CN101490263B

CN101490263B - 普伐他汀的生产

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Publication number: CN101490263B
Application number: CN2007800231926A
Authority: CN
Inventors: 马可·亚历山大·伯格·范德; 伯纳德·迈瑞克
Original assignee: DSM Sinochem Pharmaceuticals Netherlands BV
Current assignee: Centrient Pharmaceuticals Netherlands BV
Priority date: 2006-06-22
Filing date: 2007-06-19
Publication date: 2012-06-20
Anticipated expiration: 2027-06-19
Also published as: EP2029750A2; CN101490263A; ATE519849T1; WO2007147827A2; JP2009540811A; WO2007147827A3; SI2029750T1; EP2029750B1; US20100048938A1; DK2029750T3

Abstract

本发明提供了一种微生物，其含有制甲羟酶素生物合成基因和将制甲羟酶素转化为普伐他汀的基因。在一个优选的例子中，所述制甲羟酶素生物合成基因为mlcA和/或mlcB和/或mlcC和/或mlcD和/或mlcE和/或mlcF和/或mlcG和/或mlcH和/或mlcR，将制甲羟酶素转化为普伐他汀的所述基因为羟化酶基因。另外，本发明提供了生产感兴趣的化合物如抑制素的方法。在一个优选的例子中，所述抑制素为普伐他汀。

Description

普伐他汀的生产

技术领域

本发明涉及用于生产普伐他汀的一步发酵工艺。

背景技术

胆固醇和其它脂质在体液中由低密度脂蛋白(LDL)和高密度脂蛋白(HDL)转运。执行降低LDL-胆固醇机制的物质可以作为有效的抗高胆固醇药剂，因为LDL水平与冠心病风险正相关。抑制素类的降胆固醇剂是医学上非常重要的药物，因为它们通过抑制HMG-CoA还原酶降低血中的胆固醇浓度。后一酶催化胆固醇生物合成中的限速步骤，即(3S)-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A(HMG-CoA)))到甲羟戊酸的转化。市场上存在若干种类型的干扰素，其中阿托伐他汀(atorvastatin)、制甲羟酶素、洛伐他汀(lovastatin)、辛伐他汀(simvastatin)和普伐他汀。阿托伐他汀通过化学合成制造，而上文提到的其它干扰素或者通过直接发酵或者通过前体发酵生产。这些(前体)发酵通过Penicillium、Aspergillus和Monascus属的真菌进行。

普伐他汀(pravastatin)是通过两个连续的发酵生产的。首先Penicillium citrinum生产制甲羟酶素，其内酯环被氢氧化钠化学水解；随后将其补充至Streptomyces carbophilus培养物中，所述Streptomycescarbophilus将其羟基化为普伐他汀。使用不同的方法对生产这些代谢产物的工业物种和方法进行最优化。藉此将Penicillium citrinum的工业制甲羟酶素生产从原始的40mg/L提高至5g/L。对生物催化的转化而言，Metkinen获得了下述Streptomyces突变体菌株，其对具有80％转化率的3g/L美伐他汀具有抗性(Metkinen News March 2000，Metkinen Oy，Finland；reviewed by Manzoni and Rollini，2002，Appl Microbiol Biotechnol 58：555-564)。尽管这是有活力的商业方法但是其远非最优，因为与例如工业氨基酸或青霉素G效价相比，制甲羟酶素效价相对较低。另外，制甲羟酶素需要被稀释，否则其变得对生物转化中使用的Streptomyces菌株具有毒性(Hosobuchi et al.，1983，J Antibiotics 36：887-891)，有并且20％的制甲羟酶素补料不能被Streptomyces菌株转化。

作为上述问题的解决方案，若干份出版物描述了用于普伐他汀的一步发酵工艺(WO 99/10499、US 6,274,360和EP 1,266,967)。然而，作为本发明的部分，我们将展示出：解决该问题的所有这些建议是无效的并且需要解决额外的问题，即制甲羟酶素到普伐他汀的细胞内转化。WO99/10499描述了装备有编码p450酶的Streptomyces carbophilus基因的重组体Penicillium citrinum菌株。而本文中显示，根据WO 99/10499构建的菌株不生产普伐他汀，只生产制甲羟酶素。US 6,274,360描述了能够从Actinomadura物种中分离的酶体系，所述酶体系可以将制甲羟酶素转化为普伐他汀，还提出在异源物种中使用该酶体系生产普伐他汀。然而，因为没有提供蛋白质或DNA序列，所以不可能验证这类权利要求。另外，这类酶体系可能由不同的多肽组成和/或需要若干种宿主特异的氧化还原再生酶或陪伴分子，这会阻碍该酶体系所有适当成员的纯化和分离。另外，如上文所讨论的，即便是将已知的普伐他汀催化酶的DNA序列(Streptomyces carbophilus p450-sca2基因)转移至制甲羟酶素生产者Penicillium citrinum也不能导致普伐他汀形成。EP 1,266,967描述了Aspergillus terreus和Monascus ruber的突变体菌株。尽管野生型菌株只生产洛伐他汀，但是这些突变体被描述为生产洛伐他汀和/或普伐他汀。作为本发明的部分，我们将证明根据EP 1,266,967的突变体菌株不生产普伐他汀，而仅生产洛伐他汀。

因此，不能获得并且极度需要解决一步发酵法的问题的经济上可行的方式。

发明概述

本发明提供了一种微生物，其含有制甲羟酶素生物合成基因和将制甲羟酶素转化为普伐他汀的基因。更具体地，所述制甲羟酶素生物合成基因是mlcA和/或mlcB和/或mlcC和/或mlcD和/或mlcE和/或mlcF和/或mlcG和/或mlcH和/或mlcR，将制甲羟酶素转化为普伐他汀的所述基因为羟化酶基因。另外，本发明提供了生产感兴趣的化合物的方法，包括步骤：

(a)用包含感兴趣的基因的多核苷酸转化宿主细胞，所述感兴趣的基因编码制甲羟酶素生物合成的最低需要；

(b)用下述多核苷酸转化所述宿主细胞，所述多核苷酸包含编码制甲羟酶素羟化酶的感兴趣的基因和/或包含影响所述感兴趣的基因表达的DNA序列；

(c)选择经转化的细胞的克隆；

(d)培养所述经选择的细胞；

(e)任选地对所述被培养的细胞补充营养来源；和

(f)任选地从所述培养物中分离所述感兴趣的化合物。

发明详述

术语“表达”包括涉及多肽生产的任何步骤，其可包括转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰和分泌。

当核酸构建体含有编码序列在特定宿主生物中表达所需的所有控制序列时，术语“核酸构建体”与术语“表达载体”或“盒”同义。

术语“控制序列”在本文中被定义为包括对多肽的表达来说必需的或有利的所有组件。每种控制序列对编码多肽的核酸而言可以是内源的(native)或外源的(foreign)。这类控制序列可包括，但不限于启动子、前导序列、最适翻译起始序列(如Kozak，1991，J.Bio1.Chem.266：19867-19870中所述)、分泌信号序列、前肽序列、多聚腺苷酸化序列、转录终止子。控制序列至少包括启动子以及转录和翻译终止信号。控制序列可以是含有转录控制序列的适当的启动子序列。启动子可以是在细胞中显示转录调控活性的任何核酸序列，包括突变的、截短的和杂交的启动子，它们可得自编码细胞外或细胞内多肽的基因。启动子对细胞或多肽而言可以是同源的或异源的。启动子可以源自供体物种，或源自任何其它来源。控制真核生物中表达水平的一种备选方式是使用内含子。高等真核生物具有由外显子和内含子组成的基因。术语“外显子”在本文中被定义为包括开放读码框(ORF)的所有组件，其被翻译为蛋白质。术语“内含子”在本文中被定义为包括所有不包括于开放读码框中的组件。术语“开放读码框”在本文中被定义为下述多核苷酸，其从甲硫氨酸的密码子序列ATG开始，随后是连续的一串编码所有可能的氨基酸的密码子，在一定数量后被终止密码子打断。该开放读码框可以被翻译为蛋白质。含有分离自基因组的基因的多核苷酸是该基因的所谓的基因组DNA或gDNA序列，其包括所有外显子和内含子。含有通过反转录反应分离自mRNA的基因的多核苷酸是该基因的所谓的拷贝DNA或cDNA序列，其仅包括外显子，而内含子通过细胞机制被切除。后一类型的DNA尤其适用于在原核宿主中表达感兴趣的真核基因。也可以合成制造两种类型DNA的变体，这使得改变内含子的确切核苷酸序列或改变感兴趣的基因中内含子数量成为可能。这也使得向来自原核起源的感兴趣的基因中添加内含子以简化或改进在真核宿主中的表达成为可能。另外，也可以在上述控制序列如启动子、多聚腺苷酸化位点或转录终止子中引入内含子。内含子的存在、不存在、变异或引入是调节真核细胞中基因表达水平的一种手段。

术语“可操作地连接”在本文中被定义为下述构型，其中控制序列被适当地置于与DNA序列的编码序列相关的位置，使得控制序列能指导多肽的生产。

术语“普伐他汀”在本文中被定义为具有α-或β-构象的制甲羟酶素的6′-羟基变体，或α-和β-构象二者的混合物，并包括闭合的结构(带有内酯环)和开放的结构(具有羟基羧酸部件)二者。

