JP2003116567A

JP2003116567A - 遺伝子クラスター

Info

Publication number: JP2003116567A
Application number: JP2001316578A
Authority: JP
Inventors: Ario Abe; 有生阿部
Original assignee: Sankyo Co Ltd
Current assignee: Sankyo Co Ltd
Priority date: 2001-10-15
Filing date: 2001-10-15
Publication date: 2003-04-22

Abstract

(57)【要約】【課題】ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤ＭＬ−２３６Ｂ
生産菌のＭＬ−２３６Ｂ生産能を改善することを特徴と
するＤＮＡ等の提供。【解決手段】ペニシリウム・シトリナム（Ｐｅｎｉｃｉ
ｌｌｉｕｍｃｉｔｒｉｎｕｍ）由来の特定の塩基配列
を含むことからなり、ＭＬ−２３６Ｂ生産菌内に導入さ
れることにより、ＭＬ２３６Ｂ生産菌のＭＬ−２３６Ｂ
生産能を改善することを特徴とするＤＮＡ。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、ＨＭＧ−ＣｏＡ還
元酵素阻害剤ＭＬ−２３６Ｂ生産菌のＭＬ−２３６Ｂ生
産能を改善することを特徴とするＤＮＡ、該ＤＮＡとハ
イブリダイズする核酸分子、該ＤＮＡを組み込んだ組換
えＤＮＡベクター、該組換えＤＮＡベクターで形質転換
された宿主細胞、ＭＬ−２３６Ｂの製造法等に関する。

【０００２】

【従来の技術】高脂血症改善薬として臨床において使用
されているＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤プラバスタチ
ンは、ペニシリウム・シトリナムが生産するＭＬ−２３
６Ｂをストレプトミセス・カルボフィラス（Streptomyc
es carbophilus）により微生物変換することにより得ら
れる（Endo, A., et al., J. Antibiot.,29, 1346(197
6)：Matsuoka, S., et al., Eur. J. Biochem., 184, 7
07(1989)記載）。

【０００３】プラバスタチンの前駆体ＭＬ−２３６Ｂ、
及び、プラバスタチンと部分構造を共有するＨＭＧ−Ｃ
ｏＡ阻害剤ロバスタチンは、ともにポリケチドを経て生
合成されることが示されている（Moore, R. N., et a
l., J. Am. Chem. Soc., 107, 3694(1985)：Shiao, M.
and Don, H. S., Proc. Natl. Sci. Counc. ROC., 11,
223(1987)記載）。

【０００４】ポリケチドとは、酢酸、プロピオン酸、酪
酸などの低分子カルボン酸残基の連続的な縮合反応から
生じるβ―ケト炭素鎖から導かれる化合物の総称であ
り、各β―ケトカルボニル基の縮合・還元様式により、
多様な構造が導かれる（Hopwood,D. A. and Sherman,
D. H., Annu. Rev. Genet., 24, 37-66(1990)：Hutchin
son, C. R. and Fujii, I., Annu. Rev. Genet., 49, 2
01-238(1995)記載）。

【０００５】ポリケチドの合成を担うポリケチド・シン
ターゼ（ＰｏｌｙｋｅｔｉｄｅＳｙｎｔｈａｓｅ：以
下、「ＰＫＳ」という。）は糸状菌や細菌の有する酵素
であることが知られており、糸状菌では該酵素の分子生
物学的研究がなされている（Feng, G. H. and Leonard,
T. J., J. Bacteriol.,177, 6246(1995)：Takano, Y.,
et al. Mol. Gen. Genet., 249, 162(1995)記載）。ロ
バスタチン生産菌であるアスペルギルス・テレウス（As
pergillus terreus）については、トリオールＰＫＳ遺
伝子の解析がなされている（特表平９−５０４４３６号
公報記載）。

【０００６】ところで、糸状菌の二次代謝産物の生合成
関連遺伝子は、ゲノム上でクラスターを形成しているこ
とが少なくない。ポリケチドの生合成系にて、該系に関
与する遺伝子クラスターの存在が知られている。アスペ
ルギルス・フラヴァス（Aspergillus flavus）、アスペ
ルギルス・パラシティカス（Aspergillus parasiticu
s）の生産するポリケチドであるアフラトキシンの生合
成では、ＰＫＳその他ポリケチドの生合成に関与する酵
素蛋白質をコードする遺伝子がクラスター構造を形成し
ていることが知られており、両菌のアフラトキシン生合
成関連遺伝子のゲノム比較解析が行なわれている（Yu,
J., et al, Appl. Environ. Microbiol., 61, 2365(199
5)記載）。アスペルギルス・ニジュランス（Aspergillu
s nidulans）の生産するステリグマトシスチンの生合成
においては、生合成関連遺伝子が、ゲノム上の連続する
約６０ｋｂの領域においてクラスター構造を形成してい
ることが報告されている（Brown, D. W., et al., Pro
c. Natl. Acad. Sci. USA, 93,1418(1996)記載）。ペニ
シリウム・シトリナム（Penicillium citrinum）のＭＬ
−２３６Ｂ生合成に関連するＤＮＡ（以下「ＭＬ−２３
６Ｂ生合成関連ＤＮＡ」という）は、特開２００１−１
１２４８７において記載されている。その中で、ｍｌｃ
Ａ、ｍｌｃＢ、ｍｌｃＣ、ｍｌｃＤ、ｍｌｃＥ、ｍｌｃ
Ｒの６種類の異なる構造遺伝子が示されている。しか
し、ＭＬ−２３６Ｂの生合成に必要とされる生合成遺伝
子のすべては見出されていなかった。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】本発明者らは、ペニシ
リウム・シトリナムのＭＬ−２３６Ｂ生合成に関与する
酵素の遺伝子又は遺伝子クラスターをＭＬ-２３６Ｂ生
産菌のゲノムＤＮＡライブラリーよりクローニングし、
得られた組換えＤＮＡベクターを用いてＭＬ−２３６Ｂ
を形質転換することにより該生産菌のＭＬ−２３６Ｂの
生産性が向上することを見出し、本発明を完成した。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明は、（１）配列表
の配列番号１のヌクレオチド番号１乃至７２１４９で示
される塩基配列からなり、ＭＬ−２３６Ｂ生産菌内に導
入されることにより該菌のＭＬ−２３６Ｂ生産能を改善
することを特徴とするＤＮＡ、（２）配列表の配列番号
１のヌクレオチド番号１乃至４２７５８で示される塩基
配列からなり、ＭＬ−２３６Ｂ生産菌内に導入されるこ
とにより該菌のＭＬ−２３６Ｂ生産能を改善することを
特徴とするＤＮＡ、（３）配列表の配列番号１のヌクレ
オチド番号１１６１４乃至４７９１８で示される塩基配
列からなり、ＭＬ−２３６Ｂ生産菌内に導入されること
により該菌のＭＬ−２３６Ｂ生産能を改善することを特
徴とするＤＮＡ、（４）配列表の配列番号１のヌクレオ
チド番号３６１３５乃至７２１４９で示される塩基配列
からなり、ＭＬ−２３６Ｂ生産菌内に導入されることに
より該菌のＭＬ−２３６Ｂ生産能を改善することを特徴
とするＤＮＡ、（５）配列表の配列番号１のヌクレオチ
ド番号２５９７９乃至６３４１９で示される塩基配列か
らなり、ＭＬ−２３６Ｂ生産菌内に導入されることによ
り該菌のＭＬ−２３６Ｂ生産能を改善することを特徴と
するＤＮＡ。（６）請求項１乃至３記載のＤＮＡとハイ
ブリダイズし、ＭＬ−２３６Ｂ生産菌内に導入されるこ
とにより該菌のＭＬ−２３６Ｂ生産能を改善することを
特徴とするＤＮＡ、（７）（１）乃至（３）記載のＤＮ
Ａとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、Ｍ
Ｌ−２３６Ｂ生産菌内に導入されることにより該菌のＭ
Ｌ−２３６Ｂ生産能を改善することを特徴とするＤＮ
Ａ、（８）（１）乃至（５）のいずれか一つに記載のＤ
ＮＡを含む組換えＤＮＡベクター、（９）プラスミドｐ
ＭＬ４２（ＦＥＲＭＢＰ−７７２３）である（８）記
載の組換えＤＮＡベクター、（１０）プラスミドｐＭＬ
４５（ＦＥＲＭＢＰ−７７２４）である（８）記載の
組換えＤＮＡベクター、（１１）プラスミドｐＭＬ５１
（ＦＥＲＭＢＰ−７７２５）である、（８）記載の組
換えＤＮＡベクター、（１２）（７）乃至（１０）記載
の組換えＤＮＡベクターで形質転換された宿主細胞、
（１３）ＭＬ−２３６Ｂ生産菌であることを特徴とする
（１１）記載の宿主細胞、（１４）ペニシリウム・シト
リナム（Penicillium citrinum）であることを特徴とす
る、（１２）記載の宿主細胞、（１５）大腸菌であるこ
とを特徴とする、（１２）記載の宿主細胞、（１６）１
２乃至１５記載の宿主細胞を培養し、次いで該培養物か
らＭＬ−２３６Ｂを回収することを特徴とする、ＭＬ−
２３６Ｂの製造法に関する。

【０００９】

【発明の実施の形態】以下、本発明をより詳細に説明す
る。本発明は、ＭＬ−２３６Ｂ生産菌内に導入されるこ
とにより該生産菌のＭＬ−２３６Ｂ生産能を改善するこ
とを特徴とする、該生産菌のゲノムに由来するＭＬ−２
３６Ｂ生合成遺伝子及び遺伝子クラスター等に関する。

【００１０】本発明において、ＭＬ−２３６Ｂ生産菌と
は、ＭＬ−２３６Ｂ生産能を先天的に有する微生物をい
う。ＭＬ−２３６Ｂ生産菌としては、例えば、ペニシリ
ウム（Penicillium）属に属するＭＬ−２３６Ｂ生産菌
が挙げられ、ペニシリウム・シトリナム、ペニシリウム
・ブレビコンパクタム（Penicilium brevicompactum：B
rown, A. G., et al., J. Chem. Soc. Perkin-1., 1165
(1976)記載）、ペニシリウム・シクロピウム（Penicill
ium cyclopium：Doss, S.L.,et al., J. Natl. Prod.,
49, 357(1986)記載）等が例示される。さらに、これら
以外に、ユーペニシリウム・エスピーＭ６６０３（Eu
penicillium sp.M6603：Endo, A., et al., J. Antibio
t.-Tokyo, 39, 1609(1986)記載）、ペシロミセス・ビリ
ディスＦＥＲＭＰ−６２３６（Paecilomyces virid
is FERM P-6236：特開昭５８−９８０９２号公報記
載）、ペシロミセス・エスピーＭ２０１６（Paecilom
yces sp.M2016：Endo, A., et al., J. Antibiot.-Toky
o, 39, 1609(1986)記載）、トリコデルマ・ロンギブラ
チアタムＭ６７３５（Trichoderma longibrachiatum
M6735：Endo, A., et al., J. Antibiot.-Tokyo, 39, 1
609(1986)記載）、ヒポミセス・クリソスペルムスＩ
ＦＯ７７９８（Hypomyces chrysospermus IFO 7798：
Endo, A., et al., J. Antibiot.-Tokyo, 39, 1609(198
6)記載）、グリオクラディウム・エスピーＹＪ−９５
１５（Gliocladium sp. YJ-9515：ＷＯ９８０６８６７
号公報記載）、トリコデルマ・ビリデＩＦＯ５８３
６（Trichoderma viride IFO 5836：特公昭６２−１９
１５号公報記載）、ユーペニシリウム・レチクリスポル
ムＩＦＯ９０２２（Eupenicillium reticulisporum
IFO 9022：特公昭６２−１９１５９号公報記載）等が
挙げられる。ＭＬ−２３６Ｂ生産菌としてはこれらのう
ち、好適にはペニシリウム・シトリナムであり、より好
適にはペニシリウム・シトリナムＳＡＮＫ１３３８０
株およびその変異株を挙げることができる。ペニシリウ
ム・シトリナムＳＡＮＫ１３３８０株は、平成４年
（１９９２年）１２月２２日付けで独立行政法人産業技
術総合研究所特許生物寄託センターに国際寄託され、受
託番号ＦＥＲＭＢＰ−４１２９を付された。

【００１１】ゲノムＤＮＡライブラリーの作成法として
は、通常真核生物のゲノムＤＮＡライブラリーを作製す
るための方法であれば特に限定されないが、例えば、マ
ニアティスらの方法（Maniatis, T., et al., Molecula
r cloning, a laboratory manual, 2nd ed., Cold Spri
ng Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.(198
9)記載）等が挙げられる。

【００１２】ＭＬ−２３６Ｂ生産菌のゲノムＤＮＡは、
該生産菌培養物から菌体を回収して物理的に破砕した
後、核内ＤＮＡを抽出、精製することにより得られる。

【００１３】ＭＬ−２３６Ｂ生産菌の培養は、各ＭＬ−
２３６Ｂ生産菌に適した条件下で行なうことができる。
好適なＭＬ−２３６Ｂ生産菌であるペニシリウム・シト
リナムの培養は、該菌体を培養したスラントから、ＭＢ
Ｇ３−８培地（組成；７％(w/v)グリセリン、３％(w/v)
グルコース、１％(w/v)大豆粉、１％(w/v)ペプトン（極
東製薬工業（株）製）、１％(w/v)コーンスチープリカ
ー（ホーネンコーポレーション（株）製）、０．５％(w
/v)硝酸ナトリウム、０．１％(w/v)硫酸マグネシウム
七水和物、ｐＨ６．５）へ該菌体を接種し、２２乃至２
８℃、３乃至７日間、振盪しつつ保温することにより行
なうことができる。該スラントは、溶解させたＰＧＡ寒
天培地（組成；２００ｇ/Ｌ馬鈴薯抽出液、１５％(w/v)
グリセリン、２％(w/v)寒天）を試験管に注ぎ、傾斜さ
せつつ固化させたものに、白金耳を用いてペニシリウム
・シトリナムを接種し、２２乃至２８℃、７乃至１５日
間保温することにより作製する。該スラントを０乃至４
℃で保存することにより、該スラント上で該菌を継続的
に生存させることができる。

【００１４】液体培地で培養したＭＬ−２３６Ｂ生産菌
の菌体は、遠心分離により、固体培地で培養した該菌の
菌体は、セル・スクレーパー等でかきとることにより、
それぞれ回収することができる。

【００１５】菌体の物理的破砕は、菌体を液体窒素等で
凍結しつつ乳鉢と乳棒ですり潰すことにより行なうこと
ができる。破砕された菌体の核内ＤＮＡの抽出は、ドデ
シル硫酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍｄｏｄｅｃｙｌｓ
ｕｌｆａｔｅ：以下、「ＳＤＳ」という。）等の界面活
性剤を用いて行なうことができる。抽出されたゲノムＤ
ＮＡは、フェノール・クロロホルム抽出を行なうことに
より除タンパクされ、エタノール沈澱を行なうことによ
り沈澱として回収することができる。

【００１６】得られたゲノムＤＮＡは適当な制限酵素で
限定分解させ、断片化することができる。限定分解に使
用される制限酵素としては、通常入手可能な制限酵素で
あれば特に限定されないが、例えば、Ｓａｕ３ＡＩ等を
挙げることができる。断片化されたＤＮＡをゲル電気泳
動に供し、適当なサイズのゲノムＤＮＡを含むゲルから
ＤＮＡを回収する。ＤＮＡ断片のサイズには特に限定は
ないが、好適には２０ｋｂ以上である。

【００１７】ゲノムＤＮＡライブラリー作製用のＤＮＡ
ベクターとしては、該ＤＮＡベクターで形質転換された
宿主細胞内で複製されるのに必要な塩基配列を有するも
のであれば特に限定されないが、例えば、プラスミドベ
クター、ファージベクター、コスミドベクター、ＢＡＣ
ベクター等が挙げられ、好適にはコスミドベクターであ
る。また、これらＤＮＡベクターは発現ベクターであっ
てもよい。さらに、該ＤＮＡベクターは、該ＤＮＡベク
ターで形質転換された宿主細胞に表現形質（表現型；Ｐ
ｈｅｎｏｔｙｐｅ）の選択性を付与する塩基配列を有し
ていることが好ましい。

【００１８】該ＤＮＡベクターは、クローニング及び機
能発現の双方に適用できるものであることが好ましい。
該ＤＮＡベクターとしては、複数の微生物群に形質転換
可能なシャトルベクターを用いることが好ましい。該シ
ャトルベクターは、少なくとも一方の微生物群の宿主細
胞において複製されるのに必要な塩基配列を有する。ま
た、シャトルベクターは複数の微生物群の宿主にそれぞ
れ表現形質の選択性を付与する塩基配列を有しているこ
とが好ましい。

【００１９】該シャトルベクターにより形質転換される
微生物群の組合わせとしては、一方の微生物群がクロー
ニングに適用でき、且つ他方がＭＬ−２３６Ｂ生産能を
有していれば特に限定されないが、例えば、細菌及び糸
状菌の組合わせ、酵母及び糸状菌の組合わせ等が挙げら
れ、好適には細菌及び糸状菌の組合わせである。細菌と
しては、通常遺伝子工学に使用されるものであれば特に
限定されないが、例えば、大腸菌、枯草菌等を挙げるこ
とができ、好適には大腸菌であり、より好適には大腸菌
ＸＬ１−ＢｌｕｅＭＲ株である。酵母としては、通常遺
伝子工学に用いられるものであれば特に限定されない
が、例えば、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomy
ces cerevisiae）等を挙げることができる。糸状菌とし
ては、上述のＭＬ−２３６Ｂ生産菌等が挙げられる。な
お、本発明において微生物群は、細菌、糸状菌及び酵母
から選択される。

【００２０】このようなシャトルベクターとしては、例
えば、適当な表現型選択マーカー遺伝子及びコス（ｃｏ
ｓ）部位を有するコスミドベクター等を挙げることがで
き、好適には大腸菌ハイグロマイシンＢホスフォトラン
スフェラーゼ遺伝子配列を有するプラスミドｐＳＡＫ３
３３（特開平３−２６２４８６号公報記載）にコスミド
ベクターｐＷＥ１５（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）の有
するコス（ｃｏｓ）部位を挿入して作製されたｐＳＡＫ
ｃｏｓ１が挙げられるが、これらに限定されない。ｐＳ
ＡＫｃｏｓ１の構築手順については特開２０００−１１
２４８７図１に記載されている。

【００２１】上述のＭＬ−２３６Ｂ生産菌ゲノムＤＮＡ
断片をライゲーションしたシャトルベクターを宿主細胞
に導入することにより、所望のゲノムＤＮＡライブラリ
ーが完成する。宿主細胞には、好適には大腸菌、より好
適には大腸菌ＸＬ１−ＢｌｕｅＭＲ株がそれぞれ使用さ
れる。宿主細胞が大腸菌の場合、該導入はｉｎｖｉｔ
ｒｏパッケージングにより行なう。本発明において、形
質転換とは、ｉｎｖｉｔｒｏパッケージングによる外
来ＤＮＡの導入も意味し、ｉｎｖｉｔｒｏパッケージ
ングにより外来ＤＮＡを導入された細胞も形質転換細胞
の意味に包含される。

【００２２】ペニシリウム・シトリナムＳＡＮＫ１３
３８０株およびその変異株からのＭＬ−２３６Ｂ生合成
遺伝子及び遺伝子クラスターは、特開２０００−１１２
４８７に記載の方法、あるいは本発明における実施例に
より単離できる。所望のクローンのスクリーニングに
は、抗体又は核酸プローブを用い、好適には、核酸プロ
ーブを用いる。該核酸プローブは、特開２０００−１１
２４８７において公開された塩基配列に基づいて、ゲノ
ムＤＮＡの部分塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプ
ローブの合成により、またオリゴヌクレオチドプライマ
ーを作製し、ゲノムＤＮＡあるいはｐＭＬ４８（特開２
０００−１１２４８７公報記載）を鋳型としたポリメラ
ーゼ連鎖反応（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒ
ｅａｃｔｉｏｎ：以下、「ＰＣＲ」という。：Saiki,
R. K., et al., Science, 239, 487(1988)記載）を行な
うことにより、又は、ｐＭＬ４８の制限酵素消化断片を
取得することにより、作製することができる。

【００２３】組換えＤＮＡベクターｐＭＬ４８を保持す
る、形質転換大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉｐＭＬ４８ＳＡＮ
Ｋ７１１９９は平成１１年（１９９９年）７月７日付け
で独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センタ
ーに国際寄託され、受託番号ＦＥＲＭＢＰ−６７８０
を付されている。

【００２４】核酸プローブの標識は、放射性標識及び非
放射性標識に大別される。放射性標識に使用される放射
性核種としては、通常使用されるものであれば特に限定
されないが、例えば、³²Ｐ、³⁵Ｓ、¹⁴Ｃ等を挙げること
ができ、好適には³²Ｐである。非放射性標識に用いる試
薬としては、通常核酸の標識に用いられるものであれば
特に限定されないが、例えば、ジゴキシゲニン、ビオチ
ン等が挙げられ、好適にはジゴキシゲニンである。核酸
プローブを標識する方法としては、通常使用される方法
であれば特に限定されないが、例えば、標識基質を用い
たＰＣＲにより該産物中に取り込ませる方法、ニック・
トランスレーション法、ランダム・プライマー法、末端
標識法、標識基質を用いてオリゴヌクレオチドＤＮＡを
合成する方法等を挙げることができ、核酸プローブの種
類等によりこれらの方法から適宜選択できる。

【００２５】上述の通り作製された標識核酸プローブを
用い、ゲノムＤＮＡライブラリーから目的クローンをス
クリーニングすることができる。該スクリーニング方法
としては、通常遺伝子クローニングに使用される方法で
あれば特に限定されないが、好適にはコロニー・ハイブ
リダイゼーション法（Maniatis, T., et al., Molecula
r cloning, a laboratory manual, 2nd ed., Cold Spri
ng Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor, N. Y.(198
9)記載）を使用することができる。コロニー・ハイブリ
ダイゼーションに用いるコロニーの培養は、各宿主細胞
に適した条件下で行なうことができ、好適な宿主細胞で
ある大腸菌の形質転換体の培養は、ＬＢ寒天培地（１％
(w/v)トリプトン、０．５％(w/v)イーストエキストラク
ト、０．５％(w/v)塩化ナトリウム、１．５％(w/v)アガ
ロース）上で、３０乃至３７℃、１８時間乃至２日間保
温することにより行なうことができる。コロニー・ハイ
ブリダイゼーションにより得られる陽性クローンからの
組換えＤＮＡベクターの調製は、該陽性クローンの培養
物からプラスミドを抽出及び精製することによりなされ
る。

【００２６】形質転換宿主細胞の培養物からのプラスミ
ドの調製は、該宿主細胞の菌体を回収し、ゲノムＤＮＡ
やタンパク質を除去することによりなされる。好適な宿
主細胞である大腸菌の形質転換体の培養物からのプラス
ミドの調製は、マニアティスらのアルカリ法（Maniati
s, T., et al., Molecular cloning, a laboratory man
ual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold
Spring Harbor, N. Y.(1989)記載）により行なうことが
できる。また、より純度の高いプラスミドを得るための
キットが市販されており、このようなキットとして、例
えば、ＰｌａｓｍｉｄＭｉｎｉＫｉｔ（ＱＩＡＧＥ
Ｎ社製）が好適に使用される。さらに、プラスミドの大
量調製を行うキットが市販されており、このようなキッ
トとして、例えば、ＰｌａｓｍｉｄＭａｘｉＫｉｔ
（ＱＩＡＧＥＮ社製）が好適に使用される。

【００２７】得られたプラスミドのＤＮＡ濃度は、ＤＮ
Ａ試料を適宜希釈して波長２６０ｎｍにおける吸光度を
測定し、吸光度１＝ＤＮＡ５０μｇ／ｍｌとして算出す
ることができる。ＤＮＡの純度は、波長２８０及び２６
０ｎｍの吸光度の比率から算出することができる。

【００２８】本発明において新たに取得された組換えＤ
ＮＡベクターであるｐＭＬ４２は、平成１3年９月４日
付けで独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託セ
ンターに国際寄託され、受託番号ＦＥＲＭＢＰ−７７
２３を付された。また、組換えＤＮＡベクターｐＭＬ４
５は、平成１３年９月４日付けで独立行政法人産業技術
総合研究所特許生物寄託センターに国際寄託され、受託
番号ＦＥＲＭＢＰ−７７２４を付された。また、組換
えＤＮＡベクターｐＭＬ５１は、平成１３年９月４日付
けで独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託セン
ターに国際寄託され、受託番号ＦＥＲＭＢＰ−７７２
５を付された。

【００２９】ＤＮＡの塩基配列は、マキサム−ギルバー
トの化学修飾法（Maxiam, A. M. M.and Gilbert, W.,
Methods in Enzymology, 65, 499(1980)記載）又はジデ
オキシヌクレオチド鎖終結法（Messing, J. and Vieir
a, J., Gene, 19, 269(1982)記載）等により決定でき
る。なお、塩基配列決定に供するプラスミドＤＮＡとし
ては、より純度の高い標品が好ましい。

【００３０】ｐＭＬ４２の挿入塩基配列は、配列表の配
列番号１のヌクレオチド番号１乃至４２７５８に示され
る。ｐＭＬ４５の挿入塩基配列は、配列表の配列番号１
のヌクレオチド番号１１６１４乃至４７９１８に示され
る。ｐＭＬ５１の挿入塩基配列は、配列表の配列番号１
のヌクレオチド番号３６１３５乃至７２１４９に示され
る。また、特開２０００−１１２４８７に記載のｐＭＬ
４８の挿入塩基配列は、配列表の配列番号１のヌクレオ
チド番号２９５８１乃至６３７８３に示される。通常ゲ
ノムＤＮＡの塩基配列は同種内において遺伝的多型（ポ
リモルフィズム：ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｙｓｍ）を有して
いる。また、ＤＮＡクローニングの過程及び塩基配列決
定の過程において、ヌクレオチドの置換等が一定の確率
で生じ得る。従って、本発明は、配列表の配列番号１の
ヌクレオチド番号１乃至７２１４９に示される塩基配列
およびその相補鎖を有するＤＮＡにハイブリダイズする
ＤＮＡ、及び配列表の配列番号１およびその相補鎖を有
するＤＮＡにストリンジェントな条件下でハイブリダイ
ズするＤＮＡをも包合する。これらＤＮＡとしては、配
列表の配列番号１のヌクレオチド番号１乃至７２１４９
に示される塩基配列およびその相補鎖に１つ以上のヌク
レオチドの置換、欠失及び／又は付加が生じたもの、並
びに、ＭＬ−２３６Ｂ又はその誘導体を生産する、ペニ
シリウム・シトリナムＳＡＮＫ１３３８０株以外の微
生物に由来するものであり、該微生物に導入されること
により該菌のＭＬ−２３６Ｂ又はその誘導体の生産能を
改善する機能を有するものをも包合する。

【００３１】なお、本発明において、ハイブリダイズと
は、２本の一本鎖核酸同士が互いに相補的な領域又は相
補性の高い領域において二本鎖を形成することをいい、
ストリンジェントな条件とは、ハイブリダイゼーション
液の組成が６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣの組成は、１５０ｍ
ＭＮａＣｌ、１５ｍＭクエン酸三ナトリウム。）で
あり且つハイブリダイゼーションを行なう際の保温温度
が５５℃の場合をいう。ゲノムＤＮＡ配列中の遺伝子領
域の推定は、既存の遺伝子解析プログラム（Ｇｅｎｅ
Ｆｉｎｄｉｎｇプログラム（以下、「ＧＲＡＩＬ」とい
う。）及び配列の相同性検索プログラム（ＢＬＡＳＴＮ
及びＢＬＡＳＴＸ）により行なうことができる。

【００３２】ＧＲＡＩＬはゲノム配列の「遺伝子配列ら
しさ」を評価する７つのパラメータに分割し、それらの
結果をニューラルネット法を用いて統合することによ
り、ゲノムＤＮＡ上の構造遺伝子を検索するプログラム
（Uberbacher, E. C. & Mural, R. J., Proc. Natl. Ac
ad. Sci. USA., 88, 11261(1991)記載）であり、Ａｐｏ
ＣｏｍＧＲＡＩＬＴｏｏｌｋｉｔ（ＡＰＯＣＯＭ社
製）が好適に使用される。ＢＬＡＳＴは核酸配列及びア
ミノ酸配列の相同性検索を行なうアルゴリズム（Altech
ul, S. F., Madden, T. L., et al., Nucl. Acids Re
s.,25, 3389(1997)記載）を用いたプログラムである。

【００３３】ゲノムＤＮＡ配列を適当な長さに分割し、
ＢＬＡＳＴＮを用いて遺伝子データベースに対し相同性
検索することにより、被検ＤＮＡ配列上の構造遺伝子の
位置及び方向を推定することができる。また、分割され
たゲノムＤＮＡ配列を６つの翻訳フレーム（センス配列
及びアンチセンス配列に各々３つずつ）に従ってアミノ
酸配列に翻訳し、該アミノ酸配列のペプチド・データベ
ースに対する相同性検索をＢＬＡＳＴＸにより行なうこ
とにより、被検ＤＮＡ配列上の構造遺伝子の位置及び方
向の推定を行なうこともできる。さらに、真核生物にお
いては、ゲノムＤＮＡ配列中に含まれる構造遺伝子のコ
ード領域がイントロン配列により分断されている場合が
あり、このようなギャップを有する構造遺伝子の解析に
はギャップ含有配列用のＢＬＡＳＴがより有効であり、
Ｇａｐｐｅｄ−ＢＬＡＳＴ（ＢＬＡＳＴ２：ＷＩＳＣＯ
ＮＳＩＮＧＣＧｐａｃｋａｇｅｖｅｒ．１０．
０に搭載）が好適に使用される。

