主细胞的情况下，对启动子的选择由对宿主的选择决定。
优选地，启动子来自高度表达(在本文中定义为具有至少0.5％(w/w)的总细胞mRNA的mRNA浓度)的基因。启动子可以来自中度表达(在本文中定义为具有至少0.01％直到0.5％(w/w)的总细胞mRNA的mRNA浓度)的基因。在另一个优选的实施方案中，启动子可以来自低表达(在本文中定义为低于0.01％(w/w)总细胞mRNA的mRNA浓度)的基因。更优选地，使用微阵列数据来选择基因，并从而选择具有某转录水平和调价的这些基因的启动子。藉此，可以将基因表达盒改造为最适合其要发挥功能的条件。这些启动子片段可以来自许多来源，即不同的物种、PCR扩增的、合成的等等。
控制序列还可以包括合适的转录终止序列，这是被真核细胞识别为终止转录的序列。终止子序列与编码多肽的核酸序列的3’末端可操作地连接。在细胞中有功能的任何终止子都可用于本发明中。丝状真菌细胞优选的终止子得自编码以下的基因：Aspergillus oryzae TAKA淀粉酶；Penicillium chrysogenum pcbAB，pcbC和penDE终止子；Aspergillu sniger葡萄糖淀粉酶；Aspergillus nidulans邻氨基苯甲酸合酶；Aspergillus niger α-葡萄糖苷酶；Aspergillus nidulans trpC基因；Aspergillus nidulans amdS；Aspergillus nidulans gpdA；Fusarium oxysporum胰蛋白酶样蛋白酶。进一步更优选的终止子是来自天然生产者Penicillium citrinum的基因的终止子。在来自除丝状真菌物种以外其它的制甲羟酶素生产宿主细胞的情况下。对终止序列的选择将由对宿主的选择决定。
控制序列也可以是合适的前导序列，这是对细胞翻译重要的mRNA的非翻译区。前导序列与编码多肽的核酸序列的5’端可操作地连接。在细胞中有功能的任何前导序列可以用于本发明中。丝状真菌细胞优选的前导序列得自编码Aspergillus oryzae TAKA淀粉酶和Aspergillus nidulans磷酸丙糖异构酶和Aspergillus niger glaA的基因。
控制序列也可以是多聚腺苷酸化序列，其与核酸3’端可操作地连接，并且在转录后被丝状真菌细胞识别为对经转录的mRNA添加多聚腺苷残基的信号。在细胞中有功能的任何多聚腺苷酸化序列可以被用于本发明中。对丝状真菌细胞来说优选的多聚腺苷酸化序列得自编码下述的基因：Aspergillus oryzae TAKA淀粉酶；Aspergillus niger葡萄糖淀粉酶；Aspergillus nidulans邻氨基苯甲酸合酶；Fusarium oxysporum胰蛋白酶样蛋白酶和Aspergillus niger α-葡萄糖苷酶。
对于待分泌的多肽而言，控制序列也可包括编码与多肽氨基端连接的氨基酸序列的信号肽-编码区，其能够指导编码的多肽进入细胞的分泌途径。核酸编码序列的5’端可固有地含有与编码区区段按照翻译读码框天然连接的信号肽-编码区，所述编码区区段编码被分泌的蛋白质。或者，编码序列的5’端可含有信号肽-编码区，其对于编码序列来说是外源的。当编码序列不正常地含有信号肽-编码区时，外源信号肽-编码区可能是必需的。或者，外源信号肽-编码区可以简单地替换天然的信号肽-编码区，从而获得多肽的增强的分泌。
在真核制甲羟酶素生产宿主细胞的情况下，控制序列可包括细胞器靶向信号。这类序列由与多肽连接的氨基酸序列编码，其能够针对细胞中最终的目的地(即区室或细胞器)。核酸序列编码序列的5’或3’端可固有地含有与编码区区段按照翻译读码框天然连接的这些靶向信号编码区，所述编码区区段编码多肽。多种序列是本领域技术人员公知的，并可被用于将蛋白质靶向区室如线粒体、过氧化物酶体、内质网、高尔基体、液泡、细胞核等等。