提供普伐他汀的一步发酵工艺的方法是本发明的一个目的。

在本发明的第一方面中，提供了生产普伐他汀的菌株，其具有至少一种下述特征：

·含有制甲羟酶素生物合成必需的所有基因，

·含有制甲羟酶素转化为普伐他汀必需的所有基因(即表达制甲羟酶素羟化酶的宿主细胞)，

·能够在一次发酵中生产普伐他汀。

在本发明的上下文中，“普伐他汀生产细胞”被定义为下述细胞：所述细胞展示至少一种上述特征，优选两种上述特征，最优选所有上述特征。

在一个实施方案中提供了来自生产菌株Penicillium chrysogenum的制甲羟酶素生产宿主细胞。该生物经历了若干轮的经典菌株改进和随后的工艺适应和改进，达成目前的高效价青霉素G发酵工艺。生物的DNA中大量的改变不仅导致针对产物青霉素G的提高的通量和产量(见图1)，而且还导致针对150,000-升发酵管中苛刻条件(即氧限制、剪切力、葡萄糖限制等等)的形态学改变和适应。通过缺失β-内酰胺生物合成机制，获得了下述菌株，所述菌株缺乏β-内酰胺生产能力，但是仍然保持所有下述突变，所述突变导致工业规模上的良好性能，例如剪切力抗性、适合按比例放大、针对代谢产物的高代谢通量、适应确定的培养基、工业顺流加工(down stream processing)和低粘度模式(即形态学、调节和代谢突变)。在本发明的Penicillin chrysogenum菌株中，至少编码异青霉素N合酶的β-内酰胺生物合成基因pcbC被失活。优选地，其它β-内酰胺生物合成基因也被失活，所述基因是编码L-(α-氨基己二酰基)-L-半胱氨酰-D-缬氨酸合成酶的pcbAB和/或编码酰基-辅酶A：异青霉素N酰基转移酶的penDE。更优选地，通过去除基因的部分来失活基因。最优选的是完全去除基因序列。因为这些基因的完全去除产生下述Penicillium chrysogenum菌株，所述菌株缺乏任何β-内酰胺生物合成能力并因此是非常适合于生产所有种类产物的菌株。尽管事实上工业生物可能是非常难以操作的，但是该Penicilliumchrysogenum菌株惊人地易于转化，并能够以比天然生产宿主高得多的效价生产抑制素。

尽管不是本发明所必需的，但是优选地从能够在工业环境中生产的生物获得Penicillium chrysogenum突变体。这类生物典型地可被定义为：具有高生产力和/或基于消耗的碳源的高产物产率和/或基于产生的生物质数量的高产物产率和/或高生产力率和/或高产物效价。这类生物极其适合于转化为制甲羟酶素宿主细胞。对生产青霉素G的Penicillium chrysogenum菌株而言，这类高效价是高于1.5g/L青霉素G，优选地高于2g/L青霉素G，更优选地高于3g/L青霉素G，最优选地高于4g/L青霉素G的效价。前述数值应用于在复合发酵培养基(每升含有：乳糖，40g/L；玉米浸渍固体；20g/L；CaCO₃，10g/L；KH₂PO₄，7g/L；苯乙酸，0.5g/L；pH 6.0)中96小时后的发酵效价。合适的工业菌株是实验部分(一般方法)中提到的菌株。

Penicillium chrysogenum的所有工业菌株系经历了多轮经典的菌株改进，导致三种常见的突变类型：

(i)直接扩增生物合成基因，导致青霉素代谢产物途径的酶活性提高

(ii)修饰初级代谢基因，最后导致多种适应的代谢重排，均引起针对终产物的更高通量。例子：增加的氨基酸构建块合成，减少的苯乙酸的消耗等等。

(iii)细胞结构修饰，导致形态学、膜组成、细胞器组织的改变，从而“有助于”高代谢通量和以工业规模发酵。例子：增加的过氧化物酶体数，其为青霉素合成的“装配线”之一。

与第(ii)和(iii)类相比，在(i)类突变类型中DNA水平有显著不同。尽管后两类主要是碱基对水平上经分离的突变、缺失、重复和/或改变，但是(i)类中的突变是非常不同的60到100kb区的扩增，其导致基因组中若干直接的和反向的重复。这有时候导致显著的遗传不稳定性，得到不稳定和可变的群体。事实上，这表示在给定的青霉素生产菌株中，(ii)和(iii)类的所有突变是固定的，但是(i)类中突变的精确拷贝数可以波动。使用该原则和本领域技术人员已知的技术，可以获得稳定的分离株，其中仅一个拷贝的青霉素生物合成基因仍然存在。取决于初始菌株的拷贝数，可以在一、二、三或若干轮筛选和选择中获得该状况。就该特定的特征而言，然后分离株可与物种的模式株(type strain)NRRL1951及经典菌株改进后其第一代后代直到Wisconsin 54-1255相比，所有菌株均含有一个拷贝的青霉素生物合成基因。主要的差异是来自高生产菌株的一拷贝分离株仍然含有(ii)和(iii)类的所有其它突变，使其与从NRRL1951到Wisconsin 54-1255的菌株相比成为工业高生产菌株。随后，可以使用本领域工艺水平(state-of-the-art)重组技术缺失最后一组青霉素生物合成基因。这些步骤的详细综述在实施例中给出，并概括于以下的步骤中：

(a)从Penicillium菌株分离分离株，其具有单个基因组拷贝的青霉素基因簇

(b)从步骤(a)中获得的分离株中缺失基因pcbC

(c)从步骤(a)或(b)中获得的分离株中任选地缺失基因pcbAB和/或penDE。

基因可以被部分失活。更优选地，基因序列被完全去除。因为这些基因的完全去除产生下述Penicillium chrysogenum菌株，所述菌株缺乏任何β-内酰胺生物合成能力并因此是非常适合于生产所有种类产物的菌株。可以使用的重组技术是本领域技术人员公知的(即单交叉或双同源重组(Single Cross Over or Double Homologous Recombination))。

缺失和置换的一个优选的策略是EP 357，127中描述的基因置换技术。如EP 635,574所述，优选地使用amdS基因作为选择标记物，进行对基因和/或启动子序列的特定缺失。借助于在氟乙酰胺培养基(EP 635,574)上的反选择，得到的菌株是不含选择标记物的，并可用于进一步的基因修饰。或者可以使用，或与其它提到的技术组合使用基于Escherichia coli中粘粒体内重组的技术，如Chaveroche et al.(2000，Nucl Acids Res，28，E97)所述。该技术适用于其它丝状真菌，例如Penicillium chrysogenum。此外，用于去除扩增的基因组片段的相同原则也可用于其它工业生产物种中，其中经典的菌株改进程序已经诱导了基因和基因组重复。另外，此处，(ii)和(iii)类的额外突变是固定的，并确保该菌株能够在工业发酵过程中茁壮生长。

这类Penicillium chrysogenum细胞可以用下述基因装备，所述基因编码制甲羟酶素生物合成必需的所有蛋白质和酶。九个Penicillium citrinum基因被描述为涉及制甲羟酶素生物合成(Abe et al.，2002，Mol GenetGenomics 267：636-646；Abe et al.，2002，Mol Genet Genomics 268：130-137)：mlcA编码聚酮化合物合酶；mlcB编码聚酮化合物合酶；mlcC编码P450单加氧酶；mlcD编码HMG-CoA还原酶；mlcE编码流出泵；mlcF编码氧化还原酶；mlcG编码脱氢酶；mlcH编码转酯酶；mlcR编码转录因子。

为了获得制甲羟酶素生产宿主细胞，用至少一种上述基因，优选地用两种或更多上述基因，更优选地用所有上述基因来转化经分离的Penicillium chrysogenum菌株。

在另一实施方案中，同样的原则可被用于得到其它真核物种的合适的制甲羟酶素生产宿主细胞，及其工业衍生物，例如但不限于：Aspergillusniger、Aspergillus terreus、Penicillium brevicompactum、Penicilliumcitrinum、Aspergillus oryzae、Trichoderma reesei、Chrysosporiumlucknowense、Saccharomyces cerevisiae、Kluyveromyces lactis、Monascusruber、Monascus paxii、Mucor hiemalis、Pichia ciferrii和Pichia pastoris。这些物种的工业衍生物经历若干轮的经典诱变，随后是针对改进的工业生产特性的筛选和选择，这使得它们特别适用于本发明。通过去除(即缺失)不想要的产物的部分或全部途径，该菌株保留其期望的工业发酵特性和朝向代谢产物(包括酶)的高通量。

又在另一实施方案中，可以通过使用具有改进的动力学特性的同源蛋白质来改进制甲羟酶素的生产。这类“同源物”或“同源序列”被定义为编码下述多肽的DNA序列，所述多肽显示由分离自供体物种的原始DNA序列编码的多肽的至少一种活性，并具有下述氨基酸序列，所述氨基酸序列与特定的DNA序列编码的蛋白质的氨基酸序列具有一定程度的同一性。具有对制甲羟酶素生物合成基因“基本同源”的氨基酸序列的多肽被定义为具有下述氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列与特定的氨基酸序列具有至少25％、更优选地至少30％、更优选地至少40％、更优选地至少50％、进一步更优选地至少60％、进一步更优选地至少70％、进一步更优选地至少80％、进一步更优选地至少90％、进一步更优选地至少98％和最优选地至少99％的同一性程度，该基本同源的肽展示朝向制甲羟酶素和/或制甲羟酶素前体合成的活性。使用该途径获得了多种优点，例如克服了反馈抑制、促进了分泌和减少了副产物形成。同源序列可包括下述多态性，所述多态性由于天然的等位基因变异或菌株内(intra-strain)变异而存在于来自不同种群或一个种群的细胞中。同源物还可来源于除特定的DNA序列来自的物种之外的物种，或可以是人工设计和合成的。与特定的DNA序列相关的和通过密码子简并获得的DNA序列也是本发明的部分。同源物也可包括全长序列的生物活性片段。