【００３４】本発明において得られた組換えＤＮＡベク
ターｐＭＬ４２、ｐＭＬ４５、ｐＭＬ５１の挿入配列上
には、２０の構造遺伝子の存在が推定され、それぞれを
ｍｌｃＡ、ｍｌｃＢ、ｍｌｃＣ、ｍｌｃＤ、ｍｌｃＥ、
ｍｌｃＦ、ｍｌｃＧ、ｍｌｃＨ、ｍｌｃＲ、ｏｒｆ１、
ｏｒｆ１１、ｏｒｆ１２、ｏｒｆ１３、ｏｒｆ１４、ｏ
ｒｆ１５、ｏｒｆ１６、ｏｒｆ１７、ｏｒｆ１８、ｏｒ
ｆ１９、ｏｒｆ２０と命名した。これらの構造遺伝子の
うち、ｍｌｃＡ、ｍｌｃＢ、ｍｌｃＣ、ｍｌｃＤ、ｍｌ
ｃＥ及びｍｌｃＲの６つの遺伝子については、特開２０
００−１１２４８７において記載されている。

【００３５】これらの構造遺伝子は配列表の配列番号１
に示される塩基配列上にコード領域を有する。

【００３６】本発明においては、新規に１４の構造遺伝
子を見出し、その中で、ＭＬ−２３６Ｂの生合成に関与
する３つの構造遺伝子ｍｌｃＦ、ｍｌｃＧ及びｍｌｃＨ
を見出すことができる。

【００３７】ノーザンブロット・ハイブリダイゼーショ
ン法により、構造遺伝子の発現を調べることができる。

【００３８】ノーザンブロット・ハイブリダイゼーショ
ンに供するＭＬ−２３６Ｂ生産菌の全ＲＮＡは、該菌の
培養物より得ることができる。好適なＭＬ−２３６Ｂ生
産菌であるペニシリウム・シトリナムの培養は、該菌の
スラントからＭＧＢ３−８培地に該菌を接種し、２２乃
至２８℃、１乃至４日間、振盪しつつ保温することによ
り行なうことができる。

【００３９】ＭＬ−２３６Ｂ生産菌からのＲＮＡの抽出
は、通常全ＲＮＡを調製するのに使用される方法であれ
ば特に限定されないが、例えば、グアニジン・チオシア
ネート・ホットフェノール法、グアニジン・チオシアネ
ート−グアニジン・塩酸法等が挙げられる。また、より
純度の高い全ＲＮＡを調製するための市販キットとして
は、例えば、ＲＮｅａｓｙＰｌａｎｔＭｉｎｉＫ
ｉｔ（キアゲン社製）等が挙げられる。さらに、ｍＲＮ
Ａは、全ＲＮＡをオリゴ（ｄＴ）カラムに添加し、該カ
ラムに吸着した画分を回収することにより得ることがで
きる。

【００４０】ＲＮＡのメンブレンへのトランスファー、
プローブの調製、ハイブリダイゼーション及びシグナル
の検出はマニアティスらの方法（Maniatis T., et al.,
Molecular cloning, a laboratory manual, 2nd ed.,
Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor,
N.Y.(1989)記載）により行うことができる。各構造遺
伝子の５’−末端及び３’−末端の解析は、ＲＡＣＥ
（ｒａｐｉｄａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｃ
ＤＮＡｅｎｄｓ）法により行なうことができる。ＲＡ
ＣＥは、ｍＲＮＡを鋳型とし、塩基配列が決定されてい
る領域から塩基配列が決定されていない５’−末端又は
３’−末端領域までを含むｃＤＮＡを、ＲＴ−ＰＣＲの
応用により取得する方法である（Frohman. M. A., et a
l.,Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.,85, 8998(1988)記
載）。

【００４１】ＲＴ−ＰＣＲとはｍＲＮＡを鋳型として、
逆転写酵素（ｒｅｖｅｒｓｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａ
ｓｅ）でｃＤＮＡを合成した後、ＰＣＲを行なう方法
（逆転写ＰＣＲ：ｒｅｖｅｒｓｅｔｒａｎｓｃｒｉｐ
ｔａｔｉｏｎ−ＰＣＲ）のことをいう。

【００４２】５’ＲＡＣＥは以下の方法に従う。ｍＲＮ
Ａを鋳型とし、塩基配列中の公知の部分に基いて設計さ
れたアンチセンス側のオリゴヌクレオチドＤＮＡ（１）
をプライマーとした逆転写酵素反応によりｃＤＮＡ第一
鎖を合成した後、ターミナルデオキシヌクレオチヂルト
ランスフェラーゼにより該ｃＤＮＡ第一鎖の３’−末端
にホモポリメリックな（ｈｏｍｏｐｏｌｙｍｅｒｉｃ：
単一塩基からなる）ヌクレオチド鎖を付加させる。該ｃ
ＤＮＡ第一鎖を鋳型とし且つ該ホモポリメリックな塩基
配列に相補的な塩基配列を含むセンス側のオリゴヌクレ
オチドＤＮＡ、及び、アンチセンス側に存在し且つオリ
ゴヌクレオチドＤＮＡ（１）より３’−側に存在するオ
リゴヌクレオチドＤＮＡ（２）をプライマーとしたＰＣ
Ｒによって、５’−末端領域の二本鎖ｃＤＮＡを増幅さ
せる方法である（Frohman, M. A.,Methods in Enzymo
l., 218, 340(1993)記載）。５’ＲＡＣＥ用のキットが
市販されており、このようなキットとして、例えば、
５’ＲＡＣＥＳｙｓｔｅｍｆｏｒＲａｐｉｄＡｍ
ｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｃＤＮＡｅｎｄｓ，
Ｖｅｒｓｉｏｎ２．０（ギブコ社製）等が好適に使用
される。

【００４３】３’ＲＡＣＥは、ｍＲＮＡの３’−末端に
存在するポリＡ領域を利用する方法である。すなわち、
ｍＲＮＡを鋳型として、オリゴｄ（Ｔ）アダプターをプ
ライマーとした逆転写酵素反応によりｃＤＮＡ第一鎖を
合成した後、該ｃＤＮＡ第一鎖を鋳型として、塩基配列
中の公知の部分に基いて設計されたセンス側のオリゴヌ
クレオチドＤＮＡ（３）、及び、アンチセンス側のオリ
ゴｄ（Ｔ）アダプターをプライマーとしたＰＣＲによっ
て、３’−末端領域の二本鎖ｃＤＮＡを増幅させる方法
である。３’ＲＡＣＥ用のキットが市販されており、こ
のようなキットとして、例えば、Ｒｅａｄｙ−Ｔｏ−Ｇ
ｏＴ−ｐｒｉｍｅｄＦｉｒｓｔ−ＳｔｒａｎｄＫ
ｉｔ（アマシャムファルマシアバイオテク社製）が
好適に使用される。

【００４４】ＲＡＣＥにおける塩基配列中の公知の部分
に基いたプライマーの設計には、上記遺伝子解析ソフト
による解析、ノーザンブロット・ハイブリダイゼーショ
ン法による解析結果が好適に利用できる。上記遺伝子解
析ソフトによる解析、ノーザンブロット・ハイブリダイ
ゼーション法による解析、５’−末端、３’−末端の解
析により、ゲノムＤＮＡ配列上の構造遺伝子の方向、並
びに、構造遺伝子中の転写開始点の位置、翻訳開始コド
ンの位置、翻訳終止コドン及びその位置を推定すること
ができる。これらの情報に基づいて、各構造遺伝子及び
そのｃＤＮＡを取得することが可能である。

【００４５】ＭＬ−２３６Ｂ生合成遺伝子を含む組換え
ＤＮＡベクターの機能発現は、該組換えＤＮＡベクター
で細胞を形質転換し、該形質転換細胞のＭＬ−２３６Ｂ
生産能を測定することにより行なうことができる。機能
発現を行なう細胞としては、上述のＭＬ−２３６Ｂ生産
菌又はＭＬ−２３６Ｂ非生産菌を用いることができる。
ＭＬ−２３６Ｂ非生産菌としては、該ＤＮＡベクターで
形質転換される細胞であれば特に限定されないが、例え
ば、上述のＭＬ−２３６Ｂ生産菌のＭＬ−２３６Ｂ非生
産変異株等が挙げられる。該変異株を形質転換すること
によりＭＬ−２３６Ｂの生産が回復すれば、該組換えＤ
ＮＡベクターが所望の機能を有すると推定することがで
きる。

【００４６】また、ＭＬ−２３６Ｂ生産菌を形質転換し
て、ＭＬ−２３６Ｂの生産性が向上すれば、該組換えＤ
ＮＡベクターが所望の機能を有すると推定することがで
きる。このような組換えＤＮＡベクターとしては、例え
ば、ｐＭＬ４2、ｐＭＬ４５、ｐＭＬ５１のようなＭＬ
−２３６Ｂ生合成遺伝子を複数含む組換えＤＮＡベクタ
ーを挙げることができ、特にＭＬ−２３６Ｂの生合成に
関わる構造遺伝子を全て含むことが好ましい。また、上
述した構造遺伝子をそれぞれ単独で発現する組換えＤＮ
Ａベクターであってもよい。

【００４７】該構造遺伝子に対応するｃＤＮＡの取得法
としては、各構造遺伝子の塩基配列に基づいて設計され
得るプライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲによるクローニン
グ、ＤＮＡプローブを用いたｃＤＮＡライブラリーから
のクローニング等が挙げられる。

【００４８】ＲＴ−ＰＣＲに用いるプライマーは、各構
造遺伝子の塩基配列に基づいて適当なものを設計するこ
とができるが、設計にはプライマー設計用のソフトウエ
アを用いることもできる。プライマー設計用のソフトウ
エアとしては例えば、ＤＮＡＳＩＳ（日立ソフトウェア
エンジニアリング（株）製）を用いることができる。こ
れらの方法で取得できるｃＤＮＡを機能発現させるため
には、完全長のｃＤＮＡを得ることが好ましい。また、
ＲＴ−ＰＣＲにより機能発現し得るｃＤＮＡを取得する
ためには、該ＲＴ−ＰＣＲ産物が本来の位置に翻訳開始
コドンを含み且つ該翻訳開始コドンより開始される翻訳
フレーム中には本来の位置以外に翻訳終止コドンを含ま
ないようにプライマーを設計することが必須である。Ｍ
Ｌ−２３６Ｂ生産微生物体内での機能発現に適したＤＮ
Ａベクター（以下、「発現ベクター」という。）として
は、ＭＬ−２３６Ｂ生産微生物を形質転換することがで
き、且つＭＬ−２３６Ｂ生合成促進ｃＤＮＡの塩基配列
に対応するアミノ酸配列を含むことからなるポリペプチ
ドをＭＬ−２３６Ｂ生産微生物体内で機能発現させるこ
とができ、且つ宿主細胞内で安定に保持され、且つ宿主
細胞内で複製されるのに必要な塩基配列を有しているも
のであれば、特に限定されない。機能発現のための形質
転換法は、宿主細胞に依存して適宜選択される。例えば
好適なＭＬ−２３６Ｂ生産菌であるペニシリウム・シト
リナムの形質転換は、ペニシリウム・シトリナムの胞子
からプロトプラストを調製し、該プロトプラストに組換
えＤＮＡベクターを導入することにより行なうことがで
きる（Nara, F., etal., Curr. Genet. 23, 28(1993)記
載）。

【００４９】プロトプラストの調製は以下の方法によっ
て行なうことができる。ペニシリウム・シトリナムを培
養したスラントからＰＧＡ寒天培地のプレートへ該菌を
接種し、２２乃至２８℃、１０乃至１４日間保温し、該
プレートから胞子を回収し、該胞子１×１０⁷乃至１×
１０⁹個を５０乃至１００ｍｌのＹＰＬ−２０培地（組
成；０．１％(w/v)イーストエキストラクト（Ｄｉｆｃ
ｏ社製）、０．５％(w/v)ポリペプトン（日本製薬
（株）製）、２０％(w/v)ラクトース、ｐＨ５．０）に
接種し、２２乃至２８℃、１８時間乃至２日間保温す
る。該培養物から発芽胞子を回収し、細胞壁分解酵素で
処理し、プロトプラストを得る。細胞壁分解酵素として
は、ペニシリウム・シトリナムの細胞壁を分解するもの
であり且つ該菌に他に有害な作用を及ぼさないものであ
れば特に限定されないが、例えば、ザイモリアーゼ、キ
チナーゼ等が挙げられる。

【００５０】形質転換されたＭＬ−２３６Ｂ生産菌の培
養は、各宿主細胞に適した条件下で行なうことができる
が、好適なＭＬ−２３６Ｂ生産菌であるペニシリウム・
シトリナムの形質転換体の場合は、ＭＬ−２３６Ｂを生
産させる前に、形質転換された該菌のプロトプラストを
適当な条件下で培養することにより予め細胞壁を再生さ
せておく。

【００５１】該細胞壁の再生は、形質転換したペニシリ
ウム・シトリナムのプロトプラストを封入したＶＧＳ中
層寒天培地（組成；Ｖｏｇｅｌ最小培地、２％(w/v)グ
ルコース、１Ｍグルシトール、２％(w/v)寒天）をＶＧ
Ｓ下層寒天培地（組成；Ｖｏｇｅｌ最小培地、２％(w/
v)グルコース、１Ｍグルシトール、２．７％(w/v)寒
天）及びＶＧＳ上層寒天培地（組成；Ｖｏｇｅｌ最小培
地、２％(w/v)グルコース、１Ｍグルシトール、１．５
％(w/v)寒天）で挟み、２２乃至２８℃、７乃至１５日
間保温することにより行なうことができる。得られた菌
株はＰＧＡ培地上で、２２乃至２８℃で保温しつつ継代
培養する。該菌株をＰＧＡ培地で作製したスラントに白
金耳を用いて接種し、２２乃至２８℃、１０乃至１４日
間保温し、０乃至４℃で保存する。

【００５２】上述の通り細胞壁を再生させたペニシリウ
ム・シトリナムの形質転換体を培養したスラントから、
ＭＢＧ３−８培地（組成；７％(w/v)グリセリン、３％
(w/v)グルコース、１％(w/v)大豆粉、１％(w/v)ペプト
ン（極東製薬工業（株）製）、１％(w/v)コーンスチー
プリカー（ホーネンコーポレーション（株）製）、０．
５％(w/v)硝酸ナトリウム、０．１％(w/v)硫酸マグネ
シウム七水和物、ｐＨ６．５）へ該形質転換体を接種
し、２２乃至２８℃、７乃至１２日間、振盪しつつ保温
することにより、ＭＬ−２３６Ｂを効率よく生産するこ
とができる。なお、宿主細胞のペニシリウム・シトリナ
ムについても、全く同様の液体培養によりＭＬ−２３６
Ｂを生産させることができる。

【００５３】ＭＬ−２３６Ｂ生産菌の培養物からのＭＬ
−２３６Ｂの精製は、通常天然物の精製に使用される諸
技法を組み合わせることによりなされる。該技法として
は、特に限定されないが、例えば、遠心分離、濾過によ
る固液分離、アルカリ又は酸処理、有機溶媒による抽
出、転溶、吸着及び分配等の各種クロマトグラフィー、
結晶化等が挙げられる。ＭＬ−２３６Ｂは、ヒドロキシ
酸体とラクトン体の両方の形をとり、相互に変換し、更
に、ヒドロキシ酸体は安定な塩を形成する。このような
物理化学的特質を利用して、ＭＬ−２３６Ｂのヒドロキ
シ酸体（以下、「遊離型ヒドロキシ酸」という。）、Ｍ
Ｌ−２３６Ｂのヒドロキシ酸塩（以下、「ヒドロキシ酸
塩」という。）、又はＭＬ−２３６Ｂのラクトン体（以
下、「ラクトン」という。）を得ることができる。

【００５４】ＭＬ−２３６Ｂ生産菌の培養物から精製し
たＭＬ−２３６Ｂを、加熱下又は常温下でアルカリ加水
分解することにより開環し、ヒドロキシ酸塩に変換し、
該反応溶液を酸性にした後濾過し、濾液を水と混和しな
い有機溶媒で抽出することにより、目的化合物を遊離型
ヒドロキシ酸として得ることができる。水と混和しない
有機溶媒としては、特に限定されるものではないが、例
えば、ヘキサン、ヘプタン等の脂肪族炭化水素類、ベン
ゼン、トルエン等の芳香族炭化水素類、メチレンクロリ
ド、クロロホルム等のハロゲン化炭化水素類、ジエチル
エーテル等のエーテル類、蟻酸エチル、酢酸エチル等の
エステル類、それら２種以上の混合溶媒等が挙げられ
る。

【００５５】また、この遊離型ヒドロキシ酸を、水酸化
ナトリウム等のアルカリ金属塩類の水溶液に転溶するこ
とにより、目的化合物をヒドロキシ酸塩として得ること
ができる。

【００５６】さらに、この遊離型ヒドロキシ酸を、有機
溶媒中で加熱して脱水するか、又は他の方法により閉環
することにより、目的化合物をラクトンとして得ること
ができる。

【００５７】このようにして得ることができる遊離型ヒ
ドロキシ酸、ヒドロキシ酸塩及びラクトンは、カラムク
ロマトグラフィー等により精製、単離することが可能で
ある。

【００５８】カラムクロマトグラフィーの担体として
は、特に限定されるものではないが、例えば、セファデ
ックスＬＨ−２０（アマシャムファルマシアバイ
オテク社製）、ダイヤイオンＨＰ−２０（三菱化学
（株）製）、シリカゲル、逆相系担体等が挙げられ、好
適にはＣ１８系の担体である。

【００５９】ＭＬ−２３６Ｂの定量法としては、通常有
機化合物の定量に用いられる方法であれば特に限定され
ないが、例えば、逆相高速液体クロマトグラフィー（：
以下、「逆相ＨＰＬＣ」という。）法等が挙げられる。
逆相ＨＰＬＣ法による定量は、ＭＬ−２３６Ｂ生産菌の
培養物をアルカリ加水分解し、可溶性画分をＣ１８カラ
ムを用いた逆相ＨＰＬＣに供し、紫外吸収を測定し、該
吸収を定量化することにより行なうことができる。Ｃ１
８カラムとしては、通常の逆相ＨＰＬＣに使用されるＣ
１８カラムであれば特に限定されないが、例えば、ＳＳ
Ｃ−ＯＤＳ−２６２（直径６ｍｍ、長さ１００ｍｍ：セ
ンシュー科学（株）製）等が挙げられる。移動相として
は、通常逆相ＨＰＬＣに使用される溶媒であれば特に限
定されないが、例えば、７５％(v/v)メタノール−０．
１％(v/v)トリエチルアミン−０．１％(v/v)酢酸等が挙
げられる。移動相に流速２ｍｌ／分の７５％(v/v)メタ
ノール−０．１％(v/v)トリエチルアミン−０．１％(v/
v)酢酸を用いてＳＳＣ−ＯＤＳ−２６２カラムにＭＬ−
２３６Ｂを室温で添加すると、約４．０分後に溶出され
る。ＭＬ−２３６Ｂの検出は、ＨＰＬＣ用ＵＶ検出器を
用いて行なうことができ、ＵＶ検出器の吸収波長は、２
２０乃至２８０ｎｍであり、好適には２２０乃至２６０
ｎｍ、より好適には２３６ｎｍである。

【００６０】紫外吸収に基づいて定量化されたＭＬ−２
３６Ｂの量を形質転換していない菌と形質転換した菌で
比較することによりＭＬ−２３６Ｂの生合成に関わる遺
伝子の機能発現を確認することができる。そして、機能
発現が確認された遺伝子を有する所望の組換えＤＮＡベ
クターは、ＭＬ−２３６Ｂの生産性の改善に有用であ
る。

【００６１】

【実施例】以下に実施例を挙げ、本発明をさらに詳細に
説明するが、本発明はこれらに限定されるものではな
い。実施例１．ペニシリウム・シトリナムＳＡＮＫ１３３
８０株のゲノムＤＮＡの調製１）ペニシリウム・シトリナムＳＡＮＫ１３３８０株
の培養ペニシリウム・シトリナムＳＡＮＫ１３３８０株の種
菌の培養はＰＧＡ寒天培地（２０％(w/v)馬鈴薯、１５
％(w/v)グリセロール、２％(w/v)寒天）を用いたスラン
トにて行なった。すなわち、ペニシリウム・シトリナム
ＳＡＮＫ１３３８０株を白金耳により接種し、２６℃
にて１４日間保温した。このスラントは４℃で保存し
た。本培養は、液体通気培養にて行なった。上述のスラ
ント５ｍｍ角の菌体を５０ｍｌのＭＢＧ３−８培地（組
成；７％(w/v)グリセリン、３％(w/v)グルコース、１％
(w/v)大豆粉、１％(w/v)ペプトン（極東製薬工業（株）
製）、１％(w/v)コーンスチープリカー（ホーネンコー
ポレーション（株）製）、０．５％(w/v)硝酸ナトリウ
ム、０．１％(w/v)硫酸マグネシウム七水和物、ｐＨ
６．５）を入れた５００ｍｌ容の三角フラスコに接種
し、２６℃、２１０ｒｐｍの条件下で５日間振盪培養し
た。

【００６２】２）ペニシリウム・シトリナムＳＡＮＫ
１３３８０株の培養物からのゲノムＤＮＡの調製１）の培養物を、室温、１０００×Ｇの条件下で１０分
間遠心分離し、菌体を回収した。湿重量３ｇの菌体を、
ドライアイスで冷却した乳鉢上で粉末になるまで破砕し
た。菌体破砕物を２０ｍｌの６２．５ｍＭＥＤＴＡ・
２Ｎａ（和光純薬（株）製）−５％(w/v)ＳＤＳ−５０
ｍＭＴｒｉｓ（和光純薬（株）製）−塩酸（和光純薬
（株）製）緩衝液（ｐＨ８．０）で満たした遠心管に入
れ、穏やかに混合した後、０℃にて１時間静置した。１
０ｍＭＴｒｉｓ−塩酸−０．１ｍＭＥＤＴＡ・２Ｎ
ａ（ｐＨ８．０：以下「ＴＥ」という。）で飽和した１
０ｍｌのフェノールを添加し、５０℃にて１時間穏やか
に攪拌した。室温、１００００×Ｇの条件下で１０分間
遠心分離した後、１５ｍｌの上層（水相）を別の遠心管
にとり、０．５倍容のＴＥ飽和フェノール及び０．５倍
容のクロロホルム溶液を加え、２分間穏やかに攪拌した
後、室温、１００００×Ｇの条件下で１０分間遠心分離
した（以下、「フェノール・クロロホルム抽出」とい
う。）。１０ｍｌの上層（水相）に１０ｍｌの８Ｍ酢
酸アンモニウム（ｐＨ７．５）及び２５ｍｌの２−プロ
パノール（和光純薬（株）製）を添加し、−８０℃にて
１５分間冷却した後、４℃、１００００×Ｇの条件下で
１０分間遠心分離した。沈澱を５ｍｌのＴＥに溶解させ
た後、２０μｌの１０ｍｇ／ｍｌリボヌクレアーゼＡ
（Ｓｉｇｍａ社製）及び２５０単位のリボヌクレアーゼ
Ｔ１（ＧＩＢＣＯ社製）を添加し、３７℃にて２０分間
保温した。これに２０ｍｌの２−プロパノールを添加
し、穏やかに混合した後、糸状のゲノムＤＮＡをパスツ
ールピペットの先端に巻きつけ、１ｍｌのＴＥに溶解さ
せた。このＤＮＡ溶液に０．１倍容の３Ｍ酢酸ナトリ
ウム（ｐＨ６．５）及び２．５倍容のエタノールを加
え、−８０℃にて１５分冷却した後、４℃、１００００
×Ｇの条件下で５分間遠心分離した（以下、「エタノー
ル沈澱」という。）。得られた沈澱を２００μｌのＴＥ
に溶解し、ゲノムＤＮＡ画分とした。

【００６３】実施例２．ペニシリウム・シトリナムＳ
ＡＮＫ１３３８０株のゲノムＤＮＡライブラリーの作製１）ゲノムＤＮＡ断片の調製実施例１において得られたペニシリウム・シトリナム
ＳＡＮＫ１３３８０株のゲノムＤＮＡ（約５０μｇ）を
含む１００μｌの水溶液に、０．２５単位のＳａｕ３Ａ
Ｉ（宝酒造（株）製）を添加した後、１０、３０、６
０、９０及び１２０秒経過後に２０μｌずつサンプリン
グし、各サンプルに２０μｌずつの０．５ＭＥＤＴＡ
（ｐＨ８．０）を加えて制限酵素反応を停止した。アガ
ロースゲル電気泳動により、得られた部分消化ＤＮＡ断
片を分離し、３０ｋｂ以上の大きさをもつＤＮＡ断片を
含むアガロースゲルを回収した。回収したゲルを細かく
砕き、ウルトラフリーＣ３遠心式ろ過ユニット（日本ミ
リポア（株）製）に入れた。−８０℃にて１５分間冷却
し、ゲルを凍結した後、３７℃にて１０分間保温してゲ
ルを融解した。５０００×Ｇ、５分間遠心分離し、ＤＮ
Ａ抽出液を得た。このＤＮＡ抽出液について、フェノー
ル・クロロホルム抽出及びエタノール沈澱を行ない、得
られた沈澱を少量のＴＥに溶解した。

【００６４】２）ＤＮＡベクターｐＳＡＫｃｏｓ１の
前処理ｐＳＡＫｃｏｓ１（特開２００１−１１２４８７実施例
１記載）を制限酵素ＢａｍＨＩ（宝酒造（株）社製）に
より消化した後、６５℃にて３０分間アルカリフォスフ
ァターゼ（宝酒造（株）製）反応を行った。反応終了液
について、フェノール・クロロホルム抽出及びエタノー
ル沈澱を行ない、得られた沈澱を少量のＴＥに溶解し
た。

【００６５】３）ライゲーション及びｉｎｖｉｔｒｏ
パッケージング上記１）記載のゲノムＤＮＡ断片（２μｇ）及び上記
２）記載の前処理済みｐＳＡＫｃｏｓ１（１μｇ）を混
合し、ＤＮＡｌｉｇａｔｉｏｎｋｉｔＶｅｒ．２
（宝酒造（株）製）を用い、１６℃にて１６時間ライゲ
ーション反応を行なった。反応終了液について、フェノ
ール・クロロホルム抽出及びエタノール沈澱を行ない、
得られた沈澱を５μｌのＴＥに溶解させた。ライゲーシ
ョン生成物溶液を、ＧＩＧＡＰＡＫＩＩＧｏｌｄ
（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）キットを用いたｉｎｖ
ｉｔｒｏパッケージングに供し、組換えＤＮＡベクター
を含む形質転換大腸菌を得た。形質転換大腸菌のコロニ
ーを形成させたプレートに３ｍｌのＬＢ培地を注ぎ、セ
ルスクレーパーを用いてプレート上のコロニーを回収し
た（回収液１という）。さらに３ｍｌのＬＢ培地でプレ
ートを洗浄、回収した（回収液２という。）。回収液１
及び２の混合液にグリセリンを終濃度１８％となるよう
加えたものを大腸菌菌体液と称し、ペニシリウム・シト
リナムＳＡＮＫ１３３８０株のゲノムＤＮＡライブラ
リーとして、−８０℃にて保存した。

【００６６】実施例３．ペニシリウム・シトリナムＳ
ＡＮＫ１３３８０株のゲノムＤＮＡライブラリーのスク
リーニング１）メンブレンの調製ペニシリウム・シトリナムＳＡＮＫ１３３８０株のゲ
ノムＤＮＡライブラリーとして保存した大腸菌菌体液
（実施例２記載）を、ＬＢ寒天培地のプレートに、プレ
ート１枚あたり５０００乃至１００００個のコロニーが
生育するよう希釈して撒いた。このプレートを２６℃に
て１８時間保温した後、４℃にて１時間冷却した。ナイ
ロンメンブレン（Ｈｙｂｏｎｄ^TM−Ｎ＋、アマシャム
ファルマシアバイオテク社製）をプレートにのせ、１分
間接触させた。コロニーを付着させたメンブレンをプレ
ートから注意深く離し、コロニー接触面を上にして、２
００ｍｌの１．５Ｍ塩化ナトリウム−０．５規定水酸化
ナトリウムに７分間、２００ｍｌの１．５Ｍ塩化ナトリ
ウム−０．５ＭＴｒｉｓ-塩酸−１ｍＭＥＤＴＡ（ｐ
Ｈ７．５）に３分間ずつ２回浸した後、４００ｍｌの２
×ＳＳＣで洗浄した。洗浄したメンブレンを３０分間風
乾した。

【００６７】２）ハイブリダイゼーションプローブの調製は、特開２０００−１１２４８７記載の
ＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩで消化し、アガロースゲル
電気泳動後、得られた遺伝子断片ＤＮＡ９．８ｋｂを用
いて行なった。該遺伝子断片（１μｇ）をＤＩＧＤＮ
ＡＬａｂｅｌｌｉｎｇＫｉｔ（ロシュ・ダイアグノ
スティックス社製）で標識し、使用直前に１０分間煮沸
後急冷した。ハイブリダイゼーション液（ＤＩＧイージ
ーハイブ：ロシュ・ダイアグノスティックス社製）に
１）記載のメンブレンを浸し、２０ｒｐｍで振盪しつ
つ、４２℃にて２時間プレハイブリダイゼーションを行
なった後、上述の標識プローブをハイブリダイゼーショ
ン液に加え、マルチシェーカー・オーブンＨＢ（ＴＡＩ
ＴＥＣ社製）を用い、２０ｒｐｍで振盪しつつ４２℃に
て１８時間ハイブリダイゼーションを行なった。ハイブ
リダイゼーションを行なったメンブレンについて、２×
ＳＳＣを用いた室温、２０分間の洗浄を３回、０．１×
ＳＳＣを用いた６８℃、３０分間の洗浄を２回、それぞ
れ行なった。洗浄したメンブレンをＤＩＧＬｕｍｉｎ
ｅｓｃｅｎｔＤｅｔｅｃｔｉｏｎＫｉｔｆｏｒＮ
ｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ（ロシュ・ダイアグノスティ
ックス社製）で処理し、Ｘ線フィルム（ルミフィルム：
ロシュ・ダイアグノスティックス社製）に露光した。現
像は富士メディカルフィルムプロセサーＦＰＭ８００
Ａ：富士写真フィルム社製）を用いて行なった。１）及
び２）記載の操作をスクリーニングという。一回目のス
クリーニングで陽性シグナルが検出されたクローンのコ
ロニー周辺をかきとってＬＢ培地に懸濁した後、適宜希
釈してプレートに撒いて培養し、同様に二回目のスクリ
ーニングを行ない、陽性クローンを純化した。