核酸构建体可以是表达载体。表达载体可以是任何载体(例如质粒或病毒)，其可便利地进行重组DNA步骤并可导致编码多肽的核酸序列的表达。载体的选择应典型地取决于载体与要引入载体的细胞的相容性。载体可以是线性的或闭合环状质粒。载体可以是自主复制的载体，即作为染色体外实体存在的载体，其复制不依赖于染色体的复制，例如质粒、染色体外元件、小染色体或人工染色体。用于丝状真菌的自主维持的克隆载体可包括AMA1-序列(见例如Aleksenko and Clutterbuck(1997)，Fungal Genet.Biol.21：373-397)。或者，载体可以是下述载体，当其被引入细胞时整合进基因组中，并与其被整合在其中的染色体一起复制。整合型克隆载体可以随机或在预先确定的靶基因座上整合进宿主细胞的染色体中。在本发明的一个优选的实施方案中，整合型克隆载体包括与宿主细胞基因组中预先确定的靶基因座中的DNA序列同源的DNA片段，用于将克隆载体的整合靶向该预先确定的基因座上。为了促进定向整合，克隆载体优选地在转化宿主细胞前被线性化。优选地进行线性化使得克隆载体的至少一端(但是优选任一端)侧翼是与靶基因座同源的序列。靶基因座侧翼的同源序列的长度优选地至少0.1kb，进一步优选地至少0.2kb，还更优选地至少0.5kb，进一步更优选地至少1kb，最优选地至少2kb。
优选地通过增强的宿主细胞的同源重组能力来提高核酸构建体通过同源重组定向整合进宿主细胞基因组中(即预先确定的靶基因座中的整合)的效率。细胞的这类表型优选地涉及如WO 05/95624中所述的缺陷的hdfA或hdfB基因，及其任何改进。WO 05/95624公开了获得包含提高的定向整合效率的丝状真菌细胞的优选方法。
载体系统可以是单个载体或质粒，或者可以是两个或多个载体或质粒，其共同含有要被引入宿主细胞基因组中的总DNA。然而在本发明中，构建体优选被整合进宿主菌株的基因组中。因为这是随机的过程，所以这甚至能够导致基因组基因座中的整合，其高度适合于驱动基因表达，产生大量的酶并由此产生高的生产力。
可以通过原生质体形成、原生质体转化和细胞壁再生来转化真菌细胞。用于转化真菌宿主细胞的合适步骤被描述于EP 238,023和Yelton et al.(1984，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：1470-1474)中。使用Agrobacterium tumefaciens转化丝状真菌宿主细胞的合适步骤由de Groot M.J.et al.(1998，Nat Biotechnol 16：839-842；Erratum in：1998，Nat Biotechnol 16：1074)描述。也可使用针对Neurospora crassa描述的其它方法，如电穿孔。
使用共转化来转化真菌细胞，即与感兴趣的基因一起还转化了可选择的标记物基因。其可以与感兴趣的基因物理连接(即在质粒上)，或位于独立的片段上。转染后，针对该选择标记物基因的存在筛选转化体，并随后分析感兴趣的基因的存在。可选择的标记物是提供针对杀生物剂或病毒的抗性、针对重金属的抗性、针对营养缺陷型的原养型等等的产物。有用的可选择标记物包括amdS(乙酰胺酶)、argB(鸟氨酸氨甲酰基转移酶)、bar(膦丝菌素酰基转移酶)、hygB(潮霉素磷酸转移酶)、niaD(硝酸盐还原酶)、pyrG(乳清苷-5’-磷酸盐脱羧酶)、sC或sutB(硫酸盐腺嘌呤基转移酶)、trpC(邻氨基苯甲酸合酶)、ble(腐草霉素抗性蛋白质)或其等同物。
同样的原则可被用于得到原核物种的合适的制甲羟酶素生产宿主细胞，及其工业衍生物，例如但不限于：Streptomyces clavuligerus、Streptomyces avermitilis、Streptomyces peucetius、Streptomyces coelicolor、Streptomyces lividans、Streptomyces carbophilus、Amycolatopis orientalis、Corynebacterium glutamicum和Escherichia coli。这些物种的工业衍生物经历了若干轮的经典诱变，随后是针对改进的工业生产特性的筛选和选择，这使得它们特别适用于本发明。通过去除(即缺失)不想要的产物的部分或全部途径，该菌株保留其期望的工业发酵特性和朝向代谢产物(包括酶)的高通量。此处，所有斯达汀生物合成基因需要通过本领域工艺水平(state-of-the-art)方法被修饰，从而在原核细胞中被功能性地表达。本领域技术人员应当明白这涉及可与上文针对真核生物所列出的比较的多个步骤，包括但不限于：