尤其感兴趣的是通过合成手段分离的同源序列。通过该方法可以在计算机芯片上设计要被引入制甲羟酶素生产宿主细胞中的基因的所有可能的变体。这带来了下述机会：适应基因的密码子使用以便于它们在制甲羟酶素生产宿主细胞中被最优表达；去除和引入限制性酶和/或位点特异重组酶的相关序列；制造基因的不同组合等等。

就本发明的目的而言，两条氨基酸序列之间的同一性程度是指两条序列之间相同的氨基酸的百分比。使用BLAST算法测定同一性程度，所述BLAST在Altschul，et al.，J.Mol.Biol.215：403-410(1990)中描述。用于进行BLAST分析的软件是公众可以通过National Center for BiotechnologyInformation(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)获得的。BLAST算法参数W、T和X确定比对的灵敏度和速度。BLAST程序使用下述作为默认：词长(W)11、BLOSUM62评分矩阵(见Henikoff & Henikoff，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：10915(1989))、比对(B)50、预期(E)10、M＝5、N＝-4并比较两条链。

基本同源的多肽可仅含有特定氨基酸序列的一个或多个氨基酸的保守取代，或非必需氨基酸的取代、插入或缺失。因此，非必需的氨基酸是在这些序列之一中可以被改变而不显著改变生物功能的残基。例如，涉及如何制造表型沉默氨基酸取代的指南在Bowie，J.U.et al.，Science 247：1306-1310(1990)中提供，其中作者指出存在两种研究氨基酸序列对改变的耐受的途径。第一种方法依赖于进化过程，其中突变被自然选择接受或拒绝。第二种途径使用基因工程在被克隆的基因的特定位置上引入氨基酸改变，并选择或筛选以鉴定维持功能性的序列。如作者所述，这些研究解释了蛋白质惊人地耐受氨基酸取代。作者还指出在蛋白质的某位置上何种改变可能是允许的。例如，大部分被埋藏的氨基酸残基需要非极性侧链，而表面侧链通常很少有特征是保守的。其它这类表型沉默取代被描述于Bowie etal和其中所引用的参考文献中。

术语“保守取代”旨在表示下述取代，其中氨基酸残基被替换为具有相似侧链的氨基酸残基。这些家族是本领域已知的，并包括具有碱性侧链的氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸和组氨酸)、具有酸性侧链的氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)、具有不带电的极性侧链的氨基酸(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、具有非极性侧链的氨基酸(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、具有β-支链的氨基酸(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和具有芳香族侧链的氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。

另外，可以使用下述生物合成基因簇，其不是同源的，但是遵循用于抑制素合成的相同的生物合成构建原则。

本发明的核酸构建体，例如表达构建体，含有至少一个感兴趣的基因，但是通常含有若干个感兴趣的基因；每个基因与一条或多条控制序列可操作地连接，所述控制序列指导编码的多肽在制甲羟酶素生产宿主细胞中的表达。核酸构建体可以在一条DNA片段上或在多条独立的片段上。这些核酸构建体也可以被整合在一个染色体基因座上或若干个染色体基因座上。为了获得可能的最高生产力，所有感兴趣的基因的平衡表达是关键性的。因此，一系列启动子可以是有用的。丝状真菌细胞如Penicilliumchrysogenum应用的优选的启动子是本领域已知的，并可以是例如来自Penicillium citrinum的基因的启动子；葡萄糖-6-磷酸脱氢酶gpdA启动子；Penicillium chrysogenum pcbAB、pcbC和penDE启动子；蛋白酶启动子如pepA，pepB，pepC；葡萄糖淀粉酶glaA启动子；淀粉酶amyA，amyB启动子；过氧化氢酶catR或catA启动子；葡萄糖氧化酶goxC启动子；β-半乳糖苷酶lacA启动子；α-葡萄糖苷酶aglA启动子；翻译延长因子tefA启动子；木聚糖酶启动子如xlnA，xlnB，xlnC，xlnD；纤维素酶启动子如eglA，eglB，cbhA；转录调节子的启动子如areA，creA，xlnR，pacC，prtT，alcR或任何其它。所述启动子可尤其由技术人员在NCBI网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/)上容易地发现。在来自除丝状真菌物种外其它的制甲羟酶素生产宿主细胞的情况下，对启动子的选择由对宿主的选择决定。

在一个优选的实施方案中，启动子可以来自高度表达(在本文中定义为具有至少0.5％(w/w)的总细胞mRNA的mRNA浓度)的基因。启动子可以来自中度表达(在本文中定义为具有至少0.01％直到0.5％(w/w)的总细胞mRNA的mRNA浓度)的基因。在另一个优选的实施方案中，启动子可以来自低表达(在本文中定义为低于0.01％(w/w)总细胞mRNA的mRNA浓度)的基因。

还在一个更优选的实施方案中，使用微阵列数据来选择基因，并从而选择具有某转录水平和调价的这些基因的启动子。藉此，可以将基因表达盒改造为最适合其要发挥功能的条件。这些启动子片段可以来自许多来源，即不同的物种、PCR扩增的、合成的等等。

在最优选的实施方案中，为了在所有制甲羟酶素生产宿主细胞中最优生产，将原始的Penicillium citrinum启动子替换为不受途径特异转录调节子控制的由基因mlcR编码的启动子。藉此基因mlcR不必须被包含在制甲羟酶素生产宿主细胞中，并可引入备选的控制机制。

控制序列还可以包括合适的转录终止序列，这是被真核细胞识别为终止转录的序列。终止子序列与编码多肽的核酸序列的3’末端可操作地连接。在细胞中有功能的任何终止子都可用于本发明中。丝状真菌细胞优选的终止子得自编码以下的基因：Aspergillus oryzae TAKA淀粉酶；Penicillium chrysogenum pcbAB，pcbC和penDE终止子；Aspergillusniger葡萄糖淀粉酶；Aspergillus nidulans邻氨基苯甲酸合酶；Aspergillus niger α-葡萄糖苷酶；Aspergillus nidulans trpC基因；Aspergillus nidulans amdS；Aspergillus nidulans gpdA；Fusarium oxysporum胰蛋白酶样蛋白酶。进一步更优选的终止子是来自天然生产者Penicillium citrinum的基因的终止子。在来自除丝状真菌物种以外其它的制甲羟酶素生产宿主细胞的情况下。对终止序列的选择将由对宿主的选择决定。

控制序列也可以是合适的前导序列，这是对细胞翻译重要的mRNA的非翻译区。前导序列与编码多肽的核酸序列的5’端可操作地连接。在细胞中有功能的任何前导序列可以用于本发明中。丝状真菌细胞优选的前导序列得自编码Aspergillus oryzae TAKA淀粉酶和Aspergillus nidulans磷酸丙糖异构酶和Aspergillus niger glaA的基因。

控制序列也可以是多聚腺苷酸化序列，其与核酸3’端可操作地连接，并且在转录后被丝状真菌细胞识别为对经转录的mRNA添加多聚腺苷残基的信号。在细胞中有功能的任何多聚腺苷酸化序列可以被用于本发明中。对丝状真菌细胞来说优选的多聚腺苷酸化序列得自编码下述的基因：Aspergillus oryzae TAKA淀粉酶；Aspergillus niger葡萄糖淀粉酶；Aspergillus nidulans邻氨基苯甲酸合酶；Fusarium oxysporum胰蛋白酶样蛋白酶和Aspergillus niger α-葡萄糖苷酶。

对于待分泌的多肽而言，控制序列也可包括编码与多肽氨基端连接的氨基酸序列的信号肽-编码区，其能够指导编码的多肽进入细胞的分泌途径。核酸编码序列的5’端可固有地含有与编码区区段按照翻译读码框天然连接的信号肽-编码区，所述编码区区段编码被分泌的蛋白质。或者，编码序列的5’端可含有信号肽-编码区，其对于编码序列来说是外源的。当编码序列不正常地含有信号肽-编码区时，外源信号肽-编码区可能是必需的。或者，外源信号肽-编码区可以简单地替换天然的信号肽-编码区，从而获得多肽的增强的分泌。

在真核制甲羟酶素生产宿主细胞的情况下，控制序列可包括细胞器靶向信号。这类序列由与多肽连接的氨基酸序列编码，其能够针对细胞中最终的目的地(即区室或细胞器)。核酸序列编码序列的5’或3’端可固有地含有与编码区区段按照翻译读码框天然连接的这些靶向信号编码区，所述编码区区段编码多肽。多种序列是本领域技术人员公知的，并可被用于将蛋白质靶向区室如线粒体、过氧化物酶体、内质网、高尔基体、液泡、细胞核等等。核酸构建体可以是表达载体。表达载体可以是任何载体(例如质粒或病毒)，其可便利地进行重组DNA步骤并可导致编码多肽的核酸序列的表达。载体的选择应典型地取决于载体与要引入载体的细胞的相容性。载体可以是线性的或闭合环状质粒。载体可以是自主复制的载体，即作为染色体外实体存在的载体，其复制不依赖于染色体的复制，例如质粒、染色体外元件、小染色体或人工染色体。用于丝状真菌的自主维持的克隆载体可包括AMA1-序列(见例如Aleksenko and Clutterbuck(1997)，Fungal Genet.Biol.21：373-397)。或者，载体可以是下述载体，当其被引入细胞时整合进基因组中，并与其被整合在其中的染色体一起复制。整合型克隆载体可以随机或在预先确定的靶基因座上整合进宿主细胞的染色体中。在本发明的一个优选的实施方案中，整合型克隆载体包括与宿主细胞基因组中预先确定的靶基因座中的DNA序列同源的DNA片段，用于将克隆载体的整合靶向该预先确定的基因座上。为了促进定向整合，克隆载体优选地在转化宿主细胞前被线性化。优选地进行线性化使得克隆载体的至少一端(但是优选任一端)侧翼是与靶基因座同源的序列。靶基因座侧翼的同源序列的长度优选地至少0.1kb，进一步优选地至少0.2kb，还更优选地至少0.5kb，进一步更优选地至少1kb，最优选地至少2kb。