【００６８】３）組換えＤＮＡベクターの大腸菌からの
回収得られた陽性クローンを、マニアティスら（Maniatis,
T., et al., Molecularcloning, a laboratory manual,
2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spri
ng Harbor, N.Y.(1989)記載）の方法に従って培養し
た。すなわち、２ｍｌのＬＢ培地を含む２４ｍｌ容の試
験管に各コロニーを接種し、３７℃にて１８時間、振盪
培養した。この培養物からの組換えＤＮＡベクターの調
製は、アルカリ法（Maniatis, T.,et al., Molecular c
loning, a laboratory manual, 2nd ed., Cold Spring
Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.(1989)
記載）によった。すなわち、１．５ｍｌの培養液を、室
温、１００００×Ｇの条件下で２分間遠心分離し、沈澱
より菌体を回収した。菌体に１００μｌの５０ｍＭグル
コース−２５ｍＭＴｒｉｓ-塩酸−１０ｍＭＥＤＴＡ
（ｐＨ８．０）を加えて懸濁し、２００μｌの０．２
規定水酸化ナトリウム−１％(w/v)ＳＤＳを加えて穏や
かに攪拌し、溶菌させた。これに１５０μｌの３Ｍ酢
酸カリウム−１１．５％(w/v)氷酢酸を加えてタンパク
質を変成させ、室温、１００００×Ｇの条件下で１０分
間遠心分離し、上清を回収した。上清について、フェノ
ール・クロロホルム抽出及びエタノール沈澱を行ない、
得られた沈澱を４０μｇ／ｍｌのリボヌクレアーゼＡ
（Ｓｉｇｍａ社製）を含有する５０μｌのＴＥに溶解さ
せた。各組換えＤＮＡベクターを制限酵素消化して電気
泳動に供し、電気泳動パターンの異なる組換えＤＮＡベ
クター中の挿入塩基配列を、ＤＮＡシークエンサー（モ
デル３７７：パーキンエルマー・ジャパン社製）を用い
て決定した。本発明において見出された陽性クローンか
ら得られた、組換えＤＮＡベクターのうち、ｐＭＬ４
２、ｐＭＬ４５、ｐＭＬ５１は、平成１３年（２００１
年）９月４日付けで独立行政法人産業技術総合研究所特
許生物寄託センターに国際寄託され、それぞれ受託番号
ＦＥＲＭＢＰ−７７２３、ＦＥＲＭＢＰ−７７２
４、ＦＥＲＭＢＰ−７７２５を付された。

【００６９】実施例４．組換えＤＮＡベクターｐＭＬ４
２、ｐＭＬ４５およびｐＭＬ５１の挿入配列の解析
（１）実施例３で得られたｐＭＬ４２、ｐＭＬ４５およびｐＭ
Ｌ５１を各種制限酵素で消化し、ｐＵＣ１１９（宝酒造
（株）製）に組込むことにより、サブクローニングし
た。得られたクローンの有する挿入配列の塩基配列を、
ＤＮＡシークエンサーモデル３７７（パーキンエルマー
・ジャパン社製）を用いて決定することにより、ｐＭＬ
４２、ｐＭＬ４５、ｐＭＬ５１の全塩基配列を決定し
た。ｐＭＬ４２の挿入配列は全４２７５８塩基であっ
た。ｐＭＬ４５の挿入配列は全３６３０５塩基であっ
た。ｐＭＬ５１の挿入配列は全３６０１５塩基であっ
た。ｐＭＬ４２の挿入塩基配列は、配列表の配列番号１
のヌクレオチド番号１乃至４２７５８に示される。ｐＭ
Ｌ４５の挿入塩基配列は、配列表の配列番号１のヌクレ
オチド番号１１６１４乃至４７９１８に示される。ｐＭ
Ｌ５１の挿入塩基配列は、配列表の配列番号１のヌクレ
オチド番号３６１３５乃至７２１４９に示される。ま
た、特開２０００−１１２４８７に記載のｐＭＬ４８の
挿入塩基配列は、配列表の配列番号１のヌクレオチド番
号２９５８１乃至６３７８３に示される。該挿入配列上
の構造遺伝子の存在について、遺伝子検索プログラムＧ
ＲＡＩＬ（ＡｐoｃｏｍＧＲＡＩＬＴｏｏｌｋｉ
ｔ：ＡＰＯＣＯＭ社製）及び相同性検索プログラムBＬ
ＡＳＴ（Ｇａｐｐｅｄ−ＢＬＡＳＴ（ＢＬＡＳＴ２）：
ＷＩＳＣＯＮＳＩＮＧＣＧｐａｃｋａｇｅｖｅ
ｒ．１０．０に搭載）を用いて解析した。その結果、ｐ
ＭＬ４８中に確認していた６種類の構造遺伝子であるｍ
ｌｃＡ、ｍｌｃＢ、ｍｌｃＣ、ｍｌｃＤ、ｍｌｃＥ、ｍ
ｌｃＲ（特開２０００−１１２４８７記載）に加え、新
たに、１４種類の異なる遺伝子の存在が推定され、それ
ぞれをｍｌｃＦ、ｍｌｃＧ、ｍｌｃＨ、ＯＲＦ１、ＯＲ
Ｆ１１、ＯＲＦ１２、ＯＲＦ１３、ＯＲＦ１４、ＯＲＦ
１５、ＯＲＦ１６、ＯＲＦ１７、ＯＲＦ１８、ＯＲＦ１
９、ＯＲＦ２０と命名した。配列表の配列番号１のヌク
レオチド番号３１０５８乃至４０７３８に逆向きにｍｌ
ｃＡ遺伝子が、４３９４１乃至５２０３５に逆向きにｍ
ｌｃＢ遺伝子が、４１３７５乃至４３０６０にｍｌｃＣ
遺伝子が、５３９００乃至５７４７１にｍｌｃＤ遺伝子
が、５８０５１乃至６０２３８に逆向きにｍｌｃＥ遺伝
子が、２９６７２乃至３０４２７にｍｌｃＦ遺伝子が、
２９２１８乃至２７９５７に逆向きにｍｌｃＧ遺伝子
が、２６０１５乃至２６１５３にｍｌｃＨ遺伝子が、乃
至にｍｌｃＲ遺伝子が、６５１６１乃至６６９５４にｏ
ｒｆ１が、２４１１０乃至２５５５２にｏｒｆ１１が、
２１９０２乃至２３７９０にｏｒｆ１２が、１９６１２
乃至２１５８１に逆向きにｏｒｆ１３が、１８２９０乃
至１９３６０に逆向きにｏｒｆ１４が、１５８７３乃至
１７１４０に逆向きにｏｒｆ１５が１３１４９乃至１４
４１４にｏｒｆ１６が１０２０６乃至１２３０７にｏｒ
ｆ１７が、７３２５乃至９２６８にｏｒｆ１８が、５２
４４乃至６８１５に逆向きにｏｒｆ１９が、１０９９乃
至２３９７に逆向きにｏｒｆ２０がそれぞれ存在すると
推定された。本実施例の結果を図１および表１に記載し
た。なお、図1は制限酵素地図と各構造遺伝子を表す。
図中の矢印は各ｏｒｆの向きを表し、矢印の下の１１乃
至２０の数字はｏｒｆ１１乃至２０を表す。また、図中
の各アルファベットについては、ＢはＢａｍＨＩをＫは
ＫｐｎＩを表す。

【００７０】

【表１】

【００７１】実施例５．構造遺伝子ｍｌｃF、ｍｌｃGお
よびｍｌｃHの発現解析１）ペニシリウム・シトリナムＳＡＮＫ１３３８０の
全ＲＮＡの調製ペニシリウム・シトリナムＳＡＮＫ１３３８０株を培
養したスラント（実施例１記載）より５ｍｍ角の菌体を
１０ｍｌのＭＧＢ３−８培地を入れた１００ｍｌ容の三
角フラスコに接種し、２６℃にて２日乃至３日間、振盪
培養した。培養物からの全ＲＮＡの調製は、グアニジン
・イソチオシアネート法を利用したＲＮｅａｓｙＰｌ
ａｎｔＭｉｎｉＫｉｔ（キアゲン社製）を用いて行
った。すなわち、培養物を、室温、５０００×Ｇの条件
下で１０分間遠心分離して菌体を回収し、湿重量２ｇの
菌体を液体窒素により凍結した後、乳鉢上で粉末になる
まで破砕した。この破砕物をグアニジン・イソチオシア
ネートを含む４ｍｌの菌体溶解バッファー（このキット
に含まれる。）に懸濁した。懸濁液をこのキットに含ま
れるＱＩＡｓｈｒｅｄｄｅｒスピンカラム１０本に４５
０μｌずつ分注し、室温、１０００×Ｇ、１０分間遠心
分離した後、溶出液をそれぞれ回収した：各溶出液に２
２５μｌずつのエタノールを加えた後、このキットに含
まれるＲＮＡミニスピンカラムに添加した。このカラム
をこのキットに含まれる洗浄用緩衝液で洗浄した後、５
０μｌずつのリボヌクレアーゼ・フリー蒸留水で吸着物
を溶出させ、溶出液を全ＲＮＡ画分とした。

【００７２】２）ノーザンブロット・ハイブリダイゼー
ション２０μｇのペニシリウム・シトリナムＳＡＮＫ１３３
８０の全ＲＮＡを含む２．２５μｌの水溶液に、あらか
じめ１２１℃にて２０分間オートクレーブ滅菌しておい
た１μｌの１０×ＭＯＰＳ（２００ｍＭ３−モルフォ
リノプロパンスルホン酸、５０ｍＭ酢酸ナトリウム、
１０ｍＭＥＤＴＡ・２Ｎａ、ｐＨ７．０：同仁化学研
究所（株）製）、１．７５μｌのホルムアルデヒド及び
５μｌのホルムアミドを添加して混合し、ＲＮＡサンプ
ルとした。このＲＮＡサンプルを、６５℃にて１０分間
保温した後、氷水中で急冷し、アガロースゲル電気泳動
に供した。電気泳動のゲルは、１０ｍｌの１０×ＭＯＰ
Ｓ及び１ｇのＡｇａｒｏｓｅＬ０３「ＴＡＫＡＲＡ」
（宝酒造（株）製）を７２ｍｌのピロカルボニック・ア
シッド・ジエチルエステル（Ｓｉｇｍａ社製）処理水に
混合し、加熱してアガロースを溶解させた後冷却させ、
１８ｍｌのホルムアルデヒドを添加することにより作製
した。電気泳動用バッファーは、１×ＭＯＰＳ（１０×
ＭＯＰＳを水で１０倍希釈したもの。）を使用した。ゲ
ル中のＲＮＡを、１０×ＳＳＣ中でナイロンメンブレン
（Ｈｙｂｏｎｄ^TM−Ｎ＋、アマシャムファルマシア
バイオテク社製）へトランスファーした。プローブに
は、ｐＭＬ４５挿入配列を下記表２記載の制限酵素１及
び２で消化することにより得られるＤＮＡ断片（a、b及
びc）を用いた。

【００７３】

【表２】ノーザンブロット・ハイブリダイゼーションのプローブプロ制限制限酵素認識部位の制限制限酵素認識部位のーブ酵素１ヌクレオチド番号＊酵素２ヌクレオチド番号＊ a EcoRI 29810〜29815 EcoRI 30912〜30917 b BglII 27434〜27441 BglII 29772〜29777c SacI 25838〜25843 ＿＿＿＿_SacI＿＿27106〜27111 ＊各ヌクレオチド番号は、配列表の配列番号１に基く。プローブは上記ＤＮＡ断片（ａ、ｂ及びｃ）１μｇをＤ
ＩＧＤＮＡＬａｂｅｌｉｎｇＫｉｔ（ロシュ・ダ
イアグノスティックス社製）で標識し、使用直前に１０
分間煮沸急冷したものを用いた。ハイブリダイゼーショ
ン液（ＤＩＧイージーハイブ：ロシュ・ダイアグノステ
ィックス社製）に上記メンブレンを浸し、２０ｒｐｍで
振盪しつつ、４２℃にて２時間プレハイブリダイゼーシ
ョンを行なった後、上述の標識プローブをハイブリダイ
ゼーション液に添加し、マルチシェーカー・オーブンＨ
Ｂ（タイテック社製）を用い２０ｒｐｍで振盪しつつ４
２℃にて１８時間ハイブリダイゼーションを行なった。
ハイブリダイゼーションを行なったメンブレンについ
て、２×ＳＳＣを用いた室温、２０分間の洗浄を３回、
０．１×ＳＳＣを用いた５５℃、３０分間の洗浄を２
回、それぞれ行なった。洗浄したメンブレンをＤＩＧ
ＬｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔＤｅｔｅｃｔｉｏｎＫｉｔ
ｆｏｒＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ（ロシュ・ダイア
グノスティックス社製）で処理し、Ｘ線フィルム（ルミ
フィルム：ロシュ・ダイアグノスティックス社製）に露
光した。現像は富士メディカルフィルムプロセサーＦＰ
Ｍ８００Ａ（富士写真フィルム社製）を用いて行なっ
た。本実施例の結果を図２に記載した。

【００７４】各シグナルは各プローブの塩基配列と相同
な転写産物の存在を示す。ｐＭＬ４5挿入配列上に存在
が推定される新規の構造遺伝子のうち、ｍｌｃＦ、ｍｌ
ｃＧ、及びｍｌｃＨはペニシリウム・シトリナムＳＡ
ＮＫ１３３８０株内で転写されていることが確認され
た。

【００７５】実施例６．５’ＲＡＣＥによる５’−末
端配列の決定各構造遺伝子の５’−末端領域を含むｃＤＮＡの取得
は、５’ＲＡＣＥＳｙｓｔｅｍｆｏｒＲａｐｉｄ
ＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｃＤＮＡＥｎｄ
ｓ，Ｖｅｒｓｉｏｎ２．０（ＧＩＢＣＯ社製）を用い
て行なった。ｐＭＬ４８の挿入配列上の各構造遺伝子に
おいて、コード領域であり且つ該遺伝子の５’−末端近
傍に位置すると考えられる塩基配列に基いて設計された
アンチセンス側のオリゴヌクレオチドＤＮＡを２種類作
製した。表３に、各構造遺伝子のより３’−側に位置す
る塩基配列に基いて設計されたアンチセンス側のオリゴ
ヌクレオチドＤＮＡ（１）の塩基配列を、表４に、より
５’−側に位置する塩基配列に基いて設計されたアンチ
センス側のオリゴヌクレオチドＤＮＡ（２）の塩基配列
を、それぞれ記載した。

【００７６】

【表３】５’ＲＡＣＥによる５’−末端配列解析に用いるオリゴヌクレオチドＤＮＡ（１）遺伝子配列表の配列番号：塩基配列配列番号１中でのヌクレオチド番号 mlcF 配列番号４２：catttgctgttgatggagc 30076-30094 mlcG 配列番号４３：gacctattgctttgtagcac 28286-28305mlcH 配列番号４４：tctgatcagaacgacgagc ＿＿26887-26905__

【００７７】

【表４】５’ＲＡＣＥによる５’−末端配列解析に用いるオリゴヌクレオチドＤＮＡ（２）遺伝子配列表の配列番号：塩基配列配列番号１中での＿ヌクレオチド番号 mlcF 配列番号４５：tcagagaaggccactatgcc 30032-30051 mlcG 配列番号４６：cttctgcgccattcttcttgg 28520-28540mlcH 配列番号４７：agatttgcaccatagatccac ____26736-26756

【００７８】オリゴヌクレオチドＤＮＡ（１）をプライ
マーとし、ペニシリウム・シトリナムＳＡＮＫ１３３８
０株の全ＲＮＡを鋳型とした逆転写反応によりｃＤＮＡ
第一鎖を合成した。すなわち、１μｇの全ＲＮＡ、２．
５ｐｍｏｌのオリゴヌクレオチドＤＮＡ（１）、１μｌ
のＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴＴＭＩＩｒｅｖｅｒｓ
ｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（このキットに含まれ
る。）を含む２４μｌの反応液を、１６℃にて１時間保
温した後、生成物をこのキットに含まれるＧＬＡＳＳＭ
ＡＸスピンカートリッジに添加してｃＤＮＡ第一鎖を精
製した。ｃＤＮＡ第一鎖の３’−末端に、このキットに
含まれるｔｅｒｍｉｎａｌｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃ
ｌｅｏｔｉｄｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅによりポリ
Ｃ鎖を付加させた。３’−末端にポリＣ鎖の付加したｃ
ＤＮＡ第一鎖、４０ｐｍｏｌのオリゴヌクレオチドＤＮ
Ａ（２）及び４０ｐｍｏｌのＡｂｒｉｇｅｄＡｎｃｈ
ｏｒＰｒｉｍｅｒ（このキットに含まれる）を含む５
０μｌの反応液を、９４℃にて２分間保温し、続いて、
９４℃にて３０秒、５５℃にて３０秒、及び、７２℃に
て２分間を１サイクルとする反応を３５回行なった後、
７２℃にて５分間、４℃にて１８時間保温した。得られ
た産物をアガロースゲル電気泳動に供した後、ゲルから
ＤＮＡを回収し、フェノール・クロロホルム抽出及びエ
タノール沈澱により産物を精製し、エタノール沈殿を行
ない、得られた沈殿を少量のＴＥに溶解した。ここで得
られたＤＮＡ断片、ＴＡクローニング・システムｐＣＲ
２．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて、このキ
ットに含まれるプラスミドｐＣＲ２．１にライゲーショ
ンし、形質転換株を得た。得られた形質転換株より常法
により、プラスミドを抽出し５’−末端を含むｃＤＮＡ
断片の塩基配列を決定し、転写開始点を決定した。表５
に、各構造遺伝子の転写開始点の存在する配列番号を記
載した。

【００７９】

【表５】

【００８０】実施例７．３’ＲＡＣＥによる３’−末
端配列の決定各構造遺伝子の３’−末端領域を含むｃＤＮＡの取得
は、ＲｅａｄｙＴｏＧｏ：Ｔ−ＰｒｉｍｅｄＦｉ
ｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄｋｉｔ（ファルマシア社製）を
用いて行なった。ｐＭＬ４８の挿入塩基配列上の各構造
遺伝子において、コード領域であり、構造遺伝子の３’
−末端近傍に位置すると考えられるセンス側のオリゴヌ
クレオチドＤＮＡ（３）を１種類ずつ作製した。表６に
各構造遺伝子について作製したオリゴヌクレオチドＤＮ
Ａ（３）の塩基配列を表示した。

【００８１】

【表６】３’ＲＡＣＥによる３’−末端配列解析に用いるオリゴヌクレオチドＤＮＡ（３）＿遺伝子配列表の配列番号：塩基配列配列番号１中でのヌクレオチド番号＿ mlcF 配列番号２３：atgagtccagcgaggattac 29672-29691 mlcG 配列番号２４：tatgaagctgctcggtatgc 28759-28778mlcH ＿＿＿＿配列番号２５：gcgatgaatgccaaagactac 26273-26293

【００８２】オリゴヌクレオチドＤＮＡ（３）をプライ
マーとし、ペニシリウム・シトリナムＳＡＮＫ１３３８
０株の全ＲＮＡ（１μｇ）を鋳型とした逆転写反応によ
りｃＤＮＡ第一鎖を合成した。ｃＤＮＡ第一鎖、４０ｐ
ｍｏｌのオリゴヌクレオチドＤＮＡ（３）及びＮｏｔＩ
−ｄ（Ｔ）１８プライマー（このキットに含まれる。）
を含む１００μｌの反応液を、９４℃にて２分間保温
し、続いて、９４℃にて３０秒、５５℃にて３０秒、及
び、７２℃にて２分間を１サイクルとする反応を３５回
行なった後、７２℃にて５分間、４℃にて１８時間保温
した。得られた産物をアガロースゲル電気泳動に供した
後、ゲルからＤＮＡを回収し、フェノール・クロロホル
ム抽出及びエタノール沈澱により産物を精製し、実施例
６記載の方法に準じてｐＣＲ２．１を用いてクローニン
グした。得られた形質転換体からプラスミドを抽出し、
ｃＤＮＡの３’−側断片の塩基配列を決定した。各構造
遺伝子の転写終結点を表７に記載した。

【００８３】

【表７】

【００８４】以上の通り、各構造遺伝子の存在、その方
向及びその位置が明らかとなった。これらの情報に基い
て、各構造遺伝子の転写産物及び翻訳産物を取得するこ
とが可能である。

【００８５】実施例８．構造遺伝子ｍｌｃＡ、ｍｌｃ
Ｂ、ｍｌｃＣ、ｍｌｃＤ、ｍｌｃＥ、ｍｌｃＦ、ｍｌｃ
Ｇ、ｍｌｃＨ及びｍｌｃＲ、ｏｒｆ１、ｏｒｆ１１、ｏ
ｒｆ１２、ｏｒｆ１３、ｏｒｆ１４、ｏｒｆ１５、ｏｒ
ｆ１６、ｏｒｆ１７、ｏｒｆ１８、ｏｒｆ１９及びｏｒ
ｆ２０に対応する各ｃＤＮＡ配列の決定１）構造遺伝子ｍｌｃＡに対応するｃＤＮＡ配列の決定ＴＡＫＡＲＡＬＡＰＣＲｋｉｔｖｅｒ１．１
（宝酒造（株）製）を用いてｃＤＮＡ第１鎖を合成し
た。所望のｃＤＮＡの全長又はその部分領域を増幅する
ために配列表１中のゲノムＤＮＡ塩基配列を基に多種の
プライマーを設計し、該ｃＤＮＡ第１鎖を鋳型として以
下の条件によるＰＣＲを行った。片側５０ｐｍｏｌずつ
のプライマーを添加し、５０μｌの反応溶液中で、Ｔａ
ｋａｒａＴｈｅｒｍａｌｃｙｃｌｅｒＭＰ−３０
００を用い、９４℃にて３０秒、６２℃にて３０秒、７
２℃にて５分からなる反応サイクルを３０回反復した。
ＰＣＲ産物は実施例６記載の方法に従ってそれぞれプラ
スミドｐＣＲ２．１へ挿入し、大腸菌を形質転換した。
形質転換大腸菌から得られた組換プラスミドの各挿入配
列のヌクレオチド配列と構造遺伝子ｍｌｃＡのヌクレオ
チド配列とを比較することにより、エキソンとイントロ
ンの構造を決定した。このようにして、構造遺伝子ｍｌ
ｃＡに対応するｃＤＮＡの配列が決定され（配列表の配
列番号２）、該ｃＤＮＡによりコードされるポリペプチ
ドのアミノ酸配列が推定された（配列表の配列番号
３）。また、該ポリペプチドの機能が、アミノ酸配列の
相同性検索により推定された。構造遺伝子ｍｌｃＡによ
りコードされるポリペプチドと最も高い相同性を示すア
ミノ酸配列を有する公知物質はロバスタチン生合成遺伝
子クラスター上に存在するＬＮＫＳ（ｌｏｖＥ）であ
り、６０％同一であった。

【００８６】２）構造遺伝子ｍｌｃＢに対応するｃＤＮ
Ａ配列の決定１）と同様に、構造遺伝子ｍｌｃＢに対応するｃＤＮＡ
のヌクレオチド配列が決定され（配列表の配列番号
４）、該ｃＤＮＡによりコードされるポリペプチドのア
ミノ酸配列が推定された（配列表の配列番号５）。ま
た、該ポリペプチドの機能が、アミノ酸配列の相同性検
索により推定された。構造遺伝子ｍｌｃＢによりコード
されるポリペプチドと最も高い相同性を示すアミノ酸配
列を有する公知物質はロバスタチン生合成遺伝子クラス
ター上に存在するＬＤＫＳ（ｌｏｖＦ）であり、６１％
同一であった。

【００８７】３）構造遺伝子ｍｌｃＣに対応するｃＤＮ
Ａ配列の決定１）と同様に、構造遺伝子ｍｌｃＣに対応するｃＤＮＡ
のヌクレオチド配列が決定され（配列表の配列番号
６）、該ｃＤＮＡによりコードされるポリペプチドのア
ミノ酸配列が推定された（配列表の配列番号７）。ま
た、該ポリペプチドの機能が、アミノ酸配列の相同性検
索により推定された。構造遺伝子ｍｌｃＣによりコード
されるポリペプチドと最も高い相同性を示すアミノ酸配
列を有する公知物質はロバスタチン生合成遺伝子クラス
ター上に存在するｌｏｖＡであり、７２％同一であっ
た。

【００８８】４）構造遺伝子ｍｌｃＤに対応するｃＤＮ
Ａ配列の決定１）と同様に、構造遺伝子ｍｌｃＤに対応するｃＤＮＡ
のヌクレオチド配列が決定され（配列表の配列番号
８）、該ｃＤＮＡによりコードされるポリペプチドのア
ミノ酸配列が推定された（配列表の配列番号９）。ま
た、該ポリペプチドの機能が、アミノ酸配列の相同性検
索により推定された。構造遺伝子ｍｌｃＤによりコード
されるポリペプチドと最も高い相同性を示すアミノ酸配
列を有する公知物質はロバスタチン生合成遺伝子クラス
ター上に存在するＯＲＦ８であり、６３％同一であっ
た。

【００８９】５）構造遺伝子ｍｌｃＥに対応するｃＤＮ
Ａ配列の決定１）と同様に、構造遺伝子ｍｌｃEに対応するｃＤＮＡ
のヌクレオチド配列が決定され（配列表の配列番号１
０）、該ｃＤＮＡによりコードされるポリペプチドのア
ミノ酸配列が推定された（配列表の配列番号１１）。ま
た、該ポリペプチドの機能が、アミノ酸配列の相同性検
索により推定された。構造遺伝子ｍｌｃＥによりコード
されるポリペプチドと最も高い相同性を示すアミノ酸配
列を有する公知物質はロバスタチン生合成遺伝子クラス
ター上に存在するＯＲＦ１０であり、７０％同一であっ
た。

【００９０】６）構造遺伝子ｍｌｃＦに対応するｃＤＮ
Ａ配列の決定１）と同様に、構造遺伝子ｍｌｃＦに対応するｃＤＮＡ
のヌクレオチド配列が決定され（配列表の配列番号１
２）、該ｃＤＮＡによりコードされるポリペプチドのア
ミノ酸配列が推定された（配列表の配列番号１３）。ま
た、該ポリペプチドの機能が、アミノ酸配列の相同性検
索により推定された。構造遺伝子ｍｌｃＦによりコード
されるポリペプチドと最も高い相同性を示すアミノ酸配
列を有する公知物質はロバスタチン生合成遺伝子クラス
ター上に存在するＯＲＦ５であり、５７％同一であっ
た。

【００９１】７）構造遺伝子ｍｌｃＧに対応するｃＤＮ
Ａ配列の決定１）と同様に、構造遺伝子ｍｌｃＧに対応するｃＤＮＡ
のヌクレオチド配列が決定され（配列表の配列番号１
４）、該ｃＤＮＡによりコードされるポリペプチドのア
ミノ酸配列が推定された（配列表の配列番号１５）。ま
た、該ポリペプチドの機能が、アミノ酸配列の相同性検
索により推定された。構造遺伝子ｍｌｃＧによりコード
されるポリペプチドと最も高い相同性を示すアミノ酸配
列を有する公知物質はロバスタチン生合成遺伝子クラス
ター上に存在するｌｏｖＣであり、７０％同一であっ
た。

【００９２】８）構造遺伝子ｍｌｃＨに対応するｃＤＮ
Ａ配列の決定１）と同様に、構造遺伝子ｍｌｃＨに対応するｃＤＮＡ
のヌクレオチド配列が決定され（配列表の配列番号１
６）、該ｃＤＮＡによりコードされるポリペプチドのア
ミノ酸配列が推定された（配列表の配列番号１７）。ま
た、該ポリペプチドの機能が、アミノ酸配列の相同性検
索により推定された。構造遺伝子ｍｌｃＨによりコード
されるポリペプチドと最も高い相同性を示すアミノ酸配
列を有する公知物質はロバスタチン生合成遺伝子クラス
ター上に存在するｌｏｖＤであり、７５％同一であっ
た。

【００９３】９）構造遺伝子ｍｌｃＲに対応するｃＤＮ
Ａ配列の決定１）と同様に、構造遺伝子ｍｌｃＲに対応するｃＤＮＡ
のヌクレオチド配列が決定され（配列表の配列番号１
８）、該ｃＤＮＡによりコードされるポリペプチドのア
ミノ酸配列が推定された（配列表の配列番号１９）。ま
た、該ポリペプチドの機能が、アミノ酸配列の相同性検
索により推定された。構造遺伝子ｍｌｃＲによりコード
されるポリペプチドと最も高い相同性を示すアミノ酸配
列を有する公知物質はロバスタチン生合成遺伝子クラス
ター上に存在するｌｏｖＥであり、３４％同一であっ
た。

【００９４】１０）ｏｒｆ１に対応するｃＤＮＡ配列の
決定１）と同様に、ｏｒｆ１に対応するｃＤＮＡのヌクレオ
チド配列が決定され（配列表の配列番号２０）、該ｃＤ
ＮＡによりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列が
推定された（配列表の配列番号２１）。