·获得cDNA或合成的DNA(以排除真核内含子)
·任选地施用密码子最优化
·在原核生物中装配启动子
·在原核生物中装配终止子
·通过载体功能引入原核生物中。
在本发明的第二实施方案中，提供了一种宿主微生物，其包含将制甲羟酶素转化为普伐他汀必须的基因。优选地使用下述真菌宿主，所述真菌宿主包含制甲羟酶素生物合成必需的基因(一种或多种以下基因：编码聚酮化合物合酶的mlcA；编码聚酮化合物合酶的mlcB；编码P450单加氧酶的mlcC；编码HMG-CoA还原酶的mlcD；编码流出泵的mlcE；编码氧化还原酶的mlcF；编码脱氢酶的mlcG；编码转酯酶的mlcH，转录调节子lovE，包括所有同源的功能活性基因)，并且还整合了编码P450制甲羟酶素羟化酶的基因。优选地，所述P450制甲羟酶素羟化酶基因来自Amycolatopsis orientalis。更优选地，P450制甲羟酶素羟化酶基因与来自WO 2008/071673的SEQ ID NO 3或SEQ ID NO 680％同源。进一步更优选地，P450制甲羟酶素羟化酶基因与来自WO 2008/071673的SEQ ID NO 3或SEQ ID NO 5相同。本发明的范围不限于这些特定的例子。
在第三个实施方案中公开了下述宿主微生物，所述微生物提供斯达汀红曲米素J的生产必需的基因。使用不是Aspergillus terreus的真菌宿主。最优选地，真菌宿主是Penicillium chrysogenum。真菌宿主包括红曲米素J生物合成所需的基因(Abe et al.，2002，MoI Genet Genomics 267：636-646；Abe et al.，2002，MoI Genet Genomics 268：130-137中描述的所有mlc基因，而lov基因描述于Kennedy et al.，1999，Science 284，1368-1372中)：编码聚酮合酶的lovB；编码P450单氧合酶的mlcC；编码HMG-CoA还原酶的mlcD；编码流出泵的mlcE；编码氧化还原酶的mlcF；编码脱氢酶的mlcG；编码转酯酶的mlcH，转录调节子lovE。可以通过使用如本发明所述的具有经改进的动力学特性的同源蛋白，来进一步改进使用此类微生物宿主进行的红曲米素J生产。
在第四个实施方案中公开了提供洛伐他汀生产所需基因的微生物。所述微生物(优选地是真菌，但不是Aspergillus terreus，进一步更优选地是丝状真菌，最优选地是Penicillium chrysogenum)可包含导致洛伐他汀生产的基因的下述组中的一种或多种：(所有mlc基因描述于Abe et al.，2002，MoI Genet Genomics 267：636-646；Abe et al.，2002，MoI Genet Genomics 268：130-137中，而lov基因描述于Kennedy et al.，1999，Science 284，1368-1372中)：编码聚酮合酶的mlcB；编码聚酮合酶的lovB；编码P450单氧合酶的mlcC；编码HMG-CoA还原酶的mlcD；编码流出泵的mlcE；编码氧化还原酶的mlcF；编码脱氢酶的mlcG；编码转酯酶的mlcH，转录调节子lovE。本发明不限于提到的基因，其还包括同源蛋白质。
在本发明的第五个实施方案中，公开了生产红曲米素J的微生物，所述微生物还可以被用于生产辛伐他汀。在生产红曲米素J的微生物的生长期间，向培养物添加化合物2，2-二甲基丁酸或2，2-丁酸前体如2，2-二甲基丁酸酯，最优选地添加2，2-二甲基丁酸硫酯。结果，辛伐他汀得以生产。为了形成2，2-二甲基丁酸的硫酯化合物，优选地使用硫醇化合物甲基巯基丙酸、乙基巯基丙酸或N-乙酰基半胱胺。然而，本发明不限于使用所公开的硫酯。其它硫酯也是本发明的合适化合物。或者，可以通过下述方式修饰生产生物，所述方式使得生产生物从供应的原材料生产2，2-二甲基丁酸侧链自身。
在本发明的第二方面中，提供了在本发明第一方面中所述真菌菌株中生产斯达汀的方法。
在第一个实施方案中，所述斯达汀是普伐他汀，并且本发明的方法优选地包括下述步骤：
(a)向宿主细胞提供一种或多种包含感兴趣的基因的多核苷酸，所述感兴趣的基因编码制甲羟酶素生物合成的最低需要；