优选地通过增强的宿主细胞的同源重组能力来提高核酸构建体通过同源重组定向整合进宿主细胞基因组中(即预先确定的靶基因座中的整合)的效率。细胞的这类表型优选地涉及如WO 05/95624中所述的缺陷的hdfA或hdfB基因。WO 05/95624公开了获得包含提高的定向整合效率的丝状真菌细胞的优选方法。

载体系统可以是单个载体或质粒，或者可以是两个或多个载体或质粒，其共同含有要被引入宿主细胞基因组中的总DNA。然而在本发明中，构建体优选被整合进宿主菌株的基因组中。因为这是随机的过程，所以这甚至能够导致基因组基因座中的整合，其高度适合于驱动基因表达，产生大量的酶并由此产生高的生产力。

可以通过原生质体形成、原生质体转化和细胞壁再生来转化真菌细胞。用于转化真菌宿主细胞的合适步骤被描述于EP 238,023和Yelton et al.(1984，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：1470-1474)中。使用Agrobacteriumtumefaciens转化丝状真菌宿主细胞的合适步骤由de Groot M.J.et al.(1998，Nat Biotechnol 16：839-842；Erratum in：1998，Nat Biotechnol 16：1074)描述。也可使用针对Neurospora crassa描述的其它方法，如电穿孔。

使用共转化来转化真菌细胞，即与感兴趣的基因一起还转化了可选择的标记物基因。其可以与感兴趣的基因物理连接(即在质粒上)，或位于独立的片段上。转染后，针对该选择标记物基因的存在筛选转化体，并随后分析感兴趣的基因的存在。可选择的标记物是提供针对杀生物剂或病毒的抗性、针对重金属的抗性、针对营养缺陷型的原养型等等的产物。有用的可选择标记物包括amdS(乙酰胺酶)、argB(鸟氨酸氨甲酰基转移酶)、bar(膦丝菌素酰基转移酶)、hygB(潮霉素磷酸转移酶)、niaD(硝酸盐还原酶)、pyrG(乳清苷-5’-磷酸盐脱羧酶)、sC或sutB(硫酸盐腺嘌呤基转移酶)、trpC(邻氨基苯甲酸合酶)、ble(腐草霉素抗性蛋白质)或其等价物。

在另一实施方案中，同样的原则可被用于得到原核物种的合适的制甲羟酶素生产宿主细胞，及其工业衍生物，例如但不限于：Streptomycesclavuligerus、Streptomyces avermitilis、Streptomyces peucetius、Streptomyces coelicolor、Streptomyces lividans、Streptomyces carbophilus、Amycolatopis orientalis、Corynebacterium glutamicum和Escherichia coli。这些物种的工业衍生物经历了若干轮的经典诱变，随后是针对改进的工业生产特性的筛选和选择，这使得它们特别适用于本发明。通过去除(即缺失)不想要的产物的部分或全部途径，该菌株保留其期望的工业发酵特性和朝向代谢产物(包括酶)的高通量。此处，选自Penicillium citrinum制甲羟酶素基因(mlcA，mlcB，mlcC，mlcD，mlcE，mlcF，mlcG，mlcH和/或mlcR)列表中的所有基因需要通过本领域工艺水平(state-of-the-art)方法被修饰，从而在原核细胞中被功能性地表达。本领域技术人员应当明白这涉及可与上文针对真核生物所列出的比较的多个步骤，包括但不限于：

·获得cDNA或合成的DNA(以排除真核内含子)

·任选地施用密码子最优化

·在原核生物中装配启动子

·在原核生物中装配终止子

·通过载体功能引入原核生物中。

在本发明的另一实施方案中，提供了一种宿主微生物，其包含将制甲羟酶素转化为普伐他汀必须的基因。实施例3中Penicillium chrysogenum制甲羟酶素生产宿主细胞的青霉素生产亲本菌株惊人地尤其适用于将制甲羟酶素转化为普伐他汀。编码p450酶的Streptomyces carbophilus基因P-450sca-2被Watanabe et al.(1995，Gene 163：81-85)描述为制甲羟酶素转化为普伐他汀的催化剂。迄今为止，该基因仅在Streptomyces carbophilus和Streptomyces lividans中成功表达(Watanabe at al.，1995)。已知p450需要相当特异的辅因子再生体系(综述见Pylypenko and Schlichting，2004，Annu.Rev.Biochem.73：991-1018)，因此为了良好的异源表达，需要共同引入该再生体系(见例如Kubota et al.，2005，Biosci.Biotechnol.Biochem.69：2421-2430)。仅装配有来自Streptomyces carbophilus的结构性P-450sca-2基因的制甲羟酶素生产Penicillium chrysogenum宿主细胞惊人地能够将制甲羟酶素转化为普伐他汀，并因此是普伐他汀一步发酵的第一个例子。也可以通过用铁氧还蛋白装配所述Penicillium chrysogenum宿主细胞来显著提高普伐他汀的生产水平。优选地，所述铁氧还蛋白基因如US20060172383中所述来自Streptomyces helvaticus或来自Streptomyces carbophilus。本发明的范围不限于这些特定的例子。

本发明第二方面中公开了生产感兴趣的化合物的方法，包括步骤：

(c)选择经转化的细胞的克隆；

(d)培养所述经选择的细胞；

(e)任选地对所述被培养的细胞补充营养来源；和

(f)任选地从所述培养物中分离所述感兴趣的化合物。

在一个优选的实施方案中，感兴趣的化合物是普伐他汀。

在另一个实施方案中，可以通过使用具有改进的动力学特性的同源蛋白质来改进制甲羟酶素羟化酶表达宿主细胞中普伐他汀的生产。这类“同源物”或“同源序列”被定义为编码下述多肽的DNA序列，所述多肽显示由分离自供体物种的原始DNA序列编码的多肽的至少一种活性，并具有下述氨基酸序列，所述氨基酸序列与特定的DNA序列编码的蛋白质的氨基酸序列具有一定程度的同一性。具有对制甲羟酶素羟化酶合成基因“基本同源”的氨基酸序列的多肽被定义为具有下述氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列与特定的氨基酸序列具有至少25％、更优选地至少30％、更优选地至少40％、更优选地至少50％、进一步更优选地至少60％、进一步更优选地至少70％、进一步更优选地至少80％、进一步更优选地至少90％、进一步更优选地至少98％和最优选地至少99％的同一性程度，该基本同源的肽展示朝向普伐他汀合成的活性。使用该途径获得了多种优点，例如克服了反馈抑制、促进了分泌和减少了副产物形成。同源序列可包括下述多态性，所述多态性由于天然的等位基因变异或菌株内(intra-strain)变异而存在于来自不同种群或一个种群的细胞中。同源物还可来源于除特定的DNA序列来自的物种之外的物种，或可以是人工设计和合成的。与特定的DNA序列相关的和通过密码子简并获得的DNA序列也是本发明的部分。尤其重要的是通过合成手段分离的同源序列。通过该方法可以在计算机芯片上设计编码合适的p450酶的基因的所有可能的变体。这打开了下述机会：适应基因的密码子使用以便于它们在制甲羟酶素生产宿主细胞和/或制甲羟酶素羟化酶表达宿主细胞中被最优表达；去除和引入限制性酶和/或位点特异重组酶的相关序列；制造基因的不同组合等等。或者，可以施用体外进化途径如易错PCR(error prone PCR)、家族改组(family shuffling)和/或定向进化作为获得具有改进的动力学特性的同源序列的方法。同源物也可包括全长序列的生物活性片段。另外，也可使用不是同源的，但是确实能催化从制甲羟酶素或任何制甲羟酶素前体形成普伐他汀的基因。

在又一实施方案中，可以如下改进制甲羟酶素到普伐他汀转化的效率：分离p450酶需要的特定的氧化还原再生系统并将其引入表达制甲羟酶素羟化酶的宿主细胞中。在宿主细胞中引入这类系统的方法与下述方法相同，所述方法被描述用于引入制甲羟酶素羟化酶并在上文列出。这样的氧化还原再生系统可以得自与下述物种相同的物种，编码制甲羟酶素羟化酶(即p450)的多核苷酸来自所述物种或在其中异源表达；所述物种的例子是Penicillium物种(即Penicillium chrysogenum、Penicilliumcitrinum)、Aspergillus物种(即Aspergillus niger、Aspergillus nidulans、Aspergillus terreus)、Mucor物种(即Mucor hiemalis)、Monascus物种(即Monascus ruber、Monascus paxii)、Streptomyces物种(即Streptomyces carbophilus、Streptomyces flavidovirens、Streptomycescoelicolor、Streptomyces lividans、Streptomyces exfoliates、Streptomycesavermitilis、Streptomyces clavuligerus)、Amycolatopsis物种(即Amycolatopsis orientalis NRRL 18098、Amycolatopsis orientalis ATCC19795)、Bacillus物种(即Bacillus subtilus、Bacillus amyloliquefaciens、Bacillus licheniformis)、Corynebacterium物种(即Corynebacteriumglutamicum)或Escherichia物种(即Escherichia coli)。也可以使用备选的系统。备选系统的例子包括，但不限于将本发明的制甲羟酶素羟化酶整合进IV类p450系统中从而将其与氧化还原配偶体(见例如Roberts et al.，2002，J Bacteriol 184：3898-3908和Nodate et al.，2005，Appl MicrobiolBiotechnol Sep 30；：1-8[Epub ahead of print])融合，或通过产生NAD(P)H的非-p450连接酶如亚磷酸盐脱氢酶(Johannes et al.，2005，Appl EnvironMicrobiol.71：5728-5734)或通过非酶手段(见例如Hollmann et al.，2006，Trends Biotechnol 24：163-171)。由此获得的宿主细胞可被用于生产普伐他汀。