【００９５】１１）ｏｒｆ１１に対応するｃＤＮＡ配列
の決定１）と同様に、ｏｒｆ１１に対応するｃＤＮＡのヌクレ
オチド配列が決定され（配列表の配列番号２２）、該ｃ
ＤＮＡによりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列
が推定された（配列表の配列番号２３）。

【００９６】１２）ｏｒｆ１２に対応するｃＤＮＡ配列
の決定１）と同様に、ｏｒｆ１２に対応するｃＤＮＡのヌクレ
オチド配列が決定され（配列表の配列番号２４）、該ｃ
ＤＮＡによりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列
が推定された（配列表の配列番号２５）。

【００９７】１３）ｏｒｆ１３に対応するｃＤＮＡ配列
の決定１）と同様に、ｏｒｆ１３に対応するｃＤＮＡのヌクレ
オチド配列が決定され（配列表の配列番号２６）、該ｃ
ＤＮＡによりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列
が推定された（配列表の配列番号２７）。

【００９８】１４）ｏｒｆ１４に対応するｃＤＮＡ配列
の決定１）と同様に、ｏｒｆ１４に対応するｃＤＮＡのヌクレ
オチド配列が決定され（配列表の配列番号２８）、該ｃ
ＤＮＡによりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列
が推定された（配列表の配列番号２９）。

【００９９】１５）ｏｒｆ１５に対応するｃＤＮＡ配列
の決定１）と同様に、ｏｒｆ１５に対応するｃＤＮＡのヌクレ
オチド配列が決定され（配列表の配列番号３０）、該ｃ
ＤＮＡによりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列
が推定された（配列表の配列番号３１）。

【０１００】１６）ｏｒｆ１６に対応するｃＤＮＡ配列
の決定１）と同様に、ｏｒｆ１６に対応するｃＤＮＡのヌクレ
オチド配列が決定され（配列表の配列番号３２）、該ｃ
ＤＮＡによりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列
が推定された（配列表の配列番号３３）。

【０１０１】１７）ｏｒｆ１７に対応するｃＤＮＡ配列
の決定１）と同様に、ｏｒｆ１７に対応するｃＤＮＡのヌクレ
オチド配列が決定され（配列表の配列番号３４）、該ｃ
ＤＮＡによりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列
が推定された（配列表の配列番号３５）。

【０１０２】１８）ｏｒｆ１８に対応するｃＤＮＡ配列
の決定１）と同様に、ｏｒｆ１８に対応するｃＤＮＡのヌクレ
オチド配列が決定され（配列表の配列番号３６）、該ｃ
ＤＮＡによりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列
が推定された（配列表の配列番号３７）。

【０１０３】１９）ｏｒｆ１９に対応するｃＤＮＡ配列
の決定１）と同様に、ｏｒｆ１９に対応するｃＤＮＡのヌクレ
オチド配列が決定され（配列表の配列番号３８）、該ｃ
ＤＮＡによりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列
が推定された（配列表の配列番号３９）。

【０１０４】２０）ｏｒｆ２０に対応するｃＤＮＡ配列
の決定１）と同様に、ｏｒｆ２０に対応するｃＤＮＡのヌクレ
オチド配列が決定され（配列表の配列番号４０）、該ｃ
ＤＮＡによりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列
が推定された（配列表の配列番号４１）。実施例９．ｐＭＬ４５組換えＤＮＡベクターによる形質
転換ペニシリウム・シトリナムの形質転換は、ナラらの方法
（Nara, F., et al., Curr. Genet. 23, 28(1993)記
載）に従った。

【０１０５】１）プロトプラストの調製ペニシリウム・シトリナムＳＡＮＫ１３３８０株を培
養したスラントより、白金耳を用いてＰＧＡ寒天培地に
接種し、２６℃にて１４日間保温した。該培養物よりペ
ニシリウム・シトリナムＳＡＮＫ１３３８０株の胞子
を回収し、１×１０⁸個の胞子を８０ｍｌのＹＰＬ−２
０培地に接種し、２６℃にて１日間保温した。胞子の発
芽を顕微鏡観察により確認した後、発芽胞子を、室温、
５０００×Ｇの条件下で１０分間遠心分離して胞子を沈
澱として回収した。胞子を滅菌水で３回洗浄した後、プ
ロトプラスト化を行なった。すなわち、２００ｍｇのザ
イモリアーゼ２０Ｔ（生化学工業（株）製）及び１００
ｍｇのキチナーゼ（Ｓｉｇｍａ社製）を１０ｍｌの０．
５５Ｍ塩化マグネシウムに溶解し、室温、５０００×
Ｇの条件下で１０分間遠心分離して得られた上清を酵素
液とし、２０ｍｌの酵素液及び湿重量０．５ｇの発芽胞
子を１００ｍｌ容三角フラスコに入れ、３０℃にて６０
分間穏やかに振盪し、発芽胞子がプロトプラスト化した
ことを顕微鏡観察により確認した後、反応液を３Ｇ−２
ガラスフィルター（ＨＡＲＩＯ社製）で濾過した。該濾
液を、室温、１０００×Ｇの条件下で１０分間遠心分離
し、プロトプラストを沈澱として回収した。

【０１０６】２）形質転換１）で得られたプロトプラストを３０ｍｌの０．５５Ｍ
塩化マグネシウム溶液で２回、３０ｍｌの０．５５Ｍ
塩化マグネシウム−５０ｍＭ塩化カルシウム−１０ｍ
Ｍ３−モルフォリノプロパンスルホン酸（ｐＨ６．
３：以下、「ＭＣＭ溶液」という。）で１回それぞれ洗
浄し、１００μｌの４％(w/v)ポリエチレングリコール
８０００−１０ｍＭ３−モルフォリノプロパンスルホ
ン酸−０．００２５％(w/v)ヘパリン（Ｓｉｇｍａ社
製）−５０ｍＭ塩化マグネシウム（ｐＨ６．３：以
下、「形質転換用溶液」という。）に懸濁した。約５×
１０⁷個のプロトプラストを含む９６μｌの形質転換溶
液及び１２０μｇのｐＭＬ４５ＤＮＡを含む１０μｌの
ＴＥを混合し、氷上で３０分間静置した。これに１．２
ｍｌの２０％(w/v)ポリエチレングリコール−５０ｍＭ
塩化マグネシウム−１０ｍＭ３−モルフォリノプロパン
スルホン酸（ｐＨ６．３）を加えて穏やかにピペッティ
ングし、室温、２０分間静置した。これに１０ｍｌのＭ
ＣＭ溶液を加えて穏やかに混合し、室温、１０００×Ｇ
の条件下で１０分間遠心分離した。沈澱より形質転換プ
ロトプラストを回収した。

【０１０７】３）形質転換プロトプラストにおける細胞
壁の再生２）で得られた形質転換プロトプラストを５ｍｌの液状
のＶＧＳ中層寒天培地に懸濁し、固化した１０ｍｌのＶ
ＧＳ下層寒天培地プレートに重層した。該プレートを、
２６℃にて１日間培養した後、プレート１枚につき５ｍ
ｇのハイグロマイシンＢ（ＨｙｇｒｏｍｙｃｉｎＢ：
Ｓｉｇｍａ社製）を含む１０ｍｌの液状のＶＧＳ上層寒
天培地を重層した（ハイグロマイシンＢの終濃度は２０
０μｇ／ｍｌ）。２６℃にて１４日間保温して得られた
菌株を、２００μｇ／ｍｌのハイグロマイシンＢを含有
するＰＧＡ寒天培地上で継代培養した後、ＰＧＡ寒天培
地で作製したスラントに植え継ぎ、２６℃にて１４日間
保温した。これを形質転換株という。該スラントは４℃
で保存した。

【０１０８】実施例１０．ペニシリウム・シトリナムの
形質転換ペニシリウム・シトリナムの形質転換は、ナラらの方法
（Nara, F., et al., Curr. Genet. 23, 28 (1993)記
載）に従った。１）構造遺伝子ｍｌｃＦ、ｍｌｃＧ及びｍｌｃＨを含む
遺伝子断片の取得ｐＭＬ４５ 5μgを２００μｌの反応溶液中で、３７
℃、２時間、制限酵素ＭｌｕＩ、ＫｐｎＩ（ともに宝酒
造（株）製）で消化した。制限酵素処理後に、１％アガ
ロースゲルにて、電気泳動を行ない、ｍｌｃＦ、ｍｌｃ
Ｇ及びｍｌｃＨを含む目的とする９．６ｋｂの遺伝子断
片をアガロースゲルより回収した。ＤＮＡＢｌｕｎｔ
ｉｎｇＫｉｔ（宝酒造（株）製）を用い、該遺伝子断
片の末端を平滑化し、制限酵素ＳｍａＩ（宝酒造（株）
製）にて、３７℃で、1時間反応後、６５℃、３０分
間、アルカリフォスファターゼ処理を行なった、染色体
組込型シャトルベクターｐＰＴＲＩＤＮＡ（宝酒造
（株）製）のＳｍａＩ部位にＤＮＡｌｉｇａｔｉｏｎ
ｋｉｔＶｅｒ．２（宝酒造（株）製）を用いて連結
し、大腸菌のコンピーテント・セルＪＭ１０９株（宝酒
造（株）製）を形質転換した。その結果、組換えＤＮＡ
ベクターで形質転換された大腸菌株が得られた。形質転
換大腸菌より抽出したプラスミドをｐＦＧＨ９６と命名
した。

【０１０９】２）プロトプラストの調製ペニシリウム・シトリナムＳＡＮＫ１３３８０株を培
養したスラントより、白金耳を用いてＰＧＡ寒天培地に
接種し、２６℃にて１４日間保温した。該培養物よりペ
ニシリウム・シトリナムＳＡＮＫ１３３８０株の胞子
を回収し、１×１０⁸個の胞子を８０ｍｌのＹＰＬ−２
０培地に接種し、２６℃にて１日間保温した。胞子の発
芽を顕微鏡観察により確認した後、発芽胞子を、室温、
５０００×Ｇの条件下で１０分間遠心分離して胞子を沈
澱として回収した。胞子を滅菌水で３回洗浄した後、プ
ロトプラスト化を行なった。すなわち、２００ｍｇのザ
イモリアーゼ２０Ｔ（生化学工業（株）製）及び１００
ｍｇのキチナーゼ（Ｓｉｇｍａ社製）を１０ｍｌの０．
５５Ｍ塩化マグネシウムに溶解し、室温、５０００×
Ｇの条件下で１０分間遠心分離して得られた上清を酵素
液とし、２０ｍｌの酵素液及び湿重量０．５ｇの発芽胞
子を１００ｍｌ容三角フラスコに入れ、３０℃にて６０
分間穏やかに振盪し、発芽胞子がプロトプラスト化した
ことを顕微鏡観察により確認した後、反応液を３Ｇ−２
ガラスフィルター（ＨＡＲＩＯ社製）で濾過した。該濾
液を、室温、１０００×Ｇの条件下で１０分間遠心分離
し、プロトプラストを沈澱として回収した。

【０１１０】３）ｐＭＬ４８による形質転換２）で得られたプロトプラストを３０ｍｌの０．５５Ｍ
塩化マグネシウム溶液で２回、３０ｍｌの０．５５Ｍ
塩化マグネシウム−５０ｍＭ塩化カルシウム−１０
ｍＭ３−モルフォリノプロパンスルホン酸（ｐＨ６．
３：以下、「ＭＣＭ溶液」という。）で１回それぞれ洗
浄し、１００μｌの４％(w/v)ポリエチレングリコール
８０００−１０ｍＭ３−モルフォリノプロパンスルホ
ン酸−０．００２５％(w/v)ヘパリン（Ｓｉｇｍａ社
製）−５０ｍＭ塩化マグネシウム（ｐＨ６．３：以
下、「形質転換用溶液」という。）に懸濁した。約５×
１０⁷個のプロトプラストを含む９６μｌの形質転換溶
液及び１２０μｇのｐＭＬ４８ＤＮＡを含む１０μｌの
ＴＥを混合し、氷上で３０分間静置した。これに１．２
ｍｌの２０％(w/v)ポリエチレングリコール−５０ｍＭ
塩化マグネシウム−１０ｍＭ３−モルフォリノプロ
パンスルホン酸（ｐＨ６．３）を加えて穏やかにピペッ
ティングし、室温、２０分間静置した。これに１０ｍｌ
のＭＣＭ溶液を加えて穏やかに混合し、室温、１０００
×Ｇの条件下で１０分間遠心分離した。沈澱より形質転
換プロトプラストを回収した。

【０１１１】４）形質転換プロトプラストにおける細胞
壁の再生３）で得られた形質転換プロトプラストを５ｍｌの液状
のＶＧＳ中層寒天培地に懸濁し、固化した１０ｍｌのＶ
ＧＳ下層寒天培地プレートに重層した。該プレートを、
２６℃にて１日間培養した後、プレート１枚につき５ｍ
ｇのピリチアミン（宝酒造（株）製）を含む１０ｍｌの
液状のＶＧＳ上層寒天培地を重層した（ピリチアミンの
終濃度は０．１μｇ／ｍｌ）。２６℃にて１４日間保温
して得られた菌株を、０．１μｇ／ｍｌのピリチアミン
を含有するＰＧＡ寒天培地上で継代培養した後、ＰＧＡ
寒天培地で作製したスラントに植え継ぎ、２６℃にて１
４日間保温した。これを形質転換株ＭＬ−４８という。
該スラントは４℃で保存した。

【０１１２】５）ｐＦＧＨ９６による形質転換１）で得られたプラスミドｐＦＧＨ９６を用いて４）で
得られた形質転換株ＭＬ−４８を形質転換した。形質転
換株ＭＬ−４８のプロトプラスト化、形質転換は、上記
２）、３）と同様に行なった。形質転換プロトプラスト
の再生は、ハイグロマイシンBの代りに、０．１μｇ／
ｍｌのピリチアミン（宝酒造（株）製）を用いたことを
除いては４）と同様に行なった。その結果、形質転換株
ＭＬ４８−ＦＧＨを得た。形質転換株ＭＬ４８−ＦＧＨ
はペニシリウム・シトリナムＳＡＮＫ１３３８０株に
比べＭＬ−２３６Ｂの生産能が改善する。

【０１１３】

【発明の効果】本発明においてＭＬ−２３６Ｂ生産菌よ
り得られたＤＮＡは、該生産菌内に導入されることによ
り該生産菌のＭＬ−２３６Ｂ生産能を改善しうる。ま
た、該ＤＮＡ上には、２０の構造遺伝子の存在が示唆さ
れ、その方向及びその位置が明らかとなった。これらの
うち少なくとも９つの構造遺伝子はそれぞれＭＬ−２３
６Ｂの生産へ関与しており、本発明により、それぞれの
構造遺伝子に対応するｃＤＮＡを取得することが可能に
なる。