(b)用下述多核苷酸转化所述宿主细胞，所述多核苷酸包含编码制甲羟酶素羟化酶的感兴趣的基因和/或包含影响所述感兴趣的基因表达的DNA序列；
(c)选择经转化的细胞的克隆；
(d)培养所述经选择的细胞；
(e)任选地对所述被培养的细胞补充营养来源；和
(f)任选地从所述培养物中分离普伐他汀。
在第二个实施方案中，可以通过使用具有改进的动力学特性的同源蛋白质来改进制甲羟酶素羟化酶表达宿主细胞中普伐他汀的生产。这类“同源物”或“同源序列”被定义为编码下述多肽的DNA序列，所述多肽显示由分离自供体物种的原始DNA序列编码的多肽的至少一种活性，并具有下述氨基酸序列，所述氨基酸序列与特定的DNA序列编码的蛋白质的氨基酸序列具有一定程度的同一性。具有对制甲羟酶素羟化酶合成基因“基本同源”的氨基酸序列的多肽被定义为具有下述氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列与特定的氨基酸序列具有至少25％、更优选地至少30％、更优选地至少40％、更优选地至少50％、进一步更优选地至少60％、进一步更优选地至少70％、进一步更优选地至少80％、进一步更优选地至少90％、进一步更优选地至少98％和最优选地至少99％的同一性程度，该基本同源的肽展示朝向普伐他汀合成的活性。使用该途径获得了多种优点，例如克服了反馈抑制、促进了分泌和减少了副产物形成。同源序列可包括下述多态性，所述多态性由于天然的等位基因变异或菌株内(intra-strain)变异而存在于来自不同种群或一个种群的细胞中。同源物还可来源于除特定的DNA序列来自的物种之外的物种，或可以是人工设计和合成的。与特定的DNA序列相关的和通过密码子简并获得的DNA序列也是本发明的部分。尤其重要的是通过合成手段分离的同源序列。通过该方法可以在计算机芯片上设计编码合适的p450酶的基因的所有可能的变体。这打开了下述机会：适应基因的密码子使用以便于它们在制甲羟酶素生产宿主细胞和/或制甲羟酶素羟化酶表达宿主细胞中被最优表达；去除和引入限制性酶和/或位点特异重组酶的相关序列；制造基因的不同组合等等。或者，可以施用体外进化途径如易错PCR(error prone PCR)、家族改组(family shuffling)和/或定向进化作为获得具有改进的动力学特性的同源序列的方法。同源物也可包括全长序列的生物活性片段。另外，也可使用不是同源的，但是确实能催化从制甲羟酶素或任何制甲羟酶素前体形成普伐他汀的基因。
在第三个实施方案中，可以如下改进制甲羟酶素到普伐他汀转化的效率：分离p450酶需要的特定的氧化还原再生系统并将其引入表达制甲羟酶素羟化酶的宿主细胞中。在宿主细胞中引入这类系统的方法与下述方法相同，所述方法被描述用于引入上文所列的制甲羟酶素羟化酶。这样的氧化还原再生系统可以得自与下述物种相同的物种，编码制甲羟酶素羟化酶(即p450)的多核苷酸来自所述物种或在其中异源表达；所述物种的例子是Penicillium物种(即Penicillium chrysogenum、Penicillium citrinum)、Aspergillus物种(即Aspergillus niger、Aspergillus nidulans、Aspergillus terreus)、Mucor物种(即Mucor hiemalis)、Monascus物种(即Monascus ruber、Monascus paxii)、Streptomyces物种(即Streptomyces carbophilus、Streptomyces flavidovirens、Streptomyces coelicolor、Streptomyces lividans、Streptomyces exfoliates、Streptomyces avermitilis、Streptomyces clavuligerus)、Amycolatopsis物种(即Amycolatopsis orientalis NRRL 18098、Amycolatopsis orientalis ATCC 19795)、Bacillus物种(即Bacillus subtilus、Bacillus amyloliquefaciens、Bacillus licheniformis)、Corynebacterium物种(即Corynebacterium glutamicum)或Escherichia物种(即Escherichia coli)。