在另一实施方案中，如下进行普伐他汀的一步发酵：将制甲羟酶素生产宿主细胞与制甲羟酶素羟化酶表达宿主细胞混合，随后将两种宿主细胞作为混合培养物培养，应理解由制甲羟酶素生产宿主细胞生产和分泌的制甲羟酶素应被制甲羟酶素表达宿主细胞输入并转化为普伐他汀。

附图说明

图1是本发明的图示。野生型(WT)菌株具有将输入的碳在生长、产物(青霉素G)和维持之间分配的固定的比例。在制甲羟酶素生产宿主细胞中，该平衡朝向产物迁移。在平台菌株中，青霉素G途径被去除，因此碳通量在生产和维持之间再平衡。在新产物菌株中，通过引入新的产物途径恢复工业碳通量平衡。图例：I＝野生型Penicillium chrysogenum菌株；II＝工业Penicillium chrysogenum菌株；III＝Penicillium chrysogenum无β-内酰胺菌株；IV＝生产新产物的Penicillium chrysogenum无β-内酰胺菌株；S＝碳源(即糖)；G＝青霉素G；X＝生物质；M＝维持；P＝制甲羟酶素和/或普伐他汀。

图2显示了用于在Penicillium chrysogenum和Penicillium citrinum中表达Streptomyces carbophilus p-450sca-2酶的p-450sca-2表达载体pANp450a。

图3显示了对具有单拷贝青霉素生物合成基因簇的工业Penicilliumchrysogenum分离株的Southem印迹分析。图例：#＝分离株数量；N＝npe10；W＝Wis54-1255；I＝中间体亲本；N＝niaA基因片段；P＝pcbC基因片段。

图4显示了摇瓶中在含有苯氧乙酸的矿物培养基上生长的多种菌株的相对青霉素V效价。在Y轴上给出了青霉素V的百分比(工业亲本的水平设定在100)。图例：C＝工业亲本；I＝中间体亲本；W＝Wis54-1255；N＝npe10；#＝分离株数量。

图5是对从工业Penicillium chrysogenum菌株的衍生物中去除青霉素基因簇最终拷贝的缺失策略的图示。图例：A＝pcbAB基因；B＝pcbC基因；C＝penDE基因；M＝amdS基因盒；3＝3kb侧翼；5＝5kb侧翼；7＝7kb侧翼长度。划阴影线的区域指出同源侧翼区；对角阴影线指出左侧翼，竖直阴影线指出右侧翼。

图6显示了摇瓶中在含有苯乙酸的矿物培养基上生长的多种菌株的相对青霉素G效价。Y轴上给出青霉素G的百分比，工业亲本的水平设置为100。图例：C＝工业亲本；I＝中间体亲本；W＝Wis54-1255；N＝npe10；#＝分离株数量。

图7是制甲羟酶素基因簇的图示(长度为38231bp)。虚线箭头指出基因及其方向。小实线箭头指出克隆策略中使用的PCR引物的位置。顶部的大小指出通过PCR扩增的片段的长度(通过若干个克隆步骤将10和8kb片段与一个18kb片段组合，细节见实施例)。图例：A＝mlcA基因；B＝mlcB基因；C＝mlcC基因；D＝mlcD基因；E＝mlcE基因；F＝mlcF基因；G＝mlcG基因；H＝mlcH基因；R＝mlcR基因。

图8显示了对制甲羟酶素基因簇中间部分(14.3kb)和右侧部分(6kb)的PCR扩增。

图9是制甲羟酶素簇左侧部分18kb的克隆策略的图示概括。图A：在pCR2.1TOPO T/A中克隆的10kb和8kb片段的PCR扩增。图B：10和8kb片段的融合克隆。NotI-SpeI消化8kb片段，连接进经NotI-XbaI消化的10kb质粒中。PCR扩增中间6kb片段，恢复mlcA开发读码框。图C：最终18kb片段。通过Gateway反应将转移至pDONR41Zeo。图例：CGC＝制甲羟酶素基因簇；N＝NotI；A＝Acc65I；X＝XbaI；S＝SpeI。

图10展示了发酵液上清液的HPLC分析。图A：缺乏所有青霉素生物合成基因簇的Penicillium chrysogenum菌株。图B：整合了制甲羟酶素基因簇的Penicillium chrysogenum转化体之一。在2.6分钟可以看到对应于ML-236-A的峰。图例：X-轴＝分钟；Y-轴＝指出相对峰强度的任意单位。

图11显示了通过HPLC检测的普伐他汀形成。图A是来自下述Penicillium chrysogenum菌株的发酵液，其装配有制甲羟酶素生物合成基因和来自Streptomyces carbophilus的P-450sca-2基因。图B如图A，但是用纯普伐他汀使其有尖峰(spiked)，指出对应于该化合物的峰。在9.7分钟可以看到对应于普伐他汀的峰。其它主峰来自ML-236A(8.7分钟)和制甲羟酶素(11.5分钟)。

图例：X-轴＝分钟；Y-轴＝指出相对峰强度的任意单位

图12显示通过LC/MS/MS检测的普伐他汀形成。图A是通过LC分析的来自下述Penicillium chrysogenum菌株的发酵液，其装配有制甲羟酶素生物合成基因和来自Streptomyces carbophilus的P-450sca-2基因。在8.7分钟可以看到对应于普伐他汀的峰。图例：X-轴＝分钟；Y-轴＝指出相对峰强度的任意单位。图B是图A样品的MS/MS分析。峰图式对应于具有正确质量(423)和裂解谱(fragmentation pattern)(321、303和198)的普伐他汀。图例：X-轴＝分钟；Y-轴＝指出相对峰强度的任意单位。

实施例

一般方法

如其它地方所述，进行标准的DNA步骤(Sambrook，et al.，1989，Molecular cloning：a laboratory manual，2^nd Ed.，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，New York)。如果应用了特定的DNA方法，则将其列出。使用保真酶Herculase聚合酶(Stratagene)来扩增DNA。限制性酶来自Invitrogen或New England Biolabs。

比较实施例1

通过EP 1,266,967中描述的菌株生产抑制素

Manzoni et al.在三份不同的出版物(1998，Biotechnol Techn 12：529-532；1999，Biotechnol Lett 21：253-257；EP 1,266,967)中描述了对生产抑制素的多种菌株的分离。尽管不能获得前两份出版物的菌株，但是能够获得EP1,266,967中描述的菌株。Monascus ruber GN/33和Aspergillus terreusGN/2218得自German National Resource Centre for Biological Material，其收藏号分别为DSM13554和DSM13596。使用Penicillium citrinum NRRL8082和Aspergillus terreus ATCC20542作为对照菌株。在马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)斜面上于25℃下对菌株的孢子形成诱导2-7天。孢子被收集在0.5％Tween 80中并用于接种如EP 1,266,967中所述的预培养基(葡萄糖(25g/L)；酪蛋白水解产物(10g/L)；酵母提取物(15g/L)；NaNO₃(2g/L)；MgSO₄.7H₂O(0.5g/L)；NaCl(1g/L)；用1M NaOH调节至pH 6.2)，如EP1,266,967中所述孵育培养物。两天后，使用来自预培养物的发酵液接种主培养物。这用EP 1,266,967中所述培养基(甘油(60g/L)；葡萄糖(20g/L)；胨(10g/L)；全大豆粉(30g/L)；NaNO₃(2g/L)；MgSO₄.7H₂O(0.5g/L)；用1M HCl调节至pH 5.8)中10％的终体积完成，培养物如EP1,266,967中所述孵育144小时。取出发酵液样品(1mL)用于分析产生的抑制素。为此，向样品中添加CH₃CN(0.5mL)并剧烈振荡混合物。在14,000rpm将细胞碎片离心30分钟。上清液用于LC/MS分析。普伐他汀、洛伐他汀和制甲羟酶素被用作若干稀释度(15、5、5、2.5、1、0.5和0.25mg/mL)下的对照。使用以下的条件进行LC/MS：

装置LC： Waters Alliance 2795LC

流动相：溶剂A：含0.1％HCO₂H的水

溶剂B：含0.1％HCO₂H的CH₃CN

针洗涤剂： 50％Milli-Q水+50％乙腈

梯度：时间(分钟) A％ B％流速(ml/分钟) 曲线

0.00 85.0 15.0 1.00 1

1.50 40.0 60.0 1.00 6

1.70 0.0 100.0 1.50 6

1.80 85.0 15.0 1.50 6

2.00 85.0 15.0 1.00 6

2.10 结束

柱： Varian，MonoChrom CN，20x 2.0mm，颗粒大小3μm

柱温度： 25℃

注射体积： 5μl

装置MS： Waters ZQ 2000

来源： ES+

毛细管： 3.50kV

锥体(cone)： 30V

去溶剂化温度： 360℃

来源温度： 140℃

提取器(Extractor)： 2V

RF透镜： 0.3V

锥体气流： 1301/小时

去溶剂化气流： 6101/小时

LM 1重溶液： 15.0

HM 2重溶液： 15.0

离子能量1： 0.1

倍增器(Multiplier)：650V

扫描质量范围(m/z)200-600amu，扫描持续时间0.20s，扫描间延迟0.05s

6个频道的SIR：361.3、413.30、431.3、445.3、447.3、459.3；暂停(dwell)0.07s；扫描间延迟0.05s

在如EP 1,266,967中所述的条件下，菌株均不生产普伐他汀(表1)。

表1：用mg/L表示的由多种菌株生产的多种抑制素。

比较实施例2

通过WO 99/10499中描述的菌株生产抑制素

分离P-450sca-2基因

根据WO 99/10499对野生型Penicillium citrinum细胞装配Streptomyces carbophilus P-450sca-2基因。因而将菌株Streptomycescarbophilus FERM-BP 1145接种在25mL液体培养基(以g/L表示：酵母提取物，1；水解酪蛋白氨基酸4；甘油4；MgSO₄，1；CaCl₂，0.1；微量元素溶液，2ml(0.1％ZnSO₄.7H₂O、0.1％FeSO₄.7H₂O、0.1％MnCl₂.4H₂O)；0.5％甘氨酸)中，并在28℃、280rpm下孵育72小时。通过离心收获菌丝体，用0.7％NaCl洗涤一次，然后根据Hopwood et al.(1985，Genetic manipulation of Streptomyces，a laboratory manual，John InnesFoundation，Norwich)分离基因组DNA。