【図面の簡単な説明】

【図１】ｐＭＬ４２、ｐＭＬ４5、ｐＭＬ４8およびｐＭ
Ｌ５１の位置と構造遺伝子の解析。

【図２】ｍｌｃＦ、ｍｌｃＧおよびｍｌｃＨ遺伝子のノ
ーザンブロット解析

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> SANKYO CO., LTD. <120> DNAs related to the biosynthesis of ML-236B <130> 2001159SU <140> <141> <160> 50 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 72149 <212> DNA <213> Penicillium citrinum <400> 1 gatctcagat aacagtcgcc cttcatgggt cacccatctt aacgggttcc aaaatttaat 60 tcggacacga aaagaacgcc ccggtcgctc atgtcacagt caagatctgg ccagtttctt 120 caatcgttac ttcgccttcc acttagttct agcccgcact gcatttcggg tcacccctcc 180 ctcatctcat atatcgcctc ttctgccgga cagtatactg gaaaaatcag acacgattga 240 tccgtacatg ggattgagcc ctgctctctt attgatgatc gatcaagtag cagaattagc 300 atgggctcgg gaggatggca acataaaaat caaccgtaaa gatgctcatc aactcaagac 360 ggacctcgat agccttcaac aaaagatacc cacagaaaat atcgatccta atatggagtg 420 tgctgcaatc gcagaagcga acaggctcgg ggcccttctt cttctccacg agatctgttc 480 gagcaaagaa cctattaatc gctctggtat cccgacagtg gaatctgagg agaagaatgt 540 ttatgtcgaa cggatattgg cattgatgtt ggaaaagaag gtaaatatga tgcgtactgc 600 agttacgcct ttatggcctc tcttcctggc agggtgctgt gctcgcaggg aagaggagag 660 ggtcactgta ttacagttgt ttaaagatct ggagggtatt cgtcgatttg gtgtatgtat 720 attcttctat ctatttccct gttggttgac taatgactcg ttgttcctca gaacattacc 780 cctgcgattg aagttgtgga aatggtctgg cgccagcggg atctgtcggt acaagatgaa 840 agaagactcc agaaaaggct cagtgcacag cggcagaaag attccttgca agaaacccgg 900 ttctcgtggg agcatgccat ggtcatgttg ggcgggtgga agctcagctt gacttgagct 960 tctacgtggt aataaaggct tttgtttatg ttctcttgta tatattctag gaagattatc 1020 tcaatttgta tgaccagaag ttaaactgtg tgctaattat tcaacctcat tcaatctcgc 1080 acctcttatc tggacaaatc atagtttaga agcatggctt ctttcacgta tctgtctacc 1140 cttccaccct gtaaggtcgc tcaactccat ttccggatcc aaatgcgcta gattcttcgc 1200 agtactcttc tgcccagccc tccattgcca ttgactgacg atctctgggt ccagagtccc 1260 ctcaagcaaa tccgcgacat attttccaac gacaggaagg aacttgaacc catgtgctga 1320 tccgccggtt gccaggaaga gacttttgtg agcaggatga ggggtgacaa ggaaatgccg 1380 atcagccgta tcagcatccc agcacagccg tgtatagcag aagggtctgt ctgcaagttc 1440 ggggagcaca cgtcgcaagt tccggcgcat ttgggcttcg atctcaagag ggaggccatc 1500 ggtgggtgcc 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Leu Ala Gly Val Glu Leu Pro Tyr Thr Gly Cys Leu Ala Arg Asn 865 870 875 880 gtt gac gat gtg gac gct ttt gct gga ggt ctg gga tac att tgg gag 2688 Val Asp Asp Val Asp Ala Phe Ala Gly Gly Leu Gly Tyr Ile Trp Glu 885 890 895 cgt ttc gga gtt cgg agt atc gac gcc gag ggc ttc gta caa caa gtc 2736 Arg Phe Gly Val Arg Ser Ile Asp Ala Glu Gly Phe Val Gln Gln Val 900 905 910 cgg ccc gat cgt gcc gtt caa aac ctg tca aag tca ttg ccc aca tac 2784 Arg Pro Asp Arg Ala Val Gln Asn Leu Ser Lys Ser Leu Pro Thr Tyr 915 920 925 tct tgg gat cat act cgt caa tac tgg gca gaa tct cgc tcc acc cgc 2832 Ser Trp Asp His Thr Arg Gln Tyr Trp Ala Glu Ser Arg Ser Thr Arg 930 935 940 cag cat ctt cgt gga ggt gcg ccc cat ctt ctg ctt gga aag ctt tct 2880 Gln His Leu Arg Gly Gly Ala Pro His Leu Leu Leu Gly Lys Leu Ser 945 950 955 960 tct tac agc aca gca tcg acc ttc cag tgg aca aac ttc atc agg ccc 2928 Ser Tyr Ser Thr Ala Ser Thr Phe Gln Trp Thr Asn Phe Ile Arg Pro 965 970 975 cgg gat ctg gaa tgg ctc gac ggt cat gcg cta caa 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cat 6192 Gly Asp Tyr Leu Ile Arg Ser Thr Ala Ser Thr Tyr Lys Val Ser His 2050 2055 2060 gtt gag gat att cca atc ctc gag cac tct gtg gca atg gca aaa aat 6240 Val Glu Asp Ile Pro Ile Leu Glu His Ser Val Ala Met Ala Lys Asn 2065 2070 2075 2080 acc gtc tct gcg tcg act gtc gac gac act gag aaa gtt att aca gcc 6288 Thr Val Ser Ala Ser Thr Val Asp Asp Thr Glu Lys Val Ile Thr Ala 2085 2090 2095 aca caa att ctc ttg cct ggt cag ctc tct gtc aac cac aat gac caa 6336 Thr Gln Ile Leu Leu Pro Gly Gln Leu Ser Val Asn His Asn Asp Gln 2100 2105 2110 cgc ttc aat ctg gcc acc gtc atc gac tgg aag gaa aat gag gtg tcc 6384 Arg Phe Asn Leu Ala Thr Val Ile Asp Trp Lys Glu Asn Glu Val Ser 2115 2120 2125 gct agg att tgc ccc atc gac tct ggt aac tta ttt tcc aac aag aag 6432 Ala Arg Ile Cys Pro Ile Asp Ser Gly Asn Leu Phe Ser Asn Lys Lys 2130 2135 2140 acg tat ttg ctt gtt ggt ctt acc ggg gac ctt ggt cgc tct ctc tgt 6480 Thr Tyr Leu Leu Val Gly Leu Thr Gly Asp Leu Gly Arg Ser Leu Cys 2145 2150 2155 2160 cgc tgg atg atc ttg cat ggc gcc cgc cat gtt gtg ctc act agc cgg 6528 Arg Trp Met Ile Leu His Gly Ala Arg His Val Val Leu Thr Ser Arg 2165 2170 2175 aac cct cga ctt gat ccc aaa tgg atc gcc aac atg gag gca ctt ggt 6576 Asn Pro Arg Leu Asp Pro Lys Trp Ile Ala Asn Met Glu Ala Leu Gly 2180 2185 2190 ggt gac atc acc gtt ctg tca atg gat gtt gcc aat gag gat tca gtc 6624 Gly Asp Ile Thr Val Leu Ser Met Asp Val Ala Asn Glu Asp Ser Val 2195 2200 2205 gat gct ggc ctt ggc aag ctt gtc gat atg aag ttg cca cct gtt gcc 6672 Asp Ala Gly Leu Gly Lys Leu Val Asp Met Lys Leu Pro Pro Val Ala 2210 2215 2220 ggc atc gcg ttc ggg cct ttg gtg ctg cag gat gtc atg ctg aag aac 6720 Gly Ile Ala Phe Gly Pro Leu Val Leu Gln Asp Val Met Leu Lys Asn 2225 2230 2235 2240 atg gac cac cag atg atg gac atg gtg ttg aag ccc aag gta caa gga 6768 Met Asp His Gln Met Met Asp Met Val Leu Lys Pro Lys Val Gln Gly 2245 2250 2255 gca cgc att ctt cat gaa cgg ttc tcc gaa cag acg ggc agc aag gcg 6816 Ala Arg Ile Leu His Glu Arg Phe Ser Glu Gln Thr 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cgg gtg ccg tat ggc gtc atc ctc gac tgt cta ggc ctg 8784 Gln His Ala Arg Val Pro Tyr Gly Val Ile Leu Asp Cys Leu Gly Leu 2915 2920 2925 aat ctc cct acc tca ggc gag gaa ccc aag act cag aca cac gcc ccc 8832 Asn Leu Pro Thr Ser Gly Glu Glu Pro Lys Thr Gln Thr His Ala Pro 2930 2935 2940 ttg ttc cag gct gtc ttt gat tac aag cag ggt caa gcg gag agt ggc 8880 Leu Phe Gln Ala Val Phe Asp Tyr Lys Gln Gly Gln Ala Glu Ser Gly 2945 2950 2955 2960 tca att ggc aat gcc aaa atg acg agt gtt ctc gct tcc cgt gag cgc 8928 Ser Ile Gly Asn Ala Lys Met Thr Ser Val Leu Ala Ser Arg Glu Arg 2965 2970 2975 act cct tat gac atc gtt ctc gag atg tgg gat gac cct acc aag gac 8976 Thr Pro Tyr Asp Ile Val Leu Glu Met Trp Asp Asp Pro Thr Lys Asp 2980 2985 2990 cca ctc att cat gtc aaa ctt cag agc tcg ctg tat ggc cct gag cac 9024 Pro Leu Ile His Val Lys Leu Gln Ser Ser Leu Tyr Gly Pro Glu His 2995 3000 3005 gct cag gcc ttt gta gac cac ttt tct tca atc ctc act atg ttc tcg 9072 Ala Gln Ala Phe Val Asp His Phe Ser Ser Ile Leu 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Val Gly Ser Thr His Val Lys Gly Gly His Phe Ile Asp Glu 85 90 95 gat cct gct tta ttt gac gcc gcg ttc ttc aac atg acc aca gag gtc 336 Asp Pro Ala Leu Phe Asp Ala Ala Phe Phe Asn Met Thr Thr Glu Val 100 105 110 gcc agc tgc atg gat ccg cag tat cgg ctt atg ctt gag gtg gtc tac 384 Ala Ser Cys Met Asp Pro Gln Tyr Arg Leu Met Leu Glu Val Val Tyr 115 120 125 gaa tcg ctg gag agt gcc ggt atc acc atc gat ggt atg gca ggc tct 432 Glu Ser Leu Glu Ser Ala Gly Ile Thr Ile Asp Gly Met Ala Gly Ser 130 135 140 aat acg tcg gtg ttt ggg ggt gtc atg tac cac gac tat cag gat tcg 480 Asn Thr Ser Val Phe Gly Gly Val Met Tyr His Asp Tyr Gln Asp Ser 145 150 155 160 ctc aat cgt gac ccc gag aca gtt ccg cgt tat ttc ata act ggc aac 528 Leu Asn Arg Asp Pro Glu Thr Val Pro Arg Tyr Phe Ile Thr Gly Asn 165 170 175 tca gga aca atg ctt tcg aac cgg ata tca cac ttc tac gac tta cgt 576 Ser Gly Thr Met Leu Ser Asn Arg Ile Ser His Phe Tyr Asp Leu Arg 180 185 190 ggt ccc agc gtg acg gtt gac acg gcc tgt tcg acg aca ttg acc gca 624 Gly Pro Ser Val Thr Val Asp Thr Ala Cys Ser Thr Thr Leu Thr Ala 195 200 205 ctg cac ttg gcg tgc cag agc tta cgt act ggg gag tca gat aca gcc 672 Leu His Leu Ala Cys Gln Ser Leu Arg Thr Gly Glu Ser Asp Thr Ala 210 215 220 atc gtt atc ggt gca aat ctt ctg ctc aat ccc gat gtt ttt gtt acg 720 Ile Val Ile Gly Ala Asn Leu Leu Leu Asn Pro Asp Val Phe Val Thr 225 230 235 240 atg tca aac ctg gga ttt ttg tcc ccg gat ggt atc tcg tac tct ttt 768 Met Ser Asn Leu Gly Phe Leu Ser Pro Asp Gly Ile Ser Tyr Ser Phe 245 250 255 gat cct cga gcg aat gga tat ggt cgc ggg gaa gga att gcc gct ctg 816 Asp Pro Arg Ala Asn Gly Tyr Gly Arg Gly Glu Gly Ile Ala Ala Leu 260 265 270 gta ata aag gcc ctc cct aac gcg ttg cga gac caa gac cct atc cga 864 Val Ile Lys Ala Leu Pro Asn Ala Leu Arg Asp Gln Asp Pro Ile Arg 275 280 285 gcc gtc att cga gag aca gcg ctg aac cag gat ggc aaa aca ccc gca 912 Ala Val Ile Arg Glu Thr Ala Leu Asn Gln Asp Gly Lys Thr Pro Ala 290 295 300 att act gcg ccg agt gat gtg gcg cag aaa agt ctg atc cag gag tgt 960 Ile Thr Ala Pro Ser Asp Val Ala Gln Lys Ser Leu Ile Gln Glu Cys 305 310 315 320 tac gat aag gct ggg cta gat atg tcg ttg acc tcg tac gtg gag gcc 1008 Tyr Asp Lys Ala Gly Leu Asp Met Ser Leu Thr Ser Tyr Val Glu Ala 325 330 335 cac gga act gga aca cca act ggt gac ccc ctt gaa atc tca gca att 1056 His Gly Thr Gly Thr Pro Thr Gly Asp Pro Leu Glu Ile Ser Ala Ile 340 345 350 tca gca gct ttt aaa gga cat cct ctg cac ctt ggc tct gtg aaa gca 1104 Ser Ala Ala Phe Lys Gly His Pro Leu His Leu Gly Ser Val Lys Ala 355 360 365 aat att ggc cat aca gaa gcc gcc agt ggc ctg gcc agt ata atc aag 1152 Asn Ile Gly His Thr Glu Ala Ala Ser Gly Leu Ala Ser Ile Ile Lys 370 375 380 gtg gcc ttg gcc ttg gag aag ggc ttg att ccc cct aat gcg cgg ttc 1200 Val Ala Leu Ala Leu Glu Lys Gly Leu Ile Pro Pro Asn Ala Arg Phe 385 390 395 400 ctg caa aag aac agc aag ctg atg ctt gac caa aag aac atc aag atc 1248 Leu Gln Lys Asn Ser Lys Leu Met Leu Asp Gln Lys Asn Ile Lys Ile 405 410 415 ccc atg tct gct caa gac tgg cct gtg aaa gat ggg act cgt cgc gca 1296 Pro Met Ser Ala Gln Asp Trp Pro Val Lys Asp Gly Thr Arg Arg Ala 420 425 430 tct gtc aat aac ttc ggc ttt ggt ggt tcg aat gct cac gtc att ttg 1344 Ser Val Asn Asn Phe Gly Phe Gly Gly Ser Asn Ala His Val Ile Leu 435 440 445 gaa tca tat gat cgc gca tca ttg gcc ctg cca gag gat caa gtg cat 1392 Glu Ser Tyr Asp Arg Ala Ser Leu Ala Leu Pro Glu Asp Gln Val His 450 455 460 gtc aat ggt aac tct gag cat ggt agg gtt gag gat ggt tcc aaa cag 1440 Val Asn Gly Asn Ser Glu His Gly Arg Val Glu Asp Gly Ser Lys Gln 465 470 475 480 agc cgc ata tac gtt gtg cgt gcc aag gac gag caa gct tgt cgg cga 1488 Ser Arg Ile Tyr Val Val Arg Ala Lys Asp Glu Gln Ala Cys Arg Arg 485 490 495 acg ata gca agc ctg cga gac tac att aaa tcc gtc gct gac att gac 1536 Thr Ile Ala Ser Leu Arg Asp Tyr Ile Lys Ser Val Ala Asp Ile Asp 500 505 510 ggg gaa ccc ttc ctc gcc agc ctc gcc tat aca cta ggc tct cgc cgt 1584 Gly Glu Pro Phe Leu Ala Ser Leu Ala Tyr Thr Leu Gly Ser Arg Arg 515 520 525 tcc att ctg cca tgg acg tca gtg tat gta gca gac agc ctt ggc ggc 1632 Ser Ile Leu Pro Trp Thr Ser Val Tyr Val Ala Asp Ser Leu Gly Gly 530 535 540 ctt gtt tct gcc ctc agc gat gag tcc aat caa cca aaa cga gcg aat 1680 Leu Val Ser Ala Leu Ser Asp Glu Ser Asn Gln Pro Lys Arg Ala Asn 545 550 555 560 gag aaa gta cgg ctc gga ttt gta ttc acc ggt cag ggg gcg cag tgg 1728 Glu Lys Val Arg Leu Gly Phe Val Phe Thr Gly Gln Gly Ala Gln Trp 565 570 575 cat gca atg ggc aga gag ctg gtc aat aca ttc cca gta ttc aaa cag 1776 His Ala Met Gly Arg Glu Leu Val Asn Thr Phe Pro Val Phe Lys Gln 580 585 590 gcg att ctt gaa tgt gat ggc tac atc aag caa ctg ggc gcg agt tgg 1824 Ala Ile Leu Glu Cys Asp Gly Tyr Ile Lys Gln Leu Gly Ala Ser Trp 595 600 605 aat ttt atg gag gag ctc cac cgt gat gag ctg acg act cgg gta aat 1872 Asn Phe Met Glu Glu Leu His Arg Asp Glu Leu Thr Thr Arg Val Asn 610 615 620 gat gcc gaa tac agt cta cca ctg tca acc gct atc caa att gca ctt 1920 Asp Ala Glu Tyr Ser Leu Pro Leu Ser Thr Ala Ile Gln Ile Ala Leu 625 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Glu Lys Leu Leu His 740 745 750 gcc gat ggc atc ttt acc agg aaa ctg aaa gtc act gaa gcc ttc cat 2304 Ala Asp Gly Ile Phe Thr Arg Lys Leu Lys Val Thr Glu Ala Phe His 755 760 765 tca agc cac atg cga cca atg gca gat gcc ttt ggg gcg tca ctg aga 2352 Ser Ser His Met Arg Pro Met Ala Asp Ala Phe Gly Ala Ser Leu Arg 770 775 780 gat ctg ttc aac tcg gat aac aac aac gac aat ccc aat gct gac acc 2400 Asp Leu Phe Asn Ser Asp Asn Asn Asn Asp Asn Pro Asn Ala Asp Thr 785 790 795 800 tca aag ggt gta tta tat tca tca cct aag act ggt agt cgc atg acc 2448 Ser Lys Gly Val Leu Tyr Ser Ser Pro Lys Thr Gly Ser Arg Met Thr 805 810 815 gat ctt aaa ttg cta ttg gat ccc aca cac tgg atg gat agt atg cta 2496 Asp Leu Lys Leu Leu Leu Asp Pro Thr His Trp Met Asp Ser Met Leu 820 825 830 cag ccg gta gag ttc gag tcc tca ctc cgc gag atg tgc ttt gat ccc 2544 Gln Pro Val Glu Phe Glu Ser Ser Leu Arg Glu Met Cys Phe Asp Pro 835 840 845 aac acc aaa gag aaa gcc gtc gat gtg att att gaa ata ggg cct cac 2592 Asn Thr Lys Glu Lys Ala 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Arg Thr His Pro Pro His Thr Leu Ile Gly Ser Arg Glu Ser Leu Ser 965 970 975 cct cat ttc gcg cct aaa tgg aaa cat gtt ctc cgt ctg tca gat att 2976 Pro His Phe Ala Pro Lys Trp Lys His Val Leu Arg Leu Ser Asp Ile 980 985 990 cca tgg ata cga gat cac gtc gtt ggt tcg agc atc atc ttt ccg gga 3024 Pro Trp Ile Arg Asp His Val Val Gly Ser Ser Ile Ile Phe Pro Gly 995 1000 1005 gct ggc ttc atc agc atg gcc atc gag ggg ttt tca caa gtc tgc cca 3072 Ala Gly Phe Ile Ser Met Ala Ile Glu Gly Phe Ser Gln Val Cys Pro 1010 1015 1020 cca gtt gcg ggg gct agc atc aac tac aac ttg cgt gac gtt gaa ctc 3120 Pro Val Ala Gly Ala Ser Ile Asn Tyr Asn Leu Arg Asp Val Glu Leu 1025 1030 1035 1040 gcg cag gct ctc ata ata ccc gct gat gca gaa gca gag gtt gac ctg 3168 Ala Gln Ala Leu Ile Ile Pro Ala Asp Ala Glu Ala Glu Val Asp Leu 1045 1050 1055 cgc cta acg atc cgt tca tgt gag gaa agg tcc ctc ggc aca aag aac 3216 Arg Leu Thr Ile Arg Ser Cys Glu Glu Arg Ser Leu Gly Thr Lys Asn 1060 1065 1070 tgg cat caa ttt tct gtg cac tca att tcg ggc gaa aat aat acc tgg 3264 Trp His Gln Phe Ser Val His Ser Ile Ser Gly Glu Asn Asn Thr Trp 1075 1080 1085 aca gaa cac tgc acc gga tta ata cgt tcg gag agc gaa aga agc cac 3312 Thr Glu His Cys Thr Gly Leu Ile Arg Ser Glu Ser Glu Arg Ser His 1090 1095 1100 ctt gac tgt tca act gtg gaa gcc tca cgc agg ttg aat cta ggc tca 3360 Leu Asp Cys Ser Thr Val Glu Ala Ser Arg Arg Leu Asn Leu Gly Ser 1105 1110 1115 1120 gat aac cgg agc att gat ccc aac gat ctc tgg gag tcc tta cac gcg 3408 Asp Asn Arg Ser Ile Asp Pro Asn Asp Leu Trp Glu Ser Leu His Ala 1125 1130 1135 aat ggg ata tgc cac gga ccc att ttt cag aac att cag cga att caa 3456 Asn Gly Ile Cys His Gly Pro Ile Phe Gln Asn Ile Gln Arg Ile Gln 1140 1145 1150 aac aat gga cag ggc tcg ttt tgc aga ttt tcc att gct gac act gcc 3504 Asn Asn Gly Gln Gly Ser Phe Cys Arg Phe Ser Ile Ala Asp Thr Ala 1155 1160 1165 tcg gct atg cct cac tcg tac gag aat cga cac atc gtc cat cct act 3552 Ser Ala Met Pro His Ser Tyr Glu Asn Arg His Ile Val His Pro Thr 1170 1175 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tcg gcg cgt gag caa ttt gcg gat tgg caa gac gtg 4560 Gly Phe Phe Glu Ser Ala Arg Glu Gln Phe Ala Asp Trp Gln Asp Val 1505 1510 1515 1520 atg act ttc aaa aaa ttg gat att gaa agc gat ccc gag caa caa ggg 4608 Met Thr Phe Lys Lys Leu Asp Ile Glu Ser Asp Pro Glu Gln Gln Gly 1525 1530 1535 ttt gaa tgt gcc acc tac gat gtg gtc gtg gct tgc cag gtc ctg cat 4656 Phe Glu Cys Ala Thr Tyr Asp Val Val Val Ala Cys Gln Val Leu His 1540 1545 1550 gca act cga tgc atg aaa cga aca ctg agt aac gtt cga aaa ttg ctc 4704 Ala Thr Arg Cys Met Lys Arg Thr Leu Ser Asn Val Arg Lys Leu Leu 1555 1560 1565 aag cct ggg ggc aac ttg att ttg gtt gag act acc agg gat cag ctc 4752 Lys Pro Gly Gly Asn Leu Ile Leu Val Glu Thr Thr Arg Asp Gln Leu 1570 1575 1580 gat ttg ttc ttt acc ttc gga ctg ttg cca ggt tgg tgg ctc agt gag 4800 Asp Leu Phe Phe Thr Phe Gly Leu Leu Pro Gly Trp Trp Leu Ser Glu 1585 1590 1595 1600 gag cct gag cgg aag tcg acg cca tcg ctc act acc gat ctt tgg aac 4848 Glu Pro Glu Arg Lys Ser Thr Pro Ser Leu Thr Thr 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Glu Ser Ser Leu Leu Gly Glu Val Gly Ser Glu Thr Phe Lys 1715 1720 1725 tcc atc acc gcg atg ctg aat aac tgc aac gca ctt ctc tgg gtg tct 5232 Ser Ile Thr Ala Met Leu Asn Asn Cys Asn Ala Leu Leu Trp Val Ser 1730 1735 1740 aga gga gca gcc atg agc tcc gag gat cca tgg aaa gct cta cat att 5280 Arg Gly Ala Ala Met Ser Ser Glu Asp Pro Trp Lys Ala Leu His Ile 1745 1750 1755 1760 ggt ctg ctg cgt acc atc cgc aac gaa aat aac ggg aag gaa tat gta 5328 Gly Leu Leu Arg Thr Ile Arg Asn Glu Asn Asn Gly Lys Glu Tyr Val 1765 1770 1775 tcg ttg gat ctc gat cct tct cga aac gca tac acc cac gag tcc ctg 5376 Ser Leu Asp Leu Asp Pro Ser Arg Asn Ala Tyr Thr His Glu Ser Leu 1780 1785 1790 tat gct atc tgc aat atc ttc aat ggc cgc ctc ggc gac ctt tcc gaa 5424 Tyr Ala Ile Cys Asn Ile Phe Asn Gly Arg Leu Gly Asp Leu Ser Glu 1795 1800 1805 gac aag gag ttt gaa ttt gca gag aga aac ggc gtc atc cac gta ccg 5472 Asp Lys Glu Phe Glu Phe Ala Glu Arg Asn Gly Val Ile His Val Pro 1810 1815 1820 cga ctt ttc aat gac ccg cac tgg aag gac caa gaa gcg gtt gag gtc 5520 Arg Leu Phe Asn Asp Pro His Trp Lys Asp Gln Glu Ala Val Glu Val 1825 1830 1835 1840 aca ctg cag ccg ttc gag caa ccc ggg cgt cgt ctg cgg atg gag gtt 5568 Thr Leu Gln Pro Phe Glu Gln Pro Gly Arg Arg Leu Arg Met Glu Val 1845 1850 1855 gag acg cca ggg ctc tta gac tcc ctg caa ttt cga gac gac gaa gga 5616 Glu Thr Pro Gly Leu Leu Asp Ser Leu Gln Phe Arg Asp Asp Glu Gly 1860 1865 1870 cgt gaa ggc aag gat ctt ccg gat gat tgg gta gaa atc gaa ccc aaa 5664 Arg Glu Gly Lys Asp Leu Pro Asp Asp Trp Val Glu Ile Glu Pro Lys 1875 1880 1885 gct ttc ggt ctc aat ttt cgg gat gtc atg gtt gcc atg ggt caa ttg 5712 Ala Phe Gly Leu Asn Phe Arg Asp Val Met Val Ala Met Gly Gln Leu 1890 1895 1900 gag gcc aac cgt gtg atg ggc ttc gaa tgc gcc gga gtg atc aca aag 5760 Glu Ala Asn Arg Val Met Gly Phe Glu Cys Ala Gly Val Ile Thr Lys 1905 1910 1915 1920 ctc ggt gga gct gct gcc gct agc caa ggc ctc aga tta ggg gac cgc 5808 Leu Gly Gly Ala Ala Ala Ala Ser Gln Gly Leu Arg Leu Gly Asp Arg 1925 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atc gag 6480 Ile Gly Leu Ile Gly Pro Ile Gln Gln His Ser Leu Ser Asn Ile Glu 2145 2150 2155 2160 aag gcc ttc cgt acg atg cag agt ggt cag cat gtt ggc aaa gtt gtg 6528 Lys Ala Phe Arg Thr Met Gln Ser Gly Gln His Val Gly Lys Val Val 2165 2170 2175 gtc aat gta tct ggg gac gaa ctg gtc cca gtc ggc gat gga ggg ttc 6576 Val Asn Val Ser Gly Asp Glu Leu Val Pro Val Gly Asp Gly Gly Phe 2180 2185 2190 tcg ctg aag ctg aag cct gac agt tct tac cta gtt gct ggt ggg ctg 6624 Ser Leu Lys Leu Lys Pro Asp Ser Ser Tyr Leu Val Ala Gly Gly Leu 2195 2200 2205 ggg gga att gga aag cag atc tgt cag tgg ctt gtt gat cat ggc gcg 6672 Gly Gly Ile Gly Lys Gln Ile Cys Gln Trp Leu Val Asp His Gly Ala 2210 2215 2220 aag cac ttg att atc cta tcg aga agt gca aag gcc agt cca ttc ata 6720 Lys His Leu Ile Ile Leu Ser Arg Ser Ala Lys Ala Ser Pro Phe Ile 2225 2230 2235 2240 acc agc ttg caa aat caa cag tgc gct gtc tat cta cac gca tgt gac 6768 Thr Ser Leu Gln Asn Gln Gln Cys Ala Val Tyr Leu His Ala Cys Asp 2245 2250 2255 atc tca 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Lys Tyr Thr Lys Pro Leu Ala Thr Leu Ala 145 150 155 160 gac gct act att gcc aag ttg ttc ggt aaa agc gag gag tgg caa acc 528 Asp Ala Thr Ile Ala Lys Leu Phe Gly Lys Ser Glu Glu Trp Gln Thr 165 170 175 gca cct gtc tat tcc aat gga ttg gac ctt gtc aca cga aca gtc aca 576 Ala Pro Val Tyr Ser Asn Gly Leu Asp Leu Val Thr Arg Thr Val Thr 180 185 190 ctc att atg gtc ggc gac aaa atc tgc cac aat gag gag tgg ctg gat 624 Leu Ile Met Val Gly Asp Lys Ile Cys His Asn Glu Glu Trp Leu Asp 195 200 205 att gca aag aac cat gcc gtg agt gtg gcg gta caa gct cgc caa ctt 672 Ile Ala Lys Asn His Ala Val Ser Val Ala Val Gln Ala Arg Gln Leu 210 215 220 cgc gta tgg ccc atg cta ctg cga ccg ctc gct cac tgg ttt caa ccg 720 Arg Val Trp Pro Met Leu Leu Arg Pro Leu Ala His Trp Phe Gln Pro 225 230 235 240 caa gga cgc aaa ttg cgt gac caa gtg cgc cgc gca cga aag atc att 768 Gln Gly Arg Lys Leu Arg Asp Gln Val Arg Arg Ala Arg Lys Ile Ile 245 250 255 gat cct gag att cag cga cga cgt gct gaa aag gcc gca tgt gta gcg 816 Asp Pro 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cac gct ttt agc gtt cgt atg 1488 Pro Gly Asp Asp Asp Lys Tyr Tyr Arg His Ala Phe Ser Val Arg Met 485 490 495 cat cca acc aca aag ctc atg gta cgc cgg cgc aac gag gac atc ccg 1536 His Pro Thr Thr Lys Leu Met Val Arg Arg Arg Asn Glu Asp Ile Pro 500 505 510 ctc cct cat gac cgg tgc 1554 Leu Pro His Asp Arg Cys 515 <210> 7 <211> 518 <212> PRT <213> Penicillium citrinum <400> 7 Met Leu Gly Gln Val Leu Leu Thr Val Glu Ser Tyr Gln Trp Val Ser 1 5 10 15 Thr Pro Gln Ala Leu Val Ala Val Ala Val Leu Leu Ser Leu Ile Ala 20 25 30 Tyr Arg Leu Arg Gly Arg Gln Ser Glu Leu Gln Val Tyr Asn Pro Lys 35 40 45 Lys Trp Trp Glu Leu Thr Thr Met Arg Ala Arg Gln Asp Phe Asp Thr 50 55 60 Tyr Gly Pro Ser Trp Ile Glu Ala Trp Phe Ser Lys Asn Asp Lys Pro 65 70 75 80 Leu Arg Phe Ile Val Asp Ser Gly Tyr Cys Thr Ile Leu Pro Ser Ser 85 90 95 Met Ala Asp Glu Phe Arg Lys Ile Lys Asp Met Cys Met Tyr Lys Phe 100 105 110 Leu Ala Asp Asp Phe His Ser His Leu Pro Gly Phe Asp Gly Phe Lys 115 120 125 Glu Ile Cys Gln Asp Ala His Leu 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Asn His Gln Ala Leu Met Thr Leu Val Phe Pro Gly Ser Tyr Gly Val 115 120 125 gca tct caa gca gcc tca cca ttc ctt gct ccc ctc cct gtg aac cta 432 Ala Ser Gln Ala Ala Ser Pro Phe Leu Ala Pro Leu Pro Val Asn Leu 130 135 140 tct gtg att gac ctt ccc tca acg tcg agc cct tta acc gcc tat tcg 480 Ser Val Ile Asp Leu Pro Ser Thr Ser Ser Pro Leu Thr Ala Tyr Ser 145 150 155 160 aaa gat aaa gtt ttc gcc ttc tct gtg gaa tac agc agc gcg ccg gaa 528 Lys Asp Lys Val Phe Ala Phe Ser Val Glu Tyr Ser Ser Ala Pro Glu 165 170 175 ctc gtg gct gct gtt caa gaa atc ccc aac aac agt gcc gac ctg aaa 576 Leu Val Ala Ala Val Gln Glu Ile Pro Asn Asn Ser Ala Asp Leu Lys 180 185 190 ttg cag gag acg caa ttg atc gag atg gaa cgc cag atg tgg atc atg 624 Leu Gln Glu Thr Gln Leu Ile Glu Met Glu Arg Gln Met Trp Ile Met 195 200 205 aag gct gcc agg gct cac aca aaa cgc agc ctt gct caa tgg gtg cac 672 Lys Ala Ala Arg Ala His Thr Lys Arg Ser Leu Ala Gln Trp Val His 210 215 220 gat acc tgg aca gag tct ctt gat ctt atc aag agc gct caa acg ctc 720 Asp Thr Trp Thr Glu Ser Leu Asp Leu Ile Lys Ser Ala Gln Thr Leu 225 230 235 240 gac gtg gtt gtc atg gtg cta ggt tat ata tca atg cac ttg act ttc 768 Asp Val Val Val Met Val Leu Gly Tyr Ile Ser Met His Leu Thr Phe 245 250 255 gtc tca ctc ttc ctc agc atg aaa aaa ttg gga tcg aag gtt tgg ctg 816 Val Ser Leu Phe Leu Ser Met Lys Lys Leu Gly Ser Lys Val Trp Leu 260 265 270 gct aca agc gtc ctt ttg tcg tca aca ttt gcc ttt ctc ctc ggt ctc 864 Ala Thr Ser Val Leu Leu Ser Ser Thr Phe Ala Phe Leu Leu Gly Leu 275 280 285 gac gtg gcc ata aga cta ggg gtt ccg atg agc atg agg ttg cta tcc 912 Asp Val Ala Ile Arg Leu Gly Val Pro Met Ser Met Arg Leu Leu Ser 290 295 300 gaa ggc ctc ccc ttc ttg gtg gtg atc gtt ggc ttt gag aag agc atc 960 Glu Gly Leu Pro Phe Leu Val Val Ile Val Gly Phe Glu Lys Ser Ile 305 310 315 320 act ctg acc agg gct gtt ttg tcc tat gct gtg cag cac cga aag ccc 1008 Thr Leu Thr Arg Ala Val Leu Ser Tyr Ala Val Gln His Arg Lys Pro 325 330 335 cag aag ata cag tct gac cag ggt agc gtg aca gcc att gct gaa agt 1056 Gln Lys Ile Gln Ser Asp Gln Gly Ser Val Thr Ala Ile Ala Glu Ser 340 345 350 acc atc aat tac gcc gta cga agc gcc att cgg gag aag ggt tac aat 1104 Thr Ile Asn Tyr Ala Val Arg Ser Ala Ile Arg Glu Lys Gly Tyr Asn 355 360 365 atc gtg tgc cac tac gtg gtc gag atc ctg ctc cta gtt atc ggt gct 1152 Ile Val Cys His Tyr Val Val Glu Ile Leu Leu Leu Val Ile Gly Ala 370 375 380 gtc tta ggc atc caa ggt ggg cta cag cac ttc tgt gtt cta gct gca 1200 Val Leu Gly Ile Gln Gly Gly Leu Gln His Phe Cys Val Leu Ala Ala 385 390 395 400 ttg atc ctg ttc ttt gac tgt ctg ctg ctg ttt aca ttc tac act gcg 1248 Leu Ile Leu Phe Phe Asp Cys Leu Leu Leu Phe Thr Phe Tyr Thr Ala 405 410 415 att ctg tct atc aag ctc gag gta aac cgc ctc aaa cgt cat atc aac 1296 Ile Leu Ser Ile Lys Leu Glu Val Asn Arg Leu Lys Arg His Ile Asn 420 425 430 atg cgg tac gcg ttg gaa gat gag ggt ctc agt cag cgg acg gcg gag 1344 Met Arg Tyr Ala Leu Glu Asp Glu Gly Leu Ser Gln Arg Thr Ala Glu 435 440 445 agt gtc gcg acc agc aat gat gcc caa gac agt gca cgt aca tat ctg 1392 Ser Val Ala Thr Ser Asn Asp Ala Gln Asp Ser Ala Arg Thr Tyr Leu 450 455 460 ttt ggc aat gat atg aaa ggc agc agt gtt ccg aag ttc aaa ttc tgg 1440 Phe Gly Asn Asp Met Lys Gly Ser Ser Val Pro Lys Phe Lys Phe Trp 465 470 475 480 atg gtc gtt ggt ttc ctt atc gtc aac ctc gtc aac atc ggc tcc acc 1488 Met Val Val Gly Phe Leu Ile Val Asn Leu Val Asn Ile Gly Ser Thr 485 490 495 ctt ttc caa gcc tct tct agt gga tcg ttg tcc agt ata tca tct tgg 1536 Leu Phe Gln Ala Ser Ser Ser Gly Ser Leu Ser Ser Ile Ser Ser Trp 500 505 510 acc gaa agt ctg agc gga tcg gcc att aaa ccc ccg ctt gag ccc ttc 1584 Thr Glu Ser Leu Ser Gly Ser Ala Ile Lys Pro Pro Leu Glu Pro Phe 515 520 525 aag gta gct gga agt gga cta gat gaa cta ctt ttc cag gca aga ggg 1632 Lys Val Ala Gly Ser Gly Leu Asp Glu Leu Leu Phe Gln Ala Arg Gly 530 535 540 cgc ggt caa tcg act atg gtc act gtc ctc gcc ccc atc aag tac gaa 1680 Arg Gly Gln Ser Thr Met Val Thr Val Leu Ala Pro Ile Lys Tyr Glu 545 550 555 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Asp Ser Asp 660 665 670 agt gat gcc tca tta gtc tta att aaa gca tct cta aag gtc act aag 2064 Ser Asp Ala Ser Leu Val Leu Ile Lys Ala Ser Leu Lys Val Thr Lys 675 680 685 cga gca gaa gga aag aca gcc act agt gaa ctt ccc gtg tct cgc aca 2112 Arg Ala Glu Gly Lys Thr Ala Thr Ser Glu Leu Pro Val Ser Arg Thr 690 695 700 caa atc gaa ctg gac aat ttg ctg aag cag aac aca atc agc gag ttg 2160 Gln Ile Glu Leu Asp Asn Leu Leu Lys Gln Asn Thr Ile Ser Glu Leu 705 710 715 720 aac gat gag gat gtc gtt gcc ttg tct ttg cgg gga aag gtt ccc ggg 2208 Asn Asp Glu Asp Val Val Ala Leu Ser Leu Arg Gly Lys Val Pro Gly 725 730 735 tat gcc cta gag aag agt ctc aaa gac tgc act cgt gcc gtc aag gtt 2256 Tyr Ala Leu Glu Lys Ser Leu Lys Asp Cys Thr Arg Ala Val Lys Val 740 745 750 cgc cgc tct atc att tcg agg aca ccg gct acc gca gag ctt aca agt 2304 Arg Arg Ser Ile Ile Ser Arg Thr Pro Ala Thr Ala Glu Leu Thr Ser 755 760 765 atg ctg gag cac tcg aag ctg ccg tac gaa aac tac gcc tgg gaa cgc 2352 Met Leu Glu His Ser Lys Leu Pro Tyr Glu Asn Tyr Ala Trp Glu Arg 770 775 780 gtg ctc ggt gca tgt tgc gag aac gtt att ggc tat atg cca gtc cct 2400 Val Leu Gly Ala Cys Cys Glu Asn Val Ile Gly Tyr Met Pro Val Pro 785 790 795 800 gtt ggc gtc gcc ggt cct att gtt atc gac ggc aag agt tat ttc att 2448 Val Gly Val Ala Gly Pro Ile Val Ile Asp Gly Lys Ser Tyr Phe Ile 805 810 815 cct atg gca acc acc gag ggc gtc ctc gtc gct agt gct agc cgt ggc 2496 Pro Met Ala Thr Thr Glu Gly Val Leu Val Ala Ser Ala Ser Arg Gly 820 825 830 agt aag gca atc aac ctc ggt ggc ggt gcc gtg aca gtc ctg act ggc 2544 Ser Lys Ala Ile Asn Leu Gly Gly Gly Ala Val Thr Val Leu Thr Gly 835 840 845 gac ggt atg aca cga ggc ccg tgt gtg aag ttt gat gtc ctt gaa cga 2592 Asp Gly Met Thr Arg Gly Pro Cys Val Lys Phe Asp Val Leu Glu Arg 850 855 860 gct ggt gct gct aag atc tgg ctc gat tcg gac gtc ggc cag acc gta 2640 Ala Gly Ala Ala Lys Ile Trp Leu Asp Ser Asp Val Gly Gln Thr Val 865 870 875 880 atg aaa gaa gcc ttc aat tca acc agc aga ttt gcg cgc tta caa agt 2688 Met Lys 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atg gct 3024 Met Val Gln Leu Asn Ile Ser Lys Asn Leu Ile Gly Ser Ala Met Ala 995 1000 1005 ggc tca gtt ggc ggc ttc aac gcc caa gct gcc aat ctt gcg gca gcc 3072 Gly Ser Val Gly Gly Phe Asn Ala Gln Ala Ala Asn Leu Ala Ala Ala 1010 1015 1020 att ttc att gcc aca ggt cag gat ccg gcg caa gtt gtg gag agc gct 3120 Ile Phe Ile Ala Thr Gly Gln Asp Pro Ala Gln Val Val Glu Ser Ala 1025 1030 1035 1040 aac tgc atc act ctc atg aac aat ctt cgc gga tcg ctt caa atc tct 3168 Asn Cys Ile Thr Leu Met Asn Asn Leu Arg Gly Ser Leu Gln Ile Ser 1045 1050 1055 gtc tcc atg ccg tct att gag gtt gga acg ttg ggc ggt ggt acg att 3216 Val Ser Met Pro Ser Ile Glu Val Gly Thr Leu Gly Gly Gly Thr Ile 1060 1065 1070 ctg gag ccc cag ggc gca atg ctt gac atg ctt ggt gtc cgc gga tca 3264 Leu Glu Pro Gln Gly Ala Met Leu Asp Met Leu Gly Val Arg Gly Ser 1075 1080 1085 cac ccg acc act ccc ggt gag aat gca cgt caa ctt gcg cgc atc atc 3312 His Pro Thr Thr Pro Gly Glu Asn Ala Arg Gln Leu Ala Arg Ile Ile 1090 1095 1100 gga agc gct gtt ttg gct ggg gag ctc tcg cta tgt gct gcc cta gcc 3360 Gly Ser Ala Val Leu Ala Gly Glu Leu Ser Leu Cys Ala Ala Leu Ala 1105 1110 1115 1120 gcc ggt cac ctg gtc aag gcg cac atg gcg cac aac cgt tct gcc ccg 3408 Ala Gly His Leu Val Lys Ala His Met Ala His Asn Arg Ser Ala Pro 1125 1130 1135 gca tct tca gcc cct tct cga agt gtc tcc ccg tca ggc gga acc agg 3456 Ala Ser Ser Ala Pro Ser Arg Ser Val Ser Pro Ser Gly Gly Thr Arg 1140 1145 1150 aca gtc cct gtt cct aac aat gca ctg agg ccg agt gct gca gct act 3504 Thr Val Pro Val Pro Asn Asn Ala Leu Arg Pro Ser Ala Ala Ala Thr 1155 1160 1165 gat cgg gct cga cgc 3519 Asp Arg Ala Arg Arg 1170 <210> 9 <211> 1173 <212> PRT <213> Penicillium citrinum <400> 9 Met Val Ala Ser Leu Leu Pro Ser Arg Phe Arg Gly Arg Glu Ser Met 1 5 10 15 Asn Gln Gln His Pro Leu Arg Ser Gly Asn Arg Ala Leu Thr Ser Thr 20 25 30 Leu Gln Phe Leu Ser Lys Thr Ala Cys Leu His Pro Ile His Thr Val 35 40 45 Cys Thr Ile Ala Ile Leu Ala Ser Thr Thr Tyr Val Gly Leu Leu Lys 50 55 60 Asp Ser Phe 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cat tac ctg 624 Asp Phe Ala Leu Gln Gly Ser Arg Gln Met Val Glu Thr His Tyr Leu 195 200 205 cct cag aat gca gat gta ctc gag ttt cag gga aag cat aat ttt ccc 672 Pro Gln Asn Ala Asp Val Leu Glu Phe Gln Gly Lys His Asn Phe Pro 210 215 220 aac aga ccg agt gat gtc cag gag acg gtc aag cgc ttc caa cag cta 720 Asn Arg Pro Ser Asp Val Gln Glu Thr Val Lys Arg Phe Gln Gln Leu 225 230 235 240 tat caa aag gtc aag atg tca ggt tca ttt gtc 753 Tyr Gln Lys Val Lys Met Ser Gly Ser Phe Val 245 250 <210> 13 <211> 251 <212> PRT <213> Penicillium citrinum <400> 13 Met Ser Pro Ala Arg Ile Thr Asp Phe Ser Pro Gly Lys Pro Arg Lys 1 5 10 15 Ala Leu Leu Cys Ile His Gly Ala Gly Cys Ser Ala Ala Ile Phe Arg 20 25 30 Val Gln Ile Ser Lys Leu Arg Val Ala Leu Lys Asn Glu Phe Glu Phe 35 40 45 Val Tyr Ala Thr Ala Pro Phe Ser Ser Ser Pro Gly Pro Gly Val Leu 50 55 60 Pro Val Phe Gln Gly Met Gly Pro Tyr Tyr Thr Trp Phe Gln Lys His 65 70 75 80 His Asp Ala Val Thr Asn Thr Thr Thr Pro Thr Val Gly Asp Arg Val 85 90 95 Ala Ala Val Ile Gly Pro Val Gln Lys Thr Val Gln Asp Trp Ser Ile 100 105 110 Thr Asn Pro Gln Ala Pro Ile Val Gly Ile Val Ala Phe Ser Glu Gly 115 120 125 Ala Leu Val Ala Thr Leu Leu Leu His Gln Gln Gln Met Gly Lys Leu 130 135 140 Pro Trp Phe Pro Lys Met Ser Ile Ala Val Leu Ile Cys Cys Phe Tyr 145 150 155 160 Ser Asp Glu Ala Arg Asp Tyr Met Arg Ala Glu Ala Gln Asp Asp Asp 165 170 175 Asp Lys Leu Ile Ile Asn Val Pro Thr Leu His Leu His Gly Arg Gln 180 185 190 Asp Phe Ala Leu Gln Gly Ser Arg Gln Met Val Glu Thr His Tyr Leu 195 200 205 Pro Gln Asn Ala Asp Val Leu Glu Phe Gln Gly Lys His Asn Phe Pro 210 215 220 Asn Arg Pro Ser Asp Val Gln Glu Thr Val Lys Arg Phe Gln Gln Leu 225 230 235 240 Tyr Gln Lys Val Lys Met Ser Gly Ser Phe Val 245 250 <210> 14 <211> 1086 <212> DNA <213> Penicillium citrinum <220> <221> CDS <222> (1)..