也可以使用备选的系统。备选系统的例子包括，但不限于将本发明的制甲羟酶素羟化酶整合进IV类p450系统中从而将其与氧化还原配偶体(见例如Roberts et al.，2002，J Bacteriol 184：3898-3908和Nodate et al.，2005，Appl Microbiol Biotechnol Sep 30；：1-8)融合，或通过产生NAD(P)H的非-p450连接酶如亚磷酸盐脱氢酶(Johannes et al.，2005，Appl Environ Microbiol.71：5728-5734)或通过非酶手段(见例如Hollmann et al.，2006，Trends Biotechnol 24：163-171)。由此获得的宿主细胞可被用于生产普伐他汀。
在第四个实施方案中，如下进行普伐他汀的一步发酵：将制甲羟酶素生产宿主细胞与制甲羟酶素羟化酶表达宿主细胞混合，随后将两种宿主细胞作为混合培养物培养，应理解由制甲羟酶素生产宿主细胞生产和分泌的制甲羟酶素应被制甲羟酶素表达宿主细胞输入并转化为普伐他汀。
在本发明的第五个实施方案中，改进斯达汀生产力的相同原则可应用于生产红曲米素J和/或洛伐他汀的Aspergillus terreus菌株：通过添加异源转录活化子(在该情况下为MlcR)或任何同源基因或蛋白质的交换，提高生物合成基因的转录。
本发明的第三方面中公开了第一方面的斯达汀的用途。第一方面的微生物理想地适用于生产斯达汀如制甲羟酶素、普伐他汀、洛伐他汀、辛伐他汀和无锡他汀。本发明的范围不限于这些提到的例子。
实施例
一般方法
如其它地方所述，进行标准的DNA步骤(Sambrook，et al.，1989，Molecular cloning：a laboratory manual，2nd Ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York)。如果应用了特定的DNA方法，则将其列出。使用保真酶如Phusion聚合酶(Finnzyme)或Herculase聚合酶(Stratagene)来扩增DNA。限制性酶来自Invitrogen或New England Biolabs。使用的所有Penicillium chrysogenum菌株描述于专利申请WO 2007/147827中。以下实施例中称作“β-内酰胺负型”菌株的菌株构建描述于WO 2007/147827的比较实施例3中。
真菌生长在矿物培养基中进行，所述矿物培养基含有(g/L)：葡萄糖(5)；乳糖(35)；尿素(4.5)；(NH4)2SO4(1.1)；Na2SO4(2.9)；KH2PO4(5.2)；K2HPO4(4.8)和10mL/L微量元素溶液，所述微量元素溶液含有(以g/l为单位)：柠檬酸(150)；FeSO4.7H2O(15)；MgSO4.7H2O(150)；H3BO3(0.0075)；CuSO4.5H2O(0.24)；CoSO4.7H2O(0.375)；ZnSO4.7H2O(5)；MnSO4.H2O(2.28)；CaCl2.2H2O(0.99)；灭菌前pH为6.5。
比较实施例1
从Penicillium citrinum NRRL8082分离制甲羟酶素基因簇
从Penicillium citrinum NRRL8082分离染色体DNA。因为整个基因簇由于其大小而难以通过PCR扩增，所以将其分为三个片段：18kb、14kb和6kb。14和6kb的片段被容易地PCR扩增，并根据供应商的说明使用Gateway(Invitrogen)用所谓的LR gateway反应克隆进输入载体pDONR221和pDONRP2-P3中。在两步步骤中克隆18kb片段。首先扩增10kb和8kb的片段。两个片段被独立地克隆进pCR2.1 TOPO T/A(Invitrogen)中并随后通过限制性酶克隆和连接融合在一起，如WO 2007/147827中所述。最后，使用Gateway技术将片段转移至pDONR41Zeo载体。通过测序验证被扩增的片段。使用所谓的多位点Gateway反应(见Invitrogen手册)，含有制甲羟酶素生物合成基因簇的所有基因的这三个基因片段可以被重组进跨越整个区域的一个片段中。