通过PCR克隆制甲羟酶素羟化酶基因P-450sca-2，所述PCR使用基因特异的正向和反向引物(SEQ ID NO 1和2)在经分离的染色体DNA上进行。PCR反应混合物在50μl中进行，含有125ng基因组DNA作为模板、250ng两种引物、2单位的Pwo聚合酶(Boehringer Mannheim)、1xPwo缓冲液、0.2mM dNTP’s和4μl DMSO。在载体pCR-blunt(Stratagene)中克隆1.2kb平末端的PCR DNA-片段，得到构建体pCRP450a。通过DNA序列分析检验pCRP450a中含有羟化酶基因的PCR插入物。在用NcoI部分消化和用EcoRV完全消化后，从pCRP45Oa中分离1.2kb的DNA片段，并克隆在用NcoI和SmaI消化的真菌表达载体中pAN8-I(Punt&van den Hondel，1993，Meth.Enzymology 216：447-457)。通过限制性分析检验的获得的整合构建体pANP450a在Aspergillus nidulans gpdA启动子下游含有Streptomyces carbophilus制甲羟酶素羟化酶基因。获得的质粒在图2中显示。

获得带有P-450sca-2基因的Penicillium citrinum转化体

通过原生质体转化将pANP450a引入Penicillium citrinum NRRL 8082中，所述原生质体转化是用于丝状真菌的典型步骤。该方法的细节被描述于WO99/10499中。我们还共同引入了pANP450a和pAN7-1(Punt and Vanden Hondel，1993)并在潮霉素上选择转化体。获得潮霉素阳性的转化体并将其在新鲜的潮霉素平板上重新划线。进行PCR验证潮霉素阳性的克隆是否也获得pAN450a质粒。为此将一小块菌落材料重悬于50μl TE缓冲液(Sambrook et al.，1989)中并在95℃孵育10分钟。在3000rpm将细胞碎片离心5分钟。5μl上清液用于PCR反应，所述PCR反应使用P-450sca-2特异的正向和反向引物(SEQ ID NO 3和4)。获得了总计8个潮霉素抗性的、P-450sca-2阳性的且稳定的转化体。

摇瓶测试具有P-450sca-2基因的Penicillium citrinum转化体

在马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)斜面上于25℃下对菌株的孢子形成诱导2-7天。孢子被收集在0.5％Tween 80中并用于接种如实施例1中所述的预培养基。两天后，使用来自预培养物的发酵液接种主培养物。这用实施例1中所述培养基中10％的终体积完成。取出1mL发酵液样品用于分析产生的抑制素。为此，向样品中添加0.5mL乙腈并剧烈振荡混合物。在14,000rpm将细胞碎片离心30分钟。上清液用于如实施例1中所述的LC/MS分析。如从表2中可以看出，在如WO 99/10499中所述的条件下菌株均不生产普伐他汀。

表2：由Penicillium citrinum WT和具有来自Streptomyces carbophilus的P-450sca-2基因的转化体生产的多种抑制素(以mg/L表示)。

实施例3

分离生产制甲羟酶素的Penicillium chrysogenum宿主细胞

Penicillium citrinum是天然的制甲羟酶素生产者(Y.Abe et al.，2002，Mol Genet Genomics 267，636-646)。编码代谢途径的基因簇生于基因组中一个片段中。文献中描述了这些基因中的一些的功能，以及整个簇或者特定的调节子的过表达提高制甲羟酶素效价(Abe et al.，2002，Mol.Genet.Genomics 268，130-137；Abe et al.，2002，Mol.Genet.Genomics，268，352-361)。然而，野生型菌株和重组菌株的生产效价都非常低，因此更好的生产宿主会是有利的。可以使用经受了若干轮菌株改进以改进菌株性能的任何工业Penicillium chrysogenum菌株作为制甲羟酶素生产宿主细胞的起始菌株。这些菌株的例子是CBS 455.95(Gouka et al.，1991，J.Biotechnol.20，189-200)；Panlabs P2(Lein，1986，The Panlabs Penicillium strain improvementprogram，in‘Overproduction of microbial metabolites’，Vanek and Hostalek(eds.)，105-140；Butterworths，Stoneham，MA)；E1和AS-P-78(Fierro et al.，1995，Proc.Natl.Acad.Sci.92：6200-6204)；BW1890和BW1901(Newbert etal.，1997，J.Ind.Microbiol.19：18-27)。为了分离可被用作制甲羟酶素生产宿主细胞的不含β-内酰胺的衍生物，必须缺失工业Penicillium chrysogenum菌株的编码β-内酰胺生物合成蛋白质的所有基因拷贝。因为这些基因在Penicillium chrysogenum菌株谱系中被扩增为多个拷贝，所以这不能通过单基因缺失来实行。最好的途径是首先分离仅具有一个拷贝的生物合成基因集合的工业菌株的衍生物。因为所有基因扩增是在相同染色体上的直接重复(Fierro et al.，1995，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92：6200-6204)，所以在不同的重复之间能够存在导致拷贝丧失的重组(Newbert et al.，1997，J.Ind.Microbiol.19：18-27)。这是一个随机过程，并可以通过诱变处理被诱导。应当针对减少的青霉素生产和减少的青霉素生物合成基因拷贝数筛选衍生物。如果筛选了足够的衍生物，则能够找到这些单拷贝分离株。然后将这些分离株用于通过同源重组的定向基因敲除。

分离单拷贝分离株

如Cantoral et al.，1987，Bio/Technol.5：494-497中所述，使用glucanex代替novozyme作为裂解酶进行Penicillium chrysogenum原生质体的制备。从菌丝体分离原生质体，洗涤，并涂布在矿物培养基琼脂(US2002/0039758)上，所述矿物培养基琼脂不含苯乙酸，但是补充有15g/L琼脂和1M蔗糖。将再生菌落转移至不含蔗糖的平板上，以诱导孢子形成。收集孢子，用0.9mM NaCl洗涤，稀释并涂布在YEPD琼脂平板(10g/L酵母提取物、10g/L蛋白胨、20g/L葡萄糖和15g/L琼脂)上。将经分离的菌落转移至矿物培养基琼脂平板上作为储存培养物平板。选择27个随机的分离株用于Southem印迹分析，以确定相对的基因拷贝数。为此，在液体矿物培养基中于25℃和280rpm下将细胞培养48小时。收集细胞，用0.9mM NaCl洗涤并将沉淀物冷冻在液氮中。使用研钵和研杵研磨冷冻的细胞，转移至塑料管中并添加等体积的苯酚∶CHCl₃∶异戊醇(25∶24∶1)。将混合物剧烈振荡，离心并将水相转移至新管中。重复两次，每次使用新鲜的苯酚∶CHCl₃∶异戊醇(25∶24∶1)。最后，通过乙醇沉淀(Sambrook et al.，1989)从水相中分离DNA。用EcoRI消化DNA(3μg)，在0.6％琼脂糖上分离并通过Southern印迹转移至尼龙膜上。使用pcbC和niaA作为探针。前者代表了青霉素生物合成基因的拷贝数，后者是在Penicillium chrysogenum菌株中作为单拷贝存在的内部对照(编码亚硝酸盐还原酶的基因)。使用基因特异引物(见表3)扩增探针序列，并根据供应商的说明书，用ECL非放射性杂交试剂盒(Amersham)加以标记。使用两种信号强度之间的比例(pcbC∶niaA)，来评价青霉素基因簇的相对基因拷贝数。亲本菌株和单拷贝实验室菌株Wisconsin 54-1255被用作对照。

表3：用于扩增探针序列的引物序列

靶基因	正向引物	反向引物
			PcbC	SEQ ID NO 5	SEQ ID NO 6
NiaA	SEQ ID NO 7	SEQ ID NO 8

在含苯氧乙酸的液体矿物培养基中针对青霉素生产测试具有最低比例的菌株。用NMR测定青霉素V生产。所有具有降低的pcbC∶niaA比例的菌株也显示降低的青霉素V效价。选择了一个经受了第二轮原生质体化、筛选和分析的菌株，其与上文所述相同。还选择了27个随机分离株并详细分析。根据Southern印迹(见图3)，鉴定出了若干个推定的“单拷贝”青霉素生物合成基因簇后选择(由箭头指出)，因为它们显示与实验室菌株Wisconsin 54-1255可以比较的pcbC∶niaA比例。选择其中三个并在摇瓶中针对青霉素V生产进行测试。使用原始的工业Penicilliumchrysogenum亲本、中间体亲本、实验室菌株Wisconsin 54-1255和该实验室菌株的不生产衍生物npe10(Cantoral et al.，1993，J.Biol.Chem.268：737-744)作为对照。所有三个分离株都显示显著降低的青霉素V效价，并可与单拷贝实验室菌株Wisconsin 54-1255比较，从而得出结论：这三个分离株是工业单拷贝分离株，其仅维持一个拷贝的青霉素基因簇，但是也维持通过经典菌株改进引入的所有突变(图4)。