(1086) <400> 14 atg ggc gtt gcc atg act gaa ggg agt ttc atc cca ccg gtg aaa cag 48 Met Gly Val Ala Met Thr Glu Gly Ser Phe Ile Pro Pro Val Lys Gln 1 5 10 15 aca atc ctc aca gta aac gac aaa gac gag gtg gtg atc tgg gat gac 96 Thr Ile Leu Thr Val Asn Asp Lys Asp Glu Val Val Ile Trp Asp Asp 20 25 30 gcc ccg act ccg aag ctg ccc gcg gac cag gtc tac gtc cgc atc cat 144 Ala Pro Thr Pro Lys Leu Pro Ala Asp Gln Val Tyr Val Arg Ile His 35 40 45 gcc gtc gct gtc aat ccc agt gac act aag atg cga ggc gac ttt gcc 192 Ala Val Ala Val Asn Pro Ser Asp Thr Lys Met Arg Gly Asp Phe Ala 50 55 60 acg cca ttt gcc tgt cta ggt act gac tat gcc ggc act gtt gtt gct 240 Thr Pro Phe Ala Cys Leu Gly Thr Asp Tyr Ala Gly Thr Val Val Ala 65 70 75 80 gtg gga tcc gaa atc acc cat gtc aag gtg gga gac cgt gtt ttt ggg 288 Val Gly Ser Glu Ile Thr His Val Lys Val Gly Asp Arg Val Phe Gly 85 90 95 gct cag aac gag atg tgt ccg cgg acg cct gaa cag ggc gcc ttt tcg 336 Ala Gln Asn Glu Met Cys Pro Arg Thr Pro Glu Gln Gly Ala Phe Ser 100 105 110 cag tac aca atc acc cgc ggt cgc atc tgg gcc aaa atc cca gat tcg 384 Gln Tyr Thr Ile Thr Arg Gly Arg Ile Trp Ala Lys Ile Pro Asp Ser 115 120 125 atg acc tgg gaa gcc gcg gcg tcg ctt cct gcc ggt att agt acc act 432 Met Thr Trp Glu Ala Ala Ala Ser Leu Pro Ala Gly Ile Ser Thr Thr 130 135 140 ggc ttg gct atg aag ctg ctc ggt atg cca ttg ccg tac agc gag act 480 Gly Leu Ala Met Lys Leu Leu Gly Met Pro Leu Pro Tyr Ser Glu Thr 145 150 155 160 aag cct agc aaa aag act tac gtc ctg att tat ggt ggc agc act gct 528 Lys Pro Ser Lys Lys Thr Tyr Val Leu Ile Tyr Gly Gly Ser Thr Ala 165 170 175 acg gcc acc att gca atg cag ttt atg aga ttg tct gga tac aca ccg 576 Thr Ala Thr Ile Ala Met Gln Phe Met Arg Leu Ser Gly Tyr Thr Pro 180 185 190 atc gct acc tgt tct cat aag aac ttc gat ctt gcc aag aag aat ggc 624 Ile Ala Thr Cys Ser His Lys Asn Phe Asp Leu Ala Lys Lys Asn Gly 195 200 205 gca gaa gag gta ttc gac tac cgc gac gca gat tgt gca caa aaa att 672 Ala Glu Glu Val Phe Asp Tyr Arg Asp Ala Asp Cys Ala Gln Lys Ile 210 215 220 cgt gat tac acc aga aac aat ctc gct tat gcc ttg gac tgc atc att 720 Arg Asp Tyr Thr Arg Asn Asn Leu Ala Tyr Ala Leu Asp Cys Ile Ile 225 230 235 240 aac gtt gag tcc aca tcg acg tgc tac aaa gca ata ggt cgt gcc ggc 768 Asn Val Glu Ser Thr Ser Thr Cys Tyr Lys Ala Ile Gly Arg Ala Gly 245 250 255 gga cga tac gtc gcg ctg aac ccc ttc ccc gag cac gcg gcc aca cgc 816 Gly Arg Tyr Val Ala Leu Asn Pro Phe Pro Glu His Ala Ala Thr Arg 260 265 270 aag atg gtc act tcg gac tgg acc ctc ggt ccg act atc ttc ggc gag 864 Lys Met Val Thr Ser Asp Trp Thr Leu Gly Pro Thr Ile Phe Gly Glu 275 280 285 ggc tca act tgg cct gca ccg tac ggc tgt gag gcg agc gaa gag gtg 912 Gly Ser Thr Trp Pro Ala Pro Tyr Gly Cys Glu Ala Ser Glu Glu Val 290 295 300 cgt ctt ttc ggc acc gaa ctc tgg caa gtc gcc tca agg ctt gtc gag 960 Arg Leu Phe Gly Thr Glu Leu Trp Gln Val Ala Ser Arg Leu Val Glu 305 310 315 320 gag gac aag ctg tat cat cac ccc ttg cgt gtc att gat ggt ggg ctg 1008 Glu Asp Lys Leu Tyr His His Pro Leu Arg Val Ile Asp Gly Gly Leu 325 330 335 gag cag gtc aag cag ggt atg gag act gtt agg aat gga gag ctg tcg 1056 Glu Gln Val Lys Gln Gly Met Glu Thr Val Arg Asn Gly Glu Leu Ser 340 345 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Ile Ala Met Gln Phe Met Arg Leu Ser Gly Tyr Thr Pro 180 185 190 Ile Ala Thr Cys Ser His Lys Asn Phe Asp Leu Ala Lys Lys Asn Gly 195 200 205 Ala Glu Glu Val Phe Asp Tyr Arg Asp Ala Asp Cys Ala Gln Lys Ile 210 215 220 Arg Asp Tyr Thr Arg Asn Asn Leu Ala Tyr Ala Leu Asp Cys Ile Ile 225 230 235 240 Asn Val Glu Ser Thr Ser Thr Cys Tyr Lys Ala Ile Gly Arg Ala Gly 245 250 255 Gly Arg Tyr Val Ala Leu Asn Pro Phe Pro Glu His Ala Ala Thr Arg 260 265 270 Lys Met Val Thr Ser Asp Trp Thr Leu Gly Pro Thr Ile Phe Gly Glu 275 280 285 Gly Ser Thr Trp Pro Ala Pro Tyr Gly Cys Glu Ala Ser Glu Glu Val 290 295 300 Arg Leu Phe Gly Thr Glu Leu Trp Gln Val Ala Ser Arg Leu Val Glu 305 310 315 320 Glu Asp Lys Leu Tyr His His Pro Leu Arg Val Ile Asp Gly Gly Leu 325 330 335 Glu Gln Val Lys Gln Gly Met Glu Thr Val Arg Asn Gly Glu Leu Ser 340 345 350 Gly Glu Lys Ile Val Val Arg Phe Ser Val 355 360 <210> 16 <211> 1254 <212> DNA <213> Penicillium citrinum <220> <221> CDS <222> (1)..(1254) <400> 16 atg gcg ccc agc ata gat gtt att ccc act gct gct tcc acg gca gca 48 Met Ala Pro Ser Ile Asp Val Ile Pro Thr Ala Ala Ser Thr Ala Ala 1 5 10 15 gga atg att tca gac atg gaa gcg gca ttt aag tcg gcc gtt aaa tta 96 Gly Met Ile Ser Asp Met Glu Ala Ala Phe Lys Ser Ala Val Lys Leu 20 25 30 aag caa atc ccc ggg gcc gtt gtc atg gcc agg agc atg aac ggt gac 144 Lys Gln Ile Pro Gly Ala Val Val Met Ala Arg Ser Met Asn Gly Asp 35 40 45 att gat tac acg cgg tgc ttt ggg gcg aga acg gtt gag cgc gat gaa 192 Ile Asp Tyr Thr Arg Cys Phe Gly Ala Arg Thr Val Glu Arg Asp Glu 50 55 60 tgc caa aga cta cca cca atg gaa atc gac aca ccc ttg cga ctt gcc 240 Cys Gln Arg Leu Pro Pro Met Glu Ile Asp Thr Pro Leu Arg Leu Ala 65 70 75 80 agt gca aca aaa ctt ctc acc aca ata atg gcc ttg cag tgt atg gaa 288 Ser Ala Thr Lys Leu Leu Thr Thr Ile Met Ala Leu Gln Cys Met Glu 85 90 95 caa ggt ctg gtg gac ctc gat gag aat gtc aac agg ctt ctt ccc gat 336 Gln Gly Leu Val Asp Leu Asp Glu Asn Val Asn Arg Leu Leu Pro Asp 100 105 110 ttg agc gac atg caa gtc ttg 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atg aca ttc aag ctg cag cag cgg cct gac atg ctt 720 Gly Ile Thr Asp Met Thr Phe Lys Leu Gln Gln Arg Pro Asp Met Leu 225 230 235 240 gct cgt cgt tct gat cag acg cgc cgt aat gag aat ggg agt ctg cga 768 Ala Arg Arg Ser Asp Gln Thr Arg Arg Asn Glu Asn Gly Ser Leu Arg 245 250 255 tac gac gac tcg gtt tat ttc cgc cat gac ggg gag gag tgc ttc ggg 816 Tyr Asp Asp Ser Val Tyr Phe Arg His Asp Gly Glu Glu Cys Phe Gly 260 265 270 gga cag ggc gtt ttc tgc ggc ccg gag tca tat atg aag gtc ctt aac 864 Gly Gln Gly Val Phe Cys Gly Pro Glu Ser Tyr Met Lys Val Leu Asn 275 280 285 tcc ttg atg aag cat gac ggt ctc ctc ttg aag aaa gac aca att gag 912 Ser Leu Met Lys His Asp Gly Leu Leu Leu Lys Lys Asp Thr Ile Glu 290 295 300 ctt atg ttc cag ccc gct ctg gac gcg gag ctc gaa aag aaa atg aat 960 Leu Met Phe Gln Pro Ala Leu Asp Ala Glu Leu Glu Lys Lys Met Asn 305 310 315 320 gat cac atg gat acc acg ccg cac atc aac tac ggc gca gca ttg ccc 1008 Asp His Met Asp Thr Thr Pro His Ile Asn Tyr Gly Ala Ala Leu Pro 325 330 335 ccg gtt atg agg aga aac ttt ggg ctt ggt gga att atc gct atg ggc 1056 Pro Val Met Arg Arg Asn Phe Gly Leu Gly Gly Ile Ile Ala Met Gly 340 345 350 gat ctc gat ggt cat aat tgg cgg cgg gag ggg tcc ctc acc ttt ggt 1104 Asp Leu Asp Gly His Asn Trp Arg Arg Glu Gly Ser Leu Thr Phe Gly 355 360 365 ggc gga ccg aat att gtt tgg caa atc gat ccg acg gta ggg ctt tgt 1152 Gly Gly Pro Asn Ile Val Trp Gln Ile Asp Pro Thr Val Gly Leu Cys 370 375 380 acc ctg gtt gtt ttc cag cta gag ccc tgg aat gat ccg att tgc aaa 1200 Thr Leu Val Val Phe Gln Leu Glu Pro Trp Asn Asp Pro Ile Cys Lys 385 390 395 400 gat ctc act cgc aag ttc gaa aaa gcg atg tac tca cag gtg aaa tgc 1248 Asp Leu Thr Arg Lys Phe Glu Lys Ala Met Tyr Ser Gln Val Lys Cys 405 410 415 cgc aac 1254 Arg Asn <210> 17 <211> 418 <212> PRT <213> Penicillium citrinum <400> 17 Met Ala Pro Ser Ile Asp Val Ile Pro Thr Ala Ala Ser Thr Ala Ala 1 5 10 15 Gly Met Ile Ser Asp Met Glu Ala Ala Phe Lys Ser Ala Val Lys Leu 20 25 30 Lys Gln Ile Pro Gly Ala Val Val Met 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Leu His Ile Gly Glu Leu Ile Ser His Leu Asp Pro Phe Met His 340 345 350 gcc tta tct tct gca tgc acg aca ttg cgt gta agc ctt cga cta ttg 1104 Ala Leu Ser Ser Ala Cys Thr Thr Leu Arg Val Ser Leu Arg Leu Leu 355 360 365 agt gag att gag act gct ttg ggg ata gca cag gag cac ggg gct gcg 1152 Ser Glu Ile Glu Thr Ala Leu Gly Ile Ala Gln Glu His Gly Ala Ala 370 375 380 gca tct att cgt cta gtc cta tca gat atg cca agc aca tcg tgg caa 1200 Ala Ser Ile Arg Leu Val Leu Ser Asp Met Pro Ser Thr Ser Trp Gln 385 390 395 400 atc ctt ggc gct gaa aat aaa acc ata acg ccg gcc tct cgt ctc cta 1248 Ile Leu Gly Ala Glu Asn Lys Thr Ile Thr Pro Ala Ser Arg Leu Leu 405 410 415 tct gtg ctt tgg agt gac gaa gcc gga gac gaa gag ccc aag tca aca 1296 Ser Val Leu Trp Ser Asp Glu Ala Gly Asp Glu Glu Pro Lys Ser Thr 420 425 430 aag gcc tca ggg aag acg ata aat gtg ttg cga cgt tgc tat aag gaa 1344 Lys Ala Ser Gly Lys Thr Ile Asn Val Leu Arg Arg Cys Tyr Lys Glu 435 440 445 ata ttc gca tta gcg aag aaa cac aat att gct 1377 Ile Phe Ala Leu Ala Lys Lys His Asn Ile Ala 450 455 460 <210> 19 <211> 459 <212> PRT <213> Penicillium citrinum <400> 19 Met Ser Leu Pro His Ala Thr Ile Pro Thr Asn Leu Arg Arg Arg Ala 1 5 10 15 Phe Arg Arg Ser Cys Asp Arg Cys His Ala Gln Lys Leu Lys Cys Thr 20 25 30 Gly Ser Asn Ala Asn Leu Val Arg Ala Gln Cys Gln Arg Cys Gln Gln 35 40 45 Ala Gly Leu Arg Cys Val Tyr Ser Glu Arg Leu Pro Lys Arg Asn Leu 50 55 60 His Lys Glu Ala Ala Ala Gly Thr Thr Arg Ala Thr Glu Thr Ser Gln 65 70 75 80 Pro Met Thr Ala Thr Ser Ser Thr Val Phe Ser Ser Leu Ala Glu Thr 85 90 95 Pro Pro Pro Tyr Cys Ser Pro Pro Thr His Ile Gly Thr Ser Ala Leu 100 105 110 Lys Glu Thr Leu Ser Glu Pro Ser Ala Ala Thr Leu Gln Phe Tyr Asp 115 120 125 Thr Ser Ile Asn Phe Asp Asp Pro Glu Ser Phe Pro Gly Gly Trp Pro 130 135 140 Gln Pro Asn Thr Phe Arg Asp Asp Ala Asn Ser Asn Glu Ser Ser Gly 145 150 155 160 Ile Pro Asp Leu Gly Tyr Asp Phe Glu Gly Pro Leu Asp Ala Thr Ala 165 170 175 Pro Val Ser Pro Ser Leu Phe Asp Leu Glu Val Glu Gly Asn Ser Ser 180 185 190 Ser Gly Gln Ser Asn Thr Ser Asn Thr Gln Arg Asp Leu Phe Glu Ser 195 200 205 Leu Ser Asp Val Ser Gln Asp Leu Glu Val Ile Leu His Gly Val Thr 210 215 220 Val Glu Trp Pro Lys Gln Lys Ile Leu Ser Tyr Pro Ile Gly Asp Phe 225 230 235 240 Leu Asn Ala Phe Gly Arg Leu Leu Leu His Leu Gln Glu Arg Val Ile 245 250 255 Thr Ser Ser Asn Ser Ser Met Leu Asp Gly Cys Leu Gln Thr Lys Asn 260 265 270 Leu Phe Met Ala Val His Cys Tyr Met Leu Ser Val Lys Ile Met Thr 275 280 285 Ser Leu Ser Gln Leu Leu Leu Ser Glu Val Met Lys Ala Gln Pro Cys 290 295 300 Gly Gln Lys Gln Ser Thr Arg Met Asp Trp Tyr Trp Ser Gly Ser Thr 305 310 315 320 Thr Arg Asn Asp Asn Gly Arg Ala Glu Ala Leu Pro Ser Phe His Ser 325 330 335 Asn Leu His Ile Gly Glu Leu Ile Ser His Leu Asp Pro Phe Met His 340 345 350 Ala Leu Ser Ser Ala Cys Thr Thr Leu Arg Val Ser Leu Arg Leu Leu 355 360 365 Ser Glu Ile Glu Thr Ala Leu Gly Ile Ala Gln Glu His Gly Ala Ala 370 375 380 Ala Ser Ile Arg Leu Val Leu Ser Asp Met Pro Ser Thr Ser Trp Gln 385 390 395 400 Ile Leu Gly Ala Glu Asn Lys Thr Ile Thr Pro Ala Ser Arg Leu Leu 405 410 415 Ser Val Leu Trp Ser Asp Glu Ala Gly Asp Glu Glu Pro Lys Ser Thr 420 425 430 Lys Ala Ser Gly Lys Thr Ile Asn Val Leu Arg Arg Cys Tyr Lys Glu 435 440 445 Ile Phe Ala Leu Ala Lys Lys His Asn Ile Ala 450 455 <210> 20 <211> 1596 <212> DNA <213> Penicillium citrinum <220> <221> CDS <222> (1)..(1596) <400> 20 atg atg ttc gcg act ttc cgg tac agc tcc cag gag gaa tcc ttg caa 48 Met Met Phe Ala Thr Phe Arg Tyr Ser Ser Gln Glu Glu Ser Leu Gln 1 5 10 15 gtt gaa cat tcc cca agt ccg acg aat cgt aat ggt cat tat cga tcg 96 Val Glu His Ser Pro Ser Pro Thr Asn Arg Asn Gly His Tyr Arg Ser 20 25 30 gca tgt gat aat tgc cga gcg aga aag ctt cga tgc gat ggt cag aga 144 Ala Cys Asp Asn Cys Arg Ala Arg Lys Leu Arg Cys Asp Gly Gln Arg 35 40 45 gaa ggg tgc gaa cga tgc cgt gat cgc cgg gtt tct tgt gac tac tcc 192 Glu Gly Cys Glu Arg Cys Arg Asp Arg Arg Val Ser Cys Asp Tyr Ser 50 55 60 gag gga aga cta gat gga aag cga cgg cga aag gat cag gtg gct ggt 240 Glu Gly Arg Leu Asp Gly Lys Arg Arg Arg Lys Asp Gln Val Ala Gly 65 70 75 80 ctg atg atg gaa aat cct aca tca gat gga caa gat agc agc ttc aaa 288 Leu Met Met Glu Asn Pro Thr Ser Asp Gly Gln Asp Ser Ser Phe Lys 85 90 95 gac cta cct agt cat atg cct att caa aat ccg cca cca tcc gac tca 336 Asp Leu Pro Ser His Met Pro Ile Gln Asn Pro Pro Pro Ser Asp Ser 100 105 110 acg gag tca atg gag ctg tca agc ccc tcc gtc gcg aat ctg atg gac 384 Thr Glu Ser Met Glu Leu Ser Ser Pro Ser Val Ala Asn Leu Met Asp 115 120 125 atg acg ccc ttt gac atc atg tca tta gac ctc ttc atc aac agt tcg 432 Met Thr Pro Phe Asp Ile Met Ser Leu Asp Leu Phe Ile Asn Ser Ser 130 135 140 cca gat gaa cgg tcc agt ttg gaa aat ggg tct atc cga acg aca agt 480 Pro Asp Glu Arg Ser Ser Leu Glu Asn Gly Ser Ile Arg Thr Thr Ser 145 150 155 160 act act gac agc cat agg gta aat aag cac gtg aat ata cca gat tgc 528 Thr Thr Asp Ser His Arg Val Asn Lys His Val Asn Ile Pro Asp Cys 165 170 175 tca atg aat cag att atc ggc ctc tca cca gcg ctc acc cca gcg gta 576 Ser Met Asn Gln Ile Ile Gly Leu Ser Pro Ala Leu Thr Pro Ala Val 180 185 190 ctc agt cat caa acc cat aaa tcc aat cct gcg gac aat ggg ctt tcc 624 Leu Ser His Gln Thr His Lys Ser Asn Pro Ala Asp Asn Gly Leu Ser 195 200 205 gtt cat gta gat acc tac caa tcc acc acg cac ctg act cca cac caa 672 Val His Val Asp Thr Tyr Gln Ser Thr Thr His Leu Thr Pro His Gln 210 215 220 ccg acg aca cat caa tcg gct aca cac tca ccg act gca cac caa ccg 720 Pro Thr Thr His Gln Ser Ala Thr His Ser Pro Thr Ala His Gln Pro 225 230 235 240 act gca cac caa ccg act gca cac caa ccg act gca cac caa ccg act 768 Thr Ala His Gln Pro Thr Ala His Gln Pro Thr Ala His Gln Pro Thr 245 250 255 gca cac caa ccg act gca cac caa ccg act gca cac caa ccg act gca 816 Ala His Gln Pro Thr Ala His Gln Pro Thr Ala His Gln Pro Thr Ala 260 265 270 cac caa ccg act gca cac caa ccg act gca cac caa ccg act gca cac 864 His Gln Pro Thr Ala His Gln Pro Thr Ala His Gln Pro Thr Ala His 275 280 285 caa ccg act gca cac caa ccg act gca cac caa ccg act gca cac caa 912 Gln Pro Thr Ala His Gln Pro Thr Ala His Gln Pro Thr Ala His Gln 290 295 300 ccg act gca cac caa ccg act gca cac caa ccg act gca cac caa ccg 960 Pro Thr Ala His Gln Pro Thr Ala His Gln Pro Thr Ala His Gln Pro 305 310 315 320 act gca cac caa ccg act gca cac caa ccg act gca cac caa ccg act 1008 Thr Ala His Gln Pro Thr Ala His Gln Pro Thr Ala His Gln Pro Thr 325 330 335 gca cac caa ccg act gca cac caa ccg act gca cac caa ccg act gca 1056 Ala His Gln Pro Thr Ala His Gln Pro Thr Ala His Gln Pro Thr Ala 340 345 350 cac caa caa tct tca ata gaa cac tgc cac tgt gta gat gac gcc ctc 1104 His Gln Gln Ser Ser Ile Glu His Cys His Cys Val Asp Asp Ala Leu 355 360 365 cag gtc att gag aag ata gag gga atc acg aga cag gtc acg cct ttg 1152 Gln Val Ile Glu Lys Ile Glu Gly Ile Thr Arg Gln Val Thr Pro Leu 370 375 380 att ccg gac tat gcg cta gta gtt caa aga acg gca atg gac tac tgc 1200 Ile Pro Asp Tyr Ala Leu Val Val Gln Arg Thr Ala Met Asp Tyr Cys 385 390 395 400 agt agg atc atg gaa tgc ggc gtt tgc agc atg atc tct agg aat ata 1248 Ser Arg Ile Met Glu Cys Gly Val Cys Ser Met Ile Ser Arg Asn Ile 405 410 415 atg ttg gct ctg gtt gtg tgt gag aag ctc gct gtt ctt ttg cac ggg 1296 Met Leu Ala Leu Val Val Cys Glu Lys Leu Ala Val Leu Leu His Gly 420 425 430 acg ctg ctg ccg ggg ggt tgg aga aag agt ata caa agt cag ctc cac 1344 Thr Leu Leu Pro Gly Gly Trp Arg Lys Ser Ile Gln Ser Gln Leu His 435 440 445 ggt cat tac ccc gct gtg ctc aga tat cca aaa cgg acc gag gaa tct 1392 Gly His Tyr Pro Ala Val Leu Arg Tyr Pro Lys Arg Thr Glu Glu Ser 450 455 460 gtc att tta ggg tcg tat aga agc agc gac cag aag gaa tgg gcc gct 1440 Val Ile Leu Gly Ser Tyr Arg Ser Ser Asp Gln Lys Glu Trp Ala Ala 465 470 475 480 gta gtt act ttg ctg ttc aca ttt cag gaa cat cgt ctg cag aag ttg 1488 Val Val Thr Leu Leu Phe Thr Phe Gln Glu His Arg Leu Gln Lys Leu 485 490 495 atc ggg gat ctg aaa cac ctg gca gcc agc aac cac tgg cat gtg cac 1536 Ile Gly Asp Leu Lys His Leu Ala Ala Ser Asn His Trp His Val His 500 505 510 gta tcc atg ttg gag tta atg gaa aaa ggg agc gca tta ccc cag act 1584 Val Ser Met Leu Glu Leu Met Glu Lys Gly Ser Ala Leu Pro Gln Thr 515 520 525 ata ggg aca agc 1596 Ile Gly Thr Ser 530 <210> 21 <211> 532 <212> PRT <213> Penicillium citrinum <400> 21 Met Met Phe Ala Thr Phe Arg Tyr Ser Ser Gln Glu Glu Ser Leu Gln 1 5 10 15 Val Glu His Ser Pro Ser Pro Thr Asn Arg Asn Gly His Tyr Arg Ser 20 25 30 Ala Cys Asp Asn Cys Arg Ala Arg Lys Leu Arg Cys Asp Gly Gln Arg 35 40 45 Glu Gly Cys Glu Arg Cys Arg Asp Arg Arg Val Ser Cys Asp Tyr Ser 50 55 60 Glu Gly Arg Leu Asp Gly Lys Arg Arg Arg Lys Asp Gln Val Ala Gly 65 70 75 80 Leu Met Met Glu Asn Pro Thr Ser Asp Gly Gln Asp Ser Ser Phe Lys 85 90 95 Asp Leu Pro Ser His Met Pro Ile Gln Asn Pro Pro Pro Ser Asp Ser 100 105 110 Thr Glu Ser Met Glu Leu Ser Ser Pro Ser Val Ala Asn Leu Met Asp 115 120 125 Met Thr Pro Phe Asp Ile Met Ser Leu Asp Leu Phe Ile Asn Ser Ser 130 135 140 Pro Asp Glu Arg Ser Ser Leu Glu Asn Gly Ser Ile Arg Thr Thr Ser 145 150 155 160 Thr Thr Asp Ser His Arg Val Asn Lys His Val Asn Ile Pro Asp Cys 165 170 175 Ser Met Asn Gln Ile Ile Gly Leu Ser Pro Ala Leu Thr Pro Ala Val 180 185 190 Leu Ser His Gln Thr His Lys Ser Asn Pro Ala Asp Asn Gly Leu Ser 195 200 205 Val His Val Asp Thr Tyr Gln Ser Thr Thr His Leu Thr Pro His Gln 210 215 220 Pro Thr Thr His Gln Ser Ala Thr His Ser Pro Thr Ala His Gln Pro 225 230 235 240 Thr Ala His Gln Pro Thr Ala His Gln Pro Thr Ala His Gln Pro Thr 245 250 255 Ala His Gln Pro Thr Ala His Gln Pro Thr Ala His Gln Pro Thr Ala 260 265 270 His Gln Pro Thr Ala His Gln Pro Thr Ala His Gln Pro Thr Ala His 275 280 285 Gln Pro Thr Ala His Gln Pro Thr Ala His Gln Pro Thr Ala His Gln 290 295 300 Pro Thr Ala His Gln Pro Thr Ala His Gln Pro Thr Ala His Gln Pro 305 310 315 320 Thr Ala His Gln Pro Thr Ala His Gln Pro Thr Ala His Gln Pro Thr 325 330 335 Ala His Gln Pro Thr Ala His Gln Pro Thr Ala His Gln Pro Thr Ala 340 345 350 His Gln Gln Ser Ser Ile Glu His Cys His Cys Val Asp Asp 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Leu Asp Glu Ile Met Pro Val Ile Glu Leu 1 5 10 15 cca ttc gtg ctg tgt ttc cct cac tcg gat gca tca att ccg caa act 96 Pro Phe Val Leu Cys Phe Pro His Ser Asp Ala Ser Ile Pro Gln Thr 20 25 30 gtt tca gtc ctt cgg gag gga ctc tcc aag gtt tat gcc aag tta cta 144 Val Ser Val Leu Arg Glu Gly Leu Ser Lys Val Tyr Ala Lys Leu Leu 35 40 45 ttt ctt act ggc aac ctc cag caa gtc gaa aat gct ggg ctc aga cct 192 Phe Leu Thr Gly Asn Leu Gln Gln Val Glu Asn Ala Gly Leu Arg Pro 50 55 60 gga agt ttc gcc gtg gaa tca aac cca tcc gag ccg cct acc ctt tca 240 Gly Ser Phe Ala Val Glu Ser Asn Pro Ser Glu Pro Pro Thr Leu Ser 65 70 75 80 gtt cga gac atg acg agc ggc tct agt aca gat tgg agt tgg aca tac 288 Val Arg Asp Met Thr Ser Gly Ser Ser Thr Asp Trp Ser Trp Thr Tyr 85 90 95 cat gat ctc cgt gaa cgg gga ttt ccc atg agt ctg ctg aac cgg gac 336 His Asp Leu Arg Glu Arg Gly Phe Pro Met Ser Leu Leu Asn Arg Asp 100 105 110 gtt ctc gcc ccg act gat ccc tgt tca ggg cgt aca aga ctc ttg gct 384 Val Leu Ala Pro Thr Asp Pro Cys Ser Gly Arg Thr Arg Leu Leu Ala 115 120 125 gca caa gca aat ttc att ccg gga ggc tgc ctg tta tac gtc tca acc 432 Ala Gln Ala Asn Phe Ile Pro Gly Gly Cys Leu Leu Tyr Val Ser Thr 130 135 140 tcg cac gcc ttc gcg gac gcc ttt gga ctc tct acc ttg cta tgt gag 480 Ser His Ala Phe Ala Asp Ala Phe Gly Leu Ser Thr Leu Leu Cys Glu 145 150 155 160 tgg agt cgg caa tgc cgt gat gct ctt ggc acc agt gac gaa ata ccg 528 Trp Ser Arg Gln Cys Arg Asp Ala Leu Gly Thr Ser Asp Glu Ile Pro 165 170 175 aat gtt agc agg cag aag gaa att tcc acg gca ttg gat caa gac tcg 576 Asn Val Ser Arg Gln Lys Glu Ile Ser Thr Ala Leu Asp Gln Asp Ser 180 185 190 ccc tgt cgc agt cta gtc gtt caa ccc tat agt ccc acg tca gcg gtc 624 Pro Cys Arg Ser Leu Val Val Gln Pro Tyr Ser Pro Thr Ser Ala Val 195 200 205 tat gag cgt ctc aaa tcc aaa cca att ctg tgg cat gtt ttg ggg ttg 672 Tyr Glu Arg Leu Lys Ser Lys Pro Ile Leu Trp His Val Leu Gly Leu 210 215 220 gat tgg aga ccc aaa gaa cga agc agt cgg ata ttg atg tct cag atc 720 Asp Trp Arg Pro Lys Glu Arg Ser Ser Arg Ile Leu Met Ser Gln Ile 225 230 235 240 cct ccg tcg cct gtg agg tcg tgt ata ttc tct att acc gca aat tct 768 Pro Pro Ser Pro Val Arg Ser Cys Ile Phe Ser Ile Thr Ala Asn Ser 245 250 255 gtc gag aag ttg agg caa gtg gct cta ggg ggg tct tct ggt gtt cca 816 Val Glu Lys Leu Arg Gln Val Ala Leu Gly Gly Ser Ser Gly Val Pro 260 265 270 aaa tct tca cag tct att tcc acg gac gat gca ctg ggg gcc ctg ctt 864 Lys Ser Ser Gln Ser Ile Ser Thr Asp Asp Ala Leu Gly Ala Leu Leu 275 280 285 tgg agc tgc ctt atg aga gct cgt ttg acg gaa cga gaa agt ttc gag 912 Trp Ser Cys Leu Met Arg Ala Arg Leu Thr Glu Arg Glu Ser Phe Glu 290 295 300 aac ccc aag gaa gcg aca atg atg cga gcg gtc aac gtg cgc aaa ctc 960 Asn Pro Lys Glu Ala Thr Met Met Arg Ala Val Asn Val Arg Lys Leu 305 310 315 320 ctg tct gtt cca gaa aca cat ctt ggc aac acg att ctt tat gcc gtg 1008 Leu Ser Val Pro Glu Thr His Leu Gly Asn Thr Ile Leu Tyr Ala Val 325 330 335 aca aag ctg tcc att gat ctg ctc gcc act agg ggc aca gac cat ttg 1056 Thr Lys Leu Ser Ile Asp Leu Leu Ala Thr Arg Gly Thr Asp His Leu 340 345 350 aat gtt gtt gct cag agt ttg cgg gaa tct ctc gac gag ctg aga gac 1104 Asn Val Val Ala Gln Ser Leu Arg Glu Ser Leu Asp Glu Leu Arg Asp 355 360 365 tct agt atg gtt caa gag gcg gta gaa ttg gca aac aac atc ccg gat 1152 Ser Ser Met Val Gln Glu Ala Val Glu Leu Ala Asn Asn Ile Pro Asp 370 375 380 gtc cgc ggc atg gga ctc tca ttt ccc acg tgg gtt gcg gag aac atg 1200 Val Arg Gly Met Gly Leu Ser Phe Pro Thr Trp Val Ala Glu Asn Met 385 390 395 400 gtg ttt agt tct ctt tct cga ttg ccg cta cta gac tgg gat ttc gga 1248 Val Phe Ser Ser Leu Ser Arg Leu Pro Leu Leu Asp Trp Asp Phe Gly 405 410 415 agt ata tct cac ggg ggc ttg ggc aag ccg gac aga atg cga ttc ccc 1296 Ser Ile Ser His Gly Gly Leu Gly Lys Pro Asp Arg Met Arg Phe Pro 420 425 430 gac aag tgt ttt gaa ggt ata acc ttt act atg ccc cag cga cca gac 1344 Asp Lys Cys Phe Glu Gly Ile Thr Phe Thr Met Pro Gln Arg Pro Asp 435 440 445 gga tca ctg gaa atc atg atc acc atg aaa gca gtg gat atg gag ata 1392 Gly Ser Leu Glu Ile Met Ile Thr Met Lys Ala Val Asp Met Glu Ile 450 455 460 ttg atg acc gat caa acc ttc act gag ttc ttc agc ttt gta tct gag 1440 Leu Met Thr Asp Gln Thr Phe Thr Glu Phe Phe Ser Phe Val Ser Glu 465 470 475 480 <210> 23 <211> 480 <212> PRT <213> Penicillium citrinum <400> 23 Met His His Phe Ser Ser Leu Asp Glu Ile Met Pro Val Ile Glu Leu 1 5 10 15 Pro Phe Val Leu Cys Phe Pro His Ser Asp Ala Ser Ile Pro Gln Thr 20 25 30 Val Ser Val Leu Arg Glu Gly Leu Ser Lys Val Tyr Ala Lys Leu Leu 35 40 45 Phe Leu Thr Gly Asn Leu Gln Gln Val Glu Asn Ala Gly Leu Arg Pro 50 55 60 Gly Ser Phe Ala Val Glu Ser Asn Pro Ser Glu Pro Pro Thr Leu Ser 65 70 75 80 Val Arg Asp Met Thr Ser Gly Ser Ser Thr Asp Trp Ser Trp Thr Tyr 85 90 95 His Asp Leu Arg Glu Arg Gly Phe Pro Met Ser Leu Leu Asn Arg Asp 100 105 110 Val Leu Ala Pro Thr Asp Pro Cys Ser Gly Arg Thr Arg Leu Leu Ala 115 120 125 Ala Gln Ala Asn Phe Ile Pro Gly Gly Cys Leu Leu Tyr Val Ser Thr 130 135 140 Ser His Ala Phe Ala Asp Ala Phe Gly Leu Ser Thr Leu Leu Cys Glu 145 150 155 160 Trp Ser Arg Gln Cys Arg Asp Ala Leu Gly Thr Ser Asp Glu Ile Pro 165 170 175 Asn Val Ser Arg Gln Lys Glu Ile Ser Thr Ala Leu Asp Gln Asp Ser 180 185 190 Pro Cys Arg Ser Leu Val Val Gln Pro Tyr Ser Pro Thr Ser Ala Val 195 200 205 Tyr Glu Arg Leu Lys Ser Lys Pro Ile Leu Trp His Val Leu Gly Leu 210 215 220 Asp Trp Arg Pro Lys Glu Arg Ser Ser Arg Ile Leu Met Ser Gln Ile 225 230 235 240 Pro Pro Ser Pro Val Arg Ser Cys Ile Phe Ser Ile Thr Ala Asn Ser 245 250 255 Val Glu Lys Leu Arg Gln Val Ala Leu Gly Gly Ser Ser Gly Val Pro 260 265 270 Lys Ser Ser Gln Ser Ile Ser Thr Asp Asp Ala Leu Gly Ala Leu Leu 275 280 285 Trp Ser Cys Leu Met Arg Ala Arg Leu Thr Glu Arg Glu Ser Phe Glu 290 295 300 Asn Pro Lys Glu Ala Thr Met Met Arg Ala Val Asn Val Arg Lys Leu 305 310 315 320 Leu Ser Val Pro Glu Thr His Leu Gly Asn Thr Ile Leu Tyr Ala Val 325 330 335 Thr Lys Leu Ser Ile Asp Leu Leu Ala Thr Arg Gly Thr Asp His Leu 340 345 350 Asn Val Val Ala Gln Ser Leu Arg Glu Ser Leu Asp Glu Leu Arg Asp 355 360 365 Ser Ser Met Val Gln Glu Ala Val Glu Leu Ala Asn Asn Ile Pro Asp 370 375 380 Val Arg Gly Met Gly Leu Ser Phe Pro Thr Trp Val Ala Glu Asn Met 385 390 395 400 Val Phe Ser Ser Leu Ser Arg Leu Pro Leu Leu Asp Trp Asp Phe Gly 405 410 415 Ser Ile Ser His Gly Gly Leu Gly Lys Pro Asp Arg Met Arg Phe Pro 420 425 430 Asp Lys Cys Phe Glu Gly Ile Thr Phe Thr Met Pro Gln Arg Pro Asp 435 440 445 Gly Ser Leu Glu Ile Met Ile Thr Met Lys Ala Val Asp Met Glu Ile 450 455 460 Leu Met Thr Asp Gln Thr Phe Thr Glu Phe Phe Ser Phe Val Ser Glu 465 470 475 480 <210> 24 <211> 1683 <212> DNA <213> Penicillium citrinum <220> <221> CDS <222> (1)..