表1：用于扩增制甲羟酶素生物合成基因簇的寡核苷酸
实施例2
用来自Penicillium citrinum的三个制甲羟酶素基因簇片段转化Penicillium
chrysogenum
将三个制甲羟酶素基因簇片段共转化进带有编码下述蛋白质的ble表达盒的Penicillium chrysogenum β-内酰胺负型菌株(如WO2007/147827中实施例3中所述)，所述蛋白质介导腐草霉素抗性。该表达盒可以作为1.4kb SalI片段从pAMPF7中分离(Fierro et al.，1996，Curr.Genet.29：482-489)。在矿物培养基琼脂平板上进行转化体的选择，所述平板含有50μg/ml腐草霉素和1M蔗糖。将在这些原生质体再生平板上出现的腐草霉素抗性菌落在含/不含蔗糖的新鲜腐草霉素琼脂平板(100μg/mL)上再划线，并培养直至孢子形成。通过菌落PCR针对一个或多个制甲羟酶素基因片段的存在筛选腐草霉素抗性转化体。为此，将一小块菌落材料悬浮于50μl TE缓冲液(Sambrook et al.，1989)中并在95℃孵育10分钟。为了弃去细胞碎片，将混合物在3000rpm离心5分钟。上清液(5μl)被用作PCR反应的模板，该反应使用来自HT Biotechnology Ltd.的SUPER TAQ。在来自Invitrogen的E-gel96体系上分析PCR反应。
表2：菌落PCR中用于测定制甲羟酶素生物合成基因簇存在的寡核苷酸
| 靶DNA | 正向引物 | 反向引物 |
| 18kb片段 | SEQ ID NO 11 | SEQ ID NO 12 |
| 14kb片段 | SEQ ID NO 13 | SEQ ID NO 14 |
| 6kb片段 | SEQ ID NO 15 | SEQ ID NO 16 |
| niaA | SEQ ID NO 17 | SEQ ID NO 18 |
首先检验18kb片段的存在。在480个菌落中检验了112个具有稳定整合的18kb片段(～23％)。随后验证其它两个片段(14和6kb)的存在。45个18kb阳性的转化体也具有制甲羟酶素基因簇的其它两部分，从而具有推定的制甲羟酶素生产菌株的资格。
Penicillium chrysogenum转化体的摇瓶分析。
在如“一般方法”中所述的液体矿物培养基，针对(经水解的)制甲羟酶素(ML236B)和脱酰基化的制甲羟酶素ML-236A(6-(2-(1，2，6，7，8，8a-六氢-8-羟基-2-甲基-1-萘基)乙基)四氢-4-羟基-2H-吡喃-2-酮)的存在，评价具有完整制甲羟酶素基因簇的Penicillium chrysogenum平台菌株转化体。在25℃下于25ml中培养168个小时后，用HPLC分析上清液，使用以下的设备和条件：
-柱：Waters XTerra RP18
-柱温度：室温
-流速：1ml/分钟
-注射体积：10μl
-发射箱温度：室温
-设备：Waters Alliance 2695
-检测器：Waters 996光二极管阵列
-波长：238nm
-洗脱液：A：milliQ水中33％CH3CN、0.025％CF3CO2H；
B：milliQ水中80％CH3CN；
C：milliQ水
使用两种不同的梯度：
野生型Penicillium citrinum菌株不能生产任何斯达汀，但是Penicillium chrysogenum转化体生产显著的量(表3)。这些数据证实了使用Penicillium chrysogenum工业生产菌株的衍生物作为宿主细胞用于生产制甲羟酶素的高潜能。
表3.不同菌株生产的斯达汀水平(制甲羟酶素和ML-236A)。
实施例3
用P450羟化酶转化斯达汀簇转化体#1和#2(表3)：普伐他汀的生产