缺失最终拷贝的青霉素生物合成基因

为了失活最终维持的青霉素基因簇拷贝的三个生物合成基因，使用双同源重组策略。使用与生物合成基因相邻的序列作为侧翼，将amdS选择标记物靶向该基因座。如果会发生双同源杂交，则转化体应使用乙酰胺作为唯一的碳源(归因于amdS基因的存在)，不应生产青霉素并且不应与pcbC探针杂交。因为双同源杂交在Penicillium chrysogenum中是罕见的事件，所以产生了三种构建体：一个在amdS基因的任一侧具有3kb的侧翼，一个具有5kb侧翼，一个具有7kb的侧翼(见图5)。使用的寡核苷酸在表4中列出。

表4：用于构建双同源交换盒的引物集合

在PCR扩增后，通过TOPO T/A克隆(Invitrogen)将片段克隆进pCRXL中。随后用Acc651和NotI消化三个左侧翼(3、5和7kb)，然后连接在用Acc651和NotI预先消化的pBluescript II SK+(Invitrogen)中。用NotI消化获得的左侧翼质粒以便于克隆右侧翼，所述右侧翼用NotI和Eco521预先消化。获得的3、5和7kb侧翼质粒均在左侧翼和右侧翼之间具有独特的NotI位点，给位点被用于克隆amdS基因作为选择标记物。这通过用NotI消化pHELY-A1(描述于WO 04/106347中)并分离3.1kbPgpdA-AnamdS表达盒获得。由此获得的缺失片段在用KpnI消化后分离，并转化至青霉素基因簇单拷贝分离株中。根据其在乙酰胺选择平板上生长的能力选择转化体，随后通过将菌落复制涂布在矿物培养基上并在生长4天后用β-内酰胺敏感的指示物生物Escherichia coli菌株ESS覆盖，针对抗生素生产对其进行筛选。如果菌落仍然生产β-内酰胺，则这抑制Escherichia coli的生长。测试的27,076个转化体中有22个显示无抑制区(0.08％)并被选择用于进一步的分析。通过菌落PCR用三个引物组对这22个分离株进行分析：niaA，作为单拷贝基因的内部控制；amdS，用作选择标记物；penDE，作为青霉素生物合成基因存在或不存在的指示物。

表5：用于菌落PCR的引物序列

基因	FWD引物	REV引物	片段大小(bp)
				NiaA	SEQ ID NO 7	SEQ ID NO 8	251
AmdS	SEQ ID NO 17	SEQ ID NO 18	653
				penDE	SEQ ID NO 19	SEQ ID NO 20	1000

表6：对推定的Penicillium chrysogenum菌株分离株的菌落PCR

菌株	用于缺失的片段	niaA	amdS	penDE
					Npe10	-	+	-	-
Wisconsin54-1255	-	+	-	+
					CBS 455.95	-	+	-	+
缺失突变体	3kb侧翼	+	+	-
					缺失突变体	3kb侧翼	+	+	-
缺失突变体	5kb侧翼	+	+	-
					缺失突变体	5kb侧翼	+	+	-
缺失突变体	5kb侧翼	+	+	-
					缺失突变体	5kb侧翼	+	+	-
缺失突变体	7kb侧翼	+	+	-
					缺失突变体	7kb侧翼	+	+	-
缺失突变体	7kb侧翼	+	+	-
					缺失突变体	7kb侧翼	+	-	-
缺失突变体	3kb侧翼	+	+	-
					缺失突变体	3kb侧翼	+	+	-
缺失突变体	3kb侧翼	+	+	-
					缺失突变体	5kb侧翼	+	+	-
缺失突变体	5kb侧翼	+	+	-
					缺失突变体	7kb侧翼	+	+	-
缺失突变体	7kb侧翼	+	+	-
					缺失突变体	7kb侧翼	+	+	-
缺失突变体	7kb侧翼	+	+	-
					缺失突变体	7kb侧翼	+	+	-
缺失突变体	7kb侧翼	+	-	-
					缺失突变体	7kb侧翼	+	+	-

所有22个推定的突变体均未给出编码酰基转移酶的基因penDE的信号，所述酶催化青霉素生物合成中的最后一步。两个突变体未给出amdS的信号，提示选择标记物基因的自发丢失。结论是所有22个分离株均是工业Penicillium chrysogenum菌株不含β-内酰胺生物合成基因的衍生物，具有制甲羟酶素生产的可能宿主的资格。

摇瓶测试

通过在含有苯乙酸作为前体的液体矿物培养基中接种突变体，在摇瓶中测试所有22个突变体，以证实青霉素阴性的表型。用NMR分析样品，证实没有一个突变体能够生产青霉素G(图6)，因此结论是它们均是正确的不含β-内酰胺的Penicillium chrysogenum分离株。

分离制甲羟酶素基因集合

从Penicillium citrinum NRRL8082分离染色体DNA。因为整个基因簇由于其大小(38kb；图7)而难以通过PCR扩增，所以将其分为三个片段：18kb、14kb和6kb。14和6kb的片段被容易地PCR扩增(图8)，并根据供应商的说明使用Gateway(Invitrogen)用所谓的LR gateway反应克隆进输入载体pDONRP4-P1R和pDONR221中。在两步步骤中克隆18kb片段。首先扩增10kb和8kb的片段。两个片段被独立地克隆进pCR2.1TOPO T/A(Invitrogen)中并随后通过限制性酶克隆和连接融合在一起(见图9)。最后，使用Gateway技术将片段转移至pDONR41Zeo载体。通过测序验证被扩增的片段。使用所谓的多位点Gateway反应(见Invitrogen手册)，含有制甲羟酶素生物合成基因簇的所有基因的这三个基因片段可以被重组进跨越整个区域的一个片段中。

表7：用于扩增制甲羟酶素生物合成基因簇的寡核苷酸

Penicillium转化

将三个制甲羟酶素基因簇片段共转化进带有编码下述蛋白质的ble表达盒的Penicillium chrysogenum平台菌株，所述蛋白质介导腐草霉素抗性。该表达盒可以作为1.4kb SalI片段从pAMPF7从分离(Fierro et al.，1996，Curr.Genet.29：482-489)。在矿物培养基琼脂平板上进行转化体的选择，所述平板含有50μg/ml腐草霉素和1M蔗糖。将在这些原生质体再生平板上出现的腐草霉素抗性菌落在含/不含蔗糖的新鲜腐草霉素琼脂平板上再划线，并培养直至孢子形成。通过菌落PCR针对一个或多个制甲羟酶素基因片段的存在筛选腐草霉素抗性转化体。为此，将一小块菌落材料悬浮于50μl TE缓冲液(Sambrook et al.，1989)中并在95℃孵育10分钟。为了弃去细胞碎片，将混合物在3000rpm离心5分钟。上清液(5μl)被用作PCR反应的模板，该反应使用来自HT Biotechnology Ltd.的SUPER TAQ。在来自Invitrogen的E-ge196体系上分析PCR反应。

表8：菌落PCR中用于测定制甲羟酶素生物合成基因簇存在的寡核苷酸

靶DNA	正向引物	反向引物
			18kb片段	SEQ ID NO 31	SEQ ID NO 32
14kb片段	SEQ ID NO 33	SEQ ID NO 34
			6kb片段	SEQ ID NO 35	SEQ ID NO 36
niaA	SEQ ID NO 7	SEQ ID NO 8

首先检验18kb片段的存在。在480个菌落中检验了112个具有稳定整合的18kb片段(～23％)。随后验证其它两个片段(14和6kb)的存在。45个18kb阳性的转化体也具有制甲羟酶素基因簇的其它两部分，从而具有推定的制甲羟酶素生产菌株的资格。

制甲羟酶素摇瓶测试

在液体矿物培养基(不含苯乙酸)中，针对(经水解的)制甲羟酶素和ML-236A(6-(2-(1，2，6，7，8，8a-六氢-8-羟基-2-甲基-1-萘基)乙基)四氢-4-羟基-2H-吡喃-2-酮)的存在评价具有完整制甲羟酶素基因簇的Penicilliumchrysogenum平台菌株转化体。在25℃下于25ml中培养168个小时后，用HPLC分析上清液，使用以下的设备和条件：

-柱：Waters XTerra RP18

-柱温度：室温

-流速：1ml/分钟

-注射体积：10μl

-发射箱温度：室温

-设备：Waters Alliance 2695

-检测器：Waters 996光二极管阵列

-波长：238nm

-洗脱液：A：milliQ水中33％CH₃CN、0.025％CF₃CO₂H；

B：milliQ水中80％乙腈；

C：milliQ水

使用两种不同的梯度：

滞留时间(梯度1)：经水解的制甲羟酶素 10.4分钟

制甲羟酶素 10.9分钟

ML-236A 2.6分钟

滞留时间(梯度2)：经水解的制甲羟酶素 11.5分钟

制甲羟酶素 11.8分钟

ML-236A 8.6分钟

野生型Penicillium citrinum菌株不能生产任何抑制素，但是Penicillium chrysogenum转化体生产显著的量(表9)。HPLC色谱图的一个例子在图10中展示。这些数据证实了使用Penicillium chrysogenum工业生产菌株的衍生物作为宿主细胞用于生产制甲羟酶素的高潜能。

表9.不同菌株生产的抑制素水平(制甲羟酶素和ML-236A)。

菌株	制甲羟酶素(mg/L)	ML-236A(mg/L)
			Penicillium citrinum NRRL8082	＜0,5	0
Penicillium citrinum NRRL8082	＜0,5	0
			Penicillium citrinum NRRL8082	0.9	0
Penicillium citrinum NRRL8082	＜0,5	0
			不含-内酰胺的Penicillium chrysogenum分离株	0	0
不含-内酰胺的Penicillium chrysogenum分离株	0	0
			制甲羟酶素簇转化体	10	465
制甲羟酶素簇转化体	7	420