(1683) <400> 24 atg gct ttt ggc ccg tat gtt gcc tac gga gca cta gca cta gcc gcc 48 Met Ala Phe Gly Pro Tyr Val Ala Tyr Gly Ala Leu Ala Leu Ala Ala 1 5 10 15 tac aag att gca aaa ctt ttc ttt ttt gta ttt caa gcc cga aag aca 96 Tyr Lys Ile Ala Lys Leu Phe Phe Phe Val Phe Gln Ala Arg Lys Thr 20 25 30 ggt ctg cct cat gtt ctc 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acc ccg tta cgc aag gcc cac ttt gca cat caa gca ttg gac 816 Lys Leu Thr Pro Leu Arg Lys Ala His Phe Ala His Gln Ala Leu Asp 260 265 270 tat tac ttg cgg caa ttg att cga gac aag agg aaa cag ctg gtg caa 864 Tyr Tyr Leu Arg Gln Leu Ile Arg Asp Lys Arg Lys Gln Leu Val Gln 275 280 285 gat ata aat cat cag gat ggg act agc aac cgc gga aac ctg ctc act 912 Asp Ile Asn His Gln Asp Gly Thr Ser Asn Arg Gly Asn Leu Leu Thr 290 295 300 gcc gtc ctg cga gca tct cta acc gac ggc gat ttg gcc aaa gcg gga 960 Ala Val Leu Arg Ala Ser Leu Thr Asp Gly Asp Leu Ala Lys Ala Gly 305 310 315 320 ggg gct cgc aag gac gcg ttt act gaa gag gag act atg ggg aat ctg 1008 Gly Ala Arg Lys Asp Ala Phe Thr Glu Glu Glu Thr Met Gly Asn Leu 325 330 335 ttc att tat ctc ctg gca ggc tac gag acc acc gcg aac gct att atg 1056 Phe Ile Tyr Leu Leu Ala Gly Tyr Glu Thr Thr Ala Asn Ala Ile Met 340 345 350 tat ggt ctt ttc ttg ctc gcc cta cac cct gaa atc cag gaa aag gtc 1104 Tyr Gly Leu Phe Leu Leu Ala Leu His Pro Glu Ile Gln Glu Lys Val 355 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Val Val Ala Ala 465 470 475 480 gac cga tcc cgt cag atg aaa ggg act ctc tta acc ttt tct gat ggt 1488 Asp Arg Ser Arg Gln Met Lys Gly Thr Leu Leu Thr Phe Ser Asp Gly 485 490 495 gcg cgg gca tgt tta gga cgg agg ttt gcc caa gcg gaa tac att gca 1536 Ala Arg Ala Cys Leu Gly Arg Arg Phe Ala Gln Ala Glu Tyr Ile Ala 500 505 510 ttc ttt gcg gcg ttt ctg aaa ggt cac cgt gtg aag atc cgt cct gat 1584 Phe Phe Ala Ala Phe Leu Lys Gly His Arg Val Lys Ile Arg Pro Asp 515 520 525 cac gat cgg caa act gtt tgg aga gac att tat ctc aag agt gct ggg 1632 His Asp Arg Gln Thr Val Trp Arg Asp Ile Tyr Leu Lys Ser Ala Gly 530 535 540 cag atc aca ttg gct ccg tta gat aca aca ggc ctt gta att gaa cga 1680 Gln Ile Thr Leu Ala Pro Leu Asp Thr Thr Gly Leu Val Ile Glu Arg 545 550 555 560 cga 1683 Arg <210> 25 <211> 561 <212> PRT <213> Penicillium citrinum <400> 25 Met Ala Phe Gly Pro Tyr Val Ala Tyr Gly Ala Leu Ala Leu Ala Ala 1 5 10 15 Tyr Lys Ile Ala Lys Leu Phe Phe Phe Val Phe Gln Ala Arg Lys Thr 20 25 30 Gly Leu Pro 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Ser Ile Leu Leu Leu Pro Gly Trp Leu Leu 245 250 255 Lys Leu Thr Pro Leu Arg Lys Ala His Phe Ala His Gln Ala Leu Asp 260 265 270 Tyr Tyr Leu Arg Gln Leu Ile Arg Asp Lys Arg Lys Gln Leu Val Gln 275 280 285 Asp Ile Asn His Gln Asp Gly Thr Ser Asn Arg Gly Asn Leu Leu Thr 290 295 300 Ala Val Leu Arg Ala Ser Leu Thr Asp Gly Asp Leu Ala Lys Ala Gly 305 310 315 320 Gly Ala Arg Lys Asp Ala Phe Thr Glu Glu Glu Thr Met Gly Asn Leu 325 330 335 Phe Ile Tyr Leu Leu Ala Gly Tyr Glu Thr Thr Ala Asn Ala Ile Met 340 345 350 Tyr Gly Leu Phe Leu Leu Ala Leu His Pro Glu Ile Gln Glu Lys Val 355 360 365 Ile Cys Glu Val Asp Arg Val Trp Ala Glu Ala Asn Ala Ser Gly Arg 370 375 380 Glu Ser Leu Ser Tyr Gln His Asp Phe Asp Lys Phe Tyr Glu Ser Phe 385 390 395 400 Arg Leu Phe Pro Gly Val Thr Leu Ile Thr Lys Ile Ala Asn Gly Asp 405 410 415 Gln Pro Val His Val Ser Asn Ser Ser Gly Val Thr Thr Thr His Ile 420 425 430 Leu Ser Ser Gly Ile Arg Val Tyr Leu Ser Ala Pro Gly Val His Tyr 435 440 445 His Pro Arg Tyr Trp Pro Glu 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Arg Ile Ala Ser Lys Ser Pro Arg Ser Asp Phe 260 265 270 atg agt tac ttg cta cgc gaa agg agt gaa ttt gac caa gag gta tcc 864 Met Ser Tyr Leu Leu Arg Glu Arg Ser Glu Phe Asp Gln Glu Val Ser 275 280 285 gat acg caa ctc gca gcg cat gcc tcc gat ttt gtc att gcg ggg agt 912 Asp Thr Gln Leu Ala Ala His Ala Ser Asp Phe Val Ile Ala Gly Ser 290 295 300 gag aca aca gcg act act cta ctg gtc gtc gca tac tat ctt tcc cgt 960 Glu Thr Thr Ala Thr Thr Leu Leu Val Val Ala Tyr Tyr Leu Ser Arg 305 310 315 320 tac ccg gag att acc agg aag ctc cag aag gag gtg cga agt gcc ttc 1008 Tyr Pro Glu Ile Thr Arg Lys Leu Gln Lys Glu Val Arg Ser Ala Phe 325 330 335 gac agc tac gaa gag atc aac ggc tca tcc act gcg aga ctc cgg tac 1056 Asp Ser Tyr Glu Glu Ile Asn Gly Ser Ser Thr Ala Arg Leu Arg Tyr 340 345 350 ctg cat gtt atc tgc cta gag gca atg agg atg gta ccg cct ctt cca 1104 Leu His Val Ile Cys Leu Glu Ala Met Arg Met Val Pro Pro Leu Pro 355 360 365 cta ggc ctt ccc agg gtt gtc ccc aaa gga gga gcc atg gtg gac gga 1152 Leu 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48 Met Leu Ser Leu Thr Val Gln Asp Ser His Val Ala Leu Asn Leu Pro 1 5 10 15 aca act caa gag tca tct tca tgc cca aca cct ttt ctt caa ctg tcc 96 Thr Thr Gln Glu Ser Ser Ser Cys Pro Thr Pro Phe Leu Gln Leu Ser 20 25 30 aat agg tcc acc gtg aag gca agg cca tgg caa ccg gct ccc tcc cac 144 Asn Arg Ser Thr Val Lys Ala Arg Pro Trp Gln Pro Ala Pro Ser His 35 40 45 tgg gta tcc gag tgc caa ccg cga atg aac act gtt tct cgt gag gtg 192 Trp Val Ser Glu Cys Gln Pro Arg Met Asn Thr Val Ser Arg Glu Val 50 55 60 gat gag tac ttc ttg cac cac tgg cct ttt ccc gac gag cga gca aga 240 Asp Glu Tyr Phe Leu His His Trp Pro Phe Pro Asp Glu Arg Ala Arg 65 70 75 80 aag aag ttc atc gaa gct ggt ttt tcg aga gtg aca tgc ctt tac ttc 288 Lys Lys Phe Ile Glu Ala Gly Phe Ser Arg Val Thr Cys Leu Tyr Phe 85 90 95 cct ttg gcc agt gac gat cgt atc aag ttc gca tgt ctt ctg cta aca 336 Pro Leu Ala Ser Asp Asp Arg Ile Lys Phe Ala Cys Leu Leu Leu Thr 100 105 110 gtg ctc ttc ctt atc gac gat ttg ttg gag gaa atg tct ttc gcg gat 384 Val Leu Phe Leu Ile Asp Asp Leu Leu Glu Glu Met Ser Phe Ala Asp 115 120 125 ggc aag gca tac aat gaa aat tta atg ccc att tgt cgc ggc gat gtt 432 Gly Lys Ala Tyr Asn Glu Asn Leu Met Pro Ile Cys Arg Gly Asp Val 130 135 140 ctg cct gac cgc aac att cca gtt gaa tac att atg tat gat ctt tgg 480 Leu Pro Asp Arg Asn Ile Pro Val Glu Tyr Ile Met Tyr Asp Leu Trp 145 150 155 160 gaa caa atg cga gca cat gac aag aag ctg gcg gat gag att ctc gag 528 Glu Gln Met Arg Ala His Asp Lys Lys Leu Ala Asp Glu Ile Leu Glu 165 170 175 ccc aca ttc acg ttc atg cga gcc cag aca gac aac acc cgt ctc aaa 576 Pro Thr Phe Thr Phe Met Arg Ala Gln Thr Asp Asn Thr Arg Leu Lys 180 185 190 atc aac gag ctg ggt caa tat ctg gaa tat cga gag aag gac gtt gga 624 Ile Asn Glu Leu Gly Gln Tyr Leu Glu Tyr Arg Glu Lys Asp Val Gly 195 200 205 aaa gcg ctt ctt tct gcc ttg atg cgt ttt gtc atg ggt atc aac ctg 672 Lys Ala Leu Leu Ser Ala Leu Met Arg Phe Val Met Gly Ile Asn Leu 210 215 220 acc act gat gaa ctg caa atg cta tca ccc tta gag cag aac tgc gcc 720 Thr Thr Asp Glu Leu Gln Met Leu Ser Pro Leu Glu Gln Asn Cys Ala 225 230 235 240 aag cat atc tcc gtc gtg aac gat att ttc agc tgg gag aag gag ctc 768 Lys His Ile Ser Val Val Asn Asp Ile Phe Ser Trp Glu Lys Glu Leu 245 250 255 aag gca tca aag atg ggt cac cag gag ggc tct ttt ctc tgt tct gcg 816 Lys Ala Ser Lys Met Gly His Gln Glu Gly Ser Phe Leu Cys Ser Ala 260 265 270 gtt atg gtg gta gcg act gag acc aat ctc agt ttt gat gcc tcg aag 864 Val Met Val Val Ala Thr Glu Thr Asn Leu Ser Phe Asp Ala Ser Lys 275 280 285 cgc att ctt tgg cca att gtc cgt gag tgg gag ctt gtc cat gat gac 912 Arg Ile Leu Trp Pro Ile Val Arg Glu Trp Glu Leu Val His Asp Asp 290 295 300 atg tgt gca cag ttg ctc tcc gct ggc tgc agc gag gct aca aaa gca 960 Met Cys Ala Gln Leu Leu Ser Ala Gly Cys Ser Glu Ala Thr Lys Ala 305 310 315 320 tat atg aaa gga ctg gaa tat caa atg agt ggc aat gag ctg tgg agt 1008 Tyr Met Lys Gly Leu Glu Tyr Gln Met Ser Gly Asn Glu Leu Trp Ser 325 330 335 cac acg acg ctc cga tac acc aaa gtg gat 1038 His Thr Thr Leu Arg Tyr Thr Lys Val Asp 340 345 <210> 31 <211> 346 <212> PRT <213> Penicillium citrinum <400> 31 Met Leu Ser Leu Thr Val Gln Asp Ser His Val Ala Leu Asn Leu Pro 1 5 10 15 Thr Thr Gln Glu Ser Ser Ser Cys Pro Thr Pro Phe Leu Gln Leu Ser 20 25 30 Asn Arg Ser Thr Val Lys Ala Arg Pro Trp Gln Pro Ala Pro Ser His 35 40 45 Trp Val Ser Glu Cys Gln Pro Arg Met Asn Thr Val Ser Arg Glu Val 50 55 60 Asp Glu Tyr Phe Leu His His Trp Pro Phe Pro Asp Glu Arg Ala Arg 65 70 75 80 Lys Lys Phe Ile Glu Ala Gly Phe Ser Arg Val Thr Cys Leu Tyr Phe 85 90 95 Pro Leu Ala Ser Asp Asp Arg Ile Lys Phe Ala Cys Leu Leu Leu Thr 100 105 110 Val Leu Phe Leu Ile Asp Asp Leu Leu Glu Glu Met Ser Phe Ala Asp 115 120 125 Gly Lys Ala Tyr Asn Glu Asn Leu Met Pro Ile Cys Arg Gly Asp Val 130 135 140 Leu Pro Asp Arg Asn Ile Pro Val Glu Tyr Ile Met Tyr Asp Leu Trp 145 150 155 160 Glu Gln Met Arg Ala His Asp Lys Lys Leu Ala Asp Glu Ile Leu Glu 165 170 175 Pro Thr Phe Thr Phe Met Arg Ala Gln Thr Asp Asn Thr Arg Leu Lys 180 185 190 Ile Asn Glu Leu Gly Gln Tyr Leu Glu Tyr Arg Glu Lys Asp Val Gly 195 200 205 Lys Ala Leu Leu Ser Ala Leu Met Arg Phe Val Met Gly Ile Asn Leu 210 215 220 Thr Thr Asp Glu Leu Gln Met Leu Ser Pro Leu Glu Gln Asn Cys Ala 225 230 235 240 Lys His Ile Ser Val Val Asn Asp Ile Phe Ser Trp Glu Lys Glu Leu 245 250 255 Lys Ala Ser Lys Met Gly His Gln Glu Gly Ser Phe Leu Cys Ser Ala 260 265 270 Val Met Val Val Ala Thr Glu Thr Asn Leu Ser Phe Asp Ala Ser Lys 275 280 285 Arg Ile Leu Trp Pro Ile Val Arg Glu Trp Glu Leu Val His Asp Asp 290 295 300 Met Cys Ala Gln Leu Leu Ser Ala Gly Cys Ser Glu Ala Thr Lys Ala 305 310 315 320 Tyr Met Lys Gly Leu Glu Tyr Gln Met Ser Gly Asn Glu Leu Trp Ser 325 330 335 His Thr Thr Leu Arg Tyr Thr Lys Val Asp 340 345 <210> 32 <211> 1206 <212> DNA <213> Penicillium citrinum <220> <221> CDS <222> (1)..(1206) <400> 32 atg gtt atc gaa cgg ctg tcc ggc tcg aag gga cgg gcg gcg tct gcc 48 Met Val Ile Glu Arg Leu Ser Gly Ser Lys Gly Arg Ala Ala Ser Ala 1 5 10 15 ctc aga gaa gat gtt acc gga ccc aat tcc gcc aat gga tac atg aac 96 Leu Arg Glu Asp Val Thr Gly Pro Asn Ser Ala Asn Gly Tyr Met Asn 20 25 30 gca gtg ctc aag cag att cat cac act ctg gca cct gga cca ctc cta 144 Ala Val Leu Lys Gln Ile His His Thr Leu Ala Pro Gly Pro Leu Leu 35 40 45 gaa aag gtc act gat gcg gta atc acc gat ctc aat gat tct att ggg 192 Glu Lys Val Thr Asp Ala Val Ile Thr Asp Leu Asn Asp Ser Ile Gly 50 55 60 ggg ctt cag cac aaa gag acg acc att cat ctt ctt gaa tgg ttc cgc 240 Gly Leu Gln His Lys Glu Thr Thr Ile His Leu Leu Glu Trp Phe Arg 65 70 75 80 cac aat ttc agc atg tct tct acc aat gca att tac gga ccc aaa aat 288 His Asn Phe Ser Met Ser Ser Thr Asn Ala Ile Tyr Gly Pro Lys Asn 85 90 95 ccg ttc aag gat ccg aag gtt gaa aac ggc ttt tgg gag ttc gac tac 336 Pro Phe Lys Asp Pro Lys Val Glu Asn Gly Phe Trp Glu Phe Asp Tyr 100 105 110 gcg gtc agc aac cta ctt atc acc ccc aaa gcc agc tgg aca act cca 384 Ala Val Ser Asn Leu Leu Ile Thr Pro Lys Ala Ser Trp Thr Thr Pro 115 120 125 cag ggc gac aag ggg cgt tcg gat gca tgg aac ggt ttc atc gat tat 432 Gln Gly Asp Lys Gly Arg Ser Asp Ala Trp Asn Gly Phe Ile Asp Tyr 130 135 140 ttc cgg caa ggg ggt cac aac gag ggg tca gaa atg gcc aag caa cga 480 Phe Arg Gln Gly Gly His Asn Glu Gly Ser Glu Met Ala Lys Gln Arg 145 150 155 160 tac gaa gtt gca att gcc aag ggg att cca att gat gac atc ggc cga 528 Tyr Glu Val Ala Ile Ala Lys Gly Ile Pro Ile Asp Asp Ile Gly Arg 165 170 175 ttg gag gtc acg atg atc atc ggt gtc ttg act aat acc gtt cct gcg 576 Leu Glu Val Thr Met Ile Ile Gly Val Leu Thr Asn Thr Val Pro Ala 180 185 190 ggc ttc tgg atg act tat tac atc tgg tcg acg cca ggt ctc ctc gat 624 Gly Phe Trp Met Thr Tyr Tyr Ile Trp Ser Thr Pro Gly Leu Leu Asp 195 200 205 gag ctg cgc ggt gaa ctg gac aag atc att atc cgc gaa acc cag ccc 672 Glu Leu Arg Gly Glu Leu Asp Lys Ile Ile Ile Arg Glu Thr Gln Pro 210 215 220 gac ggt cga cca aag cta act ctc cga tcg gcc gat atc aag caa gac 720 Asp Gly Arg Pro Lys Leu Thr Leu Arg Ser Ala Asp Ile Lys Gln Asp 225 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Leu Val Ala Ala 340 345 350 ttc gat atc tca cct acg aag ggg gca tgg gac ttt ccc ggt gcc cat 1104 Phe Asp Ile Ser Pro Thr Lys Gly Ala Trp Asp Phe Pro Gly Ala His 355 360 365 gga cat acc att gct gcc gca atg gac tcc ccc gat cat gat gtc cag 1152 Gly His Thr Ile Ala Ala Ala Met Asp Ser Pro Asp His Asp Val Gln 370 375 380 gtc aag ctg cag cca cgc caa gga tac gaa gat gct gtg tgg aca ttg 1200 Val Lys Leu Gln Pro Arg Gln Gly Tyr Glu Asp Ala Val Trp Thr Leu 385 390 395 400 aaa cca 1206 Lys Pro <210> 33 <211> 402 <212> PRT <213> Penicillium citrinum <400> 33 Met Val Ile Glu Arg Leu Ser Gly Ser Lys Gly Arg Ala Ala Ser Ala 1 5 10 15 Leu Arg Glu Asp Val Thr Gly Pro Asn Ser Ala Asn Gly Tyr Met Asn 20 25 30 Ala Val Leu Lys Gln Ile His His Thr Leu Ala Pro Gly Pro Leu Leu 35 40 45 Glu Lys Val Thr Asp Ala Val Ile Thr Asp Leu Asn Asp Ser Ile Gly 50 55 60 Gly Leu Gln His Lys Glu Thr Thr Ile His Leu Leu Glu Trp Phe Arg 65 70 75 80 His Asn Phe Ser Met Ser Ser Thr Asn Ala Ile Tyr Gly Pro Lys Asn 85 90 95 Pro Phe Lys Asp Pro Lys Val Glu Asn Gly Phe Trp Glu Phe Asp Tyr 100 105 110 Ala Val Ser Asn Leu Leu Ile Thr Pro Lys Ala Ser Trp Thr Thr Pro 115 120 125 Gln Gly Asp Lys Gly Arg Ser Asp Ala Trp Asn Gly Phe Ile Asp Tyr 130 135 140 Phe Arg Gln Gly Gly His Asn Glu Gly Ser Glu Met Ala Lys Gln Arg 145 150 155 160 Tyr Glu Val Ala Ile Ala Lys Gly Ile Pro Ile Asp Asp Ile Gly Arg 165 170 175 Leu Glu Val Thr Met Ile Ile Gly Val Leu Thr Asn Thr Val Pro Ala 180 185 190 Gly Phe Trp Met Thr Tyr Tyr Ile Trp Ser Thr Pro Gly Leu Leu Asp 195 200 205 Glu Leu Arg Gly Glu Leu Asp Lys Ile Ile Ile Arg Glu Thr Gln Pro 210 215 220 Asp Gly Arg Pro Lys Leu Thr Leu Arg Ser Ala Asp Ile Lys Gln Asp 225 230 235 240 Cys Pro Leu Leu Tyr Ala Thr Met Gln Glu Thr Leu Arg Met Arg Thr 245 250 255 Cys Gly Ile Ser Ser Arg Ile Val Thr Glu Asp Ile Val Leu Asn Asp 260 265 270 Gln Tyr Leu Val Lys Lys Asp Ser Val Met Glu Leu Pro Asn Asn Ile 275 280 285 Ile His Ser Ala Glu Asp Leu Trp Gly Pro Thr Val Cys Gln Phe Asn 290 295 300 Asn Lys 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ctt ttg aat att gtt gcg acg gcg att ccc aaa ata aca 192 Ile Ala Met Leu Leu Asn Ile Val Ala Thr Ala Ile Pro Lys Ile Thr 50 55 60 gat gaa ttt cac agc ttg gat cag gtt gga tgg tat gga tct gcc ttt 240 Asp Glu Phe His Ser Leu Asp Gln Val Gly Trp Tyr Gly Ser Ala Phe 65 70 75 80 ttc gtt gga ctg gtg gcg ttc caa gcc gtc tgg ggt aaa atc tac cgg 288 Phe Val Gly Leu Val Ala Phe Gln Ala Val Trp Gly Lys Ile Tyr Arg 85 90 95 ttt ttt cct cta aag gct acg ttt atg gtt gcg atc gtg ctt ttt gag 336 Phe Phe Pro Leu Lys Ala Thr Phe Met Val Ala Ile Val Leu Phe Glu 100 105 110 gca ggt agc ttg ata tgc gcg gtc tcc cag aac agc atc acc tta atc 384 Ala Gly Ser Leu Ile Cys Ala Val Ser Gln Asn Ser Ile Thr Leu Ile 115 120 125 gct gga cgc gca att act ggg gca gga gga tct gga gta aca agc ggg 432 Ala Gly Arg Ala Ile Thr Gly Ala Gly Gly Ser Gly Val Thr Ser Gly 130 135 140 tgt tac atc att att gcc aat att gct gcc cca gag aaa cgt gct gca 480 Cys Tyr Ile Ile Ile Ala Asn Ile Ala Ala Pro Glu Lys Arg Ala Ala 145 150 155 160 tat acg ggc att tta ggc gcg acg tac ggg atc gcg agc att atg ggc 528 Tyr Thr Gly Ile Leu Gly Ala Thr Tyr Gly Ile Ala Ser Ile Met Gly 165 170 175 cct tta gta gga ggt gca ttc act gat caa ttg acg tgg cgt tgg tgt 576 Pro Leu Val Gly Gly Ala Phe Thr Asp Gln Leu Thr Trp Arg Trp Cys 180 185 190 ttc tgg atc aat ctc ccc atc gga ttt gcc gcg gta gtc ctt ttg ctt 624 Phe Trp Ile Asn Leu Pro Ile Gly Phe Ala Ala Val Val Leu Leu Leu 195 200 205 ttg act ttc tca acc ccg gcc tct gca aaa ccc atc aag tcc aca tgg 672 Leu Thr Phe Ser Thr Pro Ala Ser Ala Lys Pro Ile Lys Ser Thr Trp 210 215 220 atc gag ata cta cgc cat gtg gat ttg cta agt gtg gtt att att atc 720 Ile Glu Ile Leu Arg His Val Asp Leu Leu Ser Val Val Ile Ile Ile 225 230 235 240 gcc tca ttt gtg tgt tac ctc ctt gcc atg caa tgg ggt ggc gta tca 768 Ala Ser Phe Val Cys Tyr Leu Leu Ala Met Gln Trp Gly Gly Val Ser 245 250 255 aag tcc tgg gac tct gct gat gtg att ggg acc att gtt ggt tgg atc 816 Lys Ser Trp Asp Ser Ala Asp Val Ile Gly Thr Ile Val Gly Trp Ile 260 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Ala Leu Thr Ala Val Leu Glu Ala Tyr 485 490 495 atg agc ggg ttt cgg act gcg tgg att att tgc atc gcg gca gca ggt 1536 Met Ser Gly Phe Arg Thr Ala Trp Ile Ile Cys Ile Ala Ala Ala Gly 500 505 510 ctc gcc ttt gtc atc agt ctg tta cca ctt ttc gtt agg gta aac gga 1584 Leu Ala Phe Val Ile Ser Leu Leu Pro Leu Phe Val Arg Val Asn Gly 515 520 525 aag gta cag tcc gat cag gag gat cat agt cag tca cat ctg acg caa 1632 Lys Val Gln Ser Asp Gln Glu Asp His Ser Gln Ser His Leu Thr Gln 530 535 540 att tcc gtc 1641 Ile Ser Val 545 <210> 35 <211> 547 <212> PRT <213> Penicillium citrinum <400> 35 Met Arg Met Asn Asp Ala Lys Ile Val Thr Lys Glu Gln Ile Glu Pro 1 5 10 15 Val Asp Gln Asn Ala Asn Thr Asn Gly Leu Tyr Ser Gln Trp Arg Lys 20 25 30 Lys Val Leu Gly Pro Trp Ala Ser Val Cys Val Val Val Ala Leu Val 35 40 45 Ile Ala Met Leu Leu Asn Ile Val Ala Thr Ala Ile Pro Lys Ile Thr 50 55 60 Asp Glu Phe His Ser Leu Asp Gln Val Gly Trp Tyr Gly Ser Ala Phe 65 70 75 80 Phe Val Gly Leu Val Ala Phe Gln Ala Val Trp Gly 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gac aac aca aaa aat acg gtc tgg tcc atc gat ttg cac cgg gcc 288 Thr Asp Asn Thr Lys Asn Thr Val Trp Ser Ile Asp Leu His Arg Ala 85 90 95 aga gtt gta cta acc acc acc gca gga cac gtc gtt cgg atc tca ccc 336 Arg Val Val Leu Thr Thr Thr Ala Gly His Val Val Arg Ile Ser Pro 100 105 110 aac gag ctc tca ttt gca tcg gtt gaa tcc tgg aaa gcc atc tac ggc 384 Asn Glu Leu Ser Phe Ala Ser Val Glu Ser Trp Lys Ala Ile Tyr Gly 115 120 125 cac cag gtc tca gga aag cca gta ccc att aaa agc cag ttc tac gag 432 His Gln Val Ser Gly Lys Pro Val Pro Ile Lys Ser Gln Phe Tyr Glu 130 135 140 atc tac ggg gct ggc ttc act tca ctc tgt atc ggg agt gag cgt gac 480 Ile Tyr Gly Ala Gly Phe Thr Ser Leu Cys Ile Gly Ser Glu Arg Asp 145 150 155 160 ccc aag aag cat ggt cgt atg cgc aag ctg ctt tca gcc gca ttt gct 528 Pro Lys Lys His Gly Arg Met Arg Lys Leu Leu Ser Ala Ala Phe Ala 165 170 175 acg aag tca cta gtc gag caa gag gtc att gtc gcg caa gcg atc gat 576 Thr Lys Ser Leu Val Glu Gln Glu Val Ile Val Ala Gln Ala Ile Asp 180 185 190 tta ttt att gat cag ctc ggt cga aaa ggc ggc cct gaa acc agt ggg 624 Leu Phe Ile Asp Gln Leu Gly Arg Lys Gly Gly Pro Glu Thr Ser Gly 195 200 205 ctg gat ttg acg aaa tgg tat gag atg gct gcc ttt gac att ctc ggg 672 Leu Asp Leu Thr Lys Trp Tyr Glu Met Ala Ala Phe Asp Ile Leu Gly 210 215 220 gag atg gcg ttt gga gaa agt ttc aac tgc att aaa tct ggc gag ccg 720 Glu Met Ala Phe Gly Glu Ser Phe Asn Cys Ile Lys Ser Gly Glu Pro 225 230 235 240 cac ttc tgg tct gag ctg gtg ctc gat cat cta tat ttc att acg ctt 768 His Phe Trp Ser Glu Leu Val Leu Asp His Leu Tyr Phe Ile Thr Leu 245 250 255 atc gac aat tta cgt cgg att cct ttg ctt gta agg atc acc aga ttg 816 Ile Asp Asn Leu Arg Arg Ile Pro Leu Leu Val Arg Ile Thr Arg Leu 260 265 270 ctg ttc cct tca aat ctc gca gtc cgt aat cgg aac tcg gaa tac agc 864 Leu Phe Pro Ser Asn Leu Ala Val Arg Asn Arg Asn Ser Glu Tyr Ser 275 280 285 aga ggc cag gta gca aaa cga ctg tcc aag cca acg gct agg aaa gac 912 Arg Gly Gln Val Ala Lys Arg Leu Ser Lys Pro Thr Ala Arg Lys Asp 290 295 300 ttt ctt aca acc atg gtg aag cac ttt gaa gat gga aac ctt gaa aag 960 Phe Leu Thr Thr Met Val Lys His Phe Glu Asp Gly Asn Leu Glu Lys 305 310 315 320 gag gaa ctg act gca cac gtc tcc act ctt gta att gca ggg ggt gaa 1008 Glu Glu Leu Thr Ala His Val Ser Thr Leu Val Ile Ala Gly Gly Glu 325 330 335 acg att gct acc ttc ctc ggc gct gtg aca tat cat ttg cta cag tcg 1056 Thr Ile Ala Thr Phe Leu Gly Ala Val Thr Tyr His Leu Leu Gln Ser 340 345 350 caa gtc tgt cac gaa aag ctg aaa aac gag att cga ggg cat ttc gcc 1104 Gln Val Cys His Glu Lys Leu Lys Asn Glu Ile Arg Gly His Phe Ala 355 360 365 aag tcc gaa gat atc aat gcg acg gaa gca cgg aag ctt cca tat ttg 1152 Lys Ser Glu Asp Ile Asn Ala Thr Glu Ala Arg Lys Leu Pro Tyr Leu 370 375 380 caa gct gtc att gac gaa ggc ctt cgc ata tac cct cct ggc tcg cag 1200 Gln Ala Val Ile Asp Glu Gly Leu Arg Ile Tyr Pro Pro Gly Ser Gln 385 390 395 400 ggc ttc cct cgt gta tca acc gga atg ttg ata gga agt acc tgg gct 1248 Gly Phe Pro Arg Val Ser Thr Gly Met Leu Ile Gly Ser Thr Trp Ala 405 410 415 gaa ata tat act agt gct tgg aca gtc aca cac agt gaa gaa tac ttc 1296 Glu Ile Tyr Thr Ser Ala Trp Thr Val Thr His Ser Glu Glu Tyr Phe 420 425 430 tcg gag cca atg aag ttc aag cct gat aga tgg ctt gac cag ggc tcg 1344 Ser Glu Pro Met Lys Phe Lys Pro Asp Arg Trp Leu Asp Gln Gly Ser 435 440 445 acc gac gtg aaa gaa gcc agc cag cca ttt tcg ctt ggt ccc cgg ggg 1392 Thr Asp Val Lys Glu Ala Ser Gln Pro Phe Ser Leu Gly Pro Arg Gly 450 455 460 tgc ctg ggc caa aag tcc atc aat ctg atc cta gcc aag atg ttc tgg 1440 Cys Leu Gly Gln Lys Ser Ile Asn Leu Ile Leu Ala Lys Met Phe Trp 465 470 475 480 cga tac gat ctg gaa ctc cta gac ccg aac tta gac tgg gaa ggg cag 1488 Arg Tyr Asp Leu Glu Leu Leu Asp Pro Asn Leu Asp Trp Glu Gly Gln 485 490 495 agc cat atg cat gtt atg tgg tgg aag cca gag ctc ccg gtt cga ttt 1536 Ser His Met His Val Met Trp Trp Lys Pro Glu Leu Pro Val Arg Phe 500 505 510 ttt gaa agg caa gcg 1551 Phe Glu Arg Gln Ala 515 <210> 37 <211> 517 <212> PRT <213> Penicillium citrinum <400> 37 Met Asp Thr Trp Gly Gly Ile Gly Trp Val Asn Tyr Ser Gly Ile Val 1 5 10 15 Leu Ile Tyr Ile Thr Val Thr Val Ile Tyr Asn Leu Tyr Leu His Pro 20 25 30 Leu Ser Gly Phe Pro Gly Pro Phe Trp Ala Arg Ser Ser Leu Val Cys 35 40 45 Ala Val Pro Asn Gln Leu Gln Asp Pro Val Leu Met Lys Asn His Ser 50 55 60 Tyr Gly Glu Phe Thr Ile Leu Trp Val Val Asp Phe Thr Ala Pro Ser 65 70 75 80 Thr Asp Asn Thr Lys Asn Thr Val Trp Ser Ile Asp Leu His Arg Ala 85 90 95 Arg Val Val Leu Thr Thr Thr Ala Gly His Val Val Arg Ile Ser Pro 100 105 110 Asn Glu Leu Ser Phe Ala Ser Val Glu Ser Trp Lys Ala Ile Tyr Gly 115 120 125 His Gln Val Ser Gly Lys Pro Val Pro Ile Lys Ser Gln Phe Tyr Glu 130 135 140 Ile Tyr Gly Ala Gly Phe Thr Ser Leu Cys Ile Gly Ser Glu Arg Asp 145 150 155 160 Pro Lys Lys His Gly Arg Met Arg Lys Leu Leu Ser Ala Ala Phe Ala 165 170 175 Thr Lys Ser Leu Val Glu Gln Glu Val Ile Val Ala Gln Ala Ile Asp 180 185 190 Leu Phe Ile Asp Gln Leu Gly Arg Lys Gly Gly Pro Glu Thr Ser Gly 195 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Val Lys Gly Asp Thr Ser Arg Ile Ala 370 375 380 ggg cag gtg cga ttg aat gag cgc ttg gaa agt cgc acg ccg gtc tcg 1200 Gly Gln Val Arg Leu Asn Glu Arg Leu Glu Ser Arg Thr Pro Val Ser 385 390 395 400 ccg gag ttc tac aac gag atg tgc gac ctc cgg gag aaa gcc tac cag 1248 Pro Glu Phe Tyr Asn Glu Met Cys Asp Leu Arg Glu Lys Ala Tyr Gln 405 410 415 cag aag aac tat acc cct gtg gga agc gtc gac acc ctg gct ccc ggt 1296 Gln Lys Asn Tyr Thr Pro Val Gly Ser Val Asp Thr Leu Ala Pro Gly 420 425 430 acc tac tac ctt gtc cac gtt gac gag atg ttc cgg cga agt tat gag 1344 Thr Tyr Tyr Leu Val His Val Asp Glu Met Phe Arg Arg Ser Tyr Glu 435 440 445 aaa act tca gtt gtc 1359 Lys Thr Ser Val Val 450 <210> 39 <211> 453 <212> PRT <213> Penicillium citrinum <400> 39 Met Thr Ser Lys Ala Gln Asn Val Gly Ile Lys Ala Leu Glu Ile Tyr 1 5 10 15 Phe Pro Ser Arg Tyr Val Pro Gln Ser Glu Leu Glu Thr Tyr Leu Gly 20 25 30 Ala Ser Thr Gly Lys Phe Thr Ile Gly Leu Gly Gln Gln Lys Met Ser 35 40 45 Phe Cys Asp Asp Arg Glu Asp Leu 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40 atg atg gac aaa gac acg cgg atc ctc atc gtt gga gca ggc tgc ttc 48 Met Met Asp Lys Asp Thr Arg Ile Leu Ile Val Gly Ala Gly Cys Phe 1 5 10 15 ggc act tcg acc gca tac cac ctt tca cag cgc ggt tac act tcc atc 96 Gly Thr Ser Thr Ala Tyr His Leu Ser Gln Arg Gly Tyr Thr Ser Ile 20 25 30 cgc gtg ctg gat cca tac gcc cct ccc tct tgc gaa gca gcc tct acc 144 Arg Val Leu Asp Pro Tyr Ala Pro Pro Ser Cys Glu Ala Ala Ser Thr 35 40 45 gat atc agc aag gtt atc cgc agc gac tac aac gaa cct cta tat gca 192 Asp Ile Ser Lys Val Ile Arg Ser Asp Tyr Asn Glu Pro Leu Tyr Ala 50 55 60 cgt ctt gga atc gag tct att gaa gcg tgg cgg tct tgg tcc ctg ttt 240 Arg Leu Gly Ile Glu Ser Ile Glu Ala Trp Arg Ser Trp Ser Leu Phe 65 70 75 80 cgt ggg ctc tac cat gtc ccc ggg tgg att ctc agc gca gcg aac ctg 288 Arg Gly Leu Tyr His Val Pro Gly Trp Ile Leu Ser Ala Ala Asn Leu 85 90 95 tcc cgg ccc ttt gtc gag ggt tcg att gag aca tgt aag agg ctt gga 336 Ser Arg Pro Phe Val Glu Gly Ser Ile Glu Thr Cys Lys Arg Leu Gly 100 105 110 gta 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Asp Ala Asp 325 330 335 acg gct gat cgg cat ttc ctt gtc acc cct cat cct gct cac aaa agt 1056 Thr Ala Asp Arg His Phe Leu Val Thr Pro His Pro Ala His Lys Ser 340 345 350 ctc ttc ctg gca acc ggc gga tca gca cat ggg ttc aag ttc ctt cct 1104 Leu Phe Leu Ala Thr Gly Gly Ser Ala His Gly Phe Lys Phe Leu Pro 355 360 365 gtc gtt gga aaa tat gtc gcg gat ttg ctt gag ggg act ctg gac cca 1152 Val Val Gly Lys Tyr Val Ala Asp Leu Leu Glu Gly Thr Leu Asp Pro 370 375 380 gag atc gtc agt caa tgg caa tgg agg gct ggg cag aag agt act gcg 1200 Glu Ile Val Ser Gln Trp Gln Trp Arg Ala Gly Gln Lys Ser Thr Ala 385 390 395 400 aag aat cta gcg cat ttg gat ccg gaa atg gag ttg agc gac ctt aca 1248 Lys Asn Leu Ala His Leu Asp Pro Glu Met Glu Leu Ser Asp Leu Thr 405 410 415 ggg tgg aag ggt aga cag ata cgt gaa aga agc cat gct tct aaa cta 1296 Gly Trp Lys Gly Arg Gln Ile Arg Glu Arg Ser His Ala Ser Lys Leu 420 425 430 <210> 41 <211> 432 <212> PRT <213> Penicillium citrinum <400> 41 Met Met Asp Lys Asp Thr Arg Ile Leu Ile Val Gly Ala Gly Cys Phe 1 5 10 15 Gly Thr Ser Thr Ala Tyr His Leu Ser Gln Arg Gly Tyr Thr Ser Ile 20 25 30 Arg Val Leu Asp Pro Tyr Ala Pro Pro Ser Cys Glu Ala Ala Ser Thr 35 40 45 Asp Ile Ser Lys Val Ile Arg Ser Asp Tyr Asn Glu Pro Leu Tyr Ala 50 55 60 Arg Leu Gly Ile Glu Ser Ile Glu Ala Trp Arg Ser Trp Ser Leu Phe 65 70 75 80 Arg Gly Leu Tyr His Val Pro Gly Trp Ile Leu Ser Ala Ala Asn Leu 85 90 95 Ser Arg Pro Phe Val Glu Gly Ser Ile Glu Thr Cys Lys Arg Leu Gly 100 105 110 Val Gln Gly Leu Glu Lys Leu Thr Pro Asp Gln Ile Arg Thr Arg Phe 115 120 125 Ser Val Val Thr Gly Lys Leu Asp Gly Trp Asn Ile Asn Val Trp Asn 130 135 140 Pro Thr Ala Gly Trp Ala Ala Ala Gly Thr Ala Ile Glu Arg Met Ala 145 150 155 160 Gly Ala Ser Gln Glu Lys Gly Val Lys Tyr Ile Ser Gly Lys Thr Lys 165 170 175 Gly Asp Val Gln Glu Leu Ile Leu Asp Asp Ile Thr Gly Glu Cys Lys 180 185 190 Gly Val Val Thr Ala Asp Gly Thr Arg His Glu Ala Asp Val Val Ile 195 200 205 Leu Ala Ala Gly Ala Trp Thr Pro Ser Leu Leu Asp Val Lys Gly Gln 210 215 220 Leu Thr Ala Lys Gly His Ser Val Ala His Ile Gln Leu Thr Pro Ser 225 230 235 240 Glu Thr Lys His Tyr Ala Ser Met Pro Ile Met Asp Asn Leu Glu Leu 245 250 255 Gly Tyr Phe Phe Pro Pro Gln Glu Asp Gly Ile Phe Lys Met Ala His 260 265 270 Ser Gln Phe Ile Thr Asn Val Gln Thr Thr Lys Ser Gly Ile Thr Thr 275 280 285 Ser Val Pro His Thr Phe Val Gln Ala Pro Thr Asp Gly Leu Pro Leu 290 295 300 Glu Ile Glu Ala Gln Met Arg Arg Asn Leu Arg Arg Val Leu Pro Glu 305 310 315 320 Leu Ala Asp Arg Pro Phe Cys Tyr Thr Arg Leu Cys Trp Asp Ala Asp 325 330 335 Thr Ala Asp Arg His Phe Leu Val Thr Pro His Pro Ala His Lys Ser 340 345 350 Leu Phe Leu Ala Thr Gly Gly Ser Ala His Gly Phe Lys Phe Leu Pro 355 360 365 Val Val Gly Lys Tyr Val Ala Asp Leu Leu Glu Gly Thr Leu Asp Pro 370 375 380 Glu Ile Val Ser Gln Trp Gln Trp Arg Ala Gly Gln Lys Ser Thr Ala 385 390 395 400 Lys Asn Leu Ala His Leu Asp Pro Glu Met Glu Leu Ser Asp Leu Thr 405 410 415 Gly Trp Lys Gly Arg Gln Ile Arg Glu Arg Ser His Ala Ser Lys Leu 420 425 430 <210> 42 <211> 19 <212> DNA <213> Penicillium citrinum <400> 42 catttgctgt tgatggagc 19 <210> 43 <211> 20 <212> DNA <213> Penicillium citrinum <400> 43 gacctattgc tttgtagcac 20 <210> 44 <211> 19 <212> DNA <213> Penicillium citrinum <400> 44 tctgatcaga acgacgagc 19 <210> 45 <211> 20 <212> DNA <213> Penicillium citrinum <400> 45 tcagagaagg ccactatgcc 20 <210> 46 <211> 21 <212> DNA <213> Penicillium citrinum <400> 46 cttctgcgcc attcttcttg g 21 <210> 47 <211> 21 <212> DNA <213> Penicillium citrinum <400> 47 agatttgcac catagatcca c 21 <210> 48 <211> 20 <212> DNA <213> Penicillium citrinum <400> 48 atgagtccag cgaggattac 20 <210> 49 <211> 20 <212> DNA <213> Penicillium citrinum <400> 49 tatgaagctg ctcggtatgc 20 <210> 50 <211> 21 <212> DNA <213> Penicillium citrinum <400> 50 gcgatgaatg ccaaagacta c 21