合成生产编码P450制甲羟酶素羟化酶的基因(SEQ ID NO 19)。用限制性酶NocI和EcoRV限制性消化DNA；将得到的1.2kb片段(由于内部EcoRV位点而进行部分消化，但是较短的1kb片段被丢弃)克隆进用NcoI和SmaI消化的真菌表达载体pAN8-1(Punt & van den Hondel，1993，Meth.Enzymology 216：447-457)中。通过限制性分析检验过的、得到的整合构建体pANP450在Aspergillus nidulans gpdA启动子下游含有P450制甲羟酶素羟化酶基因。将经过线性化的pANP450质粒共转化进具有编码下述蛋白质的amdS表达盒的Penicillium chrysogenum制甲羟酶素簇转化体#1和#2中，所述蛋白质使得能够利用乙酰胺作为唯一氮源。通过用NotI消化pHELY-A1(WO 04/106347)并分离3.1kb PgpdA-AnamdS表达盒，获得amdS表达盒。在矿物培养基琼脂平板上进行转化体的选择，所述平板含有0.1％乙酰胺和1M蔗糖。将在这些原生质体再生平板上出现的菌落在不含蔗糖的新鲜乙酰胺琼脂平板上再划线，并培养直至孢子形成。使用寡核苷酸SEQ ID NO 20和21，通过PCR验证amdS+菌株中P450表达盒的整合。根据实施例2中公开的方法，进行带有P450表达盒的转化体的摇瓶实验。在含有P450制甲羟酶素羟化酶的Penicillium chrysogenum菌株的样品中，滞留时间为4.0分钟的一个新的峰在HPLC方法2(见实施例2)期间被洗脱，其可以被指定为普伐他汀。通过分析方法如NMR和LC-MS/MS.进一步验证了普伐他汀的形成。结果见表4。
表4
实施例4
将来自Penicillium citrinum的缺乏转录调节子mlcR的制甲羟酶素簇基因转
化进Penicillium chrysogenum中
用缺乏调节子mlcR的制甲羟酶素生物合成基因转化Penicillium chrysogenum β-内酰胺负型菌株。这通过用BsaAI消化质粒pDONRP2-P3-6kb右侧片段制甲羟酶素簇(见实施例1)来实现。藉此，切割带有mlcR基因的～2kb片段并通过琼脂糖凝胶电泳去除。在与带有18kb片段和14kb片段的其它两个制甲羟酶素簇质粒(见实施例1)的共转化中，使用含有基因mlcH的剩余6.6kb质粒片段。作为选择标记物，共转化ble表达盒。与实施例2中所述实验精确类似地进行β-内酰胺负型Penicillium chrysogenum菌株的转化。如实施例1和2中所述分析阳性转化体的分析和摇瓶实验的进行(整合了ble表达盒以及所有三个制甲羟酶素基因簇片段的Penicillium chrysogenum菌株)。摇瓶实验的结果揭示了转录调节子mlcR缺失时菌株效价的显著降低。一些转化体显示非常低的斯达汀效价，而其它不再给予任何可检出的斯达汀生产。见表5。
表5
| 菌株 | 制甲羟酶素(mg/L) | ML-236A(mg/L) |
| 制甲羟酶素簇转化体#1 | 9 | 467 |
| 制甲羟酶素簇转化体#2 | 7 | 420 |
| 转化体-mlcR#1 | 5 | 31 |
| 转化体-mlcR#2 | 0 | 0 |
| 转化体-mlcR#3 | 2 | 10 |
| 转化体-mlcR#4 | 12 | 14 |
实施例5
用mlcR和lovE表达盒转化实施例4中获得的mlcR负型菌株
为了进行转化，构建两个新的表达盒：mlcR表达盒和lovE表达盒。两个表达盒均使用相同的启动子/终止子区域，以便于在转录调节子mlcR和lovE之间比较。mlcR(SEQ ID NO 23)和lovE(SEQ ID NO 22)的两个基因合成定制。两条多核苷酸均用NcoI和EcoRV消化。将得到的1.52kb片段(对lovE而言)和1.39kb片段(对mlcR而言)克隆进用NcoI和SmaI消化的载体真菌表达载体pAN8-1(Punt & van den Hondel，1993，Meth.Enzymology 216：447-457)中。通过限制性分析检验过的，分别获得的整合构建体pANlovE和pANmlcR在Aspergillus nidulans gpdA启动子下游含有转录调节子基因。随后通过在氟乙酰胺上进行计数器选择(counter selection)，在第一个步骤中使得实施例4中获得的菌株(其含有除转录调节子mlcR之外的所有制甲羟酶素生物合成基因)不含amdS标记物(Hynes，MJ and Pateman，JA(1970)，Mol.Gen.Genetics，108，107-116)。