实施例4

分离生产普伐他汀的Penicillium chrysogenum宿主细胞

菌株构建

使用实施例2中所述的质粒pAN450a转化实施例3中所述的不含β-内酰胺的Penicillium chrysogenum菌株。为此如实施例3中所述将所有三个制甲羟酶素基因片段、pAN450a和腐草霉素基因盒共同转化至Penicilliumchrysogenum宿主细胞。在腐草霉素选择平板上最初选择后，将菌落在选择性平板上重新划线并用于菌落PCR。首先，如实施例3中所述使用表8中所示的引物证实制甲羟酶素基因的存在。其次，如实施例2中所述使用引物SEQ ID NO 3和4证实P-450sca-2基因的存在。两个转化体T1.48和T1.37显示含有所有的基因，并随后被用于摇瓶分析。

普伐他汀摇瓶培养和HPLC分析

将两种转化体均在真菌矿物无尿素培养基中培养，所述培养基含有(g/L)：葡萄糖(5)；乳糖(80)；(NH₄)₂SO₄(2.5)；Na₂SO₄(2.9)；KH₂PO₄(5.2)；K₂HPO₄(4.8)和10ml/l含柠檬酸(150)的溶液；FeSO₄.7H₂O(15)；MgSO₄.7H₂O(150)；H₃BO₃，0.0075；CuSO₄.5H₂O，0.24；CoSO₄.7H₂O，0.375；ZnSO₄.7H₂O(0.5)；MnSO₄.H₂O(2.28)和CaCl₂.2H₂O(0.99)；在灭菌前pH为6.5。在25℃于定轨摇床中以280rpm将培养物孵育120小时。HPLC分析与实施例3中相同。使用梯度2时滞留时间为：水解的制甲羟酶素11.5分钟；普伐他汀8.7分钟，ML-236A 8.6分钟。

尽管实施例2的亲本Penicillium chrysogenum菌株、Penicilliumchrysogenum制甲羟酶素转化体、野生型Penicillium citrinum菌株或Penicillium citrinum转化体不生产任何制甲羟酶素，但是装配有制甲羟酶素和P-450sca-2基因二者的Penicillium chrysogenum转化体生产普伐他汀。转化体T1.47的HPLC色谱图在图11中显示。

转化体T1.48发酵液的LC/MS/MS分析

为了验证通过HPLC鉴定的峰的确是普伐他汀，进行LC/MS/MS分析。为此用水将样品1∶1稀释并注射在如下的LC/MS/MS体系中：

LC 洗脱液： A：水中0.1％HCO₂H；B：CH₃CN中0.1％HCO₂H

梯度：时间(分钟) 流速(ml/分钟) A％ B％

0.0 0.2 70 30

20.0 0.2 10 90

20.1 0.2 70 30

25.0 0.2 70 30

柱： Varian Inertsil 3ODS 3CP22568150*2.1mm 3μm

柱温度： 55℃

注射体积： 50μl

发射箱温度： 4℃

MS 设备： LCQ(SM05)

LC/MS：对普伐他汀为ESI/neg

LC/MS/MS：普伐他汀iw＝2.1aa＝25％

滞留时间：普伐他汀8.7分钟

m/z范围 200-800

微扫描： 1

注射时间： 500ms

使用LC方法在8.7分钟时洗脱普伐他汀。ESI/neg模式中普伐他汀被表征为m/z 423处质子化的分子[M-H]-。在MS/MS模式中观察到102(甲基丁酸)和120(102-H₂O)的特征性丢失(图12)，证实装配有制甲羟酶素和P-450sca-2基因的该Penicillium chrysogenum转化体能够在单次发酵培养中从简单和确定的营养素开始生产普伐他汀。

序列表

<11o>帝斯曼知识产权资产管理有限公司

<120>普伐他汀的生产

<130>25630WO

<160>36

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成的引物

<400>1

CACCATGGCC GAGATGACAG AGAAAGCC 28

<210>2

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成的引物

<400>2

CAGGATCCCG CTCGGTCACC AGGTGACC 28

<210>3

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成的引物

<400>3

ATCACCAAGC TGGAGTCCGA AC 22

<210>4

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成的引物

<400>4

GGATGAGCTG TCCGTCGATC TC 22

<210>5

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成的引物

<400>5

GATTGGCGCT CCTCGTTCAC C 21

<210>6

<211>50

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成的引物

<400>6

CCATTATTTT TCTAGTCGAC ATGGCATCGA TTCCCAAGGC CAATGTCCCC 50

<210>7

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成的引物

<400>7

CACAGAGAAT GTGCCGTTTC TTTGG 25

<210>8

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成的引物

<400>8

TCACATATCC CCTACTCCCG AGCC 24

<210>9

<211>45

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成的引物

<400>9

GTTACACGCT TTGATTCTGT GGGTACCGAT GTTATATTCA GCTAC 45

<210>10

<211>44

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成的引物

<400>10

CCCAATAGCG GCCGCAGTTG ATAATATCAA TATCTAAAAC TCCC 44

<210>11

<211>42

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成的引物

<400>11

GGCATATACG AGCATGGTAC CAGGGACAGA TGCCCATCCT TG 42

<210>12

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成的引物

<400>12

GTATAAAAGG GGAGGGTACC GGGAAAGATT TGTGGGCCTG 40

<210>13

<211>45

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成的引物

<400>13

GTATGTAGCT GCGGCCGCCT CCGTCTTCAC TTCTTCGCCC GCACT 45

<210>14

<211>50

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成的引物

<400>14

CCGCCTTCCT CACTAACCGG CCGGCAGGTA CCGATGGACT CAGCATTATC 50

<210>15

<211>47

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成的引物

<400>15

CTCTAGAATG CTACGGCCGT TCGAGGTACC TTATAGGAAA AAGGTAG 47

<210>16

<211>45

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成的引物

<400>16

CCTTTTCGCT GAGCGGCCGC AATCACAGGT ACCGTTTTTG TCGTC 45

<210>17

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成的引物

<400>17

ATGCCTCAAT CCTGGGAAGA ACTG 24

<210>18

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成的引物

<400>18

CTTGACGTAG AAGACGGCAC CGGC 24

<210>19

<211>36

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成的引物

<400>19

CCCGCAGCAC ATATGCTTCA CATCCTCTGT CAAGGC 36

<210>20

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成的引物

<400>20

ATGACAAACA TCTCATCAGG G 21

<210>21

<211>53

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成的引物

<400>21

GGGGACAACT TTGTATAGAA AAGTTGAAGG ATGACTATTC CAGTGATTAG CAC 53

<210>22

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成的引物

<400>22

GAGAAGACGA AACTCGTGCT TTGAGTG 27

<210>23

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成的引物

<400>23

CACTCAAAGC ACGAGTTTCG TCTTCTC 27

<210>24

<211>53

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成的引物

<400>24

GGGGACTGCT TTTTTGTACA AACTTGAAGG GAGTACTTGT GTCCACGTCG TTG 53

<210>25

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成的引物

<400>25

GTGGTAGGCG GCCAGGTAGA AC 22

<210>26

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成的引物

<400>26

CAGCATCTTC GTGGAGGTGC GC 22

<210>27

<211>59

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成的引物

<400>27

GGGGACAAGT TTGTACAAAA AAGCAGGCTA ACCCGCCTTC CGACTACATA TCCACAATC 59

<210>28

<211>56

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成的引物

<400>28

GGGGACCACT TTGTACAAGA AAGCTGGGTA CTCAGGAATG AATCAGATCA ACATTC 56

<210>29

<211>54

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成的引物

<400>29

GGGGACAGCT TTCTTGTACA AAGTGGAAGT ATCAGGATTG ATGCCTGAAA CATC 54

<210>30

<211>53

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成的引物

<400>30

GGGGACAACT TTGTATAATA AAGTTGAGAT CTGCTGGTAG ACTAGAGCCT GCC 53

<210>31

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成的引物

<400>31

CACAGGAATC ACAGCAGAAC AGTCATC 27

<210>32

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成的引物

<400>32

TCCCATTTGC TGTTGATGGA GCAGC 25

<210>33

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成的引物

<400>33

GATCTGAGAT GTCACATGCG TGTAGATAGA C 31

<210>34

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成的引物

<400>34

CAATTGATCT TCTCTCGTGG CAAAGAG 27

<210>35

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成的引物

<400>35

TGGTTGCGAA GGCTGCAAAG AC 22

<210>36

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成的引物

<400>36

TGTACACGCT GACCTCGCAT ATGAAG 26

Claims

1.一种生产普伐他汀的方法，包括步骤：

(a)用包含基因mlcA、mlcB、mlcC、mlcD、mlcE、mlcF、mlcG和mlcH的多核苷酸转化Penicillium细胞；

(b)用下述多核苷酸转化所述Penicillium细胞，所述多核苷酸包含编码制甲羟酶素羟化酶的P450基因；

(c)选择经转化的细胞的克隆；

(d)培养所述经选择的细胞；

(e)任选地对所述被培养的细胞补充营养来源；和

(f)任选地从所述培养物中分离普伐他汀。

2.根据权利要求1的方法，其中所述Penicillium细胞是Penicilliumcitrinum或Penicillium chrysogenum。

3.根据权利要求2的方法，其中原始的宿主启动子被替换为不受途径特异转录调节子控制的由基因mlcR编码的启动子。

4.根据权利要求1到3中任一项的方法，其中所述P-450基因是来自Streptomyces carbophilus的P-450sca-2。

5.根据权利要求1到3中任一项的方法，其还包含铁氧还蛋白基因。

6.根据权利要求1到3中任一项的方法，其中所述宿主细胞包含氧化还原再生系统。