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｐ 3/06 Ａ６１Ｐ 43/00 １１１ 43/00 １１１Ｃ１２Ｎ 9/99 Ｃ１２Ｎ 9/99 Ｃ１２Ｒ 1:80 (Ｃ１２Ｐ 7/42 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡＣ１２Ｒ 1:80） (Ｃ１２Ｐ 17/06 Ｃ１２Ｒ 1:80）Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA80 CA04 DA06 DA11 EA04 FA15 GA11 GA21 4B064 AD32 AE46 CA02 CA05 DA06 4B065 AA26X AA67X AA67Y AB01 AC14 BA02 BA10 CA10 CA18 CA44 4C206 AA04 DB03 DB56 ZC20 ZC33

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】配列表の配列番号１のヌクレオチド番号１
乃至７２１４９で示される塩基配列からなり、ＭＬ−２
３６Ｂ生産菌内に導入されることにより該菌のＭＬ−２
３６Ｂ生産能を改善することを特徴とするＤＮＡ。
【請求項２】配列表の配列番号１のヌクレオチド番号１
乃至４２７５８で示される塩基配列からなり、ＭＬ−２
３６Ｂ生産菌内に導入されることにより該菌のＭＬ−２
３６Ｂ生産能を改善することを特徴とするＤＮＡ。
【請求項３】配列表の配列番号１のヌクレオチド番号１
１６１４乃至４７９１８で示される塩基配列からなり、
ＭＬ−２３６Ｂ生産菌内に導入されることにより該菌の
ＭＬ−２３６Ｂ生産能を改善することを特徴とするＤＮ
Ａ。
【請求項４】配列表の配列番号１のヌクレオチド番号３
６１３５乃至７２１４９で示される塩基配列からなり、
ＭＬ−２３６Ｂ生産菌内に導入されることにより該菌の
ＭＬ−２３６Ｂ生産能を改善することを特徴とするＤＮ
Ａ。
【請求項５】配列表の配列番号１のヌクレオチド番号２
５９７９乃至６３４１９で示される塩基配列からなり、
ＭＬ−２３６Ｂ生産菌内に導入されることにより該菌の
ＭＬ−２３６Ｂ生産能を改善することを特徴とするＤＮ
Ａ。
【請求項６】請求項１乃至５記載のＤＮＡとハイブリダ
イズし、ＭＬ−２３６Ｂ生産菌内に導入されることによ
り該菌のＭＬ−２３６Ｂ生産能を改善することを特徴と
するＤＮＡ。
【請求項７】請求項１乃至５記載のＤＮＡとストリンジ
ェントな条件下でハイブリダイズし、ＭＬ−２３６Ｂ生
産菌内に導入されることにより該菌のＭＬ−２３６Ｂ生
産能を改善することを特徴とするＤＮＡ。
【請求項８】請求項１乃至７のいずれか一つに記載のＤ
ＮＡを含む組換えＤＮＡベクター。
【請求項９】プラスミドｐＭＬ４２（ＦＥＲＭＢＰ−
７７２３）である請求項８記載の組換えＤＮＡベクタ
ー。
【請求項１０】プラスミドｐＭＬ４５（ＦＥＲＭＢＰ
−７７２４）である請求項８記載の組換えＤＮＡベクタ
ー。
【請求項１１】プラスミドｐＭＬ５１（ＦＥＲＭＢＰ
−７７２５）である請求項８記載の組換えＤＮＡベクタ
ー。
【請求項１２】請求項７乃至１０記載の組換えＤＮＡベ
クターで形質転換された宿主細胞。
【請求項１３】ＭＬ−２３６Ｂ生産菌であることを特徴
とする請求項１２記載の宿主細胞。
【請求項１４】ペニシリウム・シトリナム（Penicilliu
m citrinum）であることを特徴とする、請求項１３記載
の宿主細胞。
【請求項１５】大腸菌であることを特徴とする、請求項
１２記載の宿主細胞。
【請求項１６】請求項１２乃至１５記載の宿主細胞を培
養し、次いで該培養物からＭＬ−２３６Ｂを回収するこ
とを特徴とする、ＭＬ−２３６Ｂの製造法。