只有不带有功能性amdS表达盒的菌株能够在氟乙酰胺上生长，否则氟乙酰胺是有毒的。用带有mlcR或lovE表达盒的经线性化的质粒(选择载体主链上合适的特有限制性位点)、P450制甲羟酶素羟化酶表达盒pANP450(在此处也使用含有表达盒的经线性化的质粒)和amdS表达盒的共转化任一，来进一步转化amdS阴性菌株。通过用NotI消化pHELY-A1(描述于WO 2004/106347中)并分离3.1kb PgpdA-AnamdS表达盒获得amdS表达盒。在含有0.1％乙酰胺和1M蔗糖的矿物培养基上进行转化体的选择。将在这些原生质体再生平板上出现的菌落在不含蔗糖的新鲜乙酰胺琼脂平板上再划线，并培养直至孢子形成。通过菌落PCR(P450制甲羟酶素羟化酶基因使用寡核苷酸SEQ ID NO 20和21，lovE基因使用SEQ ID NO 26和27，mlcR基因使用SEQ ID NO 24和25)鉴定阳性菌落(即mlcR或lovE表达盒和/或P450制甲羟酶素羟化酶的整合)。根据实施例2中公开的方法进行摇瓶。在含有lovE或mlcR的Penicillium chrysogenum菌株的样品中，一个新的峰在HPLC方法期间被洗脱，其可以被指定为普伐他汀(使用HPLC方法2时滞留时间为4.0分钟，见实施例2)。结果见表6。结果清楚地展示了：1)mlcR以及lovE能够诱导斯达汀(普伐他汀、制甲羟酶素和ML236A)的形成，和2)lovE是比mlcR更强的斯达汀生产(特别是普伐他汀生产)诱导剂。
表6.所选择的转化体的摇瓶结果
Claims (12)
1.包含下述异源斯达汀(statin)生物合成基因转录活化子的真菌菌株，所述活化子是基因lovE或与lovE至少75％同源的多核苷酸，其特征在于所述真菌菌株不是Aspergillus terreus。
2.包含多肽LovE或与LovE至少50％同源的多肽的真菌菌株，特征是所述真菌菌株不是Aspergillus terreus。
3.根据权利要求1到2中任一项的真菌菌株，其为Penicillium chrysogenum。
4.根据权利要求1到3中任一项的真菌菌株，其生产选自以下列表的斯达汀，所述列表由制甲羟酶素(compactin)、洛伐他汀(lovastatin)、红曲米素J(monacolin J)、普伐他汀(pravastatin)、辛伐他汀(simvastatin)和无锡他汀(wuxistatin)组成。
5.用于生产斯达汀的方法，包括发酵根据权利要求1到4中任一项的真菌菌株。
6.根据权利要求5的方法，其中所述斯达汀是制甲羟酶素，所述方法还包括向所述真菌菌株中引入基因mlcA、mlcB、mlcC、mlcD、mlcE、mlcF、mlcG和mlcH或具有相似活性的同源基因中的一个或多个。
7.根据权利要求5的方法，其中所述斯达汀是普伐他汀，所述方法还包括向所述真菌菌株中引入基因mlcA、mlcB、mlcC、mlcD、mlcE、mlcF、mlcG、mlcH和编码P450制甲羟酶素羟化酶的基因或具有相似活性的同源基因中的一个或多个。
8.根据权利要求5的方法，其中所述斯达汀是红曲米素J，所述方法还包括向所述真菌菌株中引入基因lovB、mlcC、mlcD、mlcE、mlcF、mlcG和mlcH基因或具有相似活性的同源基因中的一个或多个。
9.根据权利要求5的方法，其中所述斯达汀是洛伐他汀，所述方法还包括向所述真菌菌株中引入基因lovB、mlcB、mlcC、mlcD、mlcE、mlcF、mlcG和mlcH或具有相似活性的同源基因中的一个或多个。
10.根据权利要求5的方法，其中所述斯达汀是辛伐他汀，所述方法还包括向所述真菌菌株中引入基因lovB、mlcC、mlcD、mlcE、mlcF、mlcG和mlcH(或具有相似活性的同源基因)中的一个或多个，并且其中，向所述真菌菌株的培养物添加2，2-二甲基丁酸或2，2-二甲基丁酸前体。
11.根据权利要求1到4中任一项的菌株用于制备斯达汀的用途。
12.根据权利要求11的用途，其中通过由异源基因编码的酶生产所述斯